本发明涉及一类新型紫杉醇侧链3′-N衍生的新型紫杉烷抗肿瘤化合物及其合成方法和抗肿瘤活性应用，属于医药卫生领域。
技术背景
癌症已成为继心脑血管疾病之后人类的第二大致死疾病，同时，随着环境的恶化以及人口老龄化，这一问题会更加突出。2013年发布的中国肿瘤登记年报称，全国范围内癌症发病形势十分严峻，发病率与死亡率均呈持续上升趋势。预计到2020年，中国每年癌症患病总数将达到660万，死亡总数将达300万左右。因此，在全球范围内抗肿瘤药物具有很大的市场需求。据IMS数据统计，自2007年超越降血脂药物后，抗肿瘤药物一直是全球医药市场的领头羊。
事实证明，天然产物是最具潜力的抗肿瘤药物源泉。在过去的二十多年间，有63%的抗肿瘤药物直接或间接的来源于天然产物。作为天然产物家族中的重要一员，紫杉醇及其半合成产物多烯紫杉醇和卡巴他赛无疑是最成功也是最具代表性的抗肿瘤药物。
1966年，紫杉醇首次被Wall和Wani从太平洋红豆杉树皮中提取得到，并将其命名为Taxol。因其良好的抗肿瘤活性和独特的作用机理，紫杉醇在1992年被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌，两年后又被批准用于治疗转移性乳腺癌。直到目前，紫杉醇和多烯紫杉醇已被证实是最为有效的抗肿瘤药物，在临床上被广泛用于卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、与AIDS相关的卡波剂氏肉瘤、膀胱癌、前列腺癌、食道癌、脑瘤、喉癌、宫颈癌以及子宫内膜癌等多种类型癌症的治疗。随着研究的深入，其临床适应症必将会进一步扩大。
2010年6月，美国FDA批准的紫杉烷卡巴他赛是目前唯一治疗前列腺癌的临床用药。从化学结构上分析，卡巴他赛与多烯紫杉醇的唯一差异是，后者巴卡亭环上的C7和C10连接自由羟基，而卡巴他赛则是甲氧基。结构上的唯小差异却导致了临床上的不同用途。
尽管紫杉醇和多烯紫杉醇是非常重要的抗肿瘤药物，但是，由于水溶性差及其在化疗过程中肿瘤细胞自身发展的多药耐药问题（MDR）而限制了他们在临床上的广泛运用。为了解决肿瘤细胞耐药的问题，扩大紫杉醇和多烯紫杉醇在临床上的应用。同时，为了获得具有选择性的高活性紫杉醇衍生物，就需要对其结构进行改造。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种原料易得，合成简便，具有抗肿瘤活性的一类紫杉烷衍生物及其制备方法。
本发明的实现过程如下：
结构通式（I）所示化合物，
R为H或乙酰基；
R′选自H、-CH3、-NO2、-CN、CH3O-、卤素基。
上述化合物优选为：
。
上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以天然产物10-去乙酰基巴卡亭（10-DAB）为原料，用三氯乙氧基甲酰氯（TrocCl）同时保护7-OH和10-OH，或者先使10-OH乙酰化，接着用TrocCl保护7-OH；
（2）用三氯乙醛保护侧链2′-OH和3′-NH2，或者用对甲氧基苯甲醛保护2′-OH和3′-NHBoc；
（3）在DCC和DMAP存在下，步骤（1）和（2）的产物进行偶联反应；
（4）在锌粉存在下同时脱去侧链和巴卡亭环上的保护基；
（5）在碱性介质中和DMAP存在下，取代苯基异噁唑羧酸酰氯与步骤（4）的产物反应得到结构通式（I）所示的化合物。
具体地说，7,10-diTroc巴卡亭和10-Ac-7-Troc巴卡亭的合成路线如（式1）和（式2）所示。
紫杉醇侧链3′-N衍生的新型紫杉烷的合成路线如方法1所示。首先以苯基异丝氨酸甲酯4为原料与保护基三氯乙醛反应得到苯基噁唑啉羧酸甲酯5，后者水解后与7,10-diTroc巴卡亭1或7-Troc-10-Ac巴卡亭3偶联生成7，在锌粉存在下还原同时除去侧链和巴卡亭环上的脱保护基，再在碱性介质中和催化剂的存在下与苯基（或取代苯基）异噁唑甲酰氯反应最终得到紫杉醇侧链3′-衍生的新型紫杉烷[1]。
方法1：
本发明使用的苯基（或取代苯基）异噁唑甲酰氯的结构如下式所示。
注：在方法1中紫杉醇侧链3′-N衍生的紫杉烷的合成，从6→7若用7-Troc-10-Ac-巴卡亭3代替7,10-diToc-巴卡亭1时，则最终产物是：
方法1的优点是路线短，易于操作，但在7→8的步骤中转化率低，产品8还需要柱层析纯化。为解决上述问题，发明人发明了第二条合成路线（方法2）。虽然比方法1多一步反应，但反应总产率更高，而且更易操作，也便于放大生产。
方法2：
方法2与方法1的主要区别是保护基不同，前者使用三氯乙醛作保护基，后者是对甲氧基苯甲醛。因此，首先用(Boc)2O选择性保护苯基异丝氨酸的氨基（4→9），然后再用对甲氧基苯甲醛保护-NHBoc和-OH。
本发明在保持紫杉醇整体骨架包括C13侧链的(2′R,3′S)立体构型不变的情况下，通过酯化作用在C-13侧链3′-N位引入生物活性的小分子异噁唑片段得到一系列新的紫杉烷衍生物，并在体外通过MTT方法评估其对不同肿瘤细胞（正常的和耐药株）的抗增殖活性，筛选出具有较高活性的紫杉烷衍生物作为候选药物。
具体实施方式
实施例1 7,10-diTroc巴卡亭1的合成
于63-95℃条件下，将三氯乙氧基羰酰氯（TrocCl）20.5 mmol缓慢滴加到用吡啶溶解的10-DAB（10 mmol）1中，磁力搅拌，TLC监测反应完全后将反应液冷却至室温并减压除去吡啶，剩余物用AcOEt/H2O溶解稀释后用HCl调溶液pH为中性。溶液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并依次用H2O、饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，经减压除去溶剂得粗品，经柱层析得到7,10-diTroc-巴卡亭2，产率：87.4%，m.p. 233.1-234.2℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.73 – 5.55 (m, 2H), 5.05 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.82 (dd, J = 9.6, 2H), 4.63 (dd, J = 9.6, 2H), 4.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.54 – 3.46 (m, 1H), 2.72 – 2.59 (m, 1H), 2.31 (s, 5H), 2.14 (s, 3H), 2.09 – 2.01 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.71 (s, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.10 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.77, 166.96, 153.24, 153.18,146.52, 133.77, 130.09, 129.22, 128.68, 94.57, 94.40, 83.82, 80.46, 78.68, 77.15, 77.08, 76.60, 76.36, 74.28, 67.83, 60.57, 56.19, 42.75, 38.46, 33.25, 26.68, 22.56, 21.12, 20.18, 15.31, 14.27, 10.64. HRMS(FAB): calcd for C35H38Cl6O14 (M+NH4+): 912.0707, found: 912.0709。
实施例2 10-Ac-巴卡亭2的合成
将醋酸酐0.2 mol加入用无水THF 80 mL溶解的10-DAB 10 mmol和ZnCl2 20 mmol溶液中，室温条件下反应，TLC监测反应完全后向其中加入AcOEt/H2O并用糊状NaHCO3调溶液pH为碱性。静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并依次用H2O、饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，经减压除去溶剂得粗品，重结晶后得到10-Ac-巴卡亭13纯品，系白色固体，产率：93%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 5.64 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.90 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 10.5, 6.8 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.89 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 2.66 – 2.46 (m, 2H), 2.34 – 2.28 (m, J = 7.1 Hz, 5H), 2.26 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.95 – 1.82 (m, 2H), 1.73 (s, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.12 (s, 6H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 204.19, 171.37, 170.67, 167.06, 146.45, 133.70, 131.79, 130.10, 129.32, 128.65, 84.46, 80.77, 79.08, 76.44, 76.24, 74.92, 72.30, 67.92, 58.69, 46.14, 42.70, 38.61, 35.60, 26.96, 22.59, 20.92, 15.60, 9.44。
实施例3 7-Troc-10-Ac巴卡亭3的合成
于50-93℃条件下，将三氯乙氧基羰酰氯（TrocCl）9.8 mmol缓慢滴加到用吡啶溶解的10-Ac巴卡亭2（9.3 mmol）中，磁力搅拌，TLC监测反应完全后将反应液冷却至室温并除去吡啶，剩余物用AcOEt/H2O溶解稀释后用HCl调解溶液pH为弱碱性。溶液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并依次用H2O、饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，除去溶剂得粗品，经柱层析得到7-Troc-10-Ac巴卡亭3，产率84.2%。m.p.154.8-158.2℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.73 – 5.55 (m, 2H), 5.05 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 13.9, 5.3 Hz, 1H), 4.66 (dd, J = 12.0, 0.9 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.54 – 3.46 (m, 1H), 2.72 – 2.59 (m, 1H), 2.31 (s, 5H), 2.18 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.09 – 2.01 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.71 (s, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.10 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 201.98, 170.77, 169.20, 166.96, 153.24, 145.07, 133.77, 131.60, 130.09, 129.22, 128.68, 94.57, 83.82, 80.46, 78.68, 76.32, 75.92, 74.28, 67.83, 65.87, 56.19, 47.39, 42.75, 38.46, 33.25, 26.68, 22.56, 20.82, 20.18, 15.27, 10.64. HRMS(FAB): calcd for C34H39Cl3O13 (M+NH4+): 778.1800, found: 778.1804。
实施例4 (2′R,3′S)-N-Boc苯基异丝氨酸甲酯9的合成
将用CH2Cl2溶解的(Boc)2O 50 mmol加入用CH2Cl2/H2O溶解的(2′R,3′S)-苯基异丝氨酸甲酯50 mmol和氢氧化钾3.58 g溶液中，室温下反应进行，TLC监测反应完全后向反应液中加入H2O，静置分层，分出有机相，水相用CH2Cl2萃取，合并有机相并用水洗涤、无水MgSO4干燥。除去溶剂得粗品，重结晶得到(2′R,3′S)-N-Boc-苯基异丝氨酸甲酯 9，产率93.2%。
实施例5 苯基噁唑啉羧酸甲酯10的合成
将46.4 mmol化合物 9、对甲氧基苯甲醛51 mmol和对甲苯磺酸吡啶嗡0.1 g用甲苯溶解、回流，TLC监测反应完全后冷却至室温，除去溶剂得到苯基噁唑啉羧酸甲酯10。
实施例6 苯基噁唑啉羧酸11的合成
将上述产物10用MeOH溶解，加入稀NaOH，室温下搅拌，TLC监测反应完全后除去MeOH，剩余物用AcOEt/H2O溶解稀释，静置分层。向水相中加入AcOEt，并用稀盐酸调节pH为酸性。混合液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并水洗涤、无水MgSO4干燥，除去溶剂，得到苯基噁唑啉羧酸11，两步总产率92%，m.p.132-133℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 – 7.31 (m, 7H), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.64 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172.73, 160.44, 151.71, 128.89, 128.33, 128.17, 126.32, 114.00, 92.44, 82.57, 81.14, 63.68, 55.32, 27.82。
实施例7 苯基噁唑啉羧酸7,10-diTroc-巴卡亭酯12的合成
将5.5 mmol苯基噁唑啉羧酸11、5 mmol 7,10-diTroc-巴卡亭1、10 mmol DCC和0.5 mmol DMAP用适量CH2Cl2溶解，室温条件下反应，TLC监测反应完全。反应结束后滤出不溶物，滤液经减压除去溶剂得到偶联产物12，产率：95.4%。m.p.151.9-154.2℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.65 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 – 7.37 (m, 9H), 6.95 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.64 (s, 1H), 6.38 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 6.29 (s, 1H), 5.71 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.60 (dd, J = 10.7, 7.1 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.04 – 4.90 (m, 3H), 4.81 (s, 2H), 4.77 – 4.61 (m, 3H), 4.31 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.95 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.50 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 2.69 – 2.59 (m, 1H), 2.38 – 2.21 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.11 – 2.04 (m, 1H), 1.98 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.79 (s, 1H), 1.32 (s, 3H), 1.23 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 200.66, 170.22, 166.88, 160.38, 153.22, 152.52, 142.04, 138.21, 133.94, 132.35, 130.07, 129.11, 128.93, 128.73, 128.55, 127.29, 113.93, 94.19, 91.78, 83.68, 80.50, 79.04, 78.91, 76.37, 75.21, 74.20, 71.55, 65.86, 64.12, 56.20, 55.36, 46.88, 43.17, 35.43, 33.24, 26.36, 21.80, 21.01, 15.29, 14.92, 10.74. HRMS(FAB): calcd for C55H54Cl9NO19 (M+NH4+): 1369.0772, found: 1369.0784。
实施例8 苯基异丝氨酸10-去乙酰基巴卡亭酯13的合成
将4.8 mmol偶联产物12、Zn粉143 mmol和AcOH 29 mL用AcOEt 70 mL溶解，室温条件下反应，TLC监测反应终点。滤出Zn粉，滤液用饱和NaHCO3溶液调节为弱碱性。混合液静置分层，分出有机相，向有机相中加入H2O并用烯HCl调混合液为弱酸性。混合液静置分层，分出水相并用乙醚充分洗涤至水相中不含有机杂质为止（TLC监测）。向水相中加入AcOEt并用饱和NaHCO3溶液调节为弱碱性。混合液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，经减压除去溶剂得到偶联化合物13，系白色粉末，产率：93.5%。m.p.（166.2-167.6℃）。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.95 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.73 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 4.3 Hz, 4H), 7.28 – 7.19 (m, 1H), 5.85 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 5.40 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.09 (s, 1H), 5.04 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.97 (s, 1H), 4.89 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.53 (s, 1H), 4.22 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.10 – 3.96 (m, 3H), 3.63 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.33 – 2.20 (m, 1H), 2.11 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.69 – 1.62 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.97 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 214.55, 177.74, 174.90, 170.41, 141.99, 141.07, 138.65, 135.24, 134.72, 133.89, 133.53, 133.09, 132.81, 88.93, 85.48, 82.06, 80.63, 80.37, 79.95, 78.97, 75.98, 75.04, 63.33, 62.18, 51.14, 48.09, 41.66, 40.19, 31.73, 27.64, 26.02, 18.94, 15.01.HRMS(FAB):calcd for C38H45NO12(M+H+)708.3015, found708.3005。
实施例9 紫杉醇侧链C3′-N衍生的紫杉烷[1]-A的合成
将0.1 mmol 3-(2′-氰基苯基)基异噁唑-5-甲酰氯、0.1 mmol偶联化合物13和DMAP 10 mg用适量吡啶溶解并在室温下反应大约1-5 h（TCL监控反应）。反应结束后，反应液用CH2Cl2稀释并依次用稀HCl、H2O和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，减压除去溶剂得到粗品，经柱层析得到C3′-N-芳基异噁唑紫杉醇[1]-A纯品，系白色固体，产率74.2%，产率74.2%。m.p. 202-203.1℃。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.16 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.89 – 7.79 (m, 3H), 7.71 (td, J = 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.67 – 7.59 (m, 2H), 7.57 – 7.51 (m, 4H), 7.45 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.31 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 5.83 (dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 1H), 5.70 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.25 (s, 1H), 4.97 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.29 – 4.22 (m, 2H), 3.93 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 3.50 (s, 2H), 2.64 – 2.53 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.37 – 2.29 (m, 2H), 2.27 – 2.22 (m, 1H), 2.09 (br, s, 1H), 1.91 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.79 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 1.14 (s, 3H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 211.15, 171.94, 170.70, 166.85, 163.68, 161.05, 155.07, 137.91, 137.25, 136.29, 134.32, 133.81, 133.39, 130.91, 130.65, 130.21, 129.55, 129.32, 129.05, 128.72, 128.56, 127.11, 117.45, 110.97, 107.24, 84.26, 81.32, 78.66, 74.82, 74.53, 73.45, 72.30, 71.81, 57.72, 54.84, 50.82, 46.53, 43.05, 36.91, 35.91, 26.58, 22.61, 20.57, 14.47, 9.94. HRMS (FAB): calcd for C49H49N3O14 (M+Na+): 926.3107, found: 926.3103。
实施例10 体外抗肿瘤细胞增值活性评价
发明人在已合成的紫杉醇侧链3′-N衍生的紫杉烷中选择了以下5种结构典型的化合物[1]-A，[1]-B，[1]-C，[1]-D和[1]-E进行体外抗肿瘤细胞增值活性的试验。
采用不同的肿瘤细胞株Hela（宫颈癌细胞）、SK-OV-3（卵巢癌细胞）、A549（肺癌细胞）、A2780（卵巢癌细胞）、MCF-7（乳腺癌细胞）以及多药耐药肿瘤细胞株A2780-MDR和MCF-7-MDR等7种细胞株，以多烯紫杉醇（docetaxel）做为阳性对照，通过MTT方法评价5个新型芳基异噁唑-多烯紫杉醇衍生物对不同肿瘤细胞的抗增殖活性。肿瘤细胞株在受试化合物中培养72h，每个样品浓度设三个重复，以减少误差。所得结果如表1所示。
从表中数据可以看出，这些化合物表现出与多烯紫杉醇相似或较好的选择性抑制肿瘤细胞增殖的能力。从纵向分析，对于Hela细胞，除了[1]-D，其余4个化合物都表现出较好的活性，其中[1]-B和[1]-E的抑制能力比多烯紫杉醇强2倍。对于SK-OV-3细胞，5个化合物都表现出较好的活性，其中[1]-E的抑制能力最强，比多烯紫杉醇强2.5倍。对于A549细胞，5个化合物均表现出与多烯紫杉醇相似的活性。对于A2780细胞，所有5个化合物都表现出优秀的活性，其中[1]-A和[1]-E的抑制能力比多烯紫杉醇强4倍。对于MCF-7细胞，[1]-B表现出较好的活性。
从横向分析，[1]-A表现出优先抑制A2780细胞增殖的能力。[1]-B和[1]-E对所有肿瘤细胞均表现出较好的抑制能力。[1]-C和[1]-D对A2780细胞的抑制能力优于其他几种细胞。重要的是，在C3′-N位引入芳基异噁唑骨架不仅提高了多烯紫杉醇对正常肿瘤细胞的抑制能力，而且对耐药肿瘤细胞也有很好的表现。这些化合物均不同程度抑制了A2780-MDR和MCF-7-MDR肿瘤细胞的增殖。