MERS‑CoV特异性多肽及其应用的利记博彩app

本发明涉及MERS-CoV特异性多肽及其应用，属于免疫检测领域。

背景技术：

2012年6月沙特阿拉伯发现第一例MERS病例，随后，更多的病例在阿拉伯半岛被报道，并传至亚洲，非洲，欧洲和北美洲等地，死亡率高达35.7％，2015年7月，我国也出现了一例输入性感染病例。开发安全有效的疫苗是控制MERS-CoV传播的重要手段之一。T细胞在病毒清除中发挥着非常重要的作用，在MERS-CoV疫苗免疫效果的评估中，T细胞免疫应答的评估尤为重要。MERS-CoV易感小鼠模型的建立为其疫苗的研发提供了很好的动物模型。开发高效、快速、敏感的检测MERS-CoV感染后患者和动物模型T细胞状态的检测手段尤为重要。

MHC-四聚体技术是将MHC单体分子四聚体化，提高其与T细胞上的TCR的亲和力，进而提高检测的灵敏度的技术。该技术可应用于检测抗原特异性T淋巴细胞反应、T细胞的直接分离与克隆、分离特异性TCR、原位染色等，为研究与细胞免疫反应有关的一系列工作提供了高效、快速、敏感的检测手段。然而目前还没有用四聚体技术评价MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型T细胞的报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供MERS-CoV特异性多肽，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供所述特异性多肽的衍生物，是在所述多肽的氨基酸序列上取代、或缺失，或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述多肽相同抗原性的多肽衍生物。

本发明的第三个目的是提供对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞高度特异性和高度灵敏性的多肽-MHC四聚体，所述多肽-MHC四聚体由生物素化的MHC-I与所述特异性多肽结合。

本发明的第四个目的是提供所述多肽-MHC四聚体的制备方法，包括如下步骤：(1)用大肠杆菌表达MHC轻链和MHC重链；(2)稀释复性，制备多肽/MHC复合物；(3)制备生物素化的多肽/MHC复合物；(4)与带标记的链亲和素反应。

在本发明的一种实施方式中，所述MHC重链C端连接生物素。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)是在BirA酶的催化下与D-biotin结合。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)是按照摩尔比5：1的比例与带标记的链亲和素反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：利用大肠杆菌表达MHC轻链及C端连接生物素的MHC重链，利用稀释复性的方法制备多肽/MHC复合物，用superdex200纯化，然后再BirA酶的催化下与D-biotin结合，形成生物素化的多肽/MHC复合物，再与带标记的链亲和素按照摩尔比5：1的比例反应，得到多肽/MHC复合物。

本发明的第五个目的是提供一种多肽疫苗，其活性成分含有所述的多肽和/或多肽衍生物。

本发明的第六个目的是提供MERS-CoV特异性细胞免疫检测试剂盒，所述试剂盒含有所述的多肽和/或多肽衍生物。

本发明还提供所述多肽-MHC四聚体的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：制备疫苗；作为T细胞免疫学评价的有效工具，对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞免疫应答进行评估；对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠相应组织切片的原位染色、特异性T细胞的分离与克隆、结合单细胞测序技术分离特异性TCR、作为T细胞激活试剂。

有益效果：本发明用自主筛选的3条多肽制备的四聚体有高度的特异性和敏感性，可以作为T细胞评价的有效工具。通过流式分析表明，用本发明的方法制备的多肽-MHC四聚体检测用自主筛选的三条MERS-CoV特异性多肽免疫过的小鼠的T细胞，阳性率分别为3.89％、2.12％、2.57％，明显高于阴性对照组0.088％～0.122％。细胞用相应多肽体外刺激后培养9天，免疫组T细胞阳性率分别为69.5％、27.9％、20.1％，明显高于阴性对照组0.238％～6.0％。该技术还可以用于对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠相应组织切片的原位染色、特异性T细胞的分离与克隆、结合单细胞测序技术分离特异性TCR、作为T细胞激活试剂等。

附图说明

图1为:H-2K^d与表位多肽superdex200分子筛柱形图；

图2为:H-2K^d与表位多肽形成的MHC复合物生物素化后superdex200分子筛柱形图；

图3为:生物素化效率检测；M，Marker；A，链亲和素；B，MHC和链亲和素；C，MHC；

图4为:用多肽37-1免疫小鼠后的流式分析结果代表图；

图5为:用多肽142免疫小鼠后的流式分析结果代表图；

图6为：用多肽122免疫小鼠后的流式分析结果代表图；

图7为:用表位多肽免疫小鼠后T细胞并用多肽37-1体外刺激细胞后培养9天流式分析的结果图；

图8为:用表位多肽免疫小鼠后T细胞并用多肽142体外刺激细胞后培养9天流式分析的结果图；

图9为:用表位多肽免疫小鼠后T细胞并用多肽122体外刺激细胞后培养9天流式分析的结果图。

具体实施方式

实施例1 MERS-CoV特异性多肽的筛选

用多肽预测软件对MERS-CoV的S蛋白进行预测，然后合成多肽，用载有MERS-CoV病毒的S蛋白的腺病毒免疫品系为H-2d(BALB/c)的小鼠，免疫完成后收获脾细胞，把合成的多肽编号后按照8×8的矩阵排列，横8组，竖8组，横组和竖组有交叉，有交叉的多肽混合在一起。通过Elispot技术检测混合多肽产生IFN-γ的情况，从产生IFN-γ的横组和竖组交叉的混合多肽中筛选获得3条功能肽(如表1所示)，具有较强的特异性，能够用作T细胞免疫学评价的有效工具，对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞免疫应答进行评估。

表1筛选获得的功能肽及其序列

实施例2多肽-MHC四聚体的制备

(1)多肽/MHC复合物的制备：

1)在H-2K^d(Genbank登陆号XP_017174460.1)基因C端添加能够连接生物素的氨基酸序列GGGLNDIFEAQKIEWHE，构建重组质粒pET28a-H-2K^d-Bio，将B2m基因(Genbank登录号为AAA39668.1)与载体连接，构建重组载体pET28a-B2m，并将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中；

2)将携带质粒的大肠杆菌BL21在37℃条件下培养并加入1mmol/L IPTG诱导蛋白表达，收集菌体，将菌体超声破碎，高速离心后将沉淀溶解在溶解buffer(6mol/L盐酸胍,10％甘油，50mmol/LTris pH8.0，100mmol/LNaCl，10mmol/L EDTA)中；

3)将序列如SEQ ID NO.1所示的多肽(命名为多肽37-1)和重链、轻链用稀释复性的方法在复性Buffer(100mmol/LTris pH 8.0，400mmol/L精氨酸，2mmol/L EDTA)中同时复性，使其形成MHC复合物；采用上述相同方法分别用SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的多肽(命名为多肽142和多肽122)和重链、轻链制备MHC复合物；

4)多肽/MHC复合物纯化：使用超滤杯使复性后样品通过10kDa滤膜浓缩样品，并通过浓缩换液为Exchange Buffer(20mmol/L Tris-HCl，50mmol/LNaCl,pH8.0)；将样品取出后4℃离心12000rpm 10min,将上清转移到超滤管中浓缩到约0.5-1ml，过superdex200分子筛进行多肽/MHC复合物纯化，结果如图1所示。

(2)多肽/MHC分子的生物素化

1)将经过分子筛纯化后的多肽/MHC复合物蛋白样品收集于超滤浓缩管中，浓缩至约300μL，在BirA酶的催化下与D-biotin反应，4℃孵育过夜。

2)将生物素化后的蛋白样品离心后过superdex200分子筛进行生物素化后的复合物纯化，以去除多余的生物素，结果如图2所示。

3)将纯化的多肽/MHC复合物浓缩到约500μL，取样进行Gel shift试验验证生物素化效果。

样品制备：

A.2μL链亲和素Streptavidin+8μL分子筛Buffer。

B.8μL生物素化后多肽/MHC样品+2μL 20mg/mL链亲和素Streptavidin；

C.8μL生物素化后多肽/MHC样品+2μL分子筛buffer；

将上述三支样品置冰上孵育30min-2h后进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。

生物素化后的MHC能够与Streptavidin结合成为大分子，从而使得其在SDS-PAGE中的条带滞后，通过比较(C-B)/C的MHC含量的比值可以判断生物素化的效果，既有多少比例的MHC得到较好的生物素化，图3结果显示，本发明的技术方案生物素化效应约为90％。

(3)生物素化的MHC分子四聚化：

将生物素化后的MHC分子浓缩，按照链亲和素与多肽/MHC复合物的摩尔比1:5将生物素化后的MHC分子四聚化,链亲和素为带荧光标记的链亲和素，置4℃孵育过夜，制备获得37-1-H-2K^d四聚体。

按上述相同步骤制备142-H-2K^d四聚体，122-H-2K^d四聚体。

实施例3多肽/MHC四聚体在T细胞分析中的应用

利用MERS-CoV特异性多肽/MHC四聚体的高亲和力和高特异性的特点对MERS-CoV相关疫苗免疫后小鼠T细胞进行检测，评估疫苗对小鼠细胞免疫的影响、T细胞的分离与克隆、对MERS-CoV感染小鼠相应组织切片进行原位染色等，采用下述步骤评价用载有MERS-CoV的S蛋白的腺病毒载体免疫的BABL/c小鼠T细胞水平：

1)将筛选获得的多肽37-1与不完全弗氏佐剂和GP96佐剂按照20μg多肽，50μL不完全弗氏佐剂，50μL GP96的比例制备成乳化剂，分三次免疫小鼠，每次间隔两周；以未经免疫的小鼠作为阴性对照；

2)获取免疫后的小鼠脾细胞，用FACS buffer/staining buffer(PBS+0.5％BSA)洗2遍；

3)染色。加抗体(如FITC-CD8，APC-CD4，PerCp-CD3，PE-Tetramer)。4℃冰上孵育30min；

4)洗涤。加200μL FACS buffer离心，洗2遍；

按上述相同步骤分别将多肽142，多肽122用于小鼠免疫，再分别用实施例3制备的37-1-H-2K^d四聚体142-H-2K^d四聚体，122-H-2K^d四聚体评价用载有MERS-CoV的S蛋白的腺病毒载体免疫的BABL/c小鼠T细胞水平。

用细胞流式仪进行流式分析，结果如图4-6所示，多肽免疫过的小鼠的T细胞，阳性率分别为3.89％、2.12％、2.57％，明显高于阴性对照组0.096％、0.122％、0.088％。

将细胞用相应多肽体外刺激后培养9天，再按上述步骤流式染色，结果如图7-9所示，免疫组T细胞阳性率分别为69.5％、27.9％、20.1％，明显高于阴性对照组仅为0.238％、1.92％、6.0％。

实施例4多肽、多肽衍生物制备疫苗

将上述制备获得的多肽或多肽衍生物溶于水相或油相佐剂，稀释为合适浓度，过滤除菌。可选择地，进行乳化，制备获得疫苗。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。