专利名称：低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，确切的说，涉及一种利用超声降解制备低分子量的海参岩藻聚糖硫酸酯的方法。
背景技术：
海参(seacucumber, holothurians)属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)楣手目(Aspidocita)动物,主要分布于热带和温带大洋，我国记录的海参有101种，其中20余种可供食用。海参自古以来就是名贵的药食两用的滋补佳品，位列“海”之首，传统中医认为，海参味咸，性温，入心、肾经，具有补肾益精，养血润燥，止血消炎，和胃止渴等功效。近年研究认为海参是一种高蛋白，低脂肪，低糖，不含胆固醇的健康食品，并且富含各种对人体有益的海参多糖、氨基酸、必需脂肪酸、维生素、矿物质、胶质、海参皂苷等成分，使得海参具有抗肿瘤、抗凝血、提高免疫力、降血脂、防治类风湿关节炎和骨性关节炎等作用。海参多糖主要存在于海参体壁及其废弃内脏中，占海参体壁的7_10%，主要分为两类:海参岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基化硫酸软骨素。海参岩藻聚糖硫酸酯是由L-岩藻糖所构成的直链多糖，前期研究表明，从一种美国肉参中分离得到岩藻聚糖硫酸酯，经解析其结构为[—3Fuc(2S，4S) a I — 3Fuc (2S) α I — 3Fuc (2S) a I — 3Fuc a I — ]n 的重复单元构成。海参岩藻聚糖硫酸酯具有多种生物活性，包括抗氧化、抗凝血、抑制肿瘤、降血脂、提高免疫力、抗炎、胃保护、抗病毒作用等。海参岩藻聚糖硫酸酯具有诸多活性，但由于其分子量较大，不易被人体吸收利用，因而在研究和利用方面受到了限制。低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯由于具有粘度低、易吸收、生物利用率好等优点，表现出比大分子多糖更好的生物活性。多糖的降解及其低分子量产品在保健品、药物、食品添加 剂等领域的开发及应用已经十分广泛，目前常用的降解方法主要有化学降解法、生物降解法和物理降解法。目前文献报道的降解岩藻聚糖硫酸酯的方法大多集中于化学降解法，虽然化学法反应迅速，但反应剧烈，对多糖结构破坏较大，并且产品分子量分布广。生物降解法虽然反应温和，专一性高，但是可应用于多糖、尤其是专一用于岩藻聚糖硫酸酯降解的酶类十分稀少，且反应条件较为苛刻，成本高，工业化大生产有一定困难。物理降解法由于对产物活性结构破坏小，分子量易于控制、反应效率高而成为一种理想的降解方法，多糖类物质常用物理降解方法有超声降解、辐照降解、微波降解等，其中辐照降解效率最高，对魔芋葡甘露聚糖的研究显示，经5.0kGy和100.0kGy辐照后，产物分子量由481kDa分别降至370kDa和39.8kDa,但是由于福照处理对分子结构破坏十分剧烈，且安全性尚有争议，所以其应用受到限制。武晓琳在《分子量对海参岩藻聚糖硫酸酯活性和消化吸收的影响研究》和《不同分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备及消化吸收特性的初步研究》(中国海洋药物2011年第三十卷3期，20-24)中对不同分子量海参岩藻聚糖硫酸酯对大鼠脂肪肝改善作用的比较和不同分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的消化吸收特性进行了研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，本发明利用超声降解技术，可迅速降解高分子量海参岩藻聚糖硫酸酯，反应条件温和，操作简单，绿色环保。为了解决上述技术问题，本发明提供一种低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，以将海参粉碎后利用酶解法所获得的海参多糖作为原料，包括以下步骤:I)、将海参多糖溶解于2.8^3.2mol/L (较佳为3mol/L)的氯化钠溶液(为浓盐水)中，得海参多糖溶液，海参多糖溶液中海参多糖的质量浓度为0.8^1.2% (较佳为1%)；在海参多糖溶液中加入乙醇，直至乙醇的体积终浓度为34 40%，离心除去沉淀，得上清液；在上清液中加入乙醇，直至乙醇的体积终浓度为6(Γ90%，离心，所得的沉淀经透析和冷冻干燥后，得到海参岩藻聚糖硫酸酯；2)、将海参岩藻聚糖硫酸酯溶于溶剂中于(T45°C (较佳为5 35°C)的温度下进行超声处理，处理时间为l(Tl80min (较佳为1(T80 min)，超声声场强度为6(T800W/cm2 (较佳为180 550 ff/cm2);超声频率为21 25kHz ；3 )、将步骤2 )所得的处理后溶液透析，真空冷冻干燥后，得低分子量海参岩藻聚糖硫Ife酷。
作为本发明的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法的改进:步骤I)中的透析所用的透析袋的截留分子量为8000kDa。作为本发明的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法的进一步改进:步骤2)溶剂为去离子水、质量浓度为0.5^5%的醋酸溶液、质量浓度为0.5^5%的盐酸溶液或者质量浓度为0.5^5%的硫酸溶液。作为本发明的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法的进一步改进:步骤2)中海参岩藻聚糖硫酸酯与溶剂的料液比为lg/20-200ml。即Ig海参岩藻聚糖硫酸酯配用20-200ml溶液。较佳的料液比为lg/50-70ml。作为本发明的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法的进一步改进:步骤3)中的透析所用的透析袋的截留分子量为lOOOkDa。作为本发明的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法的进一步改进:步骤2)为:将0.5g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于30ml去离子水中于13.0713°C的温度下进行超声处理，处理时间为80min，超声声场强度为508.28W/cm2。作为本发明的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法的进一步改进:步骤2)为:将0.5g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于30ml的质量浓度为2%的醋酸、30ml的质量浓度为2%的盐酸、或者30ml的质量浓度为2%的硫酸中于13.0713°C的温度下进行超声处理，处理时间为40min，超声声场强度为508.28W/cm2。本发明所采用的技术方案是以将海参粉碎后利用酶解法所获得的海参多糖(此为公知技术，例如可按照于盛文静的硕士论文《不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较》中发表的酶解法进行制备)作为原料获得海参岩藻聚糖硫酸酯，通过超声处理打破糖苷键获得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯。
与现有技术相比，本发明的突出优点在于:1、使用物理方法打破糖苷键，降解海参岩藻聚糖硫酸酯，对产物结构破坏小，无副反应，无残留物质，分子量易于控制；2、制备过程简单，成本低廉，反应效率高，无污染；3、克服了以往使用化学方法降解多糖过程中对产物结构的破坏；4、按照现有技术可知:本发明所得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯具有良好的清除自由基能力和抗凝血活性，并且易于被人体吸收，可应用于抗血栓、抗凝血、抑制肿瘤、增强免疫力的保健品、功能食品或药品的制备，具有极高的社会、经济意义和应用潜力。
具体实施例方式实施例1-1、一种低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，以将海参粉碎后利用酶解法所获得的海参多糖作为原料，依次进行以下步骤:1)、将海参多糖溶解于3mol/L的氯化钠溶液(浓盐水)中，得海参多糖溶液，海参多糖溶液中海参多糖的质量浓度为1% ;在海参多糖溶液中加入乙醇，直至乙醇的体积终浓度为37%，离心(6000r/min，15min)除去沉淀,得上清液；在所述上清液中加入乙醇，直至乙醇的体积终浓度为75%，离心(6000r/min,15min)，所得的沉淀经透析(过截留分子量为SOOOkDa的透析袋)和冷冻干燥(于_45°C，真空度0.1Mpa干燥40h)后，得到海参岩藻聚糖硫酸酯。 2 )、将0.5g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于30ml去离子水中于5 °C的温度下进行超声处理，处理时间为lOmin，超声声场强度为181.53 ff/cm2 ;此时超声频率越为21_25kHz (备注说明:仪器自行在该范围内调节)。3)、将步骤2)所得的处理后溶液透析(过截留量为IOOOkDa的透析袋)，真空冷冻干燥(于0.1Mpa的真空度、_45°C干燥40h)后，得约0.38g的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯。将上述实施例1-1所得的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯采用凝胶渗透色谱检测产物分子量，其分子量(kDa)为217.48。实施例1-2 1-5、为了验证步骤2)中不同超声声场强度进行超声降解对制备而得的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的影响，更改步骤2)中的超声声场强度，其余同实施例1-1，从而获得实施例1-2 1-5 ;具体超声声场强度和对应所得的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯分子量如表I所示。表1、不同超声声场强度所得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯分子量
权利要求
1.分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，以将海参粉碎后利用酶解法所获得的海参多糖作为原料，其特征是包括以下步骤: 1)、将海参多糖溶解于2.8^3.2mol/L的氯化钠溶液中，得海参多糖溶液，所述海参多糖溶液中海参多糖的质量浓度为0.8^1.2% ； 在所述海参多糖溶液中加入乙醇，直至乙醇的体积终浓度为34 40%，离心除去沉淀，得上清液； 在所述上清液中加入乙醇，直至乙醇的体积终浓度为60、0%，离心，所得的沉淀经透析和冷冻干燥后，得到海参岩藻聚糖硫酸酯； 2)、将海参岩藻聚糖硫酸酯溶于溶剂中于(T45°C的温度下进行超声处理，处理时间为10 180min，超声声场强度为6(T800W/cm2 ； 3)、将步骤2)所得的处理后溶液透析，真空冷冻干燥后，得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯。
2.根据权利要求1所述的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是:所述步骤I)中的透析所用的透析袋的截留分子量为8000kDa。
3.根据权利要求2所述的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是:所述步骤2)溶剂为去离子水、质量浓度为0.5^5%的醋酸溶液、质量浓度为0.5^5%的盐酸溶液或者质量浓度为0.5^5%的硫酸溶液。
4.根据权利要求3所述的低 分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是:所述步骤2)中海参岩藻聚糖硫酸酯与溶剂的料液比为lg/2(T200ml。
5.根据权利要求4所述的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是:所述步骤3)中的透析所用的透析袋的截留分子量为lOOOkDa。
6.根据权利要求5所述的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是: 所述步骤2)中:温度为5 35°C，处理时间为l(T80min，超声声场强度为18(T550W/cm2。
7.根据权利要求6所述的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是: 步骤2)为:将0.5g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于30ml去离子水中于13.0713°C的温度下进行超声处理，处理时间为80min，超声声场强度为508.28W/cm2。
8.根据权利要求6所述的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征是: 步骤2)为:将0.5g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于30ml的质量浓度为2%的醋酸、30ml的质量浓度为2%的盐酸、或者30ml的质量浓度为2%的硫酸中于13.0713°C的温度下进行超声处理，处理时间为40min，超声声场强度为508.28W/cm2。
全文摘要
本发明公开了一种低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，以将海参粉碎后利用酶解法所获得的海参多糖作为原料，包括以下步骤1)将海参多糖溶解于氯化钠溶液中，然后加入乙醇，离心除去沉淀，得上清液；在上清液中加入乙醇，离心，所得的沉淀经透析和冷冻干燥后，得到海参岩藻聚糖硫酸酯；2)将海参岩藻聚糖硫酸酯溶于溶剂中于0~45℃的温度下进行超声处理，处理时间为10~180min，超声声场强度为60~800W/cm2； 3)将步骤2)所得的处理后溶液透析，真空冷冻干燥后，得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯。本发明利用超声降解技术，可迅速降解高分子量海参岩藻聚糖硫酸酯，反应条件温和，绿色环保。
文档编号C08B37/00GK103087214SQ20131005258
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者陈士国, 郭欣, 叶兴乾, 孙玉敬, 刘东红 申请人:浙江大学