一种超顺磁性脂-pla靶向纳米颗粒及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒，该靶向纳米颗粒由PLA-磷脂-PEG纳米颗粒和叶酸配体交联构成；PLA-磷脂-PEG纳米颗粒由聚乳酸包裹Fe3O4处于中心作为PLA内核，并以磷脂以单层环绕于该PLA内核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于上述单层磷脂中作为靶向外壳形成；叶酸配体由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺以及羟基琥珀酰亚胺按一定摩尔比室温反应后与叶酸交联形成。其制备方法包括PLA-磷脂-PEG纳米颗粒、叶酸配体制备和交联成品制备。本发明颗粒交联上叶酸靶向后能够在靶向识别叶酸受体过表达的肿瘤细胞，通过磁铁吸附分离肿瘤细胞。
【专利说明】—种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米医学领域，特别是涉及一种超顺磁性纳米颗粒，具体地说是一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒及制备方法。
【背景技术】
[0002]随着纳米技术的快速进步，超顺磁性纳米颗粒在分离细胞方面获得了快速的发展，尤其是纳米颗粒因其具有的超顺磁性及表面可修饰性使其作为细胞磁性分离介质具有独特的优势，通过在其表面固定生物活性分子形成生物功能化磁纳米颗粒，使其仅对特定细胞有亲和力，在外磁场作用下，可直接从原始样品中特异性分离所需要的细胞。该方法可省去离心、过滤等复杂操作，这给目标细胞的分离带来了革命性的发展。科学发现，人类的一些恶性肿瘤细胞具有对叶酸受体的高表达。如果能制备一种具有叶酸配体修饰的靶向超顺磁性纳米颗粒就能很好的分离肿瘤细胞。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状，而提供具有工艺简单、制造成本低，肿瘤细胞分离好的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒及制备方法。其中--聚乳酸简称PLA、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基简称DSPE-PEG-C00HU-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺简称EDC、羟基琥珀酰亚胺简称NHS。
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒，该祀向纳米颗粒由PLA-磷脂-PEG纳米颗粒和叶酸配体交联构成；PLA-磷脂-PEG纳米颗粒由聚乳酸包裹Fe3O4处于中心作为PLA内核，并以磷脂以单层环绕于该PLA内核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于上述单层磷脂中作为靶向外壳形成；叶酸配体由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亚胺以及羟基琥珀酰亚胺按一定摩尔比室温反应后与叶酸交联形成。
[0005]一种的超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤:
a)、在四颈烧瓶中，先加入30mL去离子水，通N2IO min，快速称取6.7573 g FeCl3OT2O和3.4753 g FeS047H20，加入到反应瓶中，搅拌溶解，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加氨水，并在温度20°C至30°C条件下，机械剧烈搅拌，至ρΗ9、Η11，共滴加氨水24 mL,溶液颜色由红棕色逐渐变为黑色，再在室温下搅拌25 min至35 min后，升温至55°C至65°C，反应25 min至35 min，冷却，用磁铁分离，倒掉上清液，并用去离子水每次70 mL洗三次，并用超声波分散，再用乙醇每次70 mL洗三次，最后加入45 mL四甲基氢氧化铵溶解，然后加入二次蒸懼水至250 mL,用砂芯漏斗过滤从而获得磁流体；
b)、取聚乳酸溶于乙氰中，然后加入ImL步骤a中的磁流体，制得含有磁流体的PLA乙氰溶液；
C)、取0.06mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、0.24mg大豆卵磷脂，加入至3ml的乙醇水溶液中，加热搅拌至55°C至70°C，制得混合乙醇水溶液； d)、将Iml步骤b中制得的PLA乙氰溶液逐滴加至3ml步骤c制得的混合乙醇水溶液中，在一定温度的条件下连续搅拌I小时至3小时，期间允许溶剂挥发，即得的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒；
e)、将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺按摩尔比1: 1:2在室温反应一段时间后，加入叶酸，获得叶酸配体；
f)、交步骤d中制得的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒与步骤e中获得的叶酸配体交联，超滤水洗三次，即制得本产品。
[0006]上述的步骤a中恒压滴液漏斗缓慢滴加氨水时，在温度25 0C条件下，机械剧烈搅拌至pHIO。
[0007]上述的步骤a中再在室温下搅拌30min后，升温至60°C,反应30min,冷却。
[0008]上述的步骤b中PLA乙氰溶液中的PLA浓度为2mg/mL。
[0009]上述的步骤c中乙醇水溶液的浓度为4%，加热搅拌至65°C。
[0010]上述的步骤d中的温度条件为65°C，连续搅拌时间为2小时。
[0011]上述的步骤e中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺在室温反应15min后，加入叶酸。
[0012]上述的步骤f中PLA-磷脂-PEG纳米颗粒与叶酸配体的摩尔比为1:1。
[0013]与现有技术相比，本发明具有以下特点:
1、PLA、磷脂有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径排出体外。
[0014]2、同时颗粒交联上叶酸靶向后能够在靶向识别叶酸受体过表达的肿瘤细胞，通过磁铁吸附分离肿瘤细胞。
[0015]3、该颗粒制造成本低，便于操作推广。
【具体实施方式】
[0016]以下结合实施例，对本发明作进一步详细描述。
[0017]本发明的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒，该靶向纳米颗粒由PLA-磷脂-PEG纳米颗粒和叶酸配体交联构成；PLA-磷脂-PEG纳米颗粒由聚乳酸包裹Fe3O4处于中心作为PLA内核，并以磷脂以单层环绕于该PLA内核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于所述的单层磷脂中作为靶向外壳形成；叶酸配体由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺以及羟基琥珀酰亚胺按一定摩尔比室温反应后与叶酸交联形成。
[0018]本发明的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤:
a)、在四颈烧瓶中，先加入30 mL去离子水，通N2IO min，快速称取6.7573 g FeCl3OT2O
和3.4753 g FeS047H20，加入到反应瓶中，搅拌溶解，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加氨水，并在温度20°C至30°C条件下，机械剧烈搅拌，至ρΗ9、Η11，共滴加氨水24 mL,溶液颜色由红棕色逐渐变为黑色，再在室温下搅拌25 min至35 min后，升温至55°C至65°C，反应25 min至35 min，冷却，用磁铁分离，倒掉上清液，并用去离子水每次70 mL洗三次，并用超声波分散，再用乙醇每次70 mL洗三次，最后加入45 mL四甲基氢氧化铵溶解，然后加入二次蒸馏水至250 mL,用砂芯漏斗过滤从而获得磁流体； b)、取聚乳酸溶于乙氰中，然后加入ImL步骤a中的磁流体，制得含有磁流体的PLA乙氰溶液；
C)、取0.06mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、0.24mg大豆卵磷脂，加入至3ml的乙醇水溶液中，加热搅拌至55°C至70°C，制得混合乙醇水溶液；
d)、将Iml步骤b中制得的PLA乙氰溶液逐滴加至3ml步骤c制得的混合乙醇水溶液中，在一定温度的条件下连续搅拌I小时至3小时，期间允许溶剂挥发，即得的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒；
e)、将DSPE-PEG-COOH、EDC、NHS按摩尔比1:1:2在室温反应一段时间后，加入叶酸，获得叶酸配体；
f)、交步骤d中制得的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒与步骤e中获得的叶酸配体交联，超滤水洗三次，即制得本产品。以DelsaTM Nano C粒度分布测定仪进行检测，平均粒径为在50-300nm 之间。
[0019]上述的步骤a中恒压滴液漏斗缓慢滴加氨水时，在温度25 0C条件下，机械剧烈搅拌至pHIO。
[0020]上述的步骤a中再在室温下搅拌30min后，升温至60°C,反应30min,冷却。
[0021]上述的步骤b中PLA乙氰溶液中的PLA浓度为2mg/mL。
[0022]上述的步骤c中乙醇水溶液的浓度为4%，加热搅拌至65°C。
[0023]上述的步骤d中的温度条件为65°C，连续搅拌时间为2小时。
[0024]上述的步骤e中DSPE-PEG-COOH、EDC、NHS在室温反应15min后，加入叶酸。
[0025]上述的步骤f中PLA-磷脂-PEG纳米颗粒与叶酸配体的摩尔比为1:1。
[0026]叶酸受体肿瘤靶向作用的体外验证
将叶酸受体过表达的MCF-7细胞接种于培养瓶，待细胞生长至对数生长期，弃去培养基，用PBS缓冲液洗2-3遍，用胰酶消化液消化分散细胞，离心收集数目达IO4个/m L的所有细胞置于离心管内。加入100 μ L超顺磁性脂-PLA叶酸靶向纳米颗粒分散液加入到细胞悬浮液中，37°C共孵育30 m in，将离心管置于磁分离器中进行磁分离，分离细胞数达到初始加入量的91%。而叶酸受体表达量低的对照细胞A549经过同样的操作,分离细胞数量仅为初始加入量的10%。可见超顺磁性脂-PLA叶酸祀向纳米颗粒特异性分离叶酸受体过表达的肿瘤细胞。
【权利要求】
1.一种超顺磁性脂-PLA祀向纳米颗粒,其特征是:所述的祀向纳米颗粒由PLA-磷脂-PEG纳米颗粒和叶酸配体交联构成；所述的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒由聚乳酸包裹Fe3O4处于中心作为PLA内核，并以磷脂以单层环绕于该PLA内核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于所述的单层磷脂中作为靶向外壳形成；所述的叶酸配体由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺以及羟基琥珀酰亚胺按一定摩尔比室温反应后与叶酸交联形成。
2.—种权利要求1所述的超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:该方法包括以下步骤: a)、在四颈烧瓶中，先加入30mL去离子水，通N2IO min，快速称取6.7573 g FeCl3*6H20和3.4753 g FeS04*7H20，加入到反应瓶中，搅拌溶解，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加氨水，并在温度20°C至30°C条件下，机械剧烈搅拌，至ρΗ9、Η11，共滴加氨水24 mL,溶液颜色由红棕色逐渐变为黑色，再在室温下搅拌25 min至35 min后，升温至55°C至65°C，反应25 min至35 min，冷却，用磁铁分离，倒掉上清液，并用去离子水每次70 mL洗三次，并用超声波分散，再用乙醇每次70 mL洗三次，最后加入45 mL四甲基氢氧化铵溶解，然后加入二次蒸懼水至250 mL,用砂芯漏斗过滤从而获得磁流体； b)、取聚乳酸溶于乙氰中，然后加入ImL步骤a中的磁流体，制得含有磁流体的PLA乙氰溶液； C)、取0.06mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、0.24mg大豆卵磷脂，加入至3ml的乙醇水溶液中，加热搅拌至55°C至70°C，制得混合乙醇水溶液； d)、将Iml步骤b中制得的PLA乙氰溶液逐滴加至3ml步骤c制得的混合乙醇水溶液中，在一定温度的条件下连续搅拌I小时至3小时，期间允许溶剂挥发，即得的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒； e)、将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺按摩尔`比1: 1:2在室温反应一段时间后，加入叶酸，获得叶酸配体； f)、交步骤d中制得的PLA-磷脂-PEG纳米颗粒与步骤e中获得的叶酸配体交联，超滤水洗三次，即制得本产品。
3.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤a中恒压滴液漏斗缓慢滴加氨水时，在温度25 0C条件下，机械剧烈搅拌至ρΗΙΟο
4.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤a中再在室温下搅拌30min后，升温至60°C,反应30min,冷却。
5.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤b中PLA乙氰溶液中的PLA浓度为2mg/mL。
6.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤c中乙醇水溶液的浓度为4%，加热搅拌至65°C。
7.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤d中的温度条件为65°C，连续搅拌时间为2小时。
8.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤e中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺在室温反应15min后，加入叶酸。
9.根据权利要求2所述的一种超顺磁性脂-PLA靶向纳米颗粒的制备方法，其特征是:所述的步骤f中PLA- 磷脂-PEG纳米颗粒与叶酸配体的摩尔比为1:1。
【文档编号】C08J3/24GK103745793SQ201410006311
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】刘 东 申请人:江苏东博生物医药有限公司