一种催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌及其应用的利记博彩app

本发明属于基因工程领域，具体涉及利用合成生物学技术构建一种具有催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程菌及其应用。

技术背景

黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于自然界的多酚类化合物，最早是指以2-苯基色原酮(flavone)为母核而衍生的一类化合物，现在泛指两个苯环(a环和b环)通过中间三碳环(c环)相互连接而成的以c6-c3-c6为基本骨架的一系列化合物。黄酮类化合物是多种药用植物的有效成分，如黄芩素是植物黄芩的主要药用活性成分，在植物体内多以游离态或与糖结合成苷的形式存在，具有多种生理和药理活性，如抗氧化、抗抑郁和抗肿瘤等生理活性；已经被用于临床的如野黄芩苷(商品名：朗瑞西乐)在我国已制成注射剂作为活血化瘀、通脉止痛的药物应用；大豆苷元8-c-葡萄糖苷，即葛根素注射液在我国用于辅助治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、视网膜动、静脉阻塞、突发性耳聋，而且国外也越来越多把葛根素作为食品添加剂使用，用于保健。

但是由于大多数黄酮苷元及部分黄酮苷类化合物在水相中溶解度较低，限制了其制剂的开发。目前对黄酮类化合物进行分子修饰主要是以提高其水溶性为目的，对其水溶性改善所涉及的化学反应主要是糖苷化修饰，而对其糖苷化修饰目前研究最多的是葡萄糖苷化反应。糖苷化修饰可以提高黄酮类化合物水溶性和生物利用度，增加黄酮类化合物的结构和功能的多样性。因此，对黄酮类化合物的葡萄糖苷化修饰是一种极具潜力的结构修饰技术，能促进黄酮类药物的临床应用。

对黄酮类化合物进行糖苷化修饰包括化学修饰法和生物催化法，对黄酮类化合物进行糖苷化修饰生物催化法主要包括微生物法和酶法。

化学修饰法的技术瓶颈在于位置选择性的用苯基、苄基或甲氧基等把某一羟基保护，然后再进行糖苷化反应，再脱去保护基团，最终得到目标产物。例如：对黄酮的酚羟基先用酰基进行保护，再高选择性的脱保护基，然后与活化的糖基供体(如糖基三氯乙酰亚胺酯)进行糖苷化反应，最后再脱去其它保护基团获得黄酮糖苷化产物(lim,hanx,yub.facilesynthesisofflavonoid7-o-glycosides.jorgchem,2003,8:6842-6845)。这种葡萄糖苷化的化学修饰反应步骤复杂，收率低，副产物多，难以进行规模化放大和生产，不具有生产实用价值。

微生物法和酶法进行葡萄糖苷化修饰反应条件温和，无需进行保护和脱保护反应，立体和区域选择性高，可以定向高效地生物催化黄酮苷元或部分水溶性低的黄酮苷发生糖苷化修饰。

微生物细胞的糖苷化修饰：kim等利用康氏木霉(trichodermakoningii)对水飞蓟宾a和水飞蓟宾b进行葡萄苷化修饰，得到水飞蓟素a3-o-β-d-葡萄糖苷(转化率18.0％)和水飞蓟素a7-o-β-d-葡萄糖苷(转化率7.5％)及水飞蓟素b3-o-β-d-葡萄糖苷(转化率15％)和水飞蓟素b-7-o-β-d-葡萄糖苷(转化率4.5％)(kimhj,parkhs,leeis.microbialtransformationofsilybinbytrichodermakoningii.bioorgmedchemlett,2006,16:790-793)。shimoda等利用野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)可以对橙皮素3',5,和7位羟基进行糖苷化修饰反应，转化率分别为12％,10％，15％(shimodak,hamadah.productionofhesperetinglycosidesbyxanthomonascampestrisandcyclodextringlucanotransferaseandtheiranti-allergicactivities.nutrients,2010,2:171-180)。从非专利文献报道来看，以微生物细胞进行的葡萄糖苷化反应，转化率相对较低，糖苷产物较复杂；为提高转化率可增加转化体系的微生物细胞浓度，同时微生物细胞自身也产生代谢产物。因此，微生物法的产物难以分离纯化，但可以进行规模化放大，生产应用需要优化转化产物的纯化工艺。

利用糖基转移酶的酶促催化法修饰：li等将来源于puerarialobata的糖基转移酶plugt1基因通过大肠杆菌的异源表达纯化后，外源性的加入糖供体udp-glucose进行酶促催化反应，证实plugt1位置选择性的催化异黄酮生成异黄酮7-o-葡萄糖苷(lij，liz-b，lic-f，etal.molecularcloningandcharacterizationofanisoflavone7-o-glucosyltransferasefrompuerarialobata.plantcellrep,2014,33:1173–1185)。thuan等在大肠杆菌体内同时引入合成糖供体途径的基因(即：磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)以及拟南芥糖基转移酶，不需要外源性加入糖供体直接把黄酮芹菜素和黄芩素底物加入工程菌液中分别获得芹菜素7-o-葡萄糖苷和黄芩素7-o-葡萄糖苷(thuannh,parkjw,sohngjk.towardtheproductionofflavone-7-o-_-d-glucopyranosidesusingarabidopsisglycosyltransferaseinescherichiacoli.processbiochemistry,2013,48:1744–1748)。酶法催化黄酮类化合物糖苷化的主要特点是异源表达糖基转移酶后，用粗酶或纯化后的酶作为催化剂，外源加入活性糖基供体，底物加入量较少，在离体缓冲盐中反应。目前为止酶法催化主要用于鉴定酶的催化特性以及寻找新的活性酶，而不用来大量半合成黄酮苷类化合物。大肠杆菌全细胞半合成黄酮苷类化合物主要特点是大肠杆菌可以内源性的生成活性糖基供体，可以把底物直接加入菌体发酵液中，反应一定时间后，直接从菌体和发酵液中提取产物黄酮苷类化合物。全细胞合成黄酮苷类化合物省去了酶法表达后需要纯化的步骤，节省时间，而且不需要外源性加入活性糖供体，节省开支。

酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)具有真核生物的特征，遗传背景清楚、稳定，生长迅速，培养简单，从很久以前就用酿酒酵母来生产食物和酒精饮料等，通常认为是非致病菌(generallyregardedassafe，gras)。酿酒酵母表达体系与大肠杆菌表达系统相比，其适度的糖基化修饰以及翻译后修饰更适合高等植物蛋白的表达(limemi,guedone,hehna,etal.productionofphenylpropanoidcompoundsbyrecombinantmicroorganismsexpressingplant-specificbiosynthesisgenes.processbiochem,2008,43:463-479.)。此外，酿酒酵母细胞内存在大量udp-glucose胞质库(okat,jigamiy.reconstructionofdenovopathwayforsynthesisofudp-glucuronicacidandudp-xylosefromintrinsicudp-glucoseinsaccharomycescerevisiae.febsj,2006,273,2645–2657)，可以为黄酮苷类化合物的合成提供较多的糖供体，有利于黄酮苷的合成。基于以上考虑，将糖基转移酶在酿酒酵母细胞中表达，可以为利用重组酿酒酵母细胞进行全细胞催化黄酮苷类化合物生成的工艺奠定基础。但是酿酒酵母细胞中存在多种糖苷水解酶，如exg1、spr1和yir007w等(schmidts,rainieris,wittes,etal.identificationofasaccharomycescerevisiaeglucosidasethathydrolyzesflavodoidglucosides.applenvironmicrobiol,2011,77:1751-1757)，可以把生成的黄酮-o-葡萄糖苷水解，而这个水解过程阻碍了利用酿酒酵母细胞作为工程菌催化合成黄酮葡萄糖苷。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供一种具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化活性的基因工程菌，其制备过程主要包括以下步骤：1.降低或消除宿主细胞内源性的葡萄糖苷水解酶活性；2.通过提高宿主细胞参与活化的糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖(udp-葡萄糖)合成途径中的2个关键酶，即磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达，进而提高udp-葡萄糖胞内水平；3.在宿主细胞中转入udp-葡萄糖转移酶基因并通过强启动子实现其高效表达，即获得具有生物催化黄酮葡萄糖苷化的基因工程菌。

本发明一个目的是解决酿酒酵母细胞存在β-葡萄糖苷水解酶水解黄酮类葡萄糖苷的问题，提供一种降低或消除宿主细胞内β-葡萄糖苷水解酶水解黄酮-β-葡萄糖苷的酿酒酵母工程细胞，因为宿主细胞具有较高的内源性β-葡萄糖苷水解酶活性，不利于生物催化合成的黄酮葡萄糖苷产物的积累和产量提高。

本发明另一个目的是解决黄酮类化合物葡萄糖苷化反应中活化的udp-葡萄糖供体的合成难题。宿主细胞代谢池内活化的糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖浓度很低，不利于提高仅转入尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因的工程菌催化合成黄酮葡萄糖苷的效率。

本发明另一个目的是在于解决天然黄酮类苷元化合物溶解度低的问题，提供一种生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程酿酒酵母细胞。

本发明以天然或化学合成的黄酮苷元为底物，通过糖基化反应提高其水溶性，进而改善其生物利用率，对先导物进行糖基化修饰后，部分药物可以提高药效，降低毒副作用，为黄酮类化合物新药研制提供一个新的途径。

本发明还提供了一个通过从摇瓶发酵到小型发酵罐放大的生物催化合成黄酮葡萄糖苷的方法。

本发明提供了一个获得具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化功能的基因工程酿酒酵母细胞，该细胞既能稳定高效合成活化的葡萄糖基供体尿苷二磷酸(udp)葡萄糖，又能实现胞内共表达的udp-葡萄糖转移酶的级联催化反应，即这种能够实现自供给udp-葡萄糖的活细胞可直接用作生物催化剂催化黄酮类化合物葡萄糖苷化反应。

本发明通过在宿主细胞内高表达磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，提高细胞代谢池内udp-葡萄糖的浓度。通常状态下细胞代谢池内udp-葡萄糖浓度很低，即便细胞内高表达了具有催化黄酮类化合物葡萄糖苷化活性的udp-葡萄糖转移酶，也难以高效地获得黄酮类化合物的糖苷化反应。为提高细胞代谢池udp-葡萄糖的浓度并实现与udp-葡萄糖转移酶的高效耦联，本发明采用整合型表达载体pδgap′g、pδgaph(tangl,wangw,etal.threepathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)和强启动子酿酒酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(gap)或巴斯德毕赤三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gap′的构建融合表达质粒，通过转化实现目的基因整合到宿主基因组，从而实现磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在细胞中高表达，进而提高代谢池内udp-葡萄糖水平；同时再利用整合型表达载体pδgapg(tangl,wangw,etal.threepathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)和强启动子gap实现异源的udp-葡萄糖转移酶的高表达。

本发明获得的酿酒酵母工程菌直接用作生物催化剂，把黄酮苷元直接加入到利用sc培养基培养的活细胞催化体系中进行糖苷化反应，反应结束后利用有机溶剂分离纯化获得糖苷化的黄酮类化合物。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供的一种构建具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化活性的基因工程菌，其制备过程包括：

i)敲除宿主菌内源性的葡萄糖苷水解酶基因；

ii)提高宿主菌中内源性或异源性的磷酸葡萄糖变位酶基因的表达，进而提高催化效率；

iii)提高宿主菌中内源性或异源性的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达，进而提高催化效率；

iv)在宿主菌内转入尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因，并使其高表达。

所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得到所述具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化活性的基因工程菌。

在本发明的实施方案中,采用的宿主菌是酿酒酵母，宿主细胞自身具有很强的内源性糖苷水解酶活性，为消除宿主细胞内源性糖苷水解酶活性，通过同源重组的的方法分别敲除了糖苷水解酶exg1、spr1和yir007w基因。

在本发明的一个优选的实施方案中同时敲除了exg1和spr1两个基因。

本发明的一个实施方案中提供了一个敲除糖苷水解酶exg1基因所使用的具有seqidno.1所示碱基序列的同源双交换整合框。首先利用pcr方法首先从宿主基因组dna获得糖苷水解酶exg1基因的长度分别为450bp和542bp同源dna片段，然后通过限制性内切酶酶切和dna连接的方式在2个同源片段中间插入筛选标记基因trp，即得到如seqidno1所示的含有exg1同源片段和筛选标记表达框trp的质粒ez-exg1-trp，其中第1-450和第1674-2216碱基序列为exg1同源片段，第451-1673碱基序列包括筛选标记trp基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框。通过noti单酶切线性化后，通过liac转化法把同源dna片段整合至酿酒酵母基因组中，实现糖苷水解酶exg1基因的敲除。

本发明的另一个实施方案中提供了一个敲除糖苷水解酶spr1基因所使用的具有seqidno.2所示碱基序列的同源双交换整合框。首先利用pcr方法从宿主基因组dna获得糖苷水解酶spr1基因的长度分别为574bp和454bp同源dna片段，然后通过限制性内切酶酶切和dna连接的方式在2个同源片段中间插入筛选标记基因ade2，即得到如seqidno2所示的含有spr1同源片段和筛选标记表达框ade2的质粒ez-spr1-ade2，其中第1-575和第2839-3292碱基序列为spr1同源片段，第576-2838碱基序列包括ade2基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框。质粒ez-spr1-ade2用saci线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中，实现糖苷水解酶spr1基因的敲除。

本发明的另一个实施方案中提供了一个敲除糖苷水解酶yir007w基因所使用的具有seqidno.3所示碱基序列的同源双交换整合框。首先利用pcr方法从宿主基因组dna获得糖苷水解酶yir007w基因的长度分别为508bp和525bp同源dna片段，然后通过限制性内切酶酶切和dna连接的方式在2个同源片段中间插入筛选标记基因ura3，即得到如seqidno3所示的含有yir007w同源片段和筛选标记表达框ura3的质粒ez-yir-ura3，其中第1-508和第1640-2164碱基序列为yir007w同源片段，第509-1639碱基序列包括ura3基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框。质粒ez-yir-ura3用saci线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中，实现糖苷水解酶yir007w基因的敲除。

本发明的一个实施方案中提供了一个提高宿主细胞内活化的糖基供体udp-葡萄糖合成的技术方法。首先以酿酒酵母基因组dna为模板，利用pcr反应和dna连接的基因克隆方法获得编码磷酸葡萄糖变位酶基因pgm2和尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因ugp1的dna片段，然后分别亚克隆到含有毕赤酵母和酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子(组成型高表达启动子(gap))的整合型表达载体上pδgap′g和pδgaph(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)，即获得了2个整合型的表达载体pδgap′g-pgm2和pδgaph-ugp1，然后利用noti线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组的δ位点中，通过g418和潮霉素即可筛选获得阳性克隆，这样获得工程菌具有较高的合成udp-葡萄糖潜能的基础工程菌株w303-1b/es/pu(e表示敲除exg1基因，s表示敲除spr1基因，p表示整合pgm2基因进入宿主基因组，u表示整合ugp1基因进入宿主基因组)，再与udp-葡萄糖转移酶基因组合表达，实现了野黄芩素葡萄糖苷的高效合成。

本发明的另一个实施方案中也提供了一个提高宿主细胞内活化的糖基供体udp-葡萄糖合成的技术方法。首先以大肠杆菌基因组dna为模板，利用pcr反应和dna连接的基因克隆方法获得的异源磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)和尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因(galu)的dna片段，然后分别亚克隆到含有酿酒酵母和甲醇酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子(组成型高表达启动子(gap))的整合型表达载体pδgaph和pδgap′z，其中质粒载体pδgap′z是用博来霉素(zeocin)抗性标记基因置换pδgap′g中g418筛选标记基因kanmx的衍生载体，即获得了2个整合型的表达载体pδgaph-pgm和pδgap′z-galu，然后利用noti线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组的δ位点中，通过潮霉素和博来霉素即可筛选获得阳性克隆，这样获得工程菌同样具有较高的合成udp-葡萄糖能力的基础工程菌株w303-1b/es/peg(pe表示整合大肠杆菌的pgm基因进入宿主基因组，g表示整合大肠杆菌的galu基因进入宿主基因组)，再与udp-葡萄糖转移酶基因组合表达，实现了野黄芩素葡萄糖苷的高效合成。

本发明的又一个实施方案中提供了一种具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程酿酒酵母细胞。宿主细胞自身不具有催化udp-葡萄糖和黄酮底物合成黄酮葡萄糖苷的活性，本发明选取中国专利申请号201410185256.4中seqidno:29所示碱基序列(编码的氨基酸序列为seqidno:12)并通过pcr和亚克隆的方式构建能在酵母细胞中表达的整合表达载体pδgapg-sbgt34，最后再用noti线性化质粒pδgapg-sbgt34转化工程化的基础菌株w303-1b/es/pu，即获得菌种编号为cgmccno.11381的工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34。

本发明的另一个实施方案中也提供了另一种具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程酿酒酵母细胞。宿主细胞自身不具有催化udp-葡萄糖和黄酮底物合成黄酮葡萄糖苷的活性，本发明选取中国专利申请号201410185256.4中seqidno:29所示碱基序列(编码的氨基酸序列为seqidno:12)并通过pcr和亚克隆的方式构建能在酵母细胞中表达的整合表达载体pδgapg-sbgt34，最后再用noti线性化质粒pδgapg-sbgt34转化工程化的基础菌株w303-1b/es/peg(pe表示整合大肠杆菌的pgm基因进入宿主基因组，g表示整合大肠杆菌的galu基因进入宿主基因组)，即获得菌种编号为cgmccno.12057的工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34。

本发明的一个实施方案中提供了工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34在反应瓶中用sc合成培养基进行细胞培养，而后在加入不同的黄酮类苷元(如木犀草素、柚皮素、木蝴蝶素a、白杨素、汉黄芩素、槲皮素、黄芩素以及大豆黄酮)，生物催化合成相应的产物黄酮葡萄糖苷。

本发明的又一个实施方案中提供了工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34生物催化野黄芩素葡萄糖苷化反应的优选实验方案，即在碳源葡萄糖的浓度为10％和ph值5.5时生物催化效率较高。

本发明的又一个实施方案中还提供了工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34在10-l发酵罐内生物催化野黄芩素葡萄苷合成的放大培养实验方案，通过控制ph值和葡萄糖的浓度使得野黄芩素葡萄苷的产量能从摇瓶转化产量的215mg/l提高到了1200mg/l。

在本发明的实施方案中，获得2株具有生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的基因工程酿酒酵母细胞，生物材料样品保藏信息：

分类命名：酿酒酵母；拉丁学名：saccharomycescerevisiae；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所；保藏编号为：cgmccno.11381、cgmccno.12057，其保藏日期分别为：2015年09月15日和2016年1月19日。

附图说明

图1.宿主菌酿酒酵母基因操作示意图。glucose，葡萄糖；glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸；glucose-1-phosphate，葡萄糖-1-磷酸；udp-glucose，udp-葡萄糖；flavonoid，黄酮；flavonoid-o-glucoside，黄酮-o-葡萄糖苷；hk，己糖激酶；pgm，磷酸葡萄糖变位酶；ugpase，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；gts，udp-葡萄糖转移酶；glycosidase，葡萄糖苷水解酶。

图2.酿酒酵母胞内葡萄糖苷酶的活性鉴定。a.木犀草素标准品hplc色谱图；b.木犀草苷标准品hplc色谱图；c.酿酒酵母全细胞催化木犀草苷反应后hplc色谱图。

图3.敲除酿酒酵母葡萄糖苷酶同源重组质粒的构建以及同源替换基因组的示意图。a.敲除exg1基因的示意图(含有启动子/终止子序列)；b.敲除spr1基因的示意图；c.敲除yir007w基因的示意图。

图4.同源重组敲除酿酒酵母糖苷水解酶基因工程酵母的pcr鉴定。ck^-，没有敲除葡萄糖苷水解酶基因的酿酒酵母基因组pcr扩增结果；ck+，构建测序正确的没有转入酿酒酵母基因组的阳性质粒pcr扩增结果。a、b、c分别是敲除exg1、spr1和yir007w基因后阳性克隆的pcr扩增结果。

图5.敲除葡萄糖苷酶基因后宿主酵母细胞对木犀草苷水解活性的鉴定。w303-1b、w303-1b/exg1、w303-1b/spr1和w303-1b/yir007w分别代表宿主菌、敲除exg1基因、敲除spr1基因和敲除yir007w基因的工程菌。a.葡萄糖苷酶基因敲除后工程菌对木犀草苷水解活性的分析结果。b.葡萄糖苷酶基因敲除工程菌的细胞生长结果。

图6.敲除葡萄糖苷酶后并整合了糖基转移酶sbgt34的工程菌对野黄芩素转化率的影响。w303-1b/sbgt34是宿主菌直接整合糖基转移酶基因sbgt34后对野黄芩素催化动力学的曲线。w303-1b/es/sbgt34是敲除exg1和spr1基因同时整合了糖基转移酶基因sbgt34后对野黄芩素催化动力学的曲线。w303-1b/es/peg/sbugt34是在w303-1b/es/sbgt34基础上高表达大肠杆菌糖代谢过程基因pgm和galu后对野黄芩素催化动力学的曲线。w303-1b/es/pu/sbugt34是在w303-1b/es/sbgt34基础上高表达酿酒酵母糖代谢过程基因pgm2和ugp1对野黄芩素催化动力学的曲线。

图7.不同浓度野黄芩素底物的转化率及对细胞生长的影响。野黄芩素底物浓度分别为0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm，工程菌是w303-1b/es/pu/sbgt34，即敲除糖苷酶exg1和spr1基因并同时过表达磷酸葡萄糖变位酶(pgm2)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ugp1)和糖基转移酶sbgt34。a.不同浓度野黄芩素底物的转化率。b.没有加入底物的工程菌以及加入不同浓度底物的工程细胞生长曲线。

图8.不同浓度葡萄糖和ph条件对工程菌催化野黄芩素糖苷化的影响。工程菌是w303-1b/es/pu/sbgt34，底物野黄芩素浓度是0.6mm，图a是葡萄糖浓度分别为2％、5％、10％和15％时工程细胞对野黄芩素的转化率；图b是不同ph条件对工程细胞催化野黄芩素糖苷化的影响：反应液中加入50mm磷酸盐缓冲液，其中ph条件分别为4.5、5.0、5.5、6.0、ck(没有加入磷酸缓冲盐调节ph)。

图9.工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34在10-l发酵罐中放大培养对野黄芩素的生物催化活性。产物是野黄芩素7-o-葡萄糖苷，红色曲线代表目的产物随时间的延伸累积量的变化曲线；绿色曲线代表细胞生长曲线，即在od600nm下测定的菌体生长情况。

图10.工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34催化不同黄酮底物的hplc色谱图。底物分别为木犀草素、柚皮素、白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素a、野黄芩素、黄芩素、槲皮素以及大豆黄酮，箭头所示是催化产生的黄酮-o-葡萄糖苷化产物。

图11.工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34催化不同黄酮底物的相对活性。

具体实施方式

本发明公开了构建一个具有高效催化合成葡萄糖苷化的工程菌及其在黄酮糖苷化合物合成中的应用。其中所述的糖苷水解酶、磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、尿苷二磷酸葡萄糖转移酶等基因以及黄酮类化合物葡萄糖苷化反应及其产物分析，简介如下：

1.本发明中编码糖苷水解酶exg1、spr1和yir007w的多核苷酸

在实施例中工程化的酿酒酵母基因组中有3个糖苷水解酶exg1、spr1和yir007w基因，其相应的同源dna片段是直接从宿主细胞酿酒酵母w303-1b基因组中利用nested-pcr方法扩增获得的，然后与筛选标记基因trp、ade2、ura3分别构建同源整合载体ez-exg1-trp、ez-spr1-ade2和ez-yir-ura3，进而通过同源替换的方式整合到酿酒酵母基因组中，使得酿酒酵母中的葡萄糖苷酶基因失活或降低，不能发挥其糖苷水解活性。

2.本发明中编码酵母磷酸葡萄糖变位酶pgm2和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶ugp1的多核苷酸

在实施例中工程化的酿酒酵母细胞内高表达同源的pgm2、ugp1基因，其相应的多核苷酸是直接从宿主细胞酿酒酵母w303-1b基因组中利用常规pcr方法扩增获得的，然后与毕赤酵母gap启动子或酿酒酵母gap启动子和pgk终止子构建成融合基因，再通过同源替换的方式到整合到酿酒酵母基因组中，目的是促进细胞代谢通路向着udp-葡萄糖合成方向进行，进而提高细胞代谢池内udp-葡萄糖的水平；对这2个功能酶基因而言，它们不仅限于细胞自身的功能基因，本发明的保护范围只受权利要求书的限制。将实施例中所使用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其它组成型表达的启动子(如adh1启动子、tpi启动子等)或诱导型启动子(如gal1启动子)和表达载体，或这2个功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替换，这是本领域工作人员所能够理解并实现的。

3.本发明中编码大肠杆菌磷酸葡萄糖变位酶pgm和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶galu的多核苷酸

在实施例中工程化的酿酒酵母细胞内高表达异源的pgm、galu基因，其相应的多核苷酸是直接从大肠杆菌基因组中利用常规pcr方法扩增获得的，然后与酿酒酵母gap启动子或毕赤酵母gap启动子和pgk终止子构建成融合基因，再通过同源替换的方式到整合到酿酒酵母基因组中，参与udp-葡萄糖合成的来自其它异源生物的磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶通过高表达同样可以用于促进udp-葡萄糖的合成，进而提高细胞代谢池内udp-葡萄糖的水平；说明这2个功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替换，这是本领域工作人员所能够理解并实现的。

4.本发明中编码尿苷二磷酸葡萄糖转移酶ugt的多核苷酸

本发明中将来源于植物黄芩的糖基转移酶基因sbgt34亚克隆到表达载体得到质粒ptwinb-ugt34^#(中国专利申请号201410185256.4中seqidno:29)。以连接到ptwinb-ugt34^#质粒为模板，用pcr扩增获得糖基转移酶基因，再经过ndei和xbai双酶切连接到pδgapg载体上获得酿酒酵母整合型质粒。为提高其在酿酒酵母细胞内的活性，将该基因亚克隆到已高表达磷酸葡萄糖变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的工程菌中w303-1b/es/pu和w303-1b/es/peg，使其3个基因共表达，形成一个生物催化黄酮葡萄糖苷化的代谢途径，即获得具有高效催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的工程化酿酒酵母细胞。

5.黄酮类化合物葡萄糖苷化反应及其产物分析

本发明中所用载体都是整合型表达载体，整合入基因组中的外源基因随着细胞的生长而表达。在ypd液体培养基中生长的工程化细胞生长到od600nm约为3.0左右，转接入sc液体培养基中(1/100体积比)，生长约10h，通过利用新鲜的sc液体培养基调节细胞生物量至od600nm为1.0，将调节后的菌液分装于反应瓶中，往菌液中加入10μl溶于dmso的黄酮类化合物，使其终浓度为0.6mm，于30℃反应，取样1ml，冷冻干燥，冷干样品加入500ul热甲醇超声萃取3次，合并萃取液后挥干所有甲醇，再用1ml甲醇溶解提取物，上清液经0.22μm滤膜过滤后高效液相色谱分析催化产物。

通过以下的实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于实施例。

需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。

实施例1：酿酒酵母工程菌的制备

步骤一：酿酒酵母基因组dna提取：采用北京康为世纪生物科技有限公司的酵母基因组dna提取试剂盒提取基因组dna，具体操作步骤如下：

(1)挑单克隆接菌于10ml液体ypd(10g/lyeastextract,20g/ltryptone，20g/lglucose)培养基中，30℃，250rpm培养15-20h(对数期)。

(2)12000rpm，1min多次离心收集菌体于1.5mlep管中(4-5次)，离心弃上清。

(3)酵母细胞壁的去除：向菌体中加入600μllyticaseworkingbuffer(使用前加入β-巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，并加入5μllyticase(10u/μl)，充分混匀，30℃处理30min，4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。

(4)向沉淀中加入200μlbuffergtl，加入40mg玻璃珠(glassbeads)，涡旋5min，12000rpm离心5min，将上清移到一个新的离心管中。

(5)加入20μlproteinasek，混匀，55℃振荡水浴1h，温育期间每20-30min颠倒混匀一次，然后加入10μl浓度为20mg/ml的rnasea溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。

(6)13000rpm离心5min，小心吸取上清至新离心管中。

(7)加入200μlbuffergl，充分混匀。70℃孵育10min，其间颠倒混匀数次。

(8)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心，使管壁和管盖上的液体集中到管底。

(9)将步骤8所得溶液和沉淀全部加入到已装入收集管(collectiontube)的吸附柱(spincolumndm)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(10)向吸附柱中加入500μlbuffergw1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(11)向吸附柱中加入500μlbuffergw2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(12)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

(13)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入100μlbufferge或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm离心1min，收集dna溶液，-20℃保存dna。

步骤二：酿酒酵母exg1基因克隆和同源整合表达载体ez-exg1-trp的构建

以基因数据库genbank注册号为m34341的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物：

以酿酒酵母w303-1b的基因组dna为模板，用引物exg1_1/exg1_8进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮pcr产物为模板，用引物exg1_2/exg1_4和exg1_5/exg1_7进行exg1基因5′和3′两个片段的nested-pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二轮pcr扩增得到的两条片段有互补区段，通过pcr的方式把两条片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,60s；72℃，1min，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接产物为模板，用引物exg1_3/exg1_6进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1009bp的dna片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的dna片段，然后用限制性内切酶kpni和saci双酶切，再与用相同的内切酶酶切的载体ez-t(genstar康润诚业生物科技有限公司)进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物m13f和m13r进行测序验证，即得到含有exg1基因同源片段的质粒ez-exg1。

为实现exg1基因敲除后便于筛选，选择筛选标记trp。具体做法为：用引物trp_exg1和trp_exg2和野生型酿酒酵母基因组dna为模板进行pcr扩增获得trp筛选标记的dna片段，琼脂糖凝胶纯化dna片段用nhei和hpai双酶切后与用nhei和hpai双酶切的ez-exg1进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到如seqidno1所示的含有exg1同源片段和筛选标记表达框trp的质粒ez-exg1-trp，其中第1-450和第1674-2216碱基序列为exg1同源片段，第451-1673碱基序列包括筛选标记trp基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框。通过noti单酶切线性化后，通过liac转化法把同源dna片段整合至酿酒酵母基因组中。图3a是构建的质粒图及同源重组的示意图

步骤三：酿酒酵母spr1基因克隆和同源整合载体ez-spr1-ade2的构建

以genbank注册号为nm_001183609的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物如下：

以酿酒酵母w303-1b的基因组dna为模板，用引物spr1_1/spr1_8进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮pcr产物为模板，用引物spr1_2/spr1_4和spr1_5/spr1_7进行spr1基因5′和3′两个片段的nested-pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二轮pcr扩增得到的两条片段有互补区段，通过pcr的方式把两条片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,60s；72℃，1min，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接产物为模板，用引物spr1_3/spr1_6进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1056bp的dna片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的dna片段，然后用限制性内切酶kpni和saci双酶切，再与用相同的内切酶酶切的载体ez-t(genstar康润诚业生物科技有限公司)进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物m13f和m13r进行测序验证，即得到含有spr1基因同源片段的质粒ez-spr1。

为实现spr1基因敲除后的筛选鉴定，选择筛选标记ade2。具体做法为：用引物ade2_spr1和ade2_spr2和野生型酿酒酵母基因组dna为模板为模板获得ade2片段，琼脂糖凝胶纯化ade2片段用sphi和spei双酶切后与用sphi和nhei双酶切的ez-spr1进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到seqidno2所示含有spr1同源片段和ade2筛选标记基因的质粒ez-spr1-ade2，其中第1-575和第2839-3292碱基序列为spr1同源片段，第576-2838碱基序列包括ade2基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框。质粒ez-spr1-ade2用saci线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。图3b是构建的质粒图及同源重组的示意图。

步骤四：酿酒酵母yir007w基因克隆和同源整合载体ez-yir-ura3的构建

以genbank注册号为nm_001179529的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物：

以酿酒酵母w303-1b的基因组dna为模板，用引物yir_1/8进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮pcr产物为模板，用引物yir_2/4和yir_5/7进行yir基因5′和3′两个片段的nested-pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二轮pcr扩增得到的两条片段有互补区段，通过pcr的方式把两条片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,60s；72℃，1min，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接产物为模板，用引物yir_3/6进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1050bp的dna片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的dna片段，然后用限制性内切酶kpni和saci双酶切，再与用相同的内切酶酶切的载体ez-t(genstar康润诚业生物科技有限公司)进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，使用通用测序引物m13f和m13r进行测序验证，即得到含有yir007w基因同源片段的质粒ez-yir。

为实现yir007w基因敲除后的筛选鉴定，选择ura3筛选标记。具体做法为：用引物ura3_yir1和ura3_yir2和和野生型酿酒酵母基因组dna为模板为模板进行pcr扩增获得ura3基因片段，琼脂糖凝胶纯化ura3片段用sphi和nhei双酶切后与用sphi和nhei双酶切的ez-yir进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到如seqidno3所示的含有yir007w基因同源片段和ura3筛选标记基因的质粒ez-yir-ura3，其中第1-508和第1640-2164碱基序列为yir007w同源片段，第509-1639碱基序列包括ura3基因启动子、开放阅读框和终止子的整个表达框。质粒ez-yir-ura3用saci线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。图3c是构建的质粒图及同源重组的示意图。

步骤五：酿酒酵母pgm2基因的克隆和整合表达载体pδgap′g-pgm2的构建

以基因数据库genbank注册号为nm_001182605的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物：

由于酿酒酵母w303-1b的pgm2基因含有2个限制性内切酶ndei位点和1个限制性内切酶kpni位点，不适合于表达载体的构建，于是合成pcr引物进行基因片段的扩增和阅读框的拼接。首先以酿酒酵母w303-1b的基因组dna为模板，用引物pgm_y1/pgm_y9进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮pcr产物为模板，用引物pgm_y5/pgm_y6和pgm_y7/pgm_y8进行pgm基因3′端的dna片段(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，30s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二轮pcr扩增得到的两条片段有互补区段，通过pcr的方式把两条片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,50s；72℃，45s，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接产物为模板，用引物pgm_y5/pgm_y8进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，43℃，50s，72℃，45s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为568bp的dna片段；然后进行“ta”克隆到ez-t载体上，即得到ez-pgm58；同样利用第一轮pcr产物为模板，用引物pgm_y3/pgm_y4的nested-pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，pcr扩增获得pgm5′端的1027bpdna片段，然后进行“ta”克隆到ez-t载体上，即得到ez-pgm34；再利用这2个片段内的ncoi进行阅读框的拼接，即得到ez-pgm38；最后再利用质粒ez-pgm38为模板和引物pgm_y2/pgm_y8进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，即获得编码seqidno4所示的氨基酸残基序列的长度为1710bp(seqidno5)的dna片段，再利用限制性内切酶ndei和xbai酶切与经ndei和nhei酶切的质粒pδgap′g(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)进行dna连接反应，该质粒载体pδgap′g含有甲醇酵母gap启动子、酿酒酵母δ整合位点、酿酒酵母pgk1终止子和可用g418进行筛选的标记基因kanmx，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到酿酒酵母整合型质粒pδgap′g-pgm2。质粒再用noti线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。

步骤六：酿酒酵母ugp1基因的克隆和整合表达载体pδgaph-ugp1的构建

以genbank注册号为nm_001179601的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物：

由于酿酒酵母w303-1b的ugp1基因含有限制性内切酶kpni、xbaincoi、ecori、sali,bglii位点，不适合于表达载体的构建，于是合成pcr引物进行基因片段的扩增和阅读框的拼接。首先以酿酒酵母w303-1b的基因组dna为模板，用引物ugp1_1/ugp1_8进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一轮pcr产物为模板，用引物ugp1_2/ugp1_3和ugp1_4/ugp1_5进行ugp1基因5′端的dna片段(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，30s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二轮pcr扩增得到的两条片段有互补区段，通过pcr的方式把两条片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,50s；72℃，45s，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接产物为模板，用引物ugp1_2/ugp1_5进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，43℃，50s，72℃，45s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为550bp的dna片段；然后进行“ta”克隆到ez-t载体上，即得到ez-ugp25；同样利用第一轮pcr产物为模板，用引物ugp1_6/ugp1_7的nested-pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，50s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，pcr扩增获得pgm3′端的957bpdna片段，然后进行“ta”克隆到ez-t载体上，即得到ez-ugp67；再利用bamhi和xbai酶切纯化回收获得ugp67片段，然后亚克隆到用bglii和xbai酶切处理的质粒ez-ugp25上，连接转化筛选获得阳性克隆，测序验证获得含有完整的ugp1阅读框的质粒ez-ugp27；最后再利用质粒ez-ugp27为模板和引物ugp1_2/ugp1_7进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，即获得编码seqidno6所示的氨基酸残基序列的长度为1500bp(seqidno7)的dna片段，再利用限制性内切酶ndei和spei酶切与经ndei和nhei酶切的质粒pδgaph(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)进行dna连接反应，该质粒载体pδgaph含有酿酒酵母gap启动子、酿酒酵母δ整合位点、酿酒酵母pgk1终止子和可用潮霉素进行筛选的标记基因hygb，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到酿酒酵母整合型质粒pδgaph-ugp1。质粒再用noti线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。

步骤七：大肠杆菌的pgm基因的克隆和整合表达载体pδgaph-pgm的构建

以genbank注册号eg12144的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物：

以大肠杆菌的基因组dna为模板，用引物pgm_1/pgm_4进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2.0min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min),再第1轮以pcr产物为模板，用引物pgm_2/pgm_3进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，50s，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为1.6kb的dna片段；然后用限制性内切酶ndei和nhei酶切,再与经ndei和nhei酶切的质粒pδgaph(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)进行dna连接反应，该质粒载体pδgaph含有酿酒酵母gap启动子、酿酒酵母δ整合位点、酿酒酵母pgk1终止子和可用潮霉素进行筛选的标记基因hygb，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到酿酒酵母整合型质粒pδgaph-pgm。质粒再用noti线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。

步骤八：大肠杆菌的galu基因的克隆和整合表达载体pδgap′z-galu的构建

以genbank注册号np_415752的核酸序列为基础设计合成pcr反应引物：

以大肠杆菌的基因组dna为模板，用引物galu_1/galu_4进行第一轮pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min),再第1轮以pcr产物为模板，用引物galu_2/galu_3进行pcr扩增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，50s，72℃，50s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一条长约为0.9kb的dna片段；然后用限制性内切酶ndei和nhei酶切,再与经ndei和nhei酶切的质粒pδgap′z进行dna连接反应；其中质粒pδgap′z是用引物tyr-zh1/tyr-ze1和质粒ppiczαa为模板经pcr扩增得到博来霉素(zeocin)筛选标记基因，再置换质粒pδgap′g上的标记基因kanmx，该质粒载体pδgap′z含有甲醇酵母gap启动子、酿酒酵母δ整合位点、酿酒酵母pgk1终止子和可用博来霉素进行筛选的标记基因zeocin，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，即得到酿酒酵母整合型质粒pδgap′z-galu。质粒再用noti线性化后通过liac转化法把目的片段整合至酿酒酵母基因组中。

步骤九：酿酒酵母感受态细胞制备及liac转化方法

(1)挑单克隆接菌于25ml液体ypd培养基中，30℃，250rpm培养16-18h至od600约为0.8-1.0。

(2)将菌液分装于数个1.5mlep管中(4管为一次转化的感受态量)，每管1.5ml，1500rpm离心5min，弃上清，750μl灭菌水清洗后1500rpm离心5min，弃去上清。

(3)每管用30μl，100mmliac重悬并将4管合并为一管，12000rpm离心15s，弃上清，用50μl100mmliac重悬即为感受态细胞(现用现做)。

(4)将2mg/ml的单链鲑鱼精载体dna(ssdna)煮沸5min，迅速置于冰上冷却。

(5)感受态细胞12000rpm离心15s，弃上清。

(6)按顺序加入240μl500g/lpeg(peg3350)，36μlliac(1m)，25μlssdna，50μl质粒(2-3μg，若线性化整合则需10-20μg线性化质粒)，漩涡剧烈混匀1min。

(7)30℃静置孵育30min，42℃水浴热击60min，其间颠倒混匀数次。

(8)离心弃上清，加入ypd培养基复性2h。

(9)离心弃去部分上清，吹打混匀，涂于含有相应抗生素平板或缺陷性筛选标记的平板上筛选，30℃培养3d。

(10)将获得的菌株转接于含高浓度抗生素或缺陷性筛选标记的平板上进行高拷贝整合阳性克隆复筛。

目的基因转化进入工程菌后都需要提取酿酒酵母基因组，通过pcr鉴定酵母基因组的方式确定目的基因是否转入酿酒酵母工程菌中，pcr鉴定完成后以各基因的引物测序进一步进行鉴定。

步骤十：酵母葡萄糖苷酶基因的的敲除

酿酒酵母w303-1b基因组中3个葡萄糖苷酶exg1、spr1和yir007w基因敲除过程如下：首先利用限制性内切酶noti或saci线性化的同源整合质粒dna，然后采用liac转化法转化酿酒酵母细胞，利用营养缺馅型筛选标记ade2、trp、ura3进行阳性克隆筛选。提取阳性克隆的基因组，再利用3组引物exg1_3/exg1_6、spr1_3/spr1_6、yir_3/yir_6分别对被敲除exg1、spr1和yir007w三个基因的阳性工程菌株进行pcr扩增鉴定。图4是三个葡萄糖苷酶exg1、spr1和yir007w基因敲除后的pcr扩增dna片段的电泳分析，结果表明都能扩增出预期的整合dna片段，再纯化pcr产物进行测序验证。

步骤十一：敲除糖苷水解酶后对黄酮7-o-葡萄糖苷水解活性的分析

酿酒酵母w303-1b(matαade2-1leu2-3,112his3-11,15ura3-1trp1-1)胞内糖苷酶的初步鉴定：将活化在ypd固体平板上的w303-1b单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养至od6003.0左右，转接于sc液体培养基中培养10h左右用新鲜的sc培养基调节od600至1.0后，将调节后的菌体分装于灭菌的100ml三角瓶中，每个三角瓶分装10ml菌液。分装完成后直接往菌液中加入木犀草素7-o-葡萄糖苷作为底物，反应6h后取样hplc检测野生型酿酒酵母对木犀草素7-o-葡萄糖苷的水解情况，结果如图2所示。结果可知野生型酿酒酵母w303-1b胞内存在糖苷酶。

以葡萄糖苷酶基因敲除菌株w303-1b/exg1、w303-1b/spr1和w303-1b/yir007w为实验组，原始菌w303-1b为对照组鉴定三个糖苷酶敲除完成后对木犀草苷的水解情况以及对细胞生长的影响。以木犀草素7-o-葡萄糖苷为底物鉴定糖苷酶敲除完成后对黄酮葡萄糖苷水解活性的变化，具体做法如下：

(1)转化生成的各工程菌单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600nm到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始光密度od600nm为1.0，把调节光密度od600后的工程菌液1ml分装于5ml反应瓶中，每种工程菌3个平行实验组，每个反应瓶中加入木犀草苷为反应底物，使得木犀草苷的终浓度为0.2mm，30℃，165rpm反应。

(4)分别于反应1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3个平行实验组的反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22um滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图5和表1所示糖苷酶基因敲除后对木犀草素7-o-葡萄糖苷的水解活性大大降低，其中exg1是胞内糖苷水解酶的主效基因；spr1基因敲除能促进细胞生长。

表1.

a.

b.

步骤十二：编码黄芩ugt的表达载体构建和酵母细胞转化

以中国专利申请号201410185256.4中克隆得到的质粒ptwinb-ugt34#为模板，用引物sbugt_n1和sbugt_x1扩增获得糖基转移酶基因片段：

sbugt_n1：agatatacatatgggacaactccacatagtccttg(划线为ndei位点)

sbugt_x1：gagctctctagactagtttaagccctgtttcataggagg(划线为xbai位点)

pcr扩增获得的糖基转移酶基因片段用ndei和xbai双酶切后与用ndei和nhei双酶切的pδgapg载体进行dna连接反应，经cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，筛选获得阳性克隆，使用引物sbugt_n1和sbugt_x1进行测序验证，即得到pδgapg-sbgt34整合型表达载体。利用限制性内切酶noti线性化质粒，然后采用liac转化法转化入酿酒酵母细胞w303-1b和w303-1b/es(e表示exg1基因敲除，s表示spr1基因敲除)即可获得工程菌株w303-1b/sbgt34和w303-1b/es/sbgt34。

工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34构建过程如下：首先用限制性内切酶noti线性化质粒pδgap′g-pgm2和pδgaph-ugp1转化敲除了糖苷水解酶exg1和spr1基因的工程菌w303-1b/es，利用g418和潮霉素进行阳性克隆的筛选鉴定；然后使用cre-loxp重组系统，转化质粒psh47-zeocin(本实验室构建)到阳性克隆，其表达重组酶cre能切除基因组中loxp-marker-loxp结构中loxp位点间的g418或潮霉素抗性基因，留下一个loxp位点，从而实现抗性筛选标记重复使用，即获得工程菌株w303-1b/es/pu(p表示整合pgm2基因进入宿主基因组，u表示整合ugp1基因进入宿主基因组)；最后再用noti线性化质粒pδgapg-sbgt34转化工程宿主细胞w303-1b/es/pu，再使用g418抗性进行筛选即可以获得菌种编号为cgmccno.11381的工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34。

工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34构建过程如下：首先用限制性内切酶noti线性化质粒pδgaph-pgm和pδgap′z-galu转化敲除了糖苷水解酶exg1和spr1基因的工程菌w303-1b/es，利用潮霉素和博来霉素进行阳性克隆的筛选鉴定；获得工程菌株w303-1b/es/peg(pe表示整合pgm基因进入宿主基因组，g表示整合galu基因进入宿主基因组)；最后再用noti线性化质粒pδgapg-sbgt34转化工程宿主细胞w303-1b/es/peg，再使用g418抗性进行筛选即可以获得菌种编号为cgmccno.12057的工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34。

实施例2：敲除糖苷水解酶的工程菌转入糖基转移酶sbgt34催化野黄芩素活性分析

工程菌w303-1b/es/sbgt34为实验组。以原始菌w303-1b为基础通过liac转化法转化获得只含有糖基转移酶sbgt34的工程菌w303-1b/sbgt34；敲除糖苷水解酶exg1和spr1基因的工程菌为基础转入糖基转移酶基因sbgt34获得工程菌w303-1b/es/sbgt34。以野黄芩素为底物鉴定糖苷水解酶敲除完成前后对黄酮底物糖苷化活性的变化，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始od600为1.0，把调节光密度后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每种工程菌3个平行实验组，每个反应瓶中加入野黄芩素为反应底物，使得野黄芩素的终浓度为0.2mm，30℃，165rpm反应。

(4)分别于反应3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3个平行实验组的反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图6和表2所示敲除了糖苷酶exg1、spr1的工程菌w303-1b/es/sbgt34对野黄芩素的转化率从对照w303-1b/sbgt34的37％提高到了76％。

表2.

实施例3：酿酒酵母糖代谢途径pgm2和ugp1基因对工程菌催化黄酮底物转化率的影响

以工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34为实验组，工程菌w303-1b/es/sbgt34为对照组鉴定pgm2和ugp1基因对工程菌催化黄酮底物转化率的影响。以野黄芩素为底物鉴定糖苷水解酶敲除完成前后对黄酮底物糖苷化活性的变化，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始od为1.0，把调节od后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每种工程菌3个平行实验，每个反应瓶中加入野黄芩素为反应底物，使得野黄芩素的终浓度为0.2mm，30℃，165rpm反应。

(4)分别于反应3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3个平行实验室的反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图6所示酿酒酵母糖代谢途径pgm2和ugp1基因的表达能提高细胞udp-葡萄糖的合成，工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34对野黄芩素的转化率从对照w303-1b/es/sbgt34的76％提高到了92％。

实施例4：大肠杆菌糖代谢途径pgm和galu基因对工程菌催化黄酮底物转化率的影响

以工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34为实验组，工程菌w303-1b/es/sbgt34为对照组鉴定pgm和galu基因对工程菌催化黄酮底物转化率的影响。以野黄芩素为底物鉴定糖苷水解酶敲除完成前后对黄酮底物糖苷化活性的变化，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始od为1.0，把调节od后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每种工程菌3个平行实验，每个反应瓶中加入野黄芩素为反应底物，使得野黄芩素的终浓度为0.2mm，30℃，165rpm反应。

(4)分别于反应3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3个平行实验室的反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图6所示大肠杆菌糖代谢途径pgm和galu基因的表达能提高细胞udp-葡萄糖的合成，工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34对野黄芩素的转化率从对照w303-1b/es/sbgt34的76％提高到了84％。

实施例5：不同浓度野黄芩素对工程菌转化率以及生长的影响

选取工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34为催化工程菌，野黄芩素底物终浓度分别为0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm。具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始光密度od600为1.0，把调节光密度od600后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每种浓度梯度3个平行实验，每个反应瓶中加入相同体积的野黄芩素(10ul)为反应底物，使得野黄芩素的终浓度为0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm(母液浓度不同)，30℃，165rpm反应。

(4)分别于反应3h、6h、12h、24h、48h、72h取出3个平行实验组的反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22um滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图7和表3所示不同浓度的底物转化率存在较大差异，底物浓度过高是对细胞生长有抑制作用。

表3.

a.

b.

实施例6：不同浓度葡萄糖和ph条件对酿酒酵母工程菌转化黄酮底物的影响葡萄糖浓度对转化率的影响：

选取工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34为催化工程菌，野黄芩素底物终浓度分别为0.6mm，葡萄糖终浓度分别为2％、5％、10％和15％。具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始光密度od600为1.0，把调节光密度od600后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每个葡萄糖浓度3个平行实验，每个反应瓶中加入10ul野黄芩素使得终浓度为0.6mm，30℃，165rpm反应。

(4)于反应96h取出反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并后的萃取液甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图8a和表4a所示，葡萄糖浓度的提高能促进底物的转化，在葡萄糖浓度为10％时转化率较高。

ph条件对转化率的影响：

选取工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34为催化工程菌，野黄芩素底物终浓度分别为0.6mm，葡萄糖终浓度为10％，ph梯度分别为4.5、5.0、5.5、6.0，ck为没有加入磷酸盐缓冲液调节自然状态下的转化率，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始光密度od600为1.0，把调节初始光密度od600后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每个葡萄糖浓度3个平行实验，每个反应瓶中加入10ul野黄芩素使得终浓度为0.6mm，30℃，165rpm反应。

(4)于反应96h取出反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并后的萃取液甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图8b和表4b所示不同ph条件对底物转化的影响，在ph为5.5时转化率较高。

表4.

a.

b.

实施例7：10-l发酵罐放大培养合成黄酮葡萄糖苷类化合物

工程菌为w303-1b/es/pu/sbgt34，底物为野黄芩素，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)测定其od值，加入适量的菌液值至含4-lsc培养基的10-l发酵罐中，使得其初始od值为1.0。

(4)分别于发酵0h和12h加入40ml和80ml(浓度为100mm)野黄芩素底物，发酵条件为：温度为30℃，溶氧为25％，ph为5.5。

(5)分别于发酵6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h和72h取样用于检测底物转化生成黄酮-o-葡萄糖苷的情况。

(6)每个时间点取出的1ml样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并萃取液的甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析。结果如图9和表5所示发酵放大能大大提高黄酮底物的转化率，产量能从摇瓶转化产量的215mg/l提高到了1200mg/l。

表5.

实施例8：工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34对不同黄酮类底物的生物催化

工程菌为w303-1b/es/pu/sbgt34，底物分别为木犀草素、柚皮素、白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素a、野黄芩素、黄芩素、槲皮素以及大豆黄酮，具体做法如下：

(1)转化生成的单克隆接种于ypd液体培养基中，30℃，220rpm，培养至od600到3.0左右。

(2)按1％的接种量转接到sc合成培养基中，30℃，220rpm培养约10h。

(3)用sc培养基调节生物量，使得初始光密度od600为1.0，把调节光密度od600后的工程菌1ml分装于5ml反应瓶中，每个反应瓶中加入相同体积的不同底物，并使得各底物中终浓度为0.6mm，此外每个底物有3个平行实验。

(4)于反应96h后取出所有反应瓶，取出样品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并后的萃取液甲醇完全挥干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm滤膜过滤后样品后hplc分析(如图10所示)。图11和表6为各催化底物反应完成后工程菌对各底物的相对催化活性。

表6.