一种依诺肝素钠的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种依诺肝素钠的生产方法，所述方法首先将肝素钠酶解后，进行HPLC分析，采用峰面积归一化法计算各个峰的含量，根据肝素钠酶解后的二糖和四糖的标准图谱，确定待测肝素钠酶解后二糖和四糖的种类，并与标准图谱的二糖和四糖的含量进行比较，选择符合标准要求的肝素钠原料进行依诺肝素钠的生产。本发明简单有效，不仅能够保证产品的安全性有效性，而且从源头控制依诺肝素钠的质量，能够避免肝素钠原料药的浪费，大大节约了成本，提高了生产效率。
【专利说明】一种依诺肝素钠的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种依诺肝素钠的生产方法。
【背景技术】
[0002] 肝素是由L-艾杜糖醛酸（或葡糖醛酸）和N-乙酰葡糖胺（或D-葡糖胺）形成 的二糖单元重复构成的高度硫酸化的线性多糖，具有抗凝血作用，被广泛用于治疗静脉血 栓和预防凝血。低分子肝素是未分级肝素中具有较低分子量的组份或片段，是新一代肝素 类抗血栓药物。肝素经过酶或化学的方式部分降解就可以获得低分子肝素。低分子肝素类 产品因分子量较小，不易被第IV因子中和，抗凝效果和纤溶作用得以增强，而抗血小板、影 响血小板功能、影响血液凝固性、诱发出血的作用大为减弱，加之生物利用度高达98%，量 效关系明确，抗凝效果易于预测，血浆半衰期较普通肝素长2?3倍，同时具有快速和持续 的抗血栓形成作用，改善血流动力学，因而国内市场以那曲肝素钙、依诺肝素钠为代表的低 分子肝素类产品已逐步取代普通肝素产品。依诺肝素钠是由法国安万特公司研制开发的一 种目前销售量最大的新型抗凝药物。
[0003] 由于低分子肝素钠结构的多样性，因此低分子肝素钠的结构确定非常重要。FDA要 求从结构上证明仿制药物与原产家药物具有生物一致性。因此，低分子肝素精细结构的分 析方法很快成为学术界和制药界关注的焦点。
[0004] 依诺肝素钠需要严格控制完全降解后的依诺肝素钠产生的二糖及四糖的含量， 以及依诺肝素钠独有的1，6-脱氢环结构的含量，以保证产品的有效性和安全性。专利 CN102792158B提供了一种用于定量分析的依诺肝素钠特征性寡糖结构的毛细管电泳方法。 专利CN102323355B提供了一种酶解-HPLC法检测依诺肝素的方法。这两种方法都是依诺 肝素钠的结构分析方法，是对成品的质量控制，无法从源头对依诺肝素钠的质量进行控制。
[0005] 肝素原料药可直接被用于制成标准肝素制剂，或进一步加工制成低分子肝素原料 药，再制成低分子肝素制剂。肝素钠是从新鲜的健康的生猪的小肠粘膜中提取制成的，由于 原料的差异性，导致所制得的肝素钠结构的差异性。同样地，由于不同批次肝素钠结构差 异，使得加工得到的达肝素钠批次间也存在差异。在达肝素钠的生产中，存在因肝素钠的结 构不适合，致使该批达肝素钠产品的结构不符合标准的情况，不仅浪费时间、人力和物力， 而且不利于生产和经济。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术的不足，提供一种依诺肝素钠的生产方法， 本法包括对原料的筛选，本发明简单有效，不仅能够保证产品的安全性有效性，而且能够避 免肝素钠原料的浪费，提高了生产效率。
[0007] 本发明的目的可以通过以下措施达到：
[0008] -种依诺肝素钠的生产方法，其包括如下步骤：
[0009] 1)肝素钠酶解：将肝素钠原料配制成水溶液，向其加入含有肝素酶I、肝素酶II 和肝素酶III的混合肝素酶溶液，进行酶解64?72小时，制成肝素钠酶解溶液；其中混合肝 素酶溶液中各肝素酶的含量比为肝素酶I :肝素酶II :肝素酶111= 1:0. 6:0. 2;
[0010] 2)分离分析：将所述肝素钠酶解溶液注入HPLC中进行检测，记录色谱图，根据肝 素钠的二糖和四糖的保留时间，确定待测肝素钠中的二糖和四糖的种类，并计算待测肝素 钠酶解后10个二糖和2个四糖的含量；其中检测条件为：色谱柱为季铵型强阴离子交换色 谱柱，检测器为紫外检测器，检测波长为220?240nm，使用流动相A和流动相B梯度洗脱， 所述流动相A为磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为磷酸二氢钠和高氯酸钠的混合溶液；
[0011] 3)原料药筛选：选取酶解后二糖和四糖的含量符合下述要求的待测肝素钠作 为依诺肝素钠原料；其中二糖和四糖色谱峰的峰面积分别在1. 8%?3.7 %、< 1.0%、 1. 8%?3. 6%、2· 3%?4. 4%、1· 1%?2. 1%、彡 3. 9%、8· 4%?11. 9%、4· 0%?8. 8%、 1. 1%?2. 0%、彡 1. 0%、52· 4%?66. 9%、1· 6%?3. 4%范围内；
[0012] 4)生产依诺肝素钠：以步骤3)中选取的肝素钠为原料，经过季铵盐化、酯化和氧 化反应，得到依诺肝素钠。
[0013] 在步骤1)中，酶解温度优选为25°C ;混合肝素酶溶液中肝素酶I的含量为 1. 0/3IU/mL，肝素酶II的含量为0. 6/3IU/mL，肝素酶III的含量为0. 2/3IU/mL。
[0014] 在步骤2)中，流动相的配制优选为：流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A 为0. 20?0. 30g/L的磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为0. 20?0. 30g/L的磷酸二氢钠和 120?140g/L的高氯酸钠的混合溶液。在HPLC检测过程中，进样量为5?20 μ L，流速为 0· 2 ?1. 2mL/min，柱温为 50 ?55°C。
[0015] 在步骤2)中，仪器条件：所用仪器为高效液相色谱仪（HPLC)，色谱柱季铵型强 阴离子交换色谱柱，所用检测器为紫外检测器，检测波长为220?240nm，进样量为5? 20 μ L，流速为0. 2?1. 2mL/min，柱温为50?55°C，使用流动相A和流动相B梯度洗脱的 过程优选见表1。
[0016] 表 1
[0017]
【权利要求】
1. 一种依诺肝素钠的生产方法，其特征在于其包括如下步骤： 1) 肝素钠酶解：将肝素钠原料配制成水溶液，向其加入含有肝素酶I、肝素酶II和肝 素酶III的混合肝素酶溶液，进行酶解64?72小时，制成肝素钠酶解溶液；其中混合肝素酶 溶液中各肝素酶的含量比为肝素酶I :肝素酶II :肝素酶111= 1:0. 6:0. 2; 2) 分离分析：将所述肝素钠酶解溶液注入HPLC中进行检测，记录色谱图，根据肝素钠 的二糖和四糖的保留时间，确定待测肝素钠中的二糖和四糖的种类，并计算待测肝素钠酶 解后10个二糖和2个四糖的含量；其中检测条件为：色谱柱为季铵型强阴离子交换色谱 柱，检测器为紫外检测器，检测波长为220?240nm，使用流动相A和流动相B梯度洗脱，所 述流动相A为磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为磷酸二氢钠和高氯酸钠的混合溶液； 3) 原料药筛选：选取酶解后二糖和四糖的含量符合下述要求的待测肝素钠作为依诺 肝素钠原料；其中二糖和四糖色谱峰的峰面积分别在1.8%?3.7%、< 1.0%、1. 8%? 3. 6%、2· 3%?4. 4%、1· 1%?2. 1%、彡 3. 9%、8· 4%?11. 9%、4· 0%?8. 8%、1· 1%? 2.0%、彡 1·0%、52·4%?66·9%、1·6%?3.4%范围内； 4) 生产依诺肝素钠：以步骤3)中选取的肝素钠为原料，经过季铵盐化、酯化和氧化反 应，得到依诺肝素钠。
2. 根据权利要求1所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤1)中，酶解温度 为25°C ;混合肝素酶溶液中肝素酶I的含量为1.0/3IU/mL，肝素酶II的含量为0.6/3IU/ mL，肝素酶III的含量为0. 2/3IU/mL。
3. 根据权利要求1所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤2)中，所述流动 相A为0. 20?0. 30g/L的磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为0. 20?0. 30g/L的磷酸二氢 钠和120?140g/L的高氯酸钠的混合溶液。
4. 根据权利要求1所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤2)中，在HPLC检 测过程中，进样量为5?20 μ L，流速为0. 2?1. 2mL/min，柱温为50?55°C。
5. 根据权利要求1所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤2)中，10个二糖 分别为Λ IVA、A IVSgal、A IVS、A ΙΙΑ、Λ ΙΙΙΑ、Λ IISgal、A IIS、A IIIS、A IA和Λ IS， 2 个四糖分别为Λ ΠΑ-IVSglu 和Λ IIA-IISglu。
6. 根据权利要求1或5所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤3)中，选取 的依诺肝素钠原料酶解后二糖和四糖的含量要求为：
其中"P"表示此峰必须存在。
7. 根据权利要求1所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤2)中，使用流动 相Λ和流动相β进行梯度洗脱的过程为:_
8. 根据权利要求1所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤4)中，称取筛 选出的肝素钠原料，加水溶解制成8%?15%的肝素钠溶液，20?30°C下缓缓加入卞索 氯铵溶液，充分混匀，离心分离得到季铵盐肝素，重复进行洗涤和离心操作后干燥，向季铵 盐肝素中加入二氯甲烷后搅拌溶解加入氯化苄，保持溶液温度29?31°C进行酯化反应 得到酯化液，对酯化液用无水乙酸钠的甲醇液沉淀，再用水和氯化钠溶液并用甲醇沉淀 后，得到酯化肝素；取酯化肝素用纯化水溶解后加入氢氧化钠溶液反应，再用酸调节溶液 PH值至7. 0-7. 5用用甲醇沉淀，将沉淀物加入纯化水溶解溶液后加入过氧化氢，在PH值 10. 5-11. 0、温度25-30°C下进行氧化反应，反应后调节溶液PH6. 1?6. 3,再用滤膜过滤并 用乙醇沉淀，将沉淀物脱水干燥得到依诺肝素钠。
9. 根据权利要求8所述的依诺肝素钠的生产方法，其特征在于在步骤4)中，卞索氯铵 固体的加入量是肝素钠重量的1?5倍，优选为2?3倍，更优选为2. 5倍，卞索氯铵溶液的 质量含量为5?15%，所述的季铵盐肝素的干燥温度为47?53°C，干燥时间为60?70h， 所述的无水乙酸钠的甲醇液的加入量为二氯甲烷与氯化苄总体积的1. 2倍；季铵盐肝素与 二氯甲烷的重量体积比为1 :3.5 (g/ml)，季铵盐肝素与氯化苄的重量体积比为1 :1 (g/ml)， 酯化反应时间为24?26h ;酯化肝素与氢氧化钠溶液反应时,酯化肝素与氢氧化钠的质量 比为10 :1。
【文档编号】C08B37/10GK104193849SQ201410398891
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】唐咏群, 黄锡伟, 段艳冰 申请人:南京健友生化制药股份有限公司