一种超声波协同cda酶制备龙虾壳壳聚糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，以烹饪前、后虾壳为原料，经洗涤、干燥、粉碎预处理后，采用EDTA提取其中甲壳素，再以超声波协同CDA酶脱乙酰基，制备壳聚糖。与传统强酸强碱方法相比，本发明工艺简单，总制备时间短，仅需8-12h，EDTA可100%回收重复使用，不使用强酸、强碱，对环境无任何污染，产品脱乙酰度高达92-95%、黏度高达95-105mPa·s。所制备产品呈现白色粉末状，性质稳定，可用于食品、医药、生物、化妆品等领域。
【专利说明】一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及壳聚糖制备领域，具体涉及一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法。
【背景技术】
[0002]淡水小龙奸(Red Swamp Crayfish),学名克氏原螯奸,原产于美国中南部,现已成为我国特别是华东地区淡水养殖虾类的主要种类之一。甲壳素(C8H13NO5)n是天然存在的N-乙酰葡萄糖胺多糖，小龙虾壳中甲壳素含量丰富，常用酸碱法提取龙虾壳甲壳素，环境污染大。
[0003]壳聚糖(Chitosan)，是由甲壳素经脱乙酰基而得，化学名聚葡萄糖胺(1_4)-2_氨基-B-D葡萄糖，是天然多糖中唯一的碱性多糖，广泛用于纺织、医药、造纸、化妆品、食品工业、和生物技术等领域。目前工业上常用的壳聚糖制备方法均离不开强碱的脱乙酰基作用，且产品性质不稳定、能耗高、环境污染大，制备时间长。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，采用EDTA提取龙虾壳甲壳素，再以超声波协同CDA酶脱乙酰基，制备壳聚糖，整个过程不使用强酸、强碱，EDTA可100%回收重复使用，成本低、能耗少，对环境无任何污染，产品脱乙酰度高，性质稳定，制备时间短。
[0005]本发明通过以下技术方案实现:
一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，包括以下步骤:
(1)虾壳预处理:对于未经烹饪的新鲜虾壳洗净、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；或者对于烹饪后的虾壳清理后洗净，经无水乙醚和无水乙醇依次洗涤，用蒸馏水洗净后过滤、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；
(2)甲壳素提取:按料液比Ig:24?30ml称取虾壳粉加入质量浓度为18-209ffiDTA溶液，EDTA溶液pH值为13，置于超声波清洗器中搅拌反应45-60min，超声频率为60KHz、功率为180W-240W，反应后过滤并以蒸馏水洗涤滤渣，收集滤渣烘干，再用过氧化氢溶液浸泡脱色，洗净烘干后的白色粉末为甲壳素；
(3)壳聚糖制备:按料液比Ig:20ml称取甲壳素粉加入蒸馏水，100°C恒温水浴l_2h后，置于超声频率25KHz，功率400-500W超声波清洗器中，处理40_60min后，按体积比加入7%-10%的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴50°C恒温酶解2.5-3.5h，酶反应结束后，以100°C水浴下连续热灭活15 min终止酶反应，迅速冷却至室温，离心，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干得壳聚糖。
[0006]本发明进一步改进方案是，所述步骤(I)中虾壳60°C烘干，粉碎过20目筛。
[0007]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(I)中无水乙醚洗涤和无水乙醇洗涤各5次。
[0008]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(2)中收集滤渣50°C烘干，再用质量浓度10%的过氧化氢溶液在35°C水浴中浸泡2h脱色。
[0009]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(2)中以蒸馏水洗涤滤渣，提取滤液，用盐酸调节滤液pH=l,使EDTA以酸的形式沉淀回收。
[0010]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(3)中称取的甲壳素粉过80目筛。
[0011]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(3)中酶反应期间以质量浓度为0.lmol/1的NaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高。
[0012]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(3)中所述离心条件是指9000rpm离心1min0
[0013]本发明更进一步改进方案是，所述步骤(3)中CDA粗酶液酶活200U/mL左右(以每小时产生Mg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位)。
[0014]本发明与现有技术相比，具有以下明显优点:
本发明采用EDTA提取龙虾壳甲壳素，再以超声波协同CDA酶脱乙酰基，制备壳聚糖，利用超声波“空化作用”，使甲壳素紧密的结晶体疏松，改善甲壳素脱乙酰基酶(ChitinDeacetylat1n,简称CDA)与甲壳素分子之间的结合作用，同时利用CDA酶的高效催化性和专一性，大大缩短脱乙酰基时间，提高产品脱乙酰度和黏度。与传统强酸、强碱法制备壳聚糖相比，整套制备工艺，不使用强酸、强碱，EDTA可100%回收重复使用，成本低、能耗少，对环境无任何污染，产品脱乙酰度高，性质稳定，产品脱乙酰度高达92-95%、黏度高达95-105mPa.s，制备时间在8_12h，与传统的时间在48h以上相比，大幅缩短制备时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明工艺流程图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，实施例不能理解为是对技术方案的限制。
[0017]实施例1:烹饪前新鲜小虾头壳壳聚糖制备:将新鲜淡水小龙虾头壳洗净，置于60°C烘箱中烘干，使用粉碎机粉碎至过20目筛。称取一定量烹饪前小龙虾头壳粉末于烧杯中，按料液比为lg:30ml的量，加入pH=13的20%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为240W的超声波清洗器中，搅拌反应60min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50°C烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35°C水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾头壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按料液比lg:20ml加入蒸馏水，100°C水浴中加热预处理2h后，置于超声频率为25KHz，功率为500W的超声波清洗器中，超声波预处理60min后，按体积比加入10%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50°C下恒温酶解3.5h，期间以0.lmol/L NaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100°C水浴下连续灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，9000rpm离心lOmin，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得小龙虾头壳壳聚糖，壳聚糖脱乙酰度92.38%、黏度 95 mPa.S。
[0018]实施例2:烹饪前新鲜小龙虾尾壳壳聚糖制备:将新鲜淡水小龙虾尾壳(去除头壳后剩余部分)洗净，置于60°C烘箱中烘干，使用粉碎机粉碎至过20目筛，称取一定量烹饪前小龙虾尾壳粉末于烧杯中，按料液比为lg:24ml的量，加入pH=13的18%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为180W的超声波清洗器中，搅拌反应45min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50°C烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35°C水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾尾壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按料液比lg: 20ml加入蒸馏水，100°C水浴中加热预处理Ih后，置于超声频率为25KHz，功率为400W的超声波清洗器中，超声波预处理40min后，按体积比加入7%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50°C下恒温酶解2.5h，期间以0.lmol/L NaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100°C水浴下连续灭活15min终止酶反应,迅速冷却至室温，9000rpm离心lOmin，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得小龙虾尾壳壳聚糖，壳聚糖脱乙酰度93.75%、黏度98mPa.S。
[0019]实施例3:烹饪前新鲜小龙虾壳壳聚糖制备:将新鲜淡水小龙虾壳(包括头壳、尾壳)洗净，置于60°C烘箱中烘干，使用粉碎机粉碎至过20目筛，称取一定量烹饪前小龙虾壳粉末于烧杯中，按料液比为lg: 28ml的量，加入pH=13的19%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为220W的超声波清洗器中，搅拌反应55min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50°C烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35°C水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按料液比lg: 20ml加入蒸馏水，100°C水浴中加热预处理1.5h后，置于超声频率为25KHz，功率为450W的超声波清洗器中，超声波预处理50min后，按体积比加入9%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50°C下恒温酶解3h，期间以0.lmol/L NaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100°C水浴下连续灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，9000rpm离心lOmin，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得小龙虾壳聚糖，壳聚糖脱乙酸度 94.54%、黏度 101 mPa.S。
[0020]实施例4:烹饪后小龙虾壳壳聚糖制备:将烹饪后小龙虾壳洗净，以无水乙醚中洗涤5次，再以无水乙醇抽提5次，用蒸馏水洗净后过滤，滤渣于60°C烘箱中烘干，粉碎机粉碎至过20目筛。称取一定量烹饪后小龙奸壳粉末于烧杯中，按料液比为lg:26ml的量,加入PH= 13的18%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为200W的超声波清洗器中，搅拌反应50min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50°C烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35°C水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按g/ml料液比1:20加入蒸馏水，100°C水浴中加热预处理1.5h后，置于超声频率为25KHz，功率为480W的超声波清洗器中，超声波预处理55min后，按体积比加入8%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50°C下恒温酶解2.5h，期间以0.lmol/L NaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100°C水浴下连续灭活15min终止酶反应,迅速冷却至室温,9000rpm离心1min,蒸懼水反复洗漆至中性,沉淀物烘干，即得壳聚糖，壳聚糖脱乙酰度95.12%、黏度105mPa.S。
【权利要求】
1.一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)虾壳预处理:对于未经烹饪的新鲜虾壳洗净、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；或者对于烹饪后的虾壳清理后洗净，经无水乙醚和无水乙醇依次洗涤，用蒸馏水洗净后过滤、烘干、粉碎、置于干燥器中备用； (2)甲壳素提取:按料液比Ig:24?30ml称取虾壳粉加入质量浓度为18-209ffiDTA溶液，EDTA溶液pH值为13，置于超声波清洗器中搅拌反应45-60min，超声频率为60KHz、功率为180W-240W，反应后过滤并以蒸馏水洗涤滤渣，收集滤渣烘干，再用过氧化氢溶液浸泡脱色，洗净烘干后的白色粉末为甲壳素； (3)壳聚糖制备:按料液比Ig:20ml称取甲壳素粉加入蒸馏水，100°C恒温水浴l_2h后，置于超声频率25KHz，功率400-500W超声波清洗器中，处理40_60min后，按体积比加入7%-10%的⑶A粗酶液，磁力搅拌水浴50°C恒温酶解2.5-3.5h，酶反应结束后，以100°C水浴下连续热灭活15 min终止酶反应，迅速冷却至室温，离心，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干得壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(I)中虾壳60°C烘干，粉碎过20目筛。
3.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(I)中所述无水乙醚洗涤和无水乙醇洗涤各5次。
4.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(2)中收集滤渣50°C烘干，再用质量浓度10%的过氧化氢溶液在35°C水浴中浸泡2h脱色。
5.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(2)中以蒸馏水洗涤滤渣，提取滤液，用盐酸调节滤液pH=l，使EDTA以酸的形式沉淀回收。
6.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(3)中称取的甲壳素粉过80目筛。
7.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(3)中酶反应期间以质量浓度为0.lmol/1的NaOH调节pH=7.5。
8.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(3)中所述离心条件是指9000rpm离心lOmin。
9.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(3)中CDA粗酶液酶活200U/mL左右。
【文档编号】C08B37/08GK104262507SQ201410600320
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】窦勇, 胡佩红 申请人:江苏财经职业技术学院