可用于治疗诊断学的聚合纳米颗粒的利记博彩app
【专利摘要】描述了用于受控药物递送的基于淀粉的pH-响应性纳米颗粒的合成和表征。通过新的一锅法合成了具有不同的淀粉与MAA摩尔比的聚甲基丙烯酸接枝的淀粉(PMAA-g-St)纳米颗粒，所述一锅法能够同时在水性介质中实现PMAA的接枝和纳米颗粒形成。NMR数据表明，聚山梨醇酯80聚合成接枝聚合物。纳米颗粒是相对球形的，具有狭窄的尺寸分布和多孔的表面形态，且在生理pH范围表现出pH依赖性膨胀。颗粒尺寸和体积相变的量级依赖于PMAA含量和制剂参数，诸如表面活性剂水平、交联剂量和总单体浓度。结果表明，新的pH-响应性纳米颗粒具有对受控药物递送有用的性能。
【专利说明】可用于治疗诊断学的聚合纳米颗粒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及可用于递送治疗剂和/或诊断剂的聚合纳米颗粒。
【背景技术】
[0002] 许多天然的多糖（诸如淀粉和海藻酸盐）存在于食品中或被用作食品成分。淀 粉是在自然界中存在的最丰富的多糖之一。该生物聚合物具有（C 6HltlO5)J]分子式，其中 η的范围为300-1000[1]。淀粉由2种被称作直链淀粉和支链淀粉的聚合物的混合物组成 [1，2]。直链淀粉分子由通过α-1，4缩醛键连接的a-D-吡喃葡萄糖单元组成。支链淀粉 分子大得多且高度支化。所述分子含有α -1，4直链键，且通过α -1，6键支化[1，2]。大多 数在工业中使用的淀粉经常含有20-30%直链淀粉，余量为支链淀粉（70-80% )和诸如脂 质和蛋白的次要组分（小于1 % ) [3]。
[0003] 淀粉会提供独特的优势。淀粉是相对安全的，具有十分适用于体内应用的生物相 容性和生物可降解谱。在胶体系统的情形下，淀粉具有稳定性能，从而使它成为生物分子开 发的有用候选物。淀粉含有许多羟基，所述羟基能够发生醇特有的各种化学反应。这可以 将多种药物、靶向部分、金属螯合剂、荧光探针等与基于淀粉的材料结合。基于淀粉的材料 还可以是非常有成本效益的。尽管具有这些优势，但淀粉作为生物材料和在药物递送应用 中具有有限的应用。天然淀粉由于它的较差机械和化学性能而具有有限的应用；但是，可以 做出各种修饰来改善淀粉的性能和拓宽它的应用。最常见的化学修饰是接枝、氧化、酯化、 醚化和水解。由于淀粉的可生物降解性能和稳定性能与丙烯酸聚合物的PH响应特性的组 合，用基于丙烯酸的单体接枝淀粉可以产生具有潜在药物递送和生物医学应用的材料。
[0004] 已经合成淀粉-黄原胶水凝胶用于通过由三偏磷酸钠交联淀粉和黄原胶进行受 控药物递送[4]。已经使用辐射、光解或催化剂和引发剂如金属离子、过氧化物或过硫酸盐 [5-12]通过不同乙烯基单体的接枝聚合来修饰淀粉[5]。乙烯基单体在淀粉上的接枝通常 通过自由基引发来实现。已经将淀粉接枝共聚物用作水凝胶、絮凝剂、离子交换剂、超级吸 收剂等[13-18]。
[0005] 亲水丙烯酸单体可以形成具有可调节的膨胀动力学的水凝胶，且已经用于药物递 送和其它生物医学应用，诸如改善成骨细胞粘附[19-21]。淀粉的可生物降解性能与基于 丙烯酸的聚合物的PH响应特性的组合可以导致在生物医学和药物递送中具有潜力的受关 注的水凝胶。以前公开的工作已经证实，过硫酸钾能够引发甲基丙烯酸向淀粉上的接枝；但 是，形成大量的同聚物[22]。通过使用过硫酸钾/硫代硫酸钠氧化还原引发系统,Hebeish 等人能够有效地将聚甲基丙烯酸接枝到淀粉上，同时使同聚物形成最小化[6, 7]。
[0006] 在许多应用中，响应于环境刺激（诸如pH)的快速相变是受期望的。但是，大尺寸 的大块水凝胶通常经历缓慢的尺寸变化，因为聚合网络中的构象变化以及溶质和水穿过所 述网络的扩散需要时间。由于响应时间与扩散距离的平方成比例，通过调节水凝胶尺寸可 以控制相变速率[23]。通常，纳米尺寸的聚合物会经历膨胀平衡和微秒级的相变。因此，刺 激响应性纳米颗粒可以潜在地用在刺激响应性药物递送中，且可以因为它们对刺激的极快 响应而充当传感器或微开关。
[0007] 尽管存在关于乙烯基单体的接枝聚合的众多出版物，但关于基于纳米尺寸淀粉 的PH敏感颗粒的开发和表征的公开数据非常有限。Saboktakin等人最近已经描述了聚 甲基丙烯酸向羧甲基淀粉上的接枝以产生本体聚合物[24]。该作者随后使用冷冻干燥法 来生产纳米粉末；但是，他们的方法没有产生纳米颗粒在水性介质中的稳定胶体分散体。 Saboktakin等人还已经描述了聚甲基丙烯酸向作为紫杉醇的递送系统的壳聚糖纳米颗粒 上的接枝[24(a)]。Hirosue等人已经在国际专利公开WO 2010/084060中描述了具有淀粉 骨架的聚合物，在所述淀粉骨架上，在用连接物（诸如2-溴异丁酰基溴）修饰骨架以后通 过原子转移自由基聚合（ATRP)来接枝甲基丙烯酸酯单体。通过乳剂扩散法用所述淀粉聚 合物配制纳米颗粒。
【发明内容】
[0008] 本文描述的发明包括用于合成纳米颗粒的方法。
[0009] 本发明的纳米颗粒包括聚合物骨架，其具有接枝在其上的含有羧基或氨基的聚合 链。在纳米颗粒外表面上存在的聚乙氧基化物部分共价连接以作为纳米颗粒的一部分。 [0010] 本发明的纳米颗粒特别可用作例如治疗剂和/或信号分子的载体。
[0011] 优选地，在"一锅"合成过程中在水溶液中形成本发明的纳米颗粒，其中单体接枝 聚合在骨架聚合物上，并且聚乙氧基化物部分参与所述聚合以共价地合并为纳米颗粒的一 部分。
[0012] 在公开的实施方案中，所述聚合物骨架由淀粉提供，所述单体是甲基丙烯酸 (MAA)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯（DEAEM)，且所述聚乙氧基化部分由聚山梨醇酯80(吐 温? 80)提供。
[0013] 本发明的纳米颗粒特别可用作载体纳米颗粒。所述载体的货物（cargo)或净荷 (playload)可以是治疗剂，诸如药物、信号分子如荧光团（例如荧光素胺）、钆等。
[0014] 可以在纳米颗粒形成之后，向纳米颗粒加载治疗剂。可替换地，且特别是在颗粒货 物包括当在患者中存在时不希望从载体颗粒逐出的信号分子或其它分子的情况下，可以在 纳米颗粒产生之前通过与聚合物共价连接而用所述分子将所述聚合物官能化。在公开的实 例中，将有机螯合剂二亚乙基三胺五乙酸二酸酐（DTPA二酸酐）与纳米颗粒共价连接。在 一个实例中，在纳米颗粒产生之前，将DTPA与多糖聚合物骨架共价连接；在另一个实例中， 将DTPA与已经形成的纳米颗粒连接。将Gd+ 3加载入作为纳米颗粒的一部分预安装的螯合 剂中。
[0015] 在另一个实例中，将已知为水溶性的药物盐酸多柔比星加载入本发明的纳米颗粒 中，并表征体内行为。
[0016] 可能得到具有相对低的多分散性指数（PDI)的本发明的纳米颗粒。提供了单分散 体的一个实例，即其中纳米颗粒具有小于〇. 12的TOI的组合物。
[0017] 本发明的纳米颗粒（其中存在多个羧基或氨基）是pH敏感的，并且提供了解释毫 秒级相变的实例。在一个方面，已经检查了例示的颗粒的尺寸，其依赖于各种加工参数和 pH。在本文中例示了其中平均直径从IOOnm变化至超过300nm的纳米颗粒组合物。
[0018] 在抗癌药物多柔比星的情况下，一个实例示出加载药物的纳米颗粒，其提供在药 物抗性细胞系中的IC50下降，观察到多达19倍的下降。因此，载体纳米颗粒的潜在应用是 用于治疗药物抗性乳腺癌的多柔比星受控递送。
[0019] 加载Gd+3的纳米颗粒可以用在磁共振成像（MRI)造影剂中，并且在本文中例示了 该用途。
[0020] 还通过荧光素胺异构体I例示了具有与所述颗粒共价连接的有机荧光探针的纳 米颗粒的用途。
[0021] 本发明的纳米颗粒具有体外和体内应用。例如，本文描述的体外研究指示癌细胞 对所述颗粒的细胞摄取和针对肝细胞的微小细胞毒性，从而表明可用于药物递送和诊断应 用。
[0022] 例示的颗粒的NMR研究指示，聚山梨醇酯80 (PS80)被聚合入聚甲基丙烯酸接枝的 淀粉纳米颗粒且存在于颗粒表面上。使聚乙氧基化的聚山梨醇酯（已知其表现出表面活性 剂性能）与纳米颗粒共价结合，会向所述载体提供在生物系统中的稳定性。此外，已知PS80 会结合血液中的低密度脂蛋白（LDL)，从而经由LDL受体介导的胞吞转运作用促进纳米颗 粒穿过血脑屏障。共价结合的PS80可以给这样的颗粒赋予有利的脑靶向潜力。除了本文 描述的我们的离体研究以外，成像数据会提供纳米颗粒穿过血脑屏障之能力的证据。
[0023] 因此，本发明的一个实施方案是生产纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
[0024] (a)将聚合物溶解在液体溶液中；
[0025] (b)提供包含羧酸侧基的可聚合单体；
[0026] (C)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，
[0027] ⑷提供乙氧基化分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中：
[0028] 步骤（C)在乙氧基化分子的存在下进行，以使所述乙氧基化分子与所述聚合链共 价连接。
[0029] 所述液体溶液可以包括羟基溶剂诸如水，一种或多种醇，特别是乙醇，或水和醇的 混合物，特别是水和乙醇的混合物。
[0030] 所述聚合物可以是具有0.05-3 (或0. 5-3、或1-3、或2-3)取代度/聚合物单元的 多羟基聚合物，所述单体可以包括烯基，且所述接枝聚合步骤可以在有交联剂的存在下进 行。
[0031] 根据一个实施方案，步骤（C)的单体以交联剂的量的1-20倍（mol/mol)的量存 在。
[0032] 所述聚合步骤可以是在自由基引发剂的存在下进行的自由基接枝聚合过程。所述 引发剂可以基本上不含过渡金属。特定的引发剂是过硫酸盐或其功能等效物。
[0033] 乙氧基化分子的乙氧基化物基团可以用游离羟基封端。所述乙氧基化分子可以包 括烯基，所述烯基发生化学反应以将表面活性剂分子与聚合链共价连接。在一个特定实施 方案中，乙氧基化分子是具有R(C9-C31)_C(0)0-基团的聚乙氧基化脱水山梨糖醇，其中所 述脱水山梨糖醇在所述聚合步骤中通过R(C9-C31)-C(0)0-基团的C-C共价键与第二种聚 合物连接。所述R (C9-C31) -C (0) 0-基团可以含有至少一个C-C不饱和性，其在所述聚合步 骤中反应以形成C-C共价键。
[0034] 可以选择聚合物的量和步骤（C)的单体的量，以产生这样的纳米颗粒：其中聚合 链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是〇. 1-10。
[0035] 所述聚合步骤可以在表面活性剂（通常是阴离子表面活性剂）的存在下进行。
[0036] 实施方案包括：产生用于递送生物试剂的纳米颗粒，其中所述试剂与步骤（a)的 聚合物共价连接。所述聚合物可以是多羟基化聚合物，其中所述试剂通过其羟基氢原子的 置换而与所述聚合物共价连接。所述试剂可以是能够络合金属的有机部分，且所述方法可 以包括形成金属-有机部分络合物。可以选择金属，以提供在磁共振成像中的信号，例如， 可以是Gd+ 3。
[0037] 可以将步骤（c)的单体的量选择为足够高的，以使在pH 7. 4和IOmM的离子强度 测量的所产生的纳米颗粒的水溶液的ζ电位的绝对值为至少15mV。
[0038] 通过将所述试剂和从本发明的方法得到的纳米颗粒分散在液体介质中以将所述 试剂并入所述纳米颗粒，可以产生用于递送生物试剂的纳米颗粒。
[0039] 通过共价连接至从本发明的方法产生的纳米颗粒和将所述试剂共价连接至所述 纳米颗粒的聚合链的羧酸基团，可以产生用于递送生物试剂的纳米颗粒。
[0040] 根据一个实施方案，本发明是产生载体纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步 骤：
[0041] (i)将聚合物溶解在水溶液中；
[0042] (ii)提供包含羧酸侧基的可聚合单体；
[0043] (iii)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，
[0044] (iv)提供聚乙氧基化分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中：
[0045] 聚合步骤（iii)在聚乙氧基化分子的存在下进行，以将所述聚乙氧基化分子与形 成的链共价连接，且聚合的产物形成所述纳米颗粒，其中聚乙氧基化部分在所述纳米颗粒 的外部上。
[0046] 本发明包括纳米颗粒，其包含：(a)第一聚合物；(b)与所述第一聚合物接枝的第 二聚合物；和（C)与所述第二聚合物共价结合的聚乙氧基化部分。
[0047] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒的第二聚合物可以包括聚合的乙烯基，所述第 二聚合物的骨架的每2个碳具有约1个羧基。所述第二聚合物可以是聚烯基聚合物。所述 聚烯基聚合物可以是聚丙烯酸。根据一个特定实施方案，所述聚丙烯酸是聚甲基丙烯酸。
[0048] 所述聚乙氧基化部分可以是具有R(C9-C31)_C(0)0-基团的脱水山梨糖醇，其中 所述脱水山梨糖醇通过R-基团的C-C共价键与第二聚合物连接。
[0049] 所述纳米颗粒的第一聚合物可以包括多羟基聚合物。
[0050] 所述第二聚合物可以是交联的。
[0051] 实施方案包括含有多个纳米颗粒的组合物，组合物可以包括药学活性剂。这样的 试剂可以例如吸附至纳米颗粒。
[0052] 组合物可以包括纳米颗粒和信号分子。所述信号分子可以是被有机部分螯合的金 属，其中所述部分与纳米颗粒共价结合。有机部分可以与所述第一聚合物共价结合。
[0053] 所述信号分子可以与所述纳米颗粒共价结合，优选地与羧酸侧基共价连接。信号 分子的一个实例是荧光团。
[0054] 含有纳米颗粒的组合物可以进一步包括药学活性剂。
[0055] -个实施方案包括这样的纳米颗粒，其含有：（I)第一聚合物，其包含多糖；（II) 第二交联聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的聚甲基丙烯酸；和（III)聚山梨醇酯，其 包含与所述第二聚合物共价结合的（C9-C31) R-C (O) O-基团，所述共价结合通过所述第二 聚合物的碳骨架与所述R基团之间的C-C键实现。
[0056] 纳米颗粒的（C9-C31)R-C(O)O-基团可以是_(C17)R-C(O)O-,其中R是直链烷 基。所述聚山梨醇酯可以包括基团-O(CH 2CH2O)w-C(O) (C17)R、HO (CH2CH2O) x-、-HO (CH2CH2O) y-和-HO (CH2CH2O) z-，其中w+x+y+z = 20。所述多糖的分子量可以是约2, 600至约4, 500Da。
[0057] 所述多糖的单体单元与所述聚甲基丙烯酸的单体甲基丙烯酸酯单元的摩尔比可 以是在0.2-8. 0之间。
[0058] 所述聚山梨醇酯与所述聚甲基丙烯酸的单体甲基丙烯酸酯单元的摩尔比可以是 在 0.002-0. 03 之间。
[0059] 本发明的一个实施方案是生产纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：
[0060] (a)将聚合物溶解在液体溶液中；
[0061] (b)提供包含烧基氣基烧基醋侧基的可聚合单体；
[0062] (C)提供交联剂；和
[0063] (d)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，以形成所述纳米颗粒。
[0064] 所述聚合物可以是具有0. 05-3取代度/聚合物单元的多羟基聚合物，所述单体可 以包括烯基，且所述接枝聚合步骤可以在交联剂的存在下进行。所述多羟基聚合物可以具 有1-3取代度/聚合物单元。
[0065] 所述可聚合单体可以是甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，例如，甲基丙烯酸二乙基 氨基乙酯。
[0066] 所述交联剂可以是乙二醇二甲基丙烯酸酯。
[0067] 步骤（d)的单体可以以交联剂的量的1-200倍（mol/mol)的量存在。
[0068] 可以选择聚合物的量和步骤（C)的单体的量，以产生这样的纳米颗粒：其中聚合 链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是〇. 05-20,例如，2-4。
[0069] 聚山梨醇酯可以存在于步骤（d)中。
[0070] 所述可聚合单体可以以所述聚山梨醇酯的量的5-50倍（mol/mol)、或约10-40、或 约15-35、或约20-30 (mol/mol)的量存在。
[0071] 非离子稳定剂（例如，聚乙烯吡咯烷酮）可以存在于步骤（d)中。
[0072] 本发明包括纳米颗粒，其含有：⑴第一聚合物，其包含多糖；和（ii)第二交联聚 合物，其包含与所述第一聚合物接枝的甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，其中所述第二聚合 物是交联的。
[0073] 所述第二聚合物可以是聚合的甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯。
[0074] 所述第二聚合物可以包括聚合的乙烯基，所述第二聚合物的骨架的每2个碳具有 约1个羧基。所述多糖可以是淀粉。可以产生这样的纳米颗粒：当将它们的环境溶液的PH 从约4变为约7. 4时，其表现出500-1500倍的增加的体积变化，或当将它们的环境溶液的 pH从约4变为约7. 4时，则呈现约600至1400倍，或约700至约1300倍，或约500至约 1300倍，或约400至1100倍，或约700至1100倍，或约800倍，或约900倍，或约1000倍， 或约1100倍。
[0075] 附图和表格简述
[0076] 图1显示了最大化学计量为1的多柔比星和纳米颗粒的羧酸基团之间的相互作用 的图解数据。（A)在不同pH的缓冲液中滴定8. 5mM多柔比星的空白示差焓曲线。（B)在不 同pH的缓冲液中将8. 5mM多柔比星滴定进0. lmg/ml PMAA-g-St-PS80纳米颗粒中的示差 焓曲线。通过加入NaCl，将离子强度保持恒定在0. 15M。
[0077] 图 2 显示了（A)淀粉、（B)PMAA-PS 80 和（C)PMAA-PS 80-g-St 的 FTIR 光谱。指 定主峰,并在文本中解释。
[0078] 图 3 显示了在 0· 05M NaOD 中的 A)PS 80、B)淀粉、C)PMAA-PS80、D) PMAA-PS80-g-St-2、E)PS80、F)淀粉、G)DTPA、H)St-DTPA、DPMAA-PS 80-g-St 和 J) PMAA-PS 80-g-St-DTPA的1H NMR谱。如在分子路线图上所示的那样指定主峰。
[0079] 图4显示了穿过血脑屏障的来自毛细血管腔的PMAA-g-St-PS80-FITC外渗。 PMA-PS 80-g-St纳米颗粒的脑分布和积累的定性和定量结果。全脑的离体近红外荧光图 像。（A)与未注射纳米颗粒的正常脑相比，静脉内（iv)注射纳米颗粒以后随时间变化的脑 中相对荧光强度的比率。将数据表示为平均值土标准差（η = 4)。（B)静脉内施用盐水 (左）、PMAA-PS 80-g-St (中）和PMAA-PS 80-g-St (右）以后45分钟，灌注小鼠脑的荧光 显微术图像。对于用PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒处理的样品而言，可以在脑毛细血管的血 管周围区域中检测到颗粒。
[0080] 图5的示意图解释了三元共聚物合成的反应路线图中的不同步骤。
[0081] 图 6 显示了 ：⑷在 0· 15M PBS(pH = 7. 4)中的 PMAA-g-St-2 的 TEM 图像。将纳 米颗粒用钥酸铵染色，并在碳包被的网格上干燥。（B)在0. 15M pH 7. 4PBS中的纳米颗粒的 强度加权流体动力学直径。所述颗粒表现出高斯分布，且是相对单分散的。
[0082] 图7显示了 PDEAEM-g-St-2纳米颗粒的TEM图像。
[0083] 图8显示了 ：⑷对于0. 15M PBS中MAA/St的不同进料摩尔比，纳米颗粒的相对 直径相对于pH的图。D7.4和D 4分别是在pH 7. 4和4的颗粒直径。（B)对于不同MAA/St摩 尔比的颗粒，pH对表面电荷的影响。使用NaCl将离子强度保持恒定在10mM。数据点代表 3个独立测量结果的平均值土标准差。
[0084] 图9显示了 ： (A)电位测定滴定曲线。空三角形代表PMAA-g-St-2胶乳分散体的未 校正的电位测定滴定曲线。固体含量=〇· 104重量％，Cs= 0· 05N NaCl，[NaOH] = 0· 1N， [HC1] =0. IN。实心圆圈代表校正后的滴定曲线。空心圆圈显示了空白滴定曲线。箭头代 表当量点。使用当量点来计算不同纳米颗粒批次中的MA含量。（B)表观解离常数（pK a) 作为不同淀粉纳米颗粒的电离程度（α)和MAA含量的函数的变化。
[0085] 图10显示了在注射之间使用30s的稳定时间的正向和反向电位测定滴定。（A) PMAA，（B)PMAA-g-St-2,（C)PMAA-g-St-4。仅在具有高淀粉含量的纳米颗粒的情况下，观察 正向和反向滴定之间的延迟时间。
[0086] 图11显示了表观解离常数（PKa)作为不同淀粉纳米颗粒的电离程度（α)和MA 含量的函数的变化。
[0087] 图12显示了（A) SDS、（B)PS 80、（C)总单体浓度和⑶交联剂摩尔比对颗粒尺寸 和pH敏感性的影响。实心正方形代表颗粒尺寸，实心三角形代表相对颗粒直径。数据点代 表3个独立测量结果的平均值土标准差。
[0088] 图13显示了（A)在0· 15M磷酸盐缓冲液（pH 7. 4)中加载有多柔比星（LC = 33% ) 的PMA-PS 80-g-St纳米颗粒的数目加权高斯分布，和（B)加载多柔比星的纳米颗粒（LC =33% )的透射电子显微照片（TEM)。
[0089] 图14显示了以下物质的XRD谱：(A)天然形式的多柔比星，（B)PMAA-PS 80-g-St 纳米颗粒，（C)加载多柔比星的纳米颗粒（LC = 50% )，和（D)在室温贮存6个月以后的加 载多柔比星的纳米颗粒（LC = 50% )。对于多柔比星，在衍射图中看到指示结晶相在天然 形式中存在的明显峰，而纳米颗粒显示典型的无定形模式。加载多柔比星的纳米颗粒的衍 射图中的峰的缺失指示出结晶的多柔比星向无定形多柔比星的相转化。
[0090] 图15显示了最大化学计量为1的多柔比星和纳米颗粒的羧酸基团之间的相互作 用的图解数据。（A)在具有不同NaCl含量的DDIW中滴定8. 5mM多柔比星的空白示差焓 曲线。（B)在不同pH的具有不同NaCl含量的DDIW中将8. 5mM多柔比星滴定进0. lmg/ml PMAAg-St-PS80纳米颗粒中的示差焓曲线。
[0091] 图16显示了来自纳米颗粒的pH依赖性的多柔比星释放。指示了在37°C时pH对 多柔比星释放动力学的影响，所述多柔比星释放自具有50%的药物加载含量的纳米颗粒。 使用游离多柔比星从透析袋的释放作为对照。对于每个缓冲系统，通过加入NaCl将离子强 度保持恒定在〇. 15M。
[0092] 图17显示了㈧在有和没有（对照）用荧光纳米颗粒（NP)孵育4小时的情况下， MDA-MB435/LCC6细胞（野生型（WT)和多药抗性型（MDRl))的荧光显微术图像。将细胞核 用Hoescht 33342染色，并用DAPI滤光片显影，将细胞膜用Vybrant?DiI染色，并用Cy3滤 光片显影，并将纳米颗粒用荧光素胺异构体I标记，并用FITC滤光片显影。每2 μ m从细胞 的最上面和最下面区域做光学切片，从而允许选择大约在细胞核的中点处的图像。（B)用 0. 25mg/ml PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒处理4小时的MDA-MB435/LCC6细胞的TEM显微照 片。给纳米颗粒加载钆离子（金属），并且表现为电子致密沉积物。在左侧图像中用虚线指 示的区域是右侧图像的放大图。
[0093] 图18显示了野生型和药物抗性的人乳腺癌细胞有效地内吞纳米颗粒。 MDA-MB435/LCC6细胞的流式细胞计量术直方图指示孵育时间和温度对颗粒摄取的影响。 以0. 25mg/ml的最终纳米颗粒浓度，将细胞与荧光标记的纳米颗粒一起在37°C孵育。（A) 1?八-]\^435/^(1)背景，（2)1小时孵育，（3)4小时孵育，（4)24小时孵育。（8)]\0^-]\^435/ 评丁（1)背景，（2)4°〇，（3)241：。（〇]\0^-]\^ 435/]\?1?1(1)背景，（2)1小时孵育，（3)4小时孵 育，（4)24 小时孵育。（D)MDA-MB435/MDR1(1)背景，（2)4°C，（3)24°C。使用 488nm 氩离子 激光激发，并在530nm监测发射。
[0094] 图19解释了加载多柔比星的纳米颗粒在表达MDRl的人乳腺癌细胞中表现出显著 更低的IC50值。通过MTT测定确定了 MDA-MB435/LCC6细胞类型对游离多柔比星和加载 多柔比星的纳米颗粒的响应。（A-B)暴露于递增浓度的游离多柔比星和加载多柔比星的纳 米颗粒24小时（A)和48小时（B)以后，MDA-MB435/LCC6/WT(n = 3)细胞的细胞生存力。 (C-D)暴露于递增浓度的游离多柔比星和加载药物的纳米颗粒24小时（C)和48小时（D) 以后，MDA435/LCC6/MDRl(n = 3)细胞的细胞活性。使用没有处理和与空白纳米颗粒一起 孵育的细胞分别作为游离药物和加载药物的纳米颗粒的对照。将细胞活性表达为每个治疗 组相对于对照的百分比。数据点代表为每个实验指定的试验数目的平均值土标准差。
[0095] 图20显示了（A) SA-NP和PF-NP的TEM图像。（B)染料结合的纳米颗粒显示NIR 荧光特征。（C) SA-NP和PF-NP的物理化学性能的总结。颗粒直径是指在5分钟内平均的读 出的数目加权直径。加载效率（LE% )是并入纳米颗粒中的最初加入的药物的比例，而药物 加载含量（LC% )是药物重量相对于纳米颗粒总重量的百分比。将所有值描述为3个独立 试验的平均值土标准差。加载溶液中的Dox的总量是I. 25mg。
[0096] 图21显示了 Balb/c小鼠的冠状T1-加权的（3D-FLASH，TE/TR 3/25毫秒，翻转 角 20° )全身图像，所述 Balb/c 小鼠注射有⑷ Omniscan? (〇· lmmol/kg Gd3+)、（B) PolyGd(0.025mmol/kg Gd3+)和（C)PolyGd_Dox(0.025mmol/Kg Gd3+)。在幻灯片 A 中描绘 了心脏、肝、膀胱。幻灯片B显示了肾和腔静脉。在1/4剂量的Omniscan?、PolyGd和 PolyGd-Dox在延长的时段内产生了高得多的对比。
[0097] 图22显示了脑（左）和血液（右）的荧光强度（相对于基线归一化）的比率；数 据提供了 PMAA-g-St-PS80在脑中的沉积的证据。
[0098] 图23显示了⑷SA-NP和PF-NP的TEM图像。（B) SA-NP和PF-NP的物理化学性 能的总结。颗粒直径表示在5分钟内平均的读出的数目加权直径。加载效率（LE%)是并 入纳米颗粒中的最初加入的药物的比例，而药物加载含量（LC% )是药物重量相对于纳米 颗粒总重量的百分比。将所有值描述为3个独立试验的平均值土标准差。加载溶液中的 Dox的总量是I. 25mg。
[0099] 图24显示了㈧使用锥虫蓝排除测定，空白直链聚合物和纳米颗粒、加载Gd3+的 聚合物和纳米颗粒、以及游离Gd 3+在大鼠肝细胞中的体外细胞毒性。将Gd3+加载入直链聚合 物和纳米颗粒中会显著降低在细胞中的Gd 3+毒性（*与对照相比统计上显著的（p〈0. 05))。 (B)暴露30min、60min、120min或240min的盐水（黑色）、空白聚合物（深灰色）、PolyGd(浅 灰色）和游离Gd 3+(白色）对培养物中的大鼠肝细胞的毒性。"％活"表示排除锥虫蓝的肝 细胞的百分比。显示了 3个试验的平均值和标准差。星号（*)表示存活值相对于对照的显 著差异（P〈〇. 05)。
[0100] 图25显示了暴露30min、60min、120min或240min的盐水（黑色）、空白聚合物（深 灰色）、P〇lyGd(浅灰色）和游离GcT(白色）对培养物中的大鼠肝细胞的毒性。" ％活"表 示排除锥虫蓝的肝细胞的百分比。显示了 3个试验的平均值和标准差。星号（*)表示存活 值相对于对照的显著差异（P〈〇. 05)。
[0101] 图26显示了（A)携带正位乳腺肿瘤模型的小鼠中SA-NP和PF-NP的整个动物实 时生物分布和肿瘤靶向。在静脉内注射之前（基线），然后在纳米颗粒注射以后的不同小时 直到14天，确定纳米颗粒相关的荧光。用箭头指示肿瘤。（B) SA-NP和PF-NP从全身（左） 和肿瘤（右）的时间依赖性的排泄谱。将目标区域的荧光强度记录为平均辐射效率。将数 据表示为平均值土标准差（η = 2X3)。C)
[0102] 图27显示了全身分布的定量MRI : (A)用加载Gd3+的PMAA-g-St聚合物 (0· 025mm〇l/kg Gd+3)注射的 Balb/c 小鼠的 R1 图谱。（B)与基线相比，Omniscan? (0.1mmol/Kg Gd3+)、PolyGd (0.025mmol/Kg Gd3+)和 PolyGd-Dox (0.025mmol/Kg Gd3+)随 时间在左心室血液、肝、膀胱和肾中的弛豫率的变化AR1。与Omniscan?相比，PolyGd和 PolyGd-Dox造成血液弛豫率在延长的时间段中的高得多的增加。将数据表示为3个独立运 行的平均值土标准差。（C) SA-NP和PF-NP的组织分布和肿瘤积累的定量结果。与正常主 要器官和未注射NIR染料结合的纳米颗粒的肿瘤相比，在静脉内注射纳米颗粒以后，主要 器官、肿瘤和血液的相对荧光强度的比率随时间变化。将数据表示为平均值土标准差（η =2X3)。
[0103] 图28显示了 SA-NP和PF-NP的组织分布和肿瘤积累的定量结果。与正常主要器官 和未注射NIR染料结合的纳米颗粒的肿瘤相比，在静脉内注射纳米颗粒以后，主要器官、肿 瘤和血液的相对荧光强度的比率随时间变化。将数据表示为平均值土标准差（η = 2X3)。
[0104] 图29显示了 PolyGcKO. 025mmol/kg Gd3+)在荷瘤Balb/c小鼠中的生物分布、消除 和肿瘤积累。使用ICP-AES确定Gd3+含量。将数据表示为3个独立运行的平均值土标准 差。
[0105] 图30是并入纳米颗粒的聚山梨醇酯80(PS80)的示意图。PS80能够结合Apo-E， 所述Apo-E转而结合脑微血管中的LDL受体，从而实现纳米颗粒的胞吞转运作用。NMR数据 指示PS80聚合成St-g-PMAA纳米颗粒和直链聚合物。共价结合PS80确保体内稳定性。
[0106] 图31显示的TOF-SMS数据指示颗粒表面上的聚山梨醇酯80表达。TOF-SMS以 阳离子模式通过在255、265、267、281和283处的特征峰清楚地显示了 PS80的存在，表明作 为脱水山梨糖醇分子的侧链的油酸和硬脂酸脂肪酸系列。
[0107] 图32显示了给予加载Gd3+的纳米颗粒以后小鼠脑的MR成像。（A)在基线和给予 PMAA-g-St-P80以后20分钟，小鼠冠状脑切片的R1图谱。（B)在不同时间点的脑R1值。（C) 脑分布的定量MRI :注射有加载Gd3+的PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒（0.05mmol/kg Gd+3)的 Balb/c小鼠 （n = 3)的札图谱。（D)加载Gd3+的PMA-PS 80-g-St-DTPA聚合物在矢状窦、 脑室、皮质和亚皮质中随时间的纵向弛豫率（Ri)。星号（*)表示与基线相比R 1值的显著差 异（ρ〈0· 05)。（E)在不同时间点的脑R1值。
[0108] 图33显示了（A)通过用近红外染料（Hilyte Fluor 750,荧光素胺异构体I) 标记的PMA-PS 80-g-St纳米颗粒的生物发光成像（左）和分布（右）获取的脑肿瘤的 代表性图像。结果强烈地提示纳米颗粒在脑肿瘤中的积累。通过细胞的颅内注射，建立 MDA-MB-231-1UC-D3H2LN的脑转移。1周后，在腹膜内注射萤光素溶液以后3-5min，将脑肿 瘤成像。在尾静脉注射纳米颗粒以后6小时，获取荧光图像。（B)使用DAPI和RFP滤光片获 取的脑肿瘤切片的荧光显微图像，所述滤光片设置成使Hoescht 33342染色的细胞核（蓝 色）和NIR HF 750-标记的纳米颗粒显影。图像清楚地显示了纳米颗粒（红色）和Dox(绿 色）共局部化，从而提示Dox由纳米颗粒递送至肿瘤组织并且从纳米颗粒释放进入脑肿瘤 中。
[0109] 图34显示了加载Gd(III)的直链聚合物在小鼠肿瘤模型中实现显著的MR对比。 (A)PolyGd(上）和 PolyGd-Dox(下）（0.025mmol/kg Gd3+)的肿瘤分布：1\-加权的图像（1) 和对应的R1图谱（2)。箭头指示在右后胁腹皮下植入的肿瘤。（B)肿瘤周围和肿瘤核心中 的AR1的时程，从而显示甚至在造影剂注射以后48小时升高的肿瘤1^。将数据表示为3个 独立运行的平均值土标准差。
[0110] 图35显示了基于淀粉的纳米颗粒在EMT6/WT荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性。在第 0天在正位植入肿瘤细胞。在第8和15天，以等于Dox的2X10mg/kg剂量，用（A) 5%右 旋糖（n = 2 X 4)、（B)游离 Dox (n = 8)、PF-NP (n = 2 X 4)、（C) PF-NP 和（D) SA-NP (η = 2X3)治疗小鼠。测量肿瘤体积直到第62天。每条曲线代表1只动物。（Ε)5%右旋糖、游 离Dox、PF-NP和SA-NP的Kaplan Meier存活曲线。存活曲线的趋势是显著不同的（ρ = 0.0033, Mantel Cox)。在第8天和第15天，通过静脉内注射不同制剂来治疗小鼠。（F)以 等于 Dox 的 2X lOmg/kg 剂量，用 5%右旋糖（η = 2X4)、游离 Dox(n = 2X4)、PF-NP(n = 2X4)和SA-NP(η = 2X3)治疗的荷瘤小鼠的体重的时间谱。给Balb/c小鼠在乳房脂肪垫 中接种EMT6/WT肿瘤，并在接种后第8天和第15天接受治疗。每条曲线代表1只动物。（G) 以等于 Dox 的 2X 10mg/kg 剂量，用 5%右旋糖（η = 2X4)、游离 Dox(n = 2X4)、PF-NP(n =2 X 4)和SA-NP (η = 2 X 3)治疗的荷瘤小鼠的体重的时间谱。给Balb/c小鼠在乳房脂肪 垫中接种EMT6/WT肿瘤，并在接种后第8天和第15天接受治疗。每条曲线代表1只动物。
[0111] 图36显不了（A)MIP血管造影照片，其显不在以0· 03mmol Gd/kg注射加载Gd3+ 的PMAA-g-St-DTPA之前（基线）和之后15分钟得到的（1)全身和（2)头颈区域的对比增 强。（B)在全身血管造影照片中从下腔静脉测量的血管信号与噪音（S/N)比率和对比与噪 音（C/N)比率的动力学。*表示相对于基线的显著差异（p〈0. 05)。将数据表示为3个独立 运行的平均值和标准差。
[0112] 图37显示了⑷纯淀粉、⑶PDEAEM和（C)PDEAEM-g-St的FTIR光谱。
[0113] 图 38 显示了（A)淀粉、（B)PDEAEM 和（C)PDEAEM-g-St 的 HNMR 谱。
[0114] 图39显示了 0· 15M PBS(pH = 4)中的TOEAEM-g-St-l纳米颗粒的强度-重量分 布。
[0115] 图 40 显示了（λ 15M PBS(pH = 7. 4)中的 PDEAEM-g-St-Ι 的强度-重量分布。
[0116] 图41显示了不同淀粉组合物的H)EAEM-g-St颗粒的直径在25°C随介质的pH的变 化。
[0117] 图42显示了 Gd-结合的TOEAEM-g-St-DTPA纳米颗粒在不同pH的直径。
[0118] 图43显示了纳米颗粒中的近红外染料结合。A)结合反应的示意图。（B)与空白 相比用NIR染料标记的PMAA-g-St-PS80。C)纳米颗粒显示对于4. 3 μ mol/g的染料含量在 820nm的荧光发射。
[0119] 图44显示了⑷PMAA-g-St_P80聚合物在鼠乳腺癌肿瘤模型中的肿瘤积累。在尾 静脉注射0. 2ml PMAA-g-St-PS80(4. 5mg/ml)以后，在不同时间点对动物成像。用箭头指示 肿瘤。
[0120] 表1显示了纳米颗粒制备配方和聚合物组成。将反应收率定义为纯化的三元共聚 物与进料中MAA、PS 80和淀粉的总重量的比率。
[0121] 表2显示了加载药物的纳米颗粒的表征。显示了药物加载对颗粒尺寸和表面电荷 的影响。颗粒直径表示在5分钟内平均的读出的数目加权直径。加载效率是并入纳米颗 粒中的最初加入的药物的比例，而药物加载含量是药物重量相对于纳米颗粒总重量的百分 t匕。将所有值报告为3个独立试验的平均值土标准差。
[0122] 表3显示了在不同pH的0. 15M PBS中，具有不同MAA/St进料摩尔比的纳米颗粒 的强度加权流体动力学直径。使用NaCl将离子强度保持恒定。将所有值描述为3个独立 试验的平均值土标准差。
[0123] 表4显示了从滴定数据计算的进料和产物MA含量以及在pH 4和pH 7. 4及IOmM 离子强度的缓冲液中的ξ电位值。将所有值描述为3个独立试验的平均值土标准差。
[0124] 表5Α显示了 St-DTPA-g-PMAA-P80的Gd+3含量和体外弛豫率；在3Τ和7Τ在0. 9% NaCl中测量弛豫率。已经包括Omniscan用于比较。
[0125] 表 5B 显示了 Omniscan?、PolyGd 和 PolyGd-Dox 的 Gd3+含量、Dox 含量、分子量、 颗粒尺寸和A。在3和7T下于盐水中测量巧。显示了 3个独立实验的平均值和标准差。 基于它的分子式，计算Omniscan?的分子量。
[0126] 表 6 显示了 Omniscan?、PolyGd 和 PolyGd-Dox 的 Gd3+含量、Dox 含量、分子量、 颗粒尺寸和A。在3和7T下于盐水中测量巧。显示了 3个独立实验的平均值和标准差。 基于它的分子式，计算Omn i scan?的分子量。
[0127] 表7显示了不同H)EAEM-g-St批次的进料组合物。 实施例
[0128] 化学品和试剂
[0129] 可溶性淀粉（MW 2, 600-4, 500Da)、甲基丙烯酸（MAA)、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA)、硫代硫酸钠（STS)、过硫酸钾（KPS)、聚山梨醇酯80 (PS 80)和十二烷基硫酸钠（SDS) 购自Sigma-Aldrich Canada (Oakville, ON,加拿大）。在使用之前，通过真空蒸馈除去MAA 抑制剂。所有其它化学物质是试剂级，并且原样使用。
[0130] 细胞系和维持
[0131] 鼠乳腺癌细胞系 EMT6/WT 最初由 Ian Tannock 博士（Ontario Cancer 1]181:;[1：1^6，1'01'0111:0，(^，加拿大）提供，现在维持在我们的实验室中。在371€在5% C02/95%空气保湿培养箱中，在75cm2聚苯乙烯组织培养瓶上培养细胞单层。将癌细胞维持 在补充了 10%胎牛血清（Cansera Inc.，Etobicoke，ON,加拿大）的α-最低必需培养基 (Ontario Cancer Institute Media Laboratory, Toronto, 0Ν,加拿大）中。将生长至汇合 的细胞用0· 05%胰蛋白酶_EDTA(Invitrogen Inc. , Burlington, ON,加拿大）进行胰蛋白 酶处理，在新鲜生长培养基中稀释（1/10)，并重新接种。
[0132] 实验动物和正位乳腺肿瘤的诱导
[0133] 所有动物工作得到大学健康网络（University Health Network)动物护理委员会 批准，并根据加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care)颁布的所有指 南和规定进行所有实验。使用8周龄雌性Balb/c小鼠 （Jackson laboratory, Maine, USA)。 在整个研究中，允许动物自由获取食物和水。对于肿瘤研究，将100万个鼠 EMT6乳腺癌细 胞皮下注射进左胁腹。监测肿瘤的生长，并在5mm的肿瘤平均直径开始MRI研究。
[0134] 纳米颗粒的制备和表征
[0135] 实施例1.聚甲基丙烯酸接枝的淀粉（PMAA-g-St)纳米颗粒的合成
[0136] PMAA-PS-80-g-St纳米颗粒的合成
[0137] 使用过硫酸钾/硫代硫酸钠引发（KPS/STS)系统，使用自由基分散聚合法在一锅 中制备PMAA-g-St纳米颗粒。进行一系列初步研究，以鉴别合适的表面活性剂类型和浓度 以及得到稳定颗粒所需的单体浓度。
[0138] 在浸在水浴中的配有氮气入口、冷凝器、温度计和磁力搅拌器的500ml三颈烧瓶 中进行聚合。通过在95°C加热30分钟，将期望量的淀粉溶解在蒸馏水中，冷却至70°C，并 用N 2净化30分钟以除去任何溶解的氧。随后，在搅拌的同时将期望量的SDS、PS 80、KPS 和STS加入淀粉溶液中。15分钟以后，通过向溶液中加入所需量的氮净化的MA和MBA，开 始反应。在5分钟以后出现乳光，继续在70°C进行反应8小时以确保完全转化。将产物用 温水充分洗涤2次，并用甲醇萃取，随后超速离心以除去任何未反应的物质和同聚物。将纯 化的颗粒冷冻干燥，并储存在干燥器中用于将来使用。
[0139] 使用方程式1计算接枝收率百分比（GY% ):
【权利要求】
1. 生产纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤： (a)将聚合物溶解在液体溶液中； 化）提供包含駿酸侧基的可聚合单体； (C)将所述单体接枝聚合W在溶解的聚合物上形成聚合链， (d)提供己氧基化分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中： 步骤（C)在所述己氧基化分子的存在下进行，W使所述己氧基化分子与所述聚合链共 价连接。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述液体溶液包含轻基溶剂。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述轻基溶剂包含水。
4. 根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述聚合物是具有0. 05-3取代度/聚合物 单元的多轻基聚合物，所述单体包含帰基，且所述接枝聚合步骤在交联剂的存在下进行。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述多轻基聚合物具有0. 5-3的取代度。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述多轻基聚合物具有2-3的取代度。
7. 根据权利要求4所述的方法，其中所述多轻基聚合物包括取代度为0. 5-3的多糖。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述多轻基聚合物包括葡萄糖。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。
10. 根据权利要求4、5或6所述的方法，其中所述步骤（C)的单体W所述交联剂的量的 1-20倍（mol/mol)的量存在。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤（C)的单体W所述交联剂的量的3-6 倍的量存在。
12. 根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中所述聚合步骤是在自由基引发剂的 存在下进行的自由基接枝聚合。
13. 根据权利要求4-12中任一项所述的方法，其中所述引发剂基本上不含有过渡金 属。
14. 根据权利要求4-12中任一项所述的方法，其中所述引发剂是过硫酸盐或其功能等 效物。
15. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述己氧基化分子的己氧基化物基 团由游离轻基封端。
16. 根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述己氧基化分子包括帰基，所述 帰基进行化学反应W将表面活性剂分子共价连接至所述聚合链。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述己氧基化分子是具有R(C9-C31)-C(0) 0-基团的聚己氧基化脱水山梨糖醇，其中在所述聚合步骤中，将脱水山梨糖醇通过 R(C9-C31)-C(0)0-基团的C-C共价键与第二聚合物连接。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述脱水山梨糖醇是聚山梨醇醋，其中氧基亚 己基单元的总数是至少10。
19. 根据权利要求15所述的方法，其中所述氧基亚己基单元的总数是10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30 或 32。
20. 根据权利要求17、18或19所述的方法，其中所述R (C9-C31) -C做0-基团含有至少 一个C-C不饱和性，所述C-C不饱和性在所述聚合步骤中反应W形成C-C共价键。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述聚己氧基化分子是聚山梨醇醋80。
22. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤 (C)的单体的量W产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元 的摩尔比是0. 1-10。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤（C)的单体 的量W产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是 0? 3_7. 0。
24. 根据权利要求22所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤（C)的单体 的量W产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是 1-5. 0。
25. 根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中选择所述己氧基化物分子的量 和步骤（C)中的单体的量W产生纳米颗粒，其中己氧基化物分子与单体单元的摩尔比是 0.0005-1。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中选择所述己氧基化物分子的量和步骤（C)中的 单体的量W产生纳米颗粒，其中己氧基化物分子与单体单元的摩尔比是0. 003-0. 01。
27. 根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述聚合步骤在表面活性剂的存在 下进行。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。
29. 生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：权利要求1-28中任一 项所述的方法，其中将所述试剂共价连接至步骤（a)的聚合物。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述聚合物是多轻基化聚合物，并将所述试剂 通过所述聚合物的轻基氨原子的取代而共价连接至所述聚合物。
31. 根据权利要求29所述的方法，其中所述试剂包含能够络合金属的有机部分。
32. 根据权利要求31所述的方法，其还包括形成金属-有机部分络合物。
33. 根据权利要求31或32所述的方法，其中选择所述金属W在磁共振成像中提供信 号。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述金属是Gd "。
35. 根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述步骤（C)的单体的量足够高，W 使在抑7.4和lOmM的离子强度测量的所产生的纳米颗粒的水溶液的^电位的绝对值是 至少15mV。
36. 生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括；将所述试剂和通过权 利要求1-35中任一项所述的方法获得的纳米颗粒分散在液体介质中，W将所述试剂并入 所述纳米颗粒中。
37. 生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括；共价连接至通过权利 要求1-35中任一项所述的方法生产的纳米颗粒和将所述试剂共价连接至所述纳米颗粒的 聚合链的駿酸基团。
38. 生产载体纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤： (i) 将聚合物溶解在水溶液中； (ii) 提供包含駿酸侧基的可聚合单体； (iii) 将所述单体接枝聚合w在溶解的聚合物上形成聚合链， (iv) 提供聚己氧基化分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中： 聚合步骤（ii)在聚己氧基化分子的存在下进行，W将所述聚己氧基化分子与形成的 链共价连接，且聚合的产物形成所述纳米颗粒，其中聚己氧基化部分在所述纳米颗粒的外 部上。
39. 纳米颗粒，其包含： -第一聚合物； -与所述第一聚合物接枝的第二聚合物；和 -与所述第二聚合物共价结合的聚己氧基化部分。
40. 根据权利要求39所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物包含聚合的己帰基，所述 第二聚合物的骨架的每2个碳具有约1个駿基。
41. 根据权利要求39所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物是聚帰基聚合物。
42. 根据权利要求41所述的纳米颗粒，其中所述聚帰基聚合物是聚丙帰酸。
43. 根据权利要求42所述的纳米颗粒，其中所述聚丙帰酸是聚甲基丙帰酸。
44. 根据权利要求39-43中任一项所述的纳米颗粒，其中所述聚己氧基化部分是具有 R(C9-C31)-C(0)0-基团的脱水山梨糖醇，其中所述脱水山梨糖醇通过R-基团的C-C共价键 与所述第二聚合物连接。
45. 根据权利要求39-44中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一聚合物包括多轻基 聚合物。
46. 根据权利要求45所述的纳米颗粒，其中所述多轻基聚合物包括取代度为0. 05-3的 多糖。
47. 根据权利要求46所述的纳米颗粒，其中所述多糖包括淀粉。
48. 根据权利要求47所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物是交联的。
49. 组合物，其包含多个权利要求39-48中任一项所述的纳米颗粒，还包含药学活性 剂。
50. 根据权利要求49所述的组合物，其中将所述试剂吸附至所述纳米颗粒。
51. 组合物，其包含多个权利要求39-48中任一项所述的纳米颗粒，还包含信号分子。
52. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述信号分子是通过有机部分馨合的金属， 其中所述部分与所述纳米颗粒共价结合。
53. 根据权利要求52所述的组合物，其中所述有机部分与所述第一聚合物共价结合。
54. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述信号分子与所述纳米颗粒共价结合，优 选地与駿酸侧基共价连接。
55. 根据权利要求51或54所述的组合物，其中所述信号分子是英光团。
56. 根据权利要求51-54中任一项所述的组合物，其还包含药学活性剂。
57. 纳米颗粒，其包含： -第一聚合物，其包含多糖； -第二交联聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的聚甲基丙帰酸；和 -聚山梨醇醋，其包含与所述第二聚合物共价结合的（C9-C31) R-C (0) 0-基团，所述共 价结合通过所述第二聚合物的碳主链和所述R基团之间的C-C键实现。
58. 根据权利要求57所述的纳米颗粒，其中所述（C9-C31)R-C(0)0-基团是-(C17) R-C (0)0-，其中R是直链焼基。
59. 根据权利要求58所述的纳米颗粒，其中所述聚山梨醇醋包含基团-〇(邸2邸2〇) ,-C (0) (C17) R、册(邸2邸2〇) X-、-册(邸2邸2〇) y-、-册(邸2邸2〇) Z-，其中 w+x+y+z = 20。
60. 根据权利要求57、58或59所述的纳米颗粒，其中所述多糖的分子量是 2,600-4, 500Da〇
61. 根据权利要求57、58或59所述的纳米颗粒，其中所述第一聚合物包含淀粉。
62. 根据权利要求57-61中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多糖的单体单元与所述 聚甲基丙帰酸的单体甲基丙帰酸醋单元的摩尔比是0. 2-8. 0。
63. 根据权利要求57-62中任一项所述的纳米颗粒，其中所述聚山梨醇醋与所述聚甲 基丙帰酸的单体甲基丙帰酸醋单元的摩尔比是0. 002-0. 03。
64. 生产纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤： (a)将聚合物溶解在液体溶液中； 化）提供包含焼基氨基焼基醋侧基的可聚合单体； (C)提供交联剂；和 (d)将所述单体接枝聚合W在溶解的聚合物上形成聚合链，从而形成所述纳米颗粒。
65. 根据权利要求64所述的方法，其中所述聚合物是具有0. 05-3取代度/聚合物单元 的多轻基聚合物，所述单体包括帰基，且所述接枝聚合步骤在交联剂的存在下进行。
66. 根据权利要求65所述的方法，其中所述多轻基聚合物具有1-3取代度/聚合物单 JL〇
67. 根据权利要求65所述的方法，其中所述多轻基聚合物包含取代度为0.5-3的多糖。
68. 根据权利要求67所述的方法，其中所述多轻基聚合物包括葡萄糖。
69. 根据权利要求67所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。
70. 根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述液体溶液包含轻基溶剂。
71. 根据权利要求70所述的方法，其中所述轻基溶剂包含水和/或醇。
72. 根据权利要求71所述的方法，其中所述轻基溶剂包含水和己醇。
73. 根据权利要求64-72中任一项所述的方法，其中所述可聚合单体是甲基丙帰酸的 焼基氨基焼基酉旨。
74. 根据权利要求73所述的方法，其中所述单体是甲基丙帰酸二己基氨基己醋。
75. 根据权利要求64-74中任一项所述的方法，其中所述聚合步骤是在自由基引发剂 的存在下进行的自由基接枝聚合。
76. 根据权利要求75所述的方法，其中所述引发剂基本上不含有过渡金属。
77. 根据权利要求75或76所述的方法，其中所述引发剂是过硫酸盐或其功能等效物。
78. 根据权利要求64-77中任一项所述的方法，其中所述交联剂是己二醇二甲基丙帰 酸醋。
79. 根据权利要求64-78中任一项所述的方法，其中所述步骤（d)的单体W所述交联剂 的量的1-200倍（mol/mol)的量存在。
80. 根据权利要求79所述的方法，其中所述步骤（d)的单体W所述交联剂的量的3-50 倍（mol/mol)的量存在。
81. 根据权利要求64-80中任一项所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤 (C)的单体的量W产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元 的摩尔比是0.05-20。
82. 根据权利要求81所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤（C)的单体 的量W产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是 2-4。
83. 根据权利要求64-82中任一项所述的方法，其中聚山梨醇醋存在于步骤（d)中。
84. 根据权利要求83所述的方法，其中所述聚山梨醇醋的R-基团是含有不饱和性的姪 基。
85. 根据权利要求84所述的方法，其中所述聚山梨醇醋是聚山梨醇醋80。
86. 根据权利要求83、84或85所述的方法，其中所述可聚合单体W所述聚山梨醇醋的 量的5-50倍（mol/mol)的量存在。
87. 根据权利要求86所述的方法，其中所述可聚合单体W所述聚山梨醇醋的量的 20-30倍（mol/mol)的量存在。
88. 根据权利要求64-87中任一项所述的方法，其中非离子稳定剂存在于步骤（d)中。
89. 根据权利要求88所述的方法，其中所述稳定剂是聚己帰化咯焼丽。
90. 生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：权利要求64-89中任一 项所述的方法，其中将所述试剂共价连接至所述步骤（a)的聚合物。
91. 根据权利要求90所述的方法，其中所述试剂包含能够络合金属的有机部分。
92. 根据权利要求91所述的方法，其还包括形成金属-有机部分络合物。
93. 根据权利要求92所述的方法，其中所述有机部分是DTPA。
94. 根据权利要求92或93所述的方法，其中选择所述金属W在磁共振成像中提供信 号。
95. 根据权利要求94所述的方法，其中所述金属是Gd "。
96. 生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括；将所述试剂和权利要 求64-95中任一项所述的方法获得的纳米颗粒分散在液体介质中，W将所述试剂并入所述 纳米颗粒中。
97. 纳米颗粒，其包含： -第一聚合物，其包含多糖；和 -第二交联聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的甲基丙帰酸的焼基氨基焼基醋，其 中所述第二聚合物是交联的。
98. 根据权利要求97所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物是聚合的甲基丙帰酸二己 基氨基己醋。
99. 根据权利要求97所述的纳米颗粒，其中第二聚合物包含聚合的己帰基，所述第二 聚合物的骨架的每2个碳具有约1个駿基。
100. 根据权利要求97、98或99所述的纳米颗粒，其中所述多糖是淀粉。
101. 组合物，其包含权利要求97-100中任一项所述的纳米颗粒的溶液，其中当所述纳 米颗粒的环境溶液的抑从约4变至约7. 4时，所述纳米颗粒表现出增加的500-1500倍的 体积变化。
102. 根据权利要求101所述的组合物，其中当所述纳米颗粒的环境溶液的抑从约4变 至约7. 4时，所述纳米颗粒表现出增加的700-1100倍的体积变化。
103. 组合物，其包含多个权利要求97-100中任一项所述的纳米颗粒，还包含信号分 子。
104. 根据权利要求101或102所述的组合物，其还包含信号分子。
105. 根据权利要求103或104所述的组合物，其中所述信号分子是通过有机部分馨合 的金属，其中所述部分与所述纳米颗粒共价结合。
106. 根据权利要求105所述的组合物，其中所述有机部分与所述第一聚合物共价结 合。
107. 根据权利要求106所述的组合物，其中选择所述金属W在磁共振成像中提供信 号，并且所述甲基丙帰酸的焼基氨基焼基醋与所述多糖的单体单元的摩尔比是0. 5-5。
108. 根据权利要求107所述的组合物，其中所述甲基丙帰酸的焼基氨基焼基醋与所述 多糖的单体单元的摩尔比是0. 5-2。
109. 组合物，其包含多个权利要求97-100中任一项所述的纳米颗粒，还包含药学活性 剂。
110. 根据权利要求109所述的组合物，其中将所述试剂吸附至所述纳米颗粒。
【文档编号】C08F251/00GK104470975SQ201380023187
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2012年3月2日
【发明者】吴晓渔, 艾利莱扎·莎尔维利, 蔡平 申请人:多伦多大学董事局