一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基；⑵制备种子培养基；⑶制备发酵培养基；⑷鸡油菌菌丝接种至马铃薯葡萄糖斜面培养基，经恒温培养得斜面菌种；⑸1cm2斜面菌种接种至种子培养基，经振荡培养得菌种种子液；⑹菌种种子液接种至发酵培养基，经振荡培养得发酵液；发酵液离心、洗涤、烘干、磨粉后，得到菌丝体干粉末；⑺菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液离心、过滤、浓缩后得到多糖浓缩液；⑼多糖浓缩液中加Sevag试剂，离心后得多糖提取液；⑽多糖提取液加乙醇静置，得到沉淀物；⑾沉淀物离心、洗涤、干燥，即得多糖干品。本发明操作简单，成本低，多糖得率高。
【专利说明】一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及真菌多糖【技术领域】，尤其涉及一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法。
【背景技术】
[0002]真菌多糖是ー类具有广泛的药理活性和保健作用的高分子聚合物，具有抗肿瘤、抗感染、抗凝血、抗病毒、降血糖、降血脂、修复损伤组织细胞等多种生理功能。常见的真菌多糖有香菇多糖、黑木耳多糖、猴头菌多糖、银耳多糖、灵芝多糖、冬虫夏草多糖、云芝多糖、茯苓多糖、灰树花多糖等。目前，已有多种真菌多糖应用于临床，使得多糖生物资源的研究和开发日益活跃，成为生物学、医学、药物学、食品科学等领域的研究热点。
[0003]陇南康县位于甘肃省东南部，陕、甘、川三省交界地帯，是珍贵的天然植物宝库。境内气候属典型亚热带向暖温带过渡气候，温和湿润，雨量充沛，自然资源十分丰富。鸡油菌是陇南康县地区生长的ー种具有生理活性的野生食用菌，别名黄丝菌、杏菌，属真菌界、担子菌门、同担子菌纲、鸡油菌目、鸡油菌科和鸡油菌属。在我国主要分布于云南、贵州、四川、湖南、甘肃、安徽、陕西、江苏等省。研究表明，鸡油菌富含胡萝卜素、VA、V。、多糖物质、钙、鉄、磷等矿质元素和人体必需的8种氨基酸，其性平、味甘具有清肝、明目、利肺、减肥和抗衰老等多种功效。鸡油菌多糖具有多种生理活性，能够促进人体免疫功能，具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗辐射、降血压等功能。目前，鸡油菌的开发基本依靠野生资源，存在菌种污染率高、生长周期长、エ艺复杂等问题。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供ー种操作简单、成本低、多糖得率高的鸡油菌菌丝多糖的提取方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所述的ー种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg琼脂，使其pH值为6.(T8.0，在9(Tl00°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121 °C的条件下灭菌20min即得；
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在90~100で温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得；
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在90~100で温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得；⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4~10天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌种；
(5)将Icm2所述斜面菌种接种至装有IOmL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100~200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0^7.0的菌种种子液；
(6)将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心l(T30min,得到菌丝体；所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于5(T80°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30% ；
(7)在所述菌丝体干粉末中按Ig:10 mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为10(T300W的条件下超声提取20~40 min后，在温度为70~90で的条件下浸提次数2~4次，每次0.5^2h,合并提取液，得到多糖浸提液；
⑶将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心l(T20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50°C、真空度为0.06、.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液；
⑶在所述多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌l(T30min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；`
(抑所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的こ醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A;
(11)将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水こ醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0006]所述步骤⑷中鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌6?/?从areBys sp.KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝；所述鸡油菌6?/?tharellus sp.KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012114 (保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387。
[0007]所述步骤(9)中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL: ImL混合而成的混合液。
[0008]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代以往的単独水提，利用其独特的热作用、机械作用及空化等物理化学效应，可以有效缩短提取时间，显著提高多糖得率，具有提取效率高、时间短、温度低、不易破坏多糖的立体结构等优点。
[0009]2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应，不但设备简単，可操作性強，而且成本低。
[0010]3、本发明发酵菌丝体培养周期短、菌种纯、エ艺简单，利于实现规模化、产业化生产，从其发酵液或固体培养物中得到菌丝体提取多糖，为鸡油菌资源的合理开发利用提供參考。
【具体实施方式】
[0011]实施例1 一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0012]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0013]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0014]⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌种。
[0015]其中:鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌6?/?从印.KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油`菌菌丝；鸡油菌6?/?(AardAz1S sp.KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012114 (保藏单位地址:中国.武汉?武汉大学；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为 JQ086387。
[0016](5)将Icm2斜面菌种接种至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天，制得pH值为5.(T7.0的菌种种子液。
[0017](6)将菌种种子液按5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心IOmin,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于50°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0018]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
[0019](7)在菌丝体干粉末中按I g:10 mL的料液比加入去离子水，在功率为100W的条件下超声提取40 min后，在温度为70°C的条件下浸提次数2次，毎次0.5h，合并提取液，得到
多糖浸提液。
[0020]⑶将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心IOmin过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50°C、真空度为0.06MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5，得到多糖浓缩液。
[0021]⑶在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌IOmin,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0022]其中:Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL =ImL混合而成的混合液。
[0023](W)多糖提取液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的こ醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0024](11)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水こ醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0025]采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并按下式计算:
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/菌丝体干粉末质量(g)。
[0026]实施例2 —种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入IOg葡萄糖和IOg琼脂，使其PH值为6.(T8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0027]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装 ，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0028]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0029]⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养10天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌种。
[0030]其中:鸡油菌菌丝同实施例1。
[0031](5)将Icm2斜面菌种接种至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天，制得pH值为5.(T7.0的菌种种子液。
[0032](6)将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心30min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于80°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0033]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
[0034](7)在菌丝体干粉末中按I g:30mL的料液比加入去离子水，在功率为300W的条件下超声提取20 min后，在温度为90°C的条件下浸提次数4次，毎次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0035]⑶将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50°C、真空度为0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/3，得到多糖浓缩液。
[0036]⑶在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌30min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0037]其中:Sevag试剂同实施例1。
[0038](W)多糖提取液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的こ醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0039](11)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水こ醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0040]采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
[0041]实施例3 —种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂，使其pH值为6.(T8.0，在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0042]⑵制备种子培养基 :将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0043]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0044]⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养7天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌种。
[0045]其中:鸡油菌菌丝同实施例1。
[0046](5)将Icm2斜面菌种接种至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天，制得pH值为5.(T7.0的菌种种子液。
[0047](6)将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于65°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0048]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
[0049](7)在菌丝体干粉末中按I g:20mL的料液比加入去离子水，在功率为200W的条件下超声提取30 min后，在温度为80°C的条件下浸提次数3次，毎次lh，合并提取液，得到多糖浸提液。[0050]⑶将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心15min过滤后,得到上清液A，该上清液A在温度为50°C、真空度为0.07MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/4，得到多糖浓缩液。
[0051]⑶在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0052]其中:Sevag试剂同实施例1。
[0053](1Φ多糖提取液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0054](11)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0055]采用苯酚-硫酸法测`定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
【权利要求】
1.一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤: ⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg琼脂，使其pH值为6.(T8.0，在9(Tl00°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121 °C的条件下灭菌20min即得； ⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在90~100で温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得； ⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.(T8.0，在90~100で温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得； ⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4~10天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌种； (5)将Icm2所述斜面菌种接种至装有IOmL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100~200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0^7.0的菌种种子液； (6)将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心l(T30min,得到菌丝体；所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于`5(T80°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30% ； (7)在所述菌丝体干粉末中按Ig:10 mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为10(T300W的条件下超声提取20~40 min后，在温度为70~90で的条件下浸提次数2~4次，每次0.5~2h，合并提取液，得到多糖浸提液； ⑶将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心l(T20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50°C、真空度为0.06、.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液； ⑶在所述多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌l(T30min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液； (抑所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的こ醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A; (11)将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水こ醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
2.如权利要求1所述的ー种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，其特征在于:所述步骤⑷中鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌Cantharellus sp.KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝；所述鸡油菌sp.KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012114，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank 的登录号为 JQ086387。
3.如权利要求1所述的ー种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，其特征在于:所述步骤⑶中Sevag试 剂是指氯仿与正丁醇按4mL:lmL混合而成的混合液。
【文档编号】C08B37/00GK103554285SQ201310480649
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】陈朋, 严晓娟, 梁宁, 胡先望 申请人:甘肃省商业科技研究所