b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法及冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，产品效果良好。本发明的制备方法，包括以下步骤：1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。
【专利说明】b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及疫苗制备方法【技术领域】，提供了一种制备b型流感嗜血杆菌多糖-蛋 白结合物的结合技术，基于此结合技术，制备出了具有较高免疫原性的b型流感嗜血杆菌 结合疫苗。
【背景技术】：
[0002] b型流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenzae Type b，简称Hib)，是全世界儿童发 病和死亡的主要原因之一，b型流感嗜血杆菌感染性疾病主要发生在5岁以下儿童，一旦被 Hib感染，婴幼儿很有可能受到肺炎和脑膜炎等可怕疾病的侵袭，还可能并发严重的神经系 统后遗症，包括耳聋、语言障碍或延迟、视力障碍、智力低下和运动功能异常等。目前研究发 现，人类是Hib的唯一宿主，病菌的传播主要通过空气飞沫及与病菌携带者亲密接触。
[0003] Hib的荚膜多糖主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐（Polyribose ribitol phosphate，PRP)，是Hib的主要毒力因子之一，由此制备成的多糖疫苗具有一定的免疫预 防效果，但由于多糖属于T细胞非依赖性抗原，因此抗体的产生与年龄具有相关性。成人接 种后可产生免疫应答且抗体长期存在；2岁以上儿童接种疫苗后可产生抗体，但维持时间 较短，并且重复接种也无加强反应；在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，不 能有效刺激机体产生抗体。
[0004] Hib结合疫苗是将PRP以共价键的方式结合到具有免疫原性的蛋白载体上制备 的。与多糖疫苗相比，Hib结合疫苗不仅能刺激婴幼儿机体产生强的免疫反应，而且再次接 种也能加强反应，从而提高疫苗的保护性能。
[0005] 多糖和蛋白质主要是通过化学方法进行偶联的，目前普遍运用的多糖蛋白结合物 制备方法是：用CNBr活化Hib多糖并与己二酰肼连接制备衍生物，然后在碳二亚胺的作用 下多糖衍生物通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合，最后经凝胶过滤层析纯化获得高 分子多糖蛋白结合物。然而这种多糖蛋白结合物制备技术存在着以下不足：（1)工艺复杂， 反应周期长；（2)EDAC在介导多糖ADH衍生物与载体蛋白结合的同时，容易引起载体蛋白的 自身交联，形成载体蛋白的聚合物，从而降低多糖-蛋白的结合效率；（3) Hib荚膜多糖的分 子大小分布不均，每个批次的分子大小分布存在较大差异，导致每批多糖蛋白结合疫苗的 理化指标各异，影响生产工艺的稳定性、成品疫苗的批间稳定性和成品疫苗质量的一致性。
[0006] 本发明提供了一种新的多糖蛋白结合方法，采用化学方法将Hib多糖降解成分子 量均一的小分子多糖，减小多糖分子大小批间差异，生产工艺的稳定性和产品质量一致性 显著提高。用CDAP活化多糖后直接与载体蛋白结合，不添加 EDAC可避免载体蛋白的自身 交联，缩短了生产周期，提高了结合物收率。
[0007] 本发明还提供一种佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法及冻干b型流 感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，产品效果良好。
【发明内容】
：
[0008] 本发明提供了一种新的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物制备方法。
[0009] 本发明进一步提供用本发明的方法制备的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素 结合疫苗及其制剂。
[0010] 本发明所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，包括以 下步骤：
[0011] 1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；
[0012] 2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；
[0013] 3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；
[0014] 4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。
[0015] 其中，步骤1)所述将b型流感嗜血杆菌多糖降解，方法为：
[0016] b型流感嗜血杆菌多糖用0· 02mol/L?0· 04mol/L乙酸钠溶液溶解（4?5mg/ ml)，加入终浓度为0. 5%?3%的过氧化氢，于50?60°C反应20?40分钟。用注射用水 或2mol/L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质，得到降解后的b型流感嗜 血杆菌多糖。
[0017] 其中，步骤2)所述对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化，方法为
[0018] 取降解后的多糖溶液，浓度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量与CDAP比例 为1:0. 25?1:2,维持反应20?300秒。加入过量的三乙胺溶液，反应溶液pH值控制在 8. 5?10. 5之间，冰浴或室温反应5?8分钟后，调pH值至8. 3?8. 9之间。
[0019] 其中，步骤3)所述将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进 行结合，
[0020] 方法为：
[0021] 根据多糖投入量，按1:0. 5?1:3的比例加入纯化破伤风类毒素原液（以蛋白含 量计算），混匀后维持pH在8. 3?8. 9之间反应1?2小时。反应结束后调pH值至4. 8? 5. 2之间，加入过量的甘氨酸溶液，30?60分钟后终止反应，用0. 02?0. 2mol/L氯化钠溶 液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质。
[0022] 其中，步骤4)所述对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行 纯化，方法为：
[0023] 用0· 02?0· 2mol/L氯化钠溶液作为流动相，多糖-蛋白结合物经Sephacryl S-400HR层析纯化，上样量不能超过柱体积的10%，收集K d < 0. 4的洗脱液段，适当稀释后 经0. 2 μ m无菌滤器除菌过滤后即得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。
[0024] 本发明所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，优选的
[0025] 步骤1)所述多糖降解，其中所述乙酸钠溶液浓度为0· Olmol/L?0· 10m〇l/L，最佳 为0. 02mol/L?0. 04mol/L ;所述多糖溶解浓度为1?10mg/ml，最佳为4?5mg/ml ;所述 加入的过氧化氢浓度为0. 1?5%，最佳为0. 5?3%,
[0026] 步骤2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量与CDAP比例为1:0. 25?1:2 (g/g)， 维持反应20-300秒；诉述加入三乙胺浓度为0. 2mol/L，反应时间5?8分钟，维持pH值 8. 5?10. 5之间，后将溶液的pH值调至8. 3?8. 9之间，
[0027] 步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为 1:0. 5?1:3,更佳为1:0. 8?1:1. 5,最佳为I : 1 ;所述维持pH值在8. 0?9. 0之间，更佳为 8. 3?8. 9范围；所述反应时间为0. 5?4小时，更佳为1?2小时；所述调整pH值4. 5? 6. 0之间，更佳为4. 8?5. 2之间；所述过量甘氨酸溶液为Ig多糖加入50?120g的Imol/ L甘氨酸溶液；所述氯化钠溶液浓度为0. 02?0. 2mol/L，
[0028] 步骤4)所述多糖蛋白结合物纯化，其中所述氯化钠溶液浓度为0. 02?0. 2mol/L ; 所述层析介质为Sephacryl S-400HR凝胶；所述收集洗脱液为Kd < 0. 4的洗脱液段。
[0029] 本发明进一步包括，将上述纯化步骤所得的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒 素结合物作为疫苗制剂的活性成分，根据制剂学的要求制备成疫苗制剂。
[0030] 本发明优选的疫苗制剂为冻干剂型，其组分包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风 类毒素结合物、乳糖，氯化钠，其中，各组分的浓度为：
[0031] b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物（以多糖含量计） 17?30 μ g/ ml
[0032] 乳糖 0· 6 ?I. 4mg/ml
[0033] 其制备方法包括如下步骤：
[0034] a)取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液。
[0035] b)向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入赋形剂乳糖溶液， 用注射用水稀释定容。
[0036] c)分装后置入冻干机中进行冻干得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
[0037] 本发明的疫苗制剂也可以为液体剂型，组分包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风 类毒素结合物、氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，氯化钠，其中，各组分的浓度为：
[0038] b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物（以多糖含量计）17?30 μ g/ ml
[0039] 铝离子 0· 2 ?0· 8mg/ml
[0040] 氯化钠 7. 0 ?10. Omg/ml
[0041] 其制备方法包括如下步骤：
[0042] a)取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液。
[0043] b)制备氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，检测佐剂铝离子含量及氯化钠浓度。
[0044] c)向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入佐剂、氯化钠溶液， 用注射用水稀释定容。
[0045] d) 2_8°C吸附过夜，分装，得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
[0046] 以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果。
[0047] 传统b型流感嗜血杆菌-破伤风类毒素结合物原液的制备方法主要有两种：一种 是传统的CNBr方法，即用CNBr活化Hib多糖并与己二酰肼连接制备衍生物，然后在碳二亚 胺的作用下多糖衍生物通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合；另一种是传统的CDAP 活化方法，与溴化氰方法相比，只是采用了较温和的活化剂CDAP。
[0048] 本发明采用双氧水降解Hib多糖，采用CDAP活化降解多糖后直接与载体蛋白结 合的方法与传统结合技术相比具有周期短、收率高，免疫原性好的特点，效果对比如表1所 示：
[0049] 表1传统结合技术与本发明技术效果对比结果
[0050]
【权利要求】
1. b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，包括以下步骤： 1) 将b型流感嗜血杆菌多糖降解； 2) 对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化； 3) 将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合； 4) 对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。
2. 如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1)所述将b型流感嗜血杆 菌多糖降解，方法为： b型流感嗜血杆菌多糖用0. 02mol/L?0. 04mol/L乙酸钠溶液溶解（4?5mg/ml)，力口 入终浓度为〇. 5%?3%的过氧化氢，于50?60°C反应20?40分钟，用注射用水或2mol/ L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质，得到降解后的b型流感嗜血杆菌多 糖。
3. 如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤2)所述对降解后的b型流 感嗜血杆菌多糖进行活化，方法为 取降解后的多糖溶液，浓度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量与CDAP比例为 1:0. 25?1:2,维持反应20?300秒，加入过量的三乙胺溶液，反应溶液pH值控制在8. 5? 10. 5之间，冰浴或室温反应5?8分钟后，调pH值至8. 3?8. 9之间。
4. 如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤3)所述将活化的b型流感 嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合，方法为： 根据多糖投入量，按1:0. 5?1:3的比例加入纯化破伤风类毒素原液（以蛋白含量计 算），混匀后维持pH在8. 3?8. 9之间反应1?2小时，反应结束后调pH值至4. 8?5. 2 之间，加入过量的甘氨酸溶液，30?60分钟后终止反应，用0. 02?0. 2mol/L氯化钠溶液作 为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质。
5. 如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤4)所述对结合后的b型流 感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化，方法为： 用0. 02?0. 2mol/L氯化钠溶液作为流动相，多糖-蛋白结合物经S印hacryl S-400HR 层析纯化，上样量不能超过柱体积的10 %，收集KD < 0. 4的洗脱液段，适当稀释后经0. 2 μ m 无菌滤器除菌过滤后即得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。
6. 如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于， 其中，步骤1)所述多糖降解，其中所述乙酸钠溶液浓度为0. Olmol/L?0. 10m〇l/L，最 佳为0. 02mol/L?0. 04mol/L ;所述多糖溶解浓度为1?10mg/ml，最佳为4?5mg/ml ;所 述加入的过氧化氢浓度为〇. 1?5%，最佳为0. 5?3%， 其中，步骤2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量与CDAP比例为1:0. 25?1:2 (g/g)， 维持反应20-300秒；诉述加入三乙胺浓度为0. 2mol/L，反应时间5?8分钟，维持pH值 8. 5?10. 5之间，后将溶液的pH值调至8. 3?8. 9之间， 其中，步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为 1:0. 5?1:3,更佳为1:0. 8?1:1. 5,最佳为1 :1 ;所述维持pH值在8. 0?9. 0之间，更佳为 8. 3?8. 9范围；所述反应时间为0. 5?4小时，更佳为1?2小时；所述调整pH值4. 5? 6. 0之间，更佳为4. 8?5. 2之间；所述过量甘氨酸溶液为lg多糖加入50?120g的lmol/ L甘氨酸溶液；所述氯化钠溶液浓度为0. 02?0. 2mol/L， 其中，步骤4)所述多糖蛋白结合物纯化，其中所述氯化钠溶液浓度为0. 02?0. 2mol/ L ;所述层析介质为Sephacryl S-400HR凝胶；所述收集洗脱液为KD彡0. 4的洗脱液段。
7. 用权利要求1-6任何一项制备方法制备的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结 合物。
8. 以权利要求7所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物作为活性成分制 备的疫苗制剂。
9. 根据权利要求8所述的疫苗制剂，其特征在于，为冻干制剂，组分包括b型流感嗜血 杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、乳糖，其中，各组分的浓度为： b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物（以多糖含量计）17?30 μ g/ml 乳糖 0· 6 ?1. 4mg/ml 其制备方法，包括如下步骤： 1) 取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液， 2) 向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入乳糖溶液，用注射用水 稀释定容， 3) 分装后置入冻干机中进行冻干：先-40?-50°C预冻2?6小时，预冻完成后开始 抽真空处理，将真空状态的冻干机温度调至-30?_35°C，并保持4小时以上，搁板以3? 5°C /小时的速度升温至30?32°C，并维持在30?32°C的温度8?12小时，制品压塞出 箱，即获得成品。
10. 根据权利要求8所述的疫苗制剂，其特征在于，为液体制剂，组分包括b型流感嗜血 杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，氯化钠，其中，各组分的浓 度为： b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物（以多糖含量计）17?30 μ g/ml 铝离子 0· 2?0· 8mg/ml 氯化钠 7. 0?10. Omg/ml 其制备方法，包括如下步骤： 1) 取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液， 2) 制备氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，检测佐剂铝离子含量及氯化钠浓度， 3) 向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入佐剂、氯化钠溶液，用注 射用水稀释定容， 4) 2-8°C吸附过夜，分装得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
【文档编号】C08B37/00GK104225588SQ201410413100
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】苏晓叶, 石献华, 康鸿宇, 孟文茜, 潘勇, 刘刚, 黄颖, 杜琳 申请人:北京智飞绿竹生物制药有限公司