一种深层液态发酵生产安络小皮伞胞外多糖的方法
【专利摘要】本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种深层液态发酵生产安络小皮伞胞外多糖的方法。具体的说是一种工业化规模的安络小皮伞胞外多糖的生产方法，该方法是将活化好的安络小皮伞菌种通过接入到种子罐进行扩配，再将扩配好的液体种子接入到特制的产多糖的液态培养基中进行发酵，然后将发酵液进行分离，提取胞外多糖。本发明针对上述现有技术的不足进行研究，在小试和中试继续优化发酵培养基(尤其是碳源)、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了由小试放大到工业化生产中遇到的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10‐20t发酵罐进行产业化生产，并顺利生产出高品质的安络小皮伞多糖，真正实现了连续、自动化、产业化的生产。
【专利说明】一种深层液态发酵生产安络小皮伞胞外多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种深层液态发酵生产安络小皮伞胞外多糖的方法。
【背景技术】
[0002]安络小皮伞，学名为Marasmius androsaceus (L.ex Fr.) Fr.别名鬼毛针、茶褐小皮伞等，属于担子菌纲、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(ThichoLomataceae)、小皮伞属(Marasmius)。生于深山密林、阴冷潮湿、酸性土壤上面的枯枝上，主要分布于我国吉林、湖南、湖北、广东等省。我国民间早有用野生安络小皮伞的根状菌索来治疗骨折疼痛、跌打损伤等。据广东微生物研究所(1975)报道，该所与广州第一制药厂等用人工发酵培养方法，获得安络小皮伞发酵培养物，再将其浓缩制成的“安络痛胶囊”和药酒，经临床验证600例，证明对三叉神经痛、坐骨神经痛、偏头痛、眶上神经痛、面部神经麻痹、面肌痉挛及风湿性关节炎等均有一定的疗效。对中、轻麻疯神经痛、腰肌劳损等也有一定缓解作用，是对人体安全、无毒副作用的镇痛和抗风湿药物。目前用其制成的药品，除“安络痛胶囊”外，还有“安络痛酊”、“安络痛注射液”和“安络解痛片”等。临床和市场效果很好。近年来的研究表明安络小皮伞的营养保健价值也很高，能促进神经组织和纤维结缔组织的炎症消失，改善局部的血流循环和组织营养状况，恢复神经功能。菌内含有的氨基酸、糖类等成分可以作为食品和保健品的添加成分，对人体的免疫力提高和抗衰老有一定的作用。安络小皮伞其它组分的功能还处于正在研究的阶段。
[0003]近年来越来越多的学者开始研究安络小皮伞的药效成分和药理作用，但是目前国内野生的安络小皮伞资源稀少，子实体的人工栽培成功率低且重复性差，固体栽培周期长、污染率高，易受周围环境限制，无法满足日益增长的市场需求。而深层液态发酵技术具有发酵周期短、高产量、污染率低等优点、不受周围环境限制，资源设备利用率高等优点，因而受到越来越多的研究者们的青睐。国内外也有少量大专院校的研究者对安络小皮伞的深层发酵进行过研究，但往往其主要侧重点是如何获取更高的生物量，只有少部分研究者关注安络小皮伞的功效成分多糖的研究，但主要是通过菌丝体提取获取多糖，作为发酵的副产物发酵滤液大都作为废液直接排掉，浪费了大量的宝贵资源，并且增加了环保压力，提升了排污成本。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决工业化规模生产安络小皮伞多糖的技术瓶颈，采用液态发酵生产安络小皮伞多糖克服了固态发酵周期长、投资大、受季节限制、难以产业化等弊端，采用此发明能够连续、自动化、产业化的生产出高品质的安络小皮伞多糖。
[0005]为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行:
[0006]本发明的产业化深层液态发酵生产安络小皮伞胞外多糖的方法包括下述步骤:
[0007]—种制备安络小皮伞发酵液的方法,将安络小皮伞种子培养液接入灭菌后的发酵培养基，接种量为10~20%，通风比为1:0.5 - 1.5vvm，罐压0.02~0.05Mpa，在22~30°C下发酵培养4 - 6天，得到安络小皮伞发酵液；其中所述的发酵培养基配方为:葡萄糖1-3%、淀粉1-3%、酵母粉0.2-1 %、玉米浆0.5-2%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、七水硫酸镁0.1-0.5%、消泡剂 0.01-0.05%、20000u/ml 的耐高温 α -淀粉酶 0.001-0.007% (v/v), if节pH值6.5-7.5。上述培养基组成中除淀粉酶以外的，均表示g/100ml。
[0008]所述的消泡剂可以为植物油(豆油、菜籽油)类、有机醚类等物质。
[0009]其中，所述的安络小皮伞种子培养液优选通过以下方法制备得到:
[0010]I) 一级种子培养:将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为
0.1~2%，通风比为1:0.5-L 5vvm，罐压0.02~0.05Mpa，在22~30°C下培养5~6天，得到安络小皮伞一级种子培养液；
[0011]2) 二级种子培养:将步骤I)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为10~20%，通风比为1:0.5 - 1.5vvm，罐压0.02~0.05Mpa，在22~30°C下培养3~4天，得到所述的安络小皮伞种子培养液。
[0012]所述的液体种子培养基配方优选为:葡萄糖2-4%、蚕蛹粉0.1-0.5%、黄豆饼粉1-3 %、磷酸二氢钾0.1-0.5 %、七水硫酸镁0.1-0.5 %、消泡剂0.01-0.05%，调节pH值
6.5-7.5。上述培养基组成中的均表示g/100ml。
[0013]所述的发酵培养终点为:菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低并略有波动，还原糖控制0.3% (g/100g)以下；镜检菌丝细碎,无杂菌污染。
[0014]一种安络小皮伞胞外多糖提取的方法，该方法包括下述步骤:
[0015]I)分离:将权利要求1所得的安络小皮伞发酵培养液经分离，得到安络小皮伞上清液；
[0016]2)浓缩:将步骤I)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1.25~
1.40的浓缩浆；
[0017]3)醇沉、烘干:加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度约65-80% (v/v)，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75°C，真空度不低于
0.085MPa ;烘干至干燥物水分含量为3~8% (g/100g)，即得胞外糖。
[0018]其中，所述步骤I)中所述的分离采用卧螺离心机进行，转速控制在2500 - 3500r/min0
[0019]所述步骤2)中所采用的二级浓缩为:一级采用1- 3t双效蒸发器浓缩，将发酵液浓缩到比重为1.15 - 1.20(50°C热测)，二级采用1- 3t单效浓缩器浓缩，即将比重为
1.1 - 1.20(50°C热测)的浓缩液继续浓缩到比重为1.25~1.40(50°C热测)的浓缩浆；浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa。
[0020]本发明中醇沉是采用I _3t醇沉罐，醇沉次数越多，胞外糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本发明提取的胞外糖含量在20 - 50%。
[0021]本发明具有以下几个突出的优点:
[0022]本发明针对上述现有技术的不足进行研究，在小试和中试继续优化发酵培养基(尤其是碳源)、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了由小试放大到工业化生产中遇到的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10 - 20t发酵罐进行产业化生产，并顺利生产出高品质的安络小皮伞多糖,真正实现了连续、自动化、产业化的生产。
[0023]为了提高目的产物胞外多糖的产量，本发明在发酵培养基的碳源进行了优化和组合:采用短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方。发酵前期以生长菌丝体，提高生物含量为主，因此培养基中添加了菌体优先选用的葡萄糖碳源，迅速增殖；发酵后期要提高目的产物的含量，因此碳源提供菌体相对利用较慢的淀粉，并在培养基中添加适量淀粉酶，控制菌体数量在合适规模，并不断产生代谢物胞外糖。
[0024]为了提供胞外糖的产量，本发明优化发酵培养基的配方，针对碳源部分采用了复合组方，既保证了前期菌体的生物量，又保证后期代谢产物的产量。
[0025]采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在20 - 50%。
【具体实施方式】
[0026]以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0027]以下实施例使用的安络小皮伞购买于中国科学院微生物研究所普通微生物中心，菌种编码CGMCC N05.0152。以此株菌为例，详细说明本发明的具体方案。但是本发明方法通用于所有的安络小皮伞，并不仅限于该菌株。
[0028]实施例1
[0029]本发明产业化深层液态发酵生产安络小皮伞胞外多糖的方法按下述步骤进行:
[0030]1、安络小皮伞发酵液的制备:将活化好的安络小皮伞摇瓶菌株按接种量1%接种于种子培养基(300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0.3%、黄豆饼粉1.8%、磷酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0.15%、消泡剂0.02 %，调节pH值7.0，通风比为1: 1.0vvm,罐压0.03Mpa, 26~28°C振荡培养5天即得安络小皮伞一级种子液；将一级种子液按接种量15%接入二级种子培养基(3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉
0.3 %、黄豆饼粉1.8 %、磷酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0.15%、消泡剂0.02 %，调节pH值
7.0，通风比为1:1.0vvm，罐压0.03Mpa，26~28°C培养3天即得安络小皮伞二级种子液；将二级种子液按接种量18%接入发酵培养基(7500L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2%、淀粉2%、酵母粉0.5%、玉米浆1.5%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.2%、消泡剂豆油
0.03%、耐高温α -淀粉酶(枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0.002% (v/v)，调节pH值7.0 ;通风比为1:0.5vvm，罐压0.03Mpa, 26~28°C培养4天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低0.2%并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。即得安络小皮伞发酵液 8850Kg。
[0031]2、安络小皮伞发酵液分尚:将上述安络小皮伞发酵液8850Kg通过卧螺尚心机进行分离，转速控制在3000r/min，分离时间在2h，得到安络小皮伞滤液7524Kg和1105Kg的湿菌丝体(含水量为80% )，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵安络小皮伞菌粉。
[0032]4、低温浓缩:将步骤2所得的安络小皮伞滤液7524Kg真空转移至3t双效蒸发器，在真空度为-0.085MPa，浓缩温度为65°C条件下浓缩至比重为1.20(50°C热测)浓缩液，再将浓缩液真空转移至1.5t单效球型浓缩器，在真空度为0.09MPa，浓缩温度为60°C条件下继续浓缩至比重为1.30(50°C热测)的浓缩浆280kg。
[0033]5、醇沉、烘干:向盛有280kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量IlOOkg的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度72% (v/v)，静置12h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干12h得胞外糖132.8kg。检测水分含量为4%，多糖含量为30%。
[0034]实施例2
[0035]1、安络小皮伞发酵液的制备:将活化好的安络小皮伞摇瓶菌株按接种量1.5 %接种于种子培养基(300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0.3%、黄豆饼粉1.8%、磷酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0.15%、消泡剂0.02%，调节pH值7.0，通风比为1:
1.0vvm，罐压0.03Mpa, 25~27°C振荡培养6天即得安络小皮伞一级种子液；将一级种子液按接种量15%接入二级种子培养基(3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0.3 %、黄豆饼粉1.8 %、磷酸二氢钾0.3 %、七水硫酸镁0.15 %、消泡剂0.02 %，调节pH值7.0，通风比为1:1.0vvm，罐压0.03Mpa，25~27°C培养3天即得安络小皮伞二级种子液；将二级种子液按接种量18%接入发酵培养基(15000L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2 %、淀粉2 %、酵母粉0.7%、玉米浆1.5%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.2%、消泡剂菜籽油0.03%、耐高温α -淀粉酶(枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0.002% (v/V)，调节pH值7.0 ;通风比为1:0.5vvm,罐压0.04Mpa, 25~27°C培养4天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低0.2%并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，既得安络小皮伞发酵液17700Kg。
[0036]2、安络小皮伞发酵液的分尚:将上述安络小皮伞发酵液17700Kg通过卧螺尚心机进行分离，得到安络小皮伞滤液15540Kg和1800Kg的湿菌丝体(含水量为75% )，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵安络小皮伞菌粉。具体工艺条件是:转速控制在3200r/min，分离时间在4.5h。
[0037]4、低温浓缩:将步骤2所得的安络小皮伞滤液15540Kg真空转移至3t双效蒸发器，在真空度为-0.09MPa，浓缩温度为63°C条件下浓缩至比重为1.18(50°C热测)浓缩液，再将浓缩液真空转移至1.5t单效球型浓缩器，在真空度为0.09MPa，浓缩温度为65°C条件下浓缩至比重为1.35(50°C热测)的浓缩浆570kg。
[0038]5、醇沉、烘干:向盛有570kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量2300kg的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度71% (v/v)，静置10h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度65°C，真空度0.09MPa ;烘干18h得胞外糖260kg。检测水分含量为4.5%，多糖含量为32%。
[0039]实施例3
[0040]为更好验证本发明中短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方在产业化生产安络小皮伞多糖的优越性，又做了几个对比试验。试验中只调整了液体发酵培养基中碳源葡萄糖或(和)淀粉的用量，对比例I中不含有淀粉，葡萄糖浓度为1.5% ;对比例2中不含有葡萄糖，淀粉浓度为2.5%，对比例3中葡萄糖含量为2.5%，淀粉含量为0.5% ;其余条件均同实施例1，试验结果见表1:
[0041]表1
[0042]
【权利要求】
1.一种制备安络小皮伞发酵液的方法，其特征在于将安络小皮伞种子培养液接入灭菌后的发酵培养基，接种量为10~20% (v/v)，通风比为1:0.5 - 1.5vvm，罐压0.02~0.05Mpa,在22~30°C下发酵培养3~5天，得到安络小皮伞发酵液；其中所述的发酵培养基配方为:葡萄糖1_3%、淀粉1-3%、酵母粉0.2-1%、玉米浆0.5-2%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、七水硫酸镁0.1-0.5%、消泡剂0.01-0.05%,20000u/ml的耐高温α -淀粉酶0.001-0.007% (v/v)，调节 pH 值 6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的制备安络小皮伞发酵液的方法，其特征在于所述的安络小皮伞种子培养液通过以下方法制备得到: 1)一级种子培养:将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为0.1~2% (v/v)，通风比为I:0.5 -1.5vvm，罐压0.02~0.05Mpa，在22~30°C下培养5~6天，得到安络小皮伞一级种子培养液； 2)二级种子培养:将步骤I)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为10~20% (v/v)，通风比为1:0.5 -1.5vvm，罐压0.02~0.05Mpa，在22~30°C下培养3~4天，得到所述的安络小皮伞种子培养液。
3.根据权利要求2所述的一种制备安络小皮伞发酵液方法，其特征在于所述的液体种子培养基配方为:葡萄糖2-4 %、蚕蛹粉0.1-0.5%、黄豆饼粉1_3%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、七水硫酸镁 0.1-0.5%、消泡剂 0.01-0.05%，调节 pH 值 6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的一种制备安络小皮伞发酵液方法，其特征在于所述的发酵培养终点为:菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低并略有波动，还原糖控制0.3%以下；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。
5.一种安络小皮伞胞外多糖提取的方法，其特征在于该方法包括下述步骤: 1)分离:将权利要求1所得的安络小皮伞发酵培养液经分离，得到安络小皮伞上清液； 2)浓缩:将步骤I)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1.25~1.40的浓缩浆； 3)醇沉、烘干:加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度约65-80 % (v/v)，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50 - 75 °C，真空度不低于.0.085MPa ;烘干至干燥物水分含量为3~8% (g/100g)，即得胞外糖。
6.根据权利要求5所述的安络小皮伞胞外糖的方法，其特征在于所述步骤I)中所述的分离米用卧螺离心机进行，转速控制在2500 - 3500r/min。
7.根据权利要求1所述的安络小皮伞胞外糖的方法，其特征在于所述步骤2)中所采用的二级浓缩为:一级采用双效蒸发器浓缩，将发酵液浓缩到比重为1.15 - 1.20，二级采用单效浓缩器浓缩，即将比重为1.1 -1.20的浓缩液继续浓缩到比重为1.25~1.40的浓缩浆；浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa。
【文档编号】C08B37/00GK104073531SQ201410335964
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王文风, 徐国华, 徐玲, 王英燕, 张芙蓉, 杨亚威, 高岩 申请人:江苏神华药业有限公司