本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种色氨酸衰减子突变体、基于该色氨酸衰减子突变体创制的工程菌和工程菌的应用，还涉及及高效解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法。
背景技术：
：l-色氨酸(l-tryptophan)是含有吲哚基的芳香族氨基酸，是人和动物的必需氨基酸之一，广泛应用于食品、医药和饲料等行业。在医药行业，色氨酸可作为氨基酸注射液和药品，用于治疗抑郁症、提高睡眠质量、抗高血压及镇痛等。在食品行业，色氨酸作为添加剂可以提高机体对蛋白的利用效率。在饲料行业，色氨酸是安全型饲料添加剂，可以调节动物饲料的氨基酸的平衡，促进家禽家畜生长。l-色氨酸还可以衍生合成羟基色胺、烟酸、辅酶、吲哚乙酸、色素和生物碱等重要的生理活性物质，色氨酸衍生物具有广泛的应用市场。生物合成氨基酸(如l-色氨酸、l-苏氨酸、l-苯丙氨酸、l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-组氨酸等)的操纵子存在衰减调节机制。当胞内特定氨基酸浓度较高时，氨基酸操纵子的转录提前终止。相反地，当胞内特定氨基酸缺乏时，rna聚合酶转录氨基酸操纵子。生物法生产l-色氨酸或其衍生物的过程中，胞内l-色氨酸逐步积累，通过上述衰减调控机制反馈阻遏色氨酸操纵子的表达，不利于l-色氨酸或其衍生物的生物合成。因此，高效解除色氨酸对色氨酸操纵子的衰减调控，是生物合成l-色氨酸及其衍生物的关键。技术实现要素：本发明的目的是提供一种色氨酸衰减子突变体、基于该色氨酸衰减子突变体创制的工程菌和工程菌的应用，还涉及及高效解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法。本发明首先保护dna分子甲(色氨酸衰减子突变体)，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：(a1)序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示的dna分子；n1为115以上122以下的自然数(n1优选为115)，n2为135以上186以下的自然数(n2具体可为135以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为135、156或186)；(a2)将色氨酸衰减子的第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子，n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)；(a3)将色氨酸衰减子相关序列的第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子，n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)；(a4)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接标签序列得到的dna分子；(a5)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接连接序列得到的dna分子。色氨酸衰减子突变体为色氨酸衰减子截短体或色氨酸衰减子变体。色氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-135位核苷酸所示。色氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为136以上186以下的自然数(n4具体可为136以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为156或186)。本发明还保护所述dna分子甲在促进下游目的基因表达中的应用。所述应用中，所述dna分子甲作为调控元件。所述应用中，所述dna分子甲位于所述目的基因的启动子和所述目的基因的起始密码子之间。所述应用中，所述启动子具体可为序列表的序列1所示的启动子pthr-trc。所述应用中，所述目的基因具体可为序列表的序列7所示的gfp基因。本发明还保护dna分子乙，自上游至下游依次包括：所述dna分子甲和目的基因。所述目的基因具体可为序列表的序列7所示的gfp基因。本发明还保护dna分子丙，自上游至下游依次包括：启动子、所述dna分子甲、目的基因和终止子。所述启动子具体可为序列表的序列1所示的启动子pthr-trc。所述目的基因具体可为序列表的序列7所示的gfp基因。所述终止子具体可为ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。所述dna分子甲或所述dna分子乙或所述dna分子丙中，不具有色氨酸衰减子的第1至n3位核苷酸，n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。所述dna分子乙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列2第115至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因。所述dna分子乙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列2第122至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因。所述dna分子丙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第115至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。所述dna分子丙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第122至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。本发明还保护dna分子丁(解除衰减调控的色氨酸操纵子基因，又称色氨酸操纵子基因突变体)，是将色氨酸操纵子基因中的色氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子；n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。所述dna分子丁具体可为序列表的序列2第115至6687位核苷酸所示的dna分子。本发明还保护dna分子戊，自上游至下游依次包括如下元件：启动子和所述dna分子丁。所述启动子可为序列表的序列8所示的启动子pjj。所述dna分子戊自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列8所示的启动子pjj、pacyc184质粒中hindiii和bamhi酶切位点之间的小片段、序列表的序列2第115至6687位核苷酸所示的dna分子。所述dna分子戊自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列8所示的启动子pjj、pacyc184质粒中hindiii和bamhi酶切位点之间的小片段、序列表的序列2第115至6865位核苷酸所示的dna分子。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重组载体也属于本发明的保护范围。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为所述dna分子丁或所述dna分子戊插入出发质粒得到的重组质粒。所述出发质粒为低拷贝、中拷贝或高拷贝数质粒，例如psc101、pacyc184、pbr322或ptrc99a。所述重组菌是将所述dna分子丁或所述dna分子戊导入出发菌得到的。所述出发菌可为埃希氏菌属细菌或棒杆菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌k-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌k12mg1655或大肠杆菌at。所述棒杆菌属细菌具体可为谷氨酸棒杆菌，例如谷氨酸棒杆菌13032等。大肠杆菌at是在大肠杆菌k12mg1655中导入编码3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(arog蛋白或arog*蛋白；arog蛋白为野生型蛋白，arog*蛋白为在arog蛋白基础上进行突变得到的解除反馈抑制的蛋白)的基因和编码转酮酶a(tkta蛋白)的基因得到的重组菌。arog*蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列的氨基酸序列4经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。tkta蛋白为如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c2)将序列的氨基酸序列6经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列6衍生的蛋白质。编码arog*蛋白的基因具体可如序列表的序列3所示。编码arog*蛋白的基因的开放阅读框具体可为序列表的序列3第151-1203位核苷酸。编码tkta蛋白的基因具体可如序列表的序列5所示。编码tkta蛋白的基因的开放阅读框具体可为序列表的序列5第151-2142位核苷酸。本发明还保护所述重组菌在制备色氨酸中的应用。应用所述重组菌生产色氨酸时，采用发酵培养基培养所述重组菌。所述发酵培养基可以是丰富培养基，也可以是无机盐培养基。培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类；也可以是甘油、甘露醇等醇类；也可以使用葡萄糖酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；也可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。其它营养因子还包括生物素、维生素b1、吡哆醛等维生素。所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖。所述发酵培养基具体可为：葡萄糖20.0g/l、硫酸铵15.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、七水硫酸镁2.0g/l、酵母粉2.0g/l、碳酸钙15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量为水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量为水。所述培养的条件具体可为：37℃、220rpm震荡培养36h。所述培养的条件具体可为：将种子液以3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养36h。种子液的制备方法如下：将重组菌接种至含100mg/l氨苄青霉素和34mg/l氯霉素的液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液。所述种子液的od600nm值具体可为5.0。所述培养的过程中进行如下过程控制：培养过程中，用氨水调节反应体系的ph值使其维持在6.8-7.0；培养过程中，每隔3-4h取样一次，检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/l时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/l。本发明还保护一种提高微生物生产色氨酸的能力的方法，包括如下步骤：删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。所述微生物为具有色氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌k-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌k12mg1655或大肠杆菌at。本发明还保护一种解除微生物中色氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。所述微生物为具有色氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌k-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌k12mg1655或大肠杆菌at。以上任一所述色氨酸操纵子包括色氨酸衰减子、编码邻氨基苯甲酸合成酶(trpe蛋白或trpe*蛋白；trpe蛋白为野生型蛋白，trpe*蛋白为在trpe蛋白基础上进行突变得到的解除反馈抑制的蛋白的基因)、编码磷酸核糖基邻氨基苯甲酸焦磷酸化酶(trpd蛋白)的基因、编码邻氨基磷酸核糖苯甲酸异构酶(trpc蛋白)的基因、编码色氨酸合酶β亚基(trpb蛋白)和编码色氨酸合酶α亚基(trpa蛋白)的基因。所述trpe*蛋白为如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d2)将序列的氨基酸序列9经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有邻氨基苯甲酸合成酶功能的由序列9衍生的蛋白质。所述trpd蛋白为如下(e1)或(e2)：(e1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e2)将序列的氨基酸序列10经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸核糖基邻氨基苯甲酸焦磷酸化酶功能的由序列10衍生的蛋白质。所述trpc蛋白为如下(f1)或(f2)：(f1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f2)将序列的氨基酸序列11经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有邻氨基磷酸核糖苯甲酸异构酶功能的由序列11衍生的蛋白质。所述trpb蛋白为如下(g1)或(g2)：(g1)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(g2)将序列的氨基酸序列12经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有色氨酸合酶β亚基功能的由序列12衍生的蛋白质。所述trpa蛋白为如下(h1)或(h2)：(h1)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(h2)将序列的氨基酸序列13经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有色氨酸合酶α亚基功能的由序列13衍生的蛋白质。编码trpe*蛋白的基因具体可如序列表的序列2第157-1719位核苷酸所示。编码trpd蛋白的基因具体可如序列表的序列2第1719-3314位核苷酸所示。编码trpc蛋白的基因具体可如序列表的序列2第3315-4676位核苷酸所示。编码trpb蛋白的基因具体可如序列表的序列2第4688-5881位核苷酸所示。编码trpa蛋白的基因具体可如序列表的序列2第5881-6687位核苷酸所示。所述色氨酸衰减子具体如序列表的序列2第21至135位核苷酸所示。所述色氨酸衰减子相关序列具体如序列表的序列2第21至186位核苷酸所示。所述色氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第21至6687位核苷酸所示。所述色氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第21至6865位核苷酸所示。以上任一所述色氨酸具体可为l-色氨酸。本发明公开了一种色氨酸衰减子的改造方法及其在色氨酸发酵生产中的应用。本发明通过逐步截短色氨酸衰减子功能序列，获得了显著提高基因翻译水平的色衰减子突变体。本发明通过删除衰减子中编码前导肽的基因trpl和终止子茎环结构中前段反向互补回文序列，可以显著提高后续基因的表达水平。显而易见，根据本专利的试验结果，本领域技术人员可轻易推论得到，在本发明保护的色氨酸衰减子突变体上同时保留上述衰减子终止子茎环结构中前段反向互补回文序列的部分序列，但尚未形成稳定的茎环结构，同样可能得到相似性能的色氨酸衰减子突变体和色氨酸操纵子基因突变体。因此，这种类似的改造色氨酸衰减子的方法也在本专利的保护范围之中。本发明还保护含有具有所述色氨酸衰减子突变体的色氨酸操纵子基因的重组菌以及所述重组菌在生产色氨酸中的应用。应用本发明提供的色氨酸衰减子改造方法，显著提高了工程菌的色氨酸发酵性能。本发明在实践上可用于细菌发酵生产色氨酸。本发明通过从5’端逐步截短色氨酸衰减子的序列，意外的获得了可以显著提高基因表达水平的色氨酸衰减子突变体。相应的，本发明获得了色氨酸操纵子基因突变体，过表达该色氨酸操纵子基因突变体的工程菌可以显著提高色氨酸及其衍生物产量。显而易见，本发明还可用于色氨酸代谢途径下游化合物的生物合成。如羟基色胺、烟酸、辅酶、吲哚乙酸、色素和生物碱等。显而易见，本发明解除大肠杆菌的色氨酸衰减子的方法，同样可应用于其它菌属的色氨酸衰减子。采用本发明提供的方案，可以显著提高色氨酸及其衍生物产量，对于色氨酸及其衍生物的生产领域具有极其重大的应用推广价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。atcc：https://www.atcc.org/。大肠杆菌k12mg1655：atcc编号为700926。pacyc184质粒：neb公司，产品目录号e4152s。pgfpuv载体：clontechlaboratories,inc.，catalogno.632312。大肠杆菌ec135：记载于如下文献：zhangetal,plosgenetics，2012,8(9):e1002987。质粒pbr322：takara公司，产品目录号：d3050。实施例1、衰减子突变体调控gfp基因的表达一、构建重组质粒pacyc184-pthr-trc1、合成序列表的序列1所示的双链dna分子(启动子pthr-trc)。2、以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy1947和wy1948组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。wy1947：ctagtctagagcttttcattctgactgcaac；wy1948：cccaagcttacattatacgagccggatgattaattgtcaactgtctgtgcgctatgcct。3、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收酶切产物。4、取pacyc184质粒，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc。二、构建各个重组质粒以及相应的重组菌1、构建重组菌gfp3223(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3223和wy3253组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3223和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3223：cccaagcttacgtaaaaagggtatcgaca；wy3253：agttcttctcctttactcatagaaccagaaccagaacccagttcgagagtcggtttttg；wy3105：ggttctggttctggttctatgagtaaaggagaagaacttttca；wy1859：acatgcatgccaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttatttgtagagctcatccatgcca。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3223。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3223进行结构描述如下：在质粒pacyc184的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第1至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3223的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3223。2、构建重组菌gfp3224(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3224和wy3253组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3224和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3224：cccaagcttctaatgagcgggcttttttttgaaca。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3224。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3224进行结构描述如下：在质粒pacyc184的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第115至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3224的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3224。3、构建重组菌gfp3225(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3225和wy3253组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3225和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3225：cccaagcttgcgggcttttttttgaacaa。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3225。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3225进行结构描述如下：在质粒pacyc184的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第122至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3225的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3225。4、构建重组菌gfp3226(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3226和wy3253组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3226和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3226：cccaagcttaacaaaattagagaataacaatgcaaac。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3226。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3226进行结构描述如下：在质粒pacyc184的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第137至186位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-trple-gfp3226的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3226。5、构建gfp对照将重组质粒pacyc184-pthr-trc导入大肠杆菌ec135，得到的重组菌命名为gfp对照。三、gfp荧光强度分析试验菌株为：重组菌gfp3223、重组菌gfp3224、重组菌gfp3225或重组菌gfp3226。设置gfp对照作为对照菌株。1、将试验菌株或对照菌株接种至含34mg/l氯霉素的液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。2、取步骤1得到的菌液，按照1％接种量接种于含34mg/l氯霉素的液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养12小时。3、取150μl步骤2得到的菌液，加入黑边透底的96孔板中，使用高通量多功能酶标仪(infinite200pro型，瑞士tecan)同时检测细胞密度和gfp荧光信号。检测细胞密度的相关参数设置见表1。检测gfp荧光信号的相关参数设置见表2。表1吸光度(absorbance)波长(wavelength)600nm带宽(bandwidth)9nm闪光次数(numberofflashes)25建立时间(settletime)0ms表2荧光顶读(fluorescencetopreading)激发波长(excitationwavelength)400nm发射波长(emissionwavelength)510nm激发带宽(excitationbandwidth)9nm发射带宽(emissionbandwidth)20nm收集(gain)100(手动，manual)闪光次数(numberofflashes)15积分时间(integrationtime)20μs滞后时间(lagtime)0μs建立时间(settletime)0msz位置(z-position)20000μm(手动，manual)各个试验菌株的荧光强度值＝实测荧光值÷细胞密度-对照菌株的实测荧光值÷对照菌株的细胞密度。设置三次重复试验，相应的平均值和标准差结果见表3。与重组菌gfp3223(完全保留色氨酸衰减子)相比，重组菌gfp3224的荧光强度提高了10.7倍。与重组菌gfp3226(完全去除色氨酸衰减子)相比，重组菌gfp3224的荧光强度提高了10.6倍。与重组菌gfp3223相比，重组菌gfp3225的荧光强度提高了3.6倍。与重组菌gfp3226相比，重组菌gfp3225的荧光强度提高了3.6倍。结果表明，位于启动子和目的基因之间的色氨酸衰减子截短体可以作为调控元件，促进目的基因的表达。色氨酸衰减子突变体如序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示，n1为115以上122以下的自然数(n1优选为115)，n2为135以上186以下的自然数(n2具体可为135以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为135、156或186)。色氨酸衰减子突变体包括色氨酸衰减子截短体和色氨酸衰减子变体(全称为在色氨酸衰减子截短体下游连接其他核苷酸的变体)。色氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-135位核苷酸所示。色氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为136以上186以下的自然数(n4具体可为136以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为156或186)。表3荧光强度重组菌gfp32232841.4±15.2重组菌gfp322433141.9±283.2重组菌gfp322513084.2±188.3重组菌gfp32262865.1±76.5实施例2、制备色氨酸一、构建重组质粒pbr322-arog*1、以大肠杆菌k12mg1655的基因组为模板，采用wy4001和wy4002组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。2、以大肠杆菌k12mg1655的基因组为模板，采用wy4003和wy4004组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。3、将步骤1得到的pcr扩增产物和步骤2得到的pcr扩增产物混合后作为模板，采用wy4001和wy4004组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。经测序，步骤3得到的pcr扩增产物的nhei和bamhi酶切识别位点之间的核苷酸如序列表的序列3所示。序列表的序列3中，开放阅读框为第151-1203位核苷酸，编码序列表的序列4所示的arog*蛋白。与arog蛋白(野生蛋白)相比，arog*蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即将arog蛋白第150位氨基酸残基由脯氨酸突变为了亮氨酸。wy4001：ctagctagcatctcgtttttcgcgacaatct；wy4002：caggtcagcgagatattgtagggtgatcatatcgagaaac；wy4003：gtttctcgatatgatcaccctacaatatctcgctgacctg；wy4004：cgcggatccagcgaaagcagcggcggtt。4、取质粒pbr322，用限制性内切酶nhei和bamhi双酶切，回收载体骨架(约4.3kb)。5、取步骤3得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶nhei和bamhi双酶切，回收酶切产物。6、将步骤4的载体骨架和步骤5的酶切产物连接，得到重组质粒pbr322-arog*。二、构建重组质粒pbr322-arog*-tkta1、以大肠杆菌k12mg1655的基因组为模板，采用wy4005和wy4006组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。经测序，pcr扩增产物的bamhi和eco52i酶切识别位点之间的核苷酸如序列表的序列5所示。序列表的序列5中，开放阅读框为第151-2142位核苷酸，编码序列表的序列6所示的tkta蛋白。wy4005：cgcggatccatccagagatttctgaagcg；wy4006：aatcggccgttaatttcttatataacattgagttatagatataacaac。2、取重组质粒pbr322-arog*，用限制性内切酶bamhi和eco52i双酶切，回收载体骨架(约5.2kb)。3、取步骤1得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶bamhi和eco52i双酶切，回收酶切产物。4、将步骤2的载体骨架和步骤3的酶切产物连接，得到重组质粒pbr322-arog*-tkta。根据测序结果，对重组质粒pbr322-arog*-tkta进行结构描述如下：在质粒pbr322的nhei和eco52i之间插入了自上游至下游依次由如下元件组成的dna分子：序列表的序列3所示的dma分子、限制性内切酶bamhi的酶切识别序列、序列表的序列5所示的dma分子。三、构建重组质粒pacyc184-pjj1、合成序列表的序列8所示的双链dna分子(启动子pjj)。2、以步骤1制备的双链dna分子为模板，采用wy843和wy842组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。wy843：tgctctagacaattccgacgtctaagaaa；wy842：cccaagcttggtcagtgcgtcctgctgat。3、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收酶切产物。4、取pacyc184质粒，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pjj。四、构建重组质粒pacyc184-pjj-trpl*e*dcba1、以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy4007和wy4010组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy4008和wy4010组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy4009和wy4010组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3；以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy4011和wy4012组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a4。wy4007：cgcggatccacgtaaaaagggtatcgaca；wy4008：cgcggatccctaatgagcgggcttttttttgaaca；wy4009：cgcggatccaacaaaattagagaataacaatgcaaac；wy4010：atcctgcataaaaaacgtgtacgggctgggattactc；wy4011：gagtaatcccagcccgtacacgttttttatgcaggat；wy4012：acatgcatgcgttatgttgcgggattaatttgt。通过引物wy4010和wy4011在trpe基因中引入一个点突变，突变后的基因编码序列表的序列9所示的trpe*蛋白。与trpe蛋白(野生蛋白)相比，trpe*蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即将trpe蛋白第293位氨基酸残基由蛋氨酸突变为了苏氨酸。2、将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a4混合后作为模板，采用wy4007和wy4012组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物b1；将pcr扩增产物a2和pcr扩增产物a4混合后作为模板，采用wy4008和wy4012组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物b2；将pcr扩增产物a3和pcr扩增产物a4混合后作为模板，采用wy4009和wy4012组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物b3。3、取重组质粒pacyc184-pjj，用限制性内切酶bamhi和sphi双酶切，回收载体骨架。4、取步骤2得到的pcr扩增产物b1，用限制性内切酶bamhi和sphi双酶切，回收酶切产物。5、将步骤3的载体骨架和步骤4的酶切产物连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-trpl4007e*dcba。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-trpl4007e*dcba进行结构描述如下：以pacyc184质粒为出发载体，在xbai和hindiii酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的启动子pjj，在bamhi和sphi酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的dna分子。6、取步骤2得到的pcr扩增产物b2，用限制性内切酶bamhi和sphi双酶切，回收酶切产物。7、将步骤3的载体骨架和步骤6的酶切产物连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-trpl4008e*dcba。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-trpl4008e*dcba进行结构描述如下：以pacyc184质粒为出发载体，在xbai和hindiii酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的启动子pjj，在bamhi和sphi酶切位点之间插入了序列表的序列2第115至6865位核苷酸所示的dna分子。8、取步骤2得到的pcr扩增产物b3，用限制性内切酶bamhi和sphi双酶切，回收酶切产物。9、将步骤3的载体骨架和步骤8的酶切产物连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-trpl4009e*dcba。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-trpl4009e*dcba进行结构描述如下：以pacyc184质粒为出发载体，在xbai和hindiii酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的启动子pjj，在bamhi和sphi酶切位点之间插入了序列表的序列2第137至6865位核苷酸所示的dna分子。五、构建重组菌将重组质粒pbr322-arog*-tkta导入大肠杆菌k12mg1655，得到重组菌，将其命名为重组菌at。将重组质粒pacyc184-pjj-trpl4007e*dcba导入重组菌at中，得到重组菌，将其命名为工程菌trp4007。将重组质粒pacyc184-pjj-trpl4008e*dcba导入重组菌at中，得到重组菌，将其命名为工程菌trp4008。将重组质粒pacyc184-pjj-trpl4009e*dcba导入重组菌at中，得到重组菌，将其命名为工程菌trp4009。六、色氨酸工程菌的摇瓶发酵试验试验菌株为：工程菌trp4007、工程菌trp4008或工程菌trp4009。1、取试验菌株，划线接种于含100mg/l氨苄青霉素和34mg/l氯霉素的固体lb培养基平板，37℃静置培养12小时。2、完成步骤2后，挑取平板上的菌苔，接种至含100mg/l氨苄青霉素和34mg/l氯霉素的液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液(od600nm值＝5.0)。3、完成步骤3后，将种子液按照3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养。发酵培养基：葡萄糖20.0g/l、硫酸铵15.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、七水硫酸镁2.0g/l、酵母粉2.0g/l、碳酸钙15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量为水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量为水。培养过程中，用氨水调节反应体系的ph值使其维持在6.8-7.0。培养过程中，每隔3-4h取样一次，使用生物传感分析仪sba-40d检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/l时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/l。培养36h后取样，12000g离心2分钟，取上清液(即为发酵上清)，检测l-色氨酸浓度。结果见表4(三次重复试验的平均值±标准差)。工程菌trp4008生产l-色氨酸的能力最高，发酵上清中的l-色氨酸浓度为1.20±0.15g/l。表4发酵上清中的l-色氨酸含量(g/l)工程菌trp40070.43±0.08工程菌trp40081.20±0.15工程菌trp40090.51±0.10发酵上清中l-色氨酸浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯(fdbn)柱前衍生高效液相法)：取10μl上清液于2ml离心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(体积比)fdbn-乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，然后加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液调整ph)并摇匀，静置15min，然后过滤并收集滤液。滤液用于上样，进样量为15μl。色谱柱为c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相a为0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液调整ph)，流动相b为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1ml/min。洗脱过程：洗脱起始时刻(0min)流动相a占流动相总流量的体积份数为86％、流动相b占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为4个阶段，每个阶段中流动相a和流动相b占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为88％、流动相b占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为86％、流动相b占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为70％、流动相b占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为30％、流动相b占流动相总流量的体积份数为70％。以市售l-色氨酸为标准品制作标准曲线，计算样品的色氨酸浓度。最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。sequencelisting<110>中国科学院微生物研究所<120>色氨酸衰减子突变体及其应用以及解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法<130>gncyx171072<160>13<170>patentinversion3.5<210>1<211>192<212>dna<213>人工序列<400>1gcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtct60gatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttattgacttaggt120cactaaatactttaaccaatataggcatagcgcacagacagttgacaattaatcatccgg180ctcgtataatgt192<210>2<211>6865<212>dna<213>大肠杆菌<400>2acgtaaaaagggtatcgacaatgaaagcaattttcgtactgaaaggttggtggcgcactt60cctgaaacgggcagtgtattcaccatgcgtaaagcaatcagatacccagcccgcctaatg120agcgggcttttttttgaacaaaattagagaataacaatgcaaacacaaaaaccgactctc180gaactgctaacctgcgaaggcgcttatcgcgacaatcccaccgcgctttttcaccagttg240tgtggggatcgtccggcaacgctgctgctggaatccgcagatatcgacagcaaagatgat300ttaaaaagcctgctgctggtagacagtgcgctgcgcattacagctttaggtgacactgtc360acaatccaggcactttccggcaacggcgaagccctcctggcactactggataacgccctg420cctgcgggtgtggaaagtgaacaatcaccaaactgccgtgtgctgcgcttcccccctgtc480agtccactgctggatgaagacgcccgcttatgctccctttcggtttttgacgctttccgt540ttattgcagaatctgttgaatgtaccgaaggaagaacgagaagccatgttcttcggcggc600ctgttctcttatgaccttgtggcgggatttgaagatttaccgcaactgtcagcggaaaat660aactgccctgatttctgtttttatctcgctgaaacgctgatggtgattgaccatcagaaa720aaaagcacccgtattcaggccagcctgtttgctccgaatgaagaagaaaaacaacgtctc780actgctcgcctgaacgaactacgtcagcaactgaccgaagccgcgccgccgctgccagtg840gtttccgtgccgcatatgcgttgtgaatgtaatcagagcgatgaagagttcggtggcgta900gtgcgtttgttgcaaaaagcgattcgcgctggagaaattttccaggtggtgccatctcgc960cgtttctctctgccctgcccgtcaccgctggcggcctattacgtgctgaaaaagagtaat1020cccagcccgtacacgttttttatgcaggataatgatttcaccctatttggcgcgtcgccg1080gaaagctcgctcaagtatgatgccaccagccgccagattgagatctacccgattgccgga1140acacgcccacgcggtcgtcgcgccgatggttcactggacagagatctcgacagccgtatt1200gaactggaaatgcgtaccgatcataaagagctgtctgaacatctgatgctggttgatctc1260gcccgtaatgatctggcacgcatttgcacccccggcagccgctacgtcgccgatctcacc1320aaagttgaccgttattcctatgtgatgcacctcgtctctcgcgtagtcggcgaactgcgt1380cacgatcttgacgccctgcacgcttatcgcgcctgtatgaatatggggacgttaagcggt1440gcgccgaaagtacgcgctatgcagttaattgccgaggcggaaggtcgtcgccgcggcagc1500tacggcggcgcggtaggttatttcaccgcgcatggcgatctcgacacctgcattgtgatc1560cgctcggcgctggtggaaaacggtatcgccaccgtgcaagcgggtgctggtgtagtcctt1620gattctgttccgcagtcggaagccgacgaaacccgtaacaaagcccgcgctgtactgcgc1680gctattgccaccgcgcatcatgcacaggagactttctgatggctgacattctgctgctcg1740ataatatcgactcttttacgtacaacctggcagatcagttgcgcagcaatgggcataacg1800tggtgatttaccgcaaccatattccggcgcaaaccttaattgaacgcctggcgaccatga1860gcaatccggtgctgatgctttctcctggccccggtgtgccgagcgaagccggttgtatgc1920cggaactcctcacccgcttgcgtggcaagctgcccattattggcatttgcctcggacatc1980aggcgattgtcgaagcttacgggggctatgtcggtcaggcgggcgaaattctccacggta2040aagc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