一种可用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈医用支架的制备方法
【专利摘要】本发明涉及用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，属于生物医用支架领域。该方法通过在线形聚膦腈主链上引入不同比例的生物相容与生物可降解的氨基酸乙酯侧基和抗生物粘附的可交联聚乙二醇侧基，来获得具有生物粘附可调的可降解凝胶支架，并通过其与α环糊精的主客体嵌套作用来增强聚乙二醇链段的刚性，再利用紫外光快速交联将这种刚性嵌套结构固定住，从而在提高凝胶支架的力学性能的同时弥补其原先不足的抗水溶性能。与现有技术相比，本发明所制备的生物支架具有优异的亲水性、生物相容性、生物可降解性、以及从有利于粘附到抗细胞粘附可调的性能，在一些常见的脊椎修复手术中，如腰椎间盘突出等，可作为支撑材料，以达到防止术后的脊椎骨碎片向内塌陷而重新压迫神经目的。
【专利说明】—种可用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈医用支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及材料的生物医用支架领域，具体涉及一种用于腰椎间盘突出手术的新型聚膦腈生物医用支架。
【背景技术】 [0002]腰椎间盘突出症主要由错位的椎间盘压迫脊髓神经，从而导致患者腰痛、四肢麻痹、活动受限等。在临床手术中，需要适当破坏病忠处的脊椎骨，当手术完成后，这些被破坏的脊椎骨会以碎骨的形式拼接回原来位置。但这些碎骨在骨组织愈合之前极不稳定，容易塌陷进脊椎对神经造成二次压迫。所以需要通过注射等方式，将具有一定力学性能的水凝胶生物支架填充到脊椎空腔处，对碎骨起到中短期的支撑作用，并能在骨组织完全愈合之后被人体安全降解掉。
[0003]聚膦腈是一种新型的性能优异的组织工程材料。其主链由磷、氮原子交替连接形成，可通过对P-Ci键的简单亲和取代反应引入功能基团作为侧链，具有主链柔顺、侧链可调控和降解产物无毒害的特点，在过去的25年里受到世界学者的广泛关注和开发(Deng，Kumbar et al.Soft Matter20106(14):3119-3132 ；Laurencin and Khan2012Science
Translational Medicine4(160): 160edl69_160edl69)。通过两种简单基团的引入-氛
基酸酷和聚乙二醇——能够调控聚膦腈生物凝胶支架的粘附性能:当氨基酸酯被引入聚膦腈后，聚合物的生物性能得到显著提高，所以大多数用于生物材料的聚膦腈都具有一定含量的氨基酸酯侧链；而聚乙二醇是一种生物性能突出的抗粘附材料，其在主链上的含量能影响材料的抗粘附性能。所以通过调节聚膦腈主链上氨基酸酯基团和聚乙二醇基团的含量比例可以实现材料从粘附到抗粘附的性能调控。
[0004]a环糊精与聚乙二醇的主客体嵌套已有二十年的深入研究(Li2010NPG AsiaMater2:112-118)，人们利用这种嵌套的方式来提高聚乙二醇柔性链段的刚性，从而形成像牙膏一样具有触变性的可注射凝胶材料。根据这个原理，将聚乙二醇基团引入聚膦腈主链之后，也能同a环糊精形成主客体嵌套结构，使得水溶性的聚合物溶液转变成物理凝胶。通过抗压力实验证明，该种凝胶已经能达到72kpa的负荷强度。通过进一步交联，能将这种嵌套结构固定在分子链中，保证凝胶在大量水存在的环境中也不会溶胀坍塌。流变测试结果表明，只嵌套不交联的物理凝胶基本处于粘性大于弹性的类似牙膏的状态，在实际应用中无法保持原有的形貌，而且嵌套在聚乙二醇链上的a环糊精对水不稳定；交联后材料的弹性性能超越粘性性能，成为真正的凝胶；而将a环糊精引入后交联的凝胶，其弹性模量成功增强近五十倍，大大改善凝胶的物理性能。细胞实验表明，该凝胶具有优异的细胞相容性，并且通过调节聚合物侧链上氨基酸酯基团和可交联聚乙二醇基团的比例可以调控材料的粘附性能:可交联聚乙二醇含量越高，抗细胞粘附性能越优异。
[0005]由于这种凝胶不通过填充碳纳米管、石墨烯、纳米颗粒等不可降解材料来提高凝胶机械强度，所有使用材料均为生物相容性好的有机材料，不仅具有优良的柔韧性，还具备足够的支撑能力；通过调节侧基比例，可将材料设计成表面抗粘附，在骨组织愈合的同时不会诱发不必要的细胞粘附和组织增生；降解产物无毒无害，可溶于水，并最终被肾脏代谢出体外，无需愈合后重新通过手术开刀的方式取出支架。因此，这种a环糊精嵌套力学性能增强的抗粘附聚膦腈凝胶支架在腰椎间盘突出手术中具有良好的应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供一种生物相容性优异、体内可降解、抗细胞粘附、力学性能足够的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架的制备方法。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0008](I)将聚乙二醇溶解于含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂中，待用；
[0009](2)步骤I)中聚乙二醇充分溶解后，于低温缓慢滴入丙烯酰氯或其衍生物，反应5小时，得到单末端含可交联基团的聚乙二醇与双末端含可交联基团的聚乙二醇的混合物，过滤掉缚酸剂盐酸盐沉淀后，滤液倒入沉淀剂中产物析出，并用大量不良溶剂洗涤后备用；
[0010](3)将步骤2)中所得产物溶解于经干燥处理的惰性有机溶剂中，并与催化剂反应，得到丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠(亲核试剂)，在0°c下缓慢滴入溶解有2~5wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂中，在惰性气体保护下反应1-2小时，再于室温反应12小时，升温至35-66°C再反 应3-5小时，得到一定取代度的聚膦腈中间体；
[0011](4)将氨基酸酯盐酸盐加入到干燥处理的惰性有机溶剂中，同缚酸剂反应，过滤沉淀后得到氨基酸酯溶液；
[0012](5)将步骤4)制备的氨基酸酯于(TC缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，惰性气体保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至35-66°C再反应3-5小时后，将反应溶液倒入沉淀剂中沉淀出聚合物，得到末端可交联聚乙二醇基与氨基酸酯基双取代的聚膦腈产物；
[0013](6)将步骤5)制备的聚膦腈和a环糊精以及光敏自由基引发剂配成水溶液，质量浓度比为聚膦腈:a环糊精:光敏自由基引发剂为0.5:1:0.005~2:1:0.005，紫外光照射10~60秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈生物医用支架。
[0014]步骤I)所用的聚乙二醇的分子量为 600、1000、2000、3000、6000、8000、10000、20000,60000的一种或多种。
[0015]步骤I)所述的含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂中:缚酸剂为三甲胺、三乙胺、批啶、三乙烯二胺中的一种或多种；惰性有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N’ N-二甲基甲酰胺、氯仿、苯中的一种或多种。
[0016]所述的含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂中:缚酸剂的含量为:0~0.36g/ml ;聚乙二醇溶解于含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂的摩尔浓度为0.1~0.6mmol / ml。
[0017]步骤2)所述的低温为-10~4°C;所述的丙烯酰氯或其衍生物的加入量为0.13~
0.15mmol / ml ;丙烯酰氯或其衍生物为丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯中的一种或多种；所述的不良溶剂为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚、乙醚中的一种或多种。
[0018]步骤3)所述的催化剂为钠或氢化钠中的任意一种，催化剂的添加量为0.1~0.6mmol / ml，所述的惰性有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N’ N-二甲基甲酰胺、氯仿、苯中的一种或多种；所述的惰性气体为氮气或者氩气中的一种；所述的亲核试剂与溶解在惰性有机溶剂中的2~5wt%的线形聚膦腈的摩尔用量比为2:1。
[0019]步骤4)所述的惰性有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N’ N-二甲基甲酰胺、氯仿、苯中的一种或多种；所述的缚酸剂为三甲胺、三乙胺、吡啶、三乙烯二胺中的一种或多种；所述氨基酸酯为甘氨酸酯、丙氨酸酯、苯丙氨酸酯、亮氨酸酯、异亮氨酸酯中的一种或多种，其中的酯基为甲基、乙基、丙基或丁基；所述的氨基酸酯盐酸盐与缚酸剂的摩尔用量比为 2:1。
[0020]步骤5)所述的氨基酸酯与聚膦腈中间体的用量比为1.4~3.4:1 ;所述的惰性气体为氮气或者氩气中的一种；步骤(2)和(5)所述的沉淀剂包括乙醚、正庚烷、正己烷、石油醚中的任意一种或几种的混合物。
[0021]步骤6)所述的光敏自由基引发剂是安息香二甲醚、苯甲酰甲酸甲酯或1-羟基环己苯基甲酮中的任意一种；所述的紫外光照射10~60秒得到的紫外交联a环糊精嵌套的聚膦腈水凝胶要经过超纯水低温处理24小时，除去未嵌套的a环糊精后再用于细胞实验。
[0022]将步骤6)得到的a环糊精嵌套增强的聚膦腈生物医用支架用于细胞培养，于37°C培养24小时后用突光显微镜和扫描电镜表征,发现末端含可交联聚乙二醇取代度高(>70%)的凝胶材料表面不利于细胞粘附，即使有少数粘附，细胞也处于附着不良的球形形态；而末端可交联聚乙二醇取代度低的凝胶材料表面有利于细胞粘附，细胞铺展状态良好。表明该a环糊精嵌套增强的聚膦腈凝胶支架具有细胞粘附可调的特性。所述的细胞为Hela细胞、成纤维细胞、骨细胞中的任意一种。
[0023]本发明通过聚膦腈的可交联聚乙二醇侧链与a环糊精的主客体嵌套作用来提高聚膦腈凝胶材料的力学性能，并通过调节聚膦腈主链上两类基团——氨基酸酯和可交联聚乙二醇——的比例，来调控材料的抗粘附性能。使之成为具有腰椎间盘突出临床应用价值的凝胶生物支架材料。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:`[0024]I)提出了一种聚膦腈凝胶生物支架的制备方法；提供了一种通过主客体化学嵌套的手段来提高凝胶机械强度的制备技术。
[0025]2)根据实际需要，可以通过改变可交联聚乙二醇的分子量、不同的氨基酸酯侧基组成和调节两类侧基的比例、a环糊精的浓度，来调控凝胶材料的力学性能、降解性能、以及材料表面的细胞粘附性能。从而满足腰椎间盘突出手术中不同病例中的不同需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为腰椎间盘突出手术可用的聚膦腈合成路线示意图；
[0027]图2为该聚膦腈凝胶生物支架的细胞粘附实验；
[0028]图3为该凝胶材料抗细胞粘附原理示意图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0030]本发明所用的线形聚二氯膦腈是通过六氯环三膦腈于250°C下真空反应24小时开环聚合所得。[0031]实施例一:
[0032]I)分子量为600的聚乙二醇溶解于含有1.5倍摩尔量的三乙胺的干燥二氯甲烷中，充分溶解后，于0°c缓慢滴入1.5倍摩尔量的丙烯酰氯，反应5小时，得到含单末端可交联聚乙二醇与双末端可交联聚乙二醇的混合物，过滤三乙胺盐酸盐沉淀后，在低温下乙醚中析出，并用大量冰乙醚溶剂洗涤后备用。
[0033]2)将步骤I)中所得产物溶于干燥四氢呋喃溶剂中与等摩尔量氢化钠反应，得到相应的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠亲核试剂，在0°c下缓慢滴入溶解有2wt%的线形聚膦腈的四氢呋喃溶剂中，氩气保护下反应I小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应3小时，得到取代度70%的聚膦腈中间体。
[0034]3)将甘氨酸乙酯酯盐酸盐加入干燥的四氢呋喃溶剂中，同三乙胺反应，过滤三乙胺盐酸盐沉淀后得到甘氨酸乙酯的四氢呋喃溶液，浓度为20%。
[0035]4)将步骤3)制备的甘氨酸乙酯溶液于0°C缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，氩气保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应3小时后，将反应溶液高速离心除去不溶盐沉淀和部分交联的聚合物沉淀后，将溶液浓缩至40%后倒入正庚烷中沉淀出聚合物，得到可交联聚乙二醇600与甘氨酸乙酯取代比例为7:3的聚膦腈产物。整个反应过程如图1所示。
[0036]5)将步骤4)制备的聚膦腈和a环糊精以及安息香二甲醚配成水溶液，浓度比为聚膦腈:a环糊精:安息香二甲醚为0.5:1:0.005，紫外光照射60秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈凝胶支架。将该材料于37°C，5%二氧化碳条件下培养Hela细胞24小时。AO / EB双染用于荧光显微镜观察，5%戊二醛和30%~100%梯度酒精固定后用于扫描电镜表征。
[0037]6)结果表明，该凝胶有优异的抗细胞粘附性能如附图2中al~a4所示，且材料强度适中。
[0038]实施例二:
[0039]I)分子量为1000的聚乙二醇溶解于含有1.5倍摩尔量的三乙胺的干燥二氯甲烷中，充分溶解后，于0°c缓慢滴入1.5倍摩尔量的丙烯酰氯，反应5小时，得到含单末端可交联聚乙二醇与双末端可交联聚乙二醇的混合物，过滤三乙胺盐酸盐沉淀后在乙醚低温中析出，并用大量冰乙醚溶剂洗涤后备用。
[0040]2)将步骤I)中所得产物溶于干燥四氢呋喃溶剂中与等摩尔量氢化钠反应，得到相应的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠亲核试剂，在0°c下缓慢滴入溶解有2wt%的线形聚膦腈的四氢呋喃溶剂中，氩气保护下反应I小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应3小时，得到取代度70%的聚膦腈中间体。
[0041]3)将甘氨酸乙酯酯盐酸盐加入干燥的四氢呋喃溶剂中，同三乙胺反应，过滤三乙胺盐酸盐沉淀后得到甘氨酸乙酯的四氢呋喃溶液，浓度为20%。
[0042]4)将步骤3)制备的甘氨酸乙酯溶液于0°C缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，氩气保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应3小时后，将反应溶液高速离心除去不溶盐沉淀和部分交联的聚合物沉淀后，将溶液浓缩至40%后倒入正庚烷中沉淀出聚合物，得到可交联聚乙二醇1000与甘氨酸乙酯取代比例为7:3的聚膦腈产物。整个反应过程如图1所示。[0043]5)将步骤4)制备的聚膦腈和a环糊精以及安息香二甲醚配成水溶液，浓度比为聚膦腈:a环糊精:安息香二甲醚为0.5:1:0.005，紫外光照射60秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈凝胶支架。将该材料于37°C，5%二氧化碳条件下培养Hela细胞24小时。AO / EB双染用于荧光显微镜观察，5%戊二醛和30%~100%梯度酒精固定后用于扫描电镜表征。
[0044]6)结果表明，该凝胶有优异的抗细胞粘附性能如附图2中bl~b4所示，同时材料强度较高。
[0045]实施例三:
[0046]1)分子量为600的聚乙二醇溶解于含有1.5倍摩尔量的三乙胺的干燥二氯甲烷中，充分溶解后，于0°C缓慢滴入1.5倍摩尔量的丙烯酰氯，反应5小时，得到含单末端可交联聚乙二醇与双末端可交联聚乙二醇的混合物，过滤三乙胺盐酸盐沉淀后在乙醚低温中析出，并用大量冰乙醚溶剂洗涤后备用。
[0047]2)将步骤I)中所得产物溶于干燥四氢呋喃溶剂中与等摩尔量氢化钠反应，得到相应的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠亲核试剂，在0°c下缓慢滴入溶解有2wt%的线形聚膦腈的四氢呋喃溶剂中，氩气保护下反应I小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应3小时，得到取代度30%的聚膦腈中间体。
[0048]3)将甘氨酸乙酯酯盐酸盐加入干燥的四氢呋喃溶剂中，同三乙胺反应，过滤三乙胺盐酸盐沉淀后得到甘氨酸乙酯的四氢呋喃溶液，浓度为20%。
[0049]4)将步骤3)制备的甘氨酸乙酯溶液于0°C缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，氩气保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应3小时后，将反应溶液高速离心除去不溶盐沉淀和部分交联的聚合物沉淀后，将溶液浓缩至40%后倒入正庚烷中沉淀出聚合物，得到可交联聚乙二醇600与甘氨酸乙酯取代比例为3:7的聚膦腈产物。整个反应过程如图1所示。
[0050]5)将步骤4)制备的聚膦腈和a环糊精以及安息香二甲醚配成水溶液，浓度比为聚膦腈:a环糊精:安息香二甲醚为0.5:1:0.005，紫外光照射60秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈凝胶支架。将该材料于37°C，5%二氧化碳条件下培养Hela细胞24小时。AO / EB双染用于荧光显微镜观察，5%戊二醛和30%~100%梯度酒精固定后用于扫描电镜表征。
[0051]6)结果表明，该凝胶有利于细胞粘附如附图2中Cl~c4所示，且材料强度适中。
[0052]实施例4
[0053]用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架成型方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0054](I)将分子量为600的聚乙二醇溶解于含有三乙烯二胺的干燥四氢呋喃中，待用；所述的含有三乙烯二胺的干燥四氢呋喃中三乙烯二胺的含量为:0.36g / ml ;聚乙二醇溶解于含有三乙烯二胺的干燥四氢呋喃的摩尔浓度为0.6mmol / ml。
[0055](2)步骤I)中聚乙二醇充分溶解后，于4°C的低温缓慢滴入丙烯酰氯，反应5小时，得到含单末端可交联聚乙二醇与双末端可交联聚乙二醇的混合物，过滤沉淀后在沉淀剂乙醚中析出，并用大量正己烷洗涤后备用；所述的丙烯酰氯的加入量为0.15mmol / ml ；
[0056](3)将步骤2)中所得产物溶于干燥甲苯中与催化剂钠反应，催化剂的添加量为0.6mmol / ml，得到丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠亲核试剂，在0°C下缓慢滴入溶解有2wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂中，氮气保护下反应2小时，再于室温反应12小时，升温至66°C反应3小时，得到一定取代度的聚膦腈中间体；所述的亲核试剂与溶解有5wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂的摩尔用量比为2:1。
[0057](4)将氨基酸酯盐酸盐加入干燥的惰性甲苯中，同三甲胺反应，过滤沉淀后得到氨基酸酯溶液；所述氨基酸酯为甘氨酸酯，其中的酯基为甲基；所述的氨基酸酯盐酸盐与缚酸剂的摩尔用量比为2:1。
[0058](5)将步骤4)制备的氨基酸酯于(TC缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，氨基酸酯与聚膦腈中间体的用量比为3.4:1 ;氮气保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至66°C反应3小时后，将反应溶液倒入沉淀剂乙醚中沉淀出聚合物，得到可交联聚乙二醇基团与氨基酸酯基团双取代的聚膦腈产物；
[0059](6)将步骤5)制备的聚膦腈和a环糊精以及光敏自由基引发剂安息香二甲醚配成水溶液，质量浓度比为聚膦腈:a环糊精:光敏自由基引发剂为2:1:0.005，紫外光照射60秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈生物医用支架，得到的紫外交联a环糊精嵌套的聚膦腈水凝胶要经过超纯水低温处理24小时，除去未嵌套的a环糊精后再用于细胞实验。
[0060]得到的a环糊精嵌套增强的聚膦腈生物医用支架用于细胞培养，于37°C培养24小时后用突光显微镜和扫描电镜表征，发现末端可交联聚乙二醇取代度高(> 70% )的凝胶材料表面不利于细胞粘附，即使有少数粘附，细胞也处于附着不良的球形形态；而末端可交联聚乙二醇取代度低的凝胶材料表面有利于细胞粘附，细胞粘附形貌为良好的铺展状态。表明该a环糊精嵌套增强 的聚膦腈凝胶支架具有优异的细胞粘附可调性能。所述的细胞为Hela细胞、成纤维细胞、骨细胞中的任意一种。
[0061]实施例5
[0062]用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架成型方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0063](I)将分子量为60000的聚乙二醇溶解于含有三甲胺的干燥甲苯中，待用:所述的含有三甲胺的干燥甲苯中三甲胺的含量为:0.1g / ml ;聚乙二醇溶解于含有三甲胺的干燥甲苯的摩尔浓度为0.1mmol / mlo
[0064](2)步骤I)中聚乙二醇充分溶解后，于-10°C的低温缓慢滴入丙烯酰氯，反应5小时，得到含单末端可交联聚乙二醇与双末端可交联聚乙二醇的混合物，过滤沉淀后在沉淀剂乙醚中析出，并用大量正己烷洗涤后备用；所述的丙烯酰氯的加入量为0.13mmol / ml ；
[0065](3)将步骤2)中所得产物溶于干燥甲苯中与催化剂钠反应，催化剂的添加量为
0.1mmol / ml，得到丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠亲核试剂，在0°C下缓慢滴入溶解有2~5wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂中，氮气保护下反应1-2小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应5小时，得到一定取代度的聚膦腈中间体；所述的亲核试剂与溶解有2wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂的摩尔用量比为2:1。
[0066](4)将氨基酸酯盐酸盐加入干燥的惰性甲苯中，同三甲胺反应，过滤沉淀后得到氨基酸酯溶液；所述氨基酸酯为甘氨酸酯，其中的酯基为甲基；所述的氨基酸酯盐酸盐与缚酸剂的摩尔用量比为2:1。
[0067](5)将步骤4)制备的氨基酸酯于(TC缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，氨基酸酯与聚膦腈中间体的用量比为1.4:1 ;氮气保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至35°C反应5小时后，将反应溶液倒入沉淀剂乙醚中沉淀出聚合物，得到可交联聚乙二醇基团与氨基酸酯基团双取代的聚膦腈产物；
[0068](6)将步骤5)制备的聚膦腈和a环糊精以及光敏自由基引发剂安息香二甲醚配成水溶液，质量浓度比为聚膦腈:a环糊精:光敏自由基引发剂为0.5:1:0.005，紫外光照射10秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈生物医用支架，得到的紫外交联a环糊精嵌套的聚膦腈水凝胶要经过超纯水低温处理24小时，除去未嵌套的a环糊精后再用于细胞实验。
[0069]得到的a环糊精嵌套增强的聚膦腈生物医用支架用于细胞培养，于37°C培养24小时后用突光显微镜和扫描电镜表征，发现末端可交联聚乙二醇取代度高(> 70% )的凝胶材料表面不利于细胞粘附，即使有少数粘附，细胞也处于附着不良的球形形态；而末端可交联聚乙二醇取代度低的凝胶材料表面有利于细胞粘附，细胞粘附形貌为良好的铺展状态。表明该a环糊精嵌套增强的聚膦腈凝胶支架具有优异的细胞粘附可调性能。所述的细胞为Hela细胞、成纤维细胞`、骨细胞中的任意一种。
【权利要求】
1.用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)将聚乙二醇溶解于含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂中，待用； (2)步骤I)中聚乙二醇充分溶解后，于低温缓慢滴入丙烯酰氯或其衍生物，反应5小时，得到单末端含可交联基团的聚乙二醇与双末端含可交联基团聚乙二醇的混合物，过滤掉缚酸剂盐酸盐的沉淀后，滤液倒入沉淀剂中产物析出，并用大量不良溶剂洗涤后备用； (3)将步骤2)中所得产物溶于干燥惰性有机溶剂中与催化剂反应，得到丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚乙二醇钠(亲核试剂)，在0°C下缓慢滴入溶解有2~5wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂中，惰性气体保护下反应1-2小时，再于室温反应12小时，升温至35-66°C反应3-5小时，得到一定取代度的聚膦腈中间体； (4)将氨基酸酯盐酸盐加入干燥的惰性有机溶剂中，同缚酸剂反应，过滤缚酸剂盐酸盐沉淀后得到氨基酸酯溶液； (5)将步骤4)制备的氨基酸酯于0°C缓慢加入步骤3)聚膦腈中间体溶液中，惰性气体保护下反应5小时，再于室温反应12小时，升温至35-66°C反应3-5小时后，将反应溶液倒入沉淀剂中沉淀出聚合物，得到可交联聚乙二醇基团与氨基酸酯基团双取代的聚膦腈产物； (6)将步骤5)制备的聚膦腈和a环糊精以及光敏自由基引发剂配成水溶液，质量浓度比为聚膦腈:a环糊精:光敏自由基引发剂为0.5:1:0.005~2:1:0.005，紫外光照射10~60秒，得到a环糊精嵌套增强的聚膦腈水凝胶生物医用支架。
2.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤I)所用的聚乙二醇的分子量为600、1000、2000、3000、6000、8000、10000、20000,60000的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤I)所述的含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂中:缚酸剂为三甲胺、三乙胺、批啶、三乙烯二胺中的一种或多种；惰性有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N’ N-二甲基甲酰胺、氯仿、苯中的一种或多种。
4.根据权利要求1或3所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，所述的含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂中缚酸剂的含量为:0~0.36g/ml ;聚乙二醇溶解于含有缚酸剂的干燥惰性有机溶剂的摩尔浓度为0.1~0.6mmol / ml。
5.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤2)所述的低温为-10~4°C ;所述的丙烯酰氯或其衍生物的加入量为0.13~0.15mmol / ml ;丙烯酰氯或其衍生物为丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯中的一种或多种；所述的不良溶剂为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚、乙醚中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤3)所述的催化剂为钠或氢化钠中的任意一种，催化剂的添加量为0.1~0.6mmol / ml，所述的惰性有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N’ N-二甲基甲酰胺、氯仿、苯中的一种或多种；所述的惰性气体为氮气或者氩气中的一种；所述的亲核试剂与溶解有2~5wt%的线形聚膦腈的惰性有机溶剂的摩尔用量比为2:1。
7.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤4)所述的惰性有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N’ N-二甲基甲酰胺、氯仿、苯中的一种或多种；所述的缚酸剂为三甲胺、三乙胺、吡啶、三乙烯二胺中的一种或多种；所述氨基酸酯为甘氨酸酯、丙氨酸酯、苯丙氨酸酯、亮氨酸酯、异亮氨酸酯中的一种或多种，其中的酯基为甲基、乙基、丙基或丁基；所述的氨基酸酯盐酸盐与缚酸剂的摩尔用量比为 2:1。
8.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤5)所述的氨基酸酯与聚膦腈中间体的用量比为1.4~3.4:1 ;所述的惰性气体为氮气或者氩气中的一种；步骤(2)和(5)所述的沉淀剂包括乙醚、正庚烷、正己烷、石油醚中的任意一种或几种的混合物。
9.根据权利要求1所述的用于腰椎间盘突出手术的聚膦腈生物医用支架制备方法，其特征在于，步骤6)所述的光敏自由基引发剂是安息香二甲醚、苯甲酰甲酸甲酯或1-羟基环己苯基甲酮中的任意一种；所述的紫外光照射10~60秒得到的紫外交联a环糊精嵌套的聚膦腈水凝胶要经过超纯水 低温处理24小时，除去未嵌套 的a环糊精后再用于细胞实验。
【文档编号】C08L85/02GK103554507SQ201310504445
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】路庆华, 黄张君 申请人:上海交通大学