专利名称：一种从金针菇菇根废料中提取具有细胞免疫活性的多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种从金针菇菇根废料中提取具有细胞免疫活性的多糖的方法，属于生物医药领域，产品可广泛应用于功能食品、生物医药等领域。其中金针菇菇根为金针菇加エ过程中，作为废料被切除的根蒂部分。
ニ背景技术：
金针燕(Flammulina velutipes)又名朴燕、冬燕，隶属真菌门、层菌纲、伞菌目、ロ蘑科、金线菌属，含有较高的蛋白质，碳水化合物和粗纤维，而脂肪含量较低，还含有VB1、VB2、VC等多种维生素，且富含1丐、憐、铁等多种矿物质，是一种不可多得的闻营养品。随着人类对保健食品以及金针菇营养价值的认识逐渐加深，金针菇将会有非常广 阔的开发前景，与此同时，也将会有越来越多的金针菇菇根的废料产生。据我国食用菌协会统计，截止至2007年我国金针菇总产量约为144. I万吨，其中金针菇菇根占金针菇重量的15%左右，约为21. 6万吨，然而在金针菇的生产过程中，菇根大多被废弃，甚至连作牲畜的饲料都不甚理想，没有得到充分的利用。这样金针菇菇根在生产流通环节的废弃，给企业增加了处理废弃物的成本。因此，金针菇菇根的合理开发利用迫在眉睫，所以需要为金针菇菇根的利用开辟一条途径。在多糖的开发利用中，分离提取是关键的步骤之一，它不仅影响着产品的得率，还与产品的活性价值密切相关。金针菇多糖能溶于水，不溶于醇、醚、酮等有机溶剤，因而多糖传统提取方法主要有热水浸提法、酸碱浸提法、酶法等。传统的热水浸提法和酸碱浸提法，所需提取时间长、提取温度高、能耗大，而且长时间的高温或者酸碱介质有可能造成多糖发生降解，使多糖的提取很难达到理想效果，这些都大大限制了多糖的开发利用。随着科技的进步，目前关于多糖提取的采用较多的方法为超声提取法，利用超声波辐射产生的強烈空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，増加物质分子的频率和速度，从而加速目标成分进入溶剂，实现高效快速地提取细胞内容物，从而提高了效率，缩短了时间；同时提取过程不涉及化学试剂，这在一定程度上減少了对浸提物质生物活性的影响，因此超声提取技术在中药有效成分提取エ艺中已得到广泛应用。利用超声波提取金针菇菇根多糖，研究其适宜的提取条件，提高多糖得率，是提高金针菇菇根废料利用率的重要途径，也是后续生物活性研究的基础。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供ー种可以从金针菇菇根废料中提取具有细胞免疫活性多糖的方法，该方法避免了传统提取技术，提取时间长，提取率低、能耗高的弊端。同时该法操作简单，提取的多糖得率较高，可以最大程度地提高废料的利用率，減少对环境的污染。技术方案
一种从金针菇菇根废料中提取具有细胞免疫活性多糖的方法，是通过以下方法制成的I)金针菇菇根超微粉的制备新鮮金针菇菇根晾晒至半干后，放于烘箱中60°C鼓风烘干，然后经30B粉碎机粉碎，双辊破碎机破碎，80目筛分，气流粉碎机粉碎，300目筛分，制得金针菇菇根超微粉，置于-20°C备用。2)称取金针菇菇根超微粉，加入适量85%こ醇室温下静置2h以除去部分色素及杂质，再按照水料比10 50mL/g加入去离子水，利用DCTZ-2000恒温超声提取机，以200 680W超声提取5 25min,离心取上清液；上清液采用Sevag试剂(正丁醇三氯甲烧=I : 4)法去蛋白，8000r/min条件下离心IOmin取上清； 3)使用旋转蒸发仪将上清液浓缩至适量，加入4倍体积无水こ醇，4°C下醇沉12h，5000r/min离心15min取沉淀,于60°C烘箱烘干得到金针燕燕根粗多糖粉末；
4)将金针菇菇根粗多糖粉末用去离子水配成10mg/mL溶液，加入DEAE-纤维素-52交換柱，然后依次用去离子水、O. 1,0. 3mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分离得到3个组分；5)粗多糖得率的计算公式粗多糖得率)=粗多糖质量(g)/超微粉重(g) X 100%有益效果本发明与传统的热水浸提法相比，提取效率高，金针菇菇根多糖得率高。在菇根废料的开发应用中，将其中的活性成分提取出来是关键的步骤之一，它不仅单纯地影响着产品的得率，直接关系经济效益，还与产品的生物活性有着密切的关系。由于传统的热水浸提法，提取时间长，多糖得率低，很难最大程度的提高菇根废料的利用率，为了改善这种情况，本发明采用了超声波提取技术，研究了超声时间、水料比、超声功率这3个单因素对多糖得率的影响，筛选各个因素的中心点，在此基础上，采用Design expertsV6. O软件的BBD法，进行3因素3水平的提取參数优化试验，同时运用Design expertsV6. O软件进行统计分析，确定3个因素不同水平的最优组合，最后优化出金针菇菇根多糖提取的エ艺參数为超声功率680W、超声时间19. 8min，水料比为28mL/g，研究结果显示按照本发明的エ艺參数，金针菇菇根多糖的得率可达到16. 20%，与传统热水浸提相比，得率提高了 70%，时间缩短了 92%。本发明采用超声波提取技术，利用超声波辐射产生的強烈空化效应、机械振动、扰动效应等多种作用，増加物质分子的频率和速度、溶剂的穿透力，从而促进细胞中有效成分的溶出，显著提高多糖得率和提取效率，同时超声波提取技术具有设备简单，操作容易，适用范围广，生产效率高，能量损耗小等优点。因此，该技术为金针菇菇根的废料的充分利用，开辟了新的途径。
四
图I是本发明与对照提取条件比较。图2是金针菇菇根多糖DEAE-纤维素-52洗脱曲线。图3是金针菇菇根多糖及其纯化组分对巨噬细胞増殖率的影响。五具体实施例方式(一 )试验设计I、热水浸提法參照占建波等人的报道以金针菇为原料采用传统热水浸提多糖的最优条件稍作修改，提取温度80°C，提取时间4h，水料比28ml/g时，多糖的得率为9. 51%。2、超声波提取法选择超声功率、超声时间和水料比做单因素试验，通过单因素试验初步确定3个变量的适宜范围，进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，各因素的试验水平及编码列于表1，Box-Behnken试验设计及其响应值见表2。3、洗脱方法·将金针菇菇根粗多糖粉末用去离子水配成lOmg/mL溶液，加入DEAE-纤维素-52交换柱(2. 6cmX 30cm)，每次上样量为10mL，然后依次用去离子水、O. 1、0. 3、0. 5、0. 7mol/L NaCl溶液梯度洗脱，使用DHL-2B电脑数显恒流泵控制流速为lmL/min，分部收集(IOmL/管)，收集液隔管用苯酚-硫酸法显色检测，在波长为490nm下測定吸光度，以收集的管数为横坐标、吸光值(490nm)为纵坐标绘制DEAE-纤维素-52色谱柱洗脱曲线，选择最佳吸收峰区间分段收集样品。洗脱曲线见图2。4、活性采用CCK-8法。其检测细胞活性的原理是WST-8在电子载体1-Methoxy PMS的作用下能被活细胞内的细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜染料，生成的甲臜的数量与活细胞的数量成正比，且甲臜的数量可用450nm处的吸光值来衡量，从而间接地反映活细胞的数量，所以在一定的细胞数量范围内，可以用0D450值反映存活细胞的数量。(ニ)实施例金针菇菇根，由南京市高固食用菌科贸有限公司提供。金针菇菇根超微粉新鮮金针菇菇根晾晒至半干后，放于烘箱中60°C鼓风烘干，然后经30B粉碎机粉碎，双辊破碎机破碎，80目筛分，气流粉碎机粉碎，300目筛分，制得金针菇菇根超微粉，置于_20°C备用。原料预处理称取15g金针燕燕根超微粉,加入适量85%无水こ醇,室温下静置2h以除去部分色素及杂质，5000r/min离心IOmin取沉淀,备用。I、热水浸提金针菇菇根粗多糖(对照)(I)取经过こ醇预处理的沉淀物，以原料为基准，按水料比28mL/g加入420mL去离子水充分混匀，在80°C水浴中浸提4h(浸提期间可以适时搅拌)；(2)浸提液5000r/min离心15min取上清,上清液采用Sevag试剂(正丁醇三氯甲烧=I : 4)法去蛋白，8000r/min条件下离心IOmin取上清；(3)上清液置旋转蒸发仪(N-1100EYELA型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社)50°C减压浓缩至适量，浓缩液加4倍体积无水こ醇于4°C冰箱沉淀12h ；(4) 5000r/min离心15min取沉淀物，沉淀物置60°C烘箱烘干，即可得到热水浸提的金针菇菇根粗多糖。粗多糖得率为9. 51%，提取时间为240min。2、超声提取金针菇菇根粗多糖(本发明)
(I)取经过こ醇预处理的沉淀物，按水料比28mL/g加入420mL去离子水充分混匀，用DCTZ-2000多用途恒温超声提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)在功率为680W下超声19. 8min ；(2)浸提液5000r/min离心15min取上清,上清液采用Sevag试剂(正丁醇三氯甲烧=I : 4)法去蛋白，8000r/min条件下离心IOmin取上清；(3)上清液置旋转蒸发仪(N-1100EYELA型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社)50°C减压浓缩至适量，浓缩液加4倍体积无水こ醇于4°C冰箱沉淀12h ；(4) 5000r/min离心15min取沉淀物，沉淀物置60°C烘箱烘干，即可得到超声波提取的金针菇菇根粗多糖。粗多糖得率为16. 20%，所用时间为19.8min。 如图I所示，采用本发明与传统的热水提取相比，金针菇菇根粗多糖得率提高了70%，时间缩短了 92%。3.活性测定(I)在96孔板中每孔加入100 μ L对数生长期的巨噬细胞RAW264. 7细胞悬液，终浓度为2 X IO5个/mL，置于5% C02、37°C培养箱(HEPA ClasslOO细胞培养箱)培养4h。(2)弃去培养液，每孔加入100 μ L DMEM培养基配制不同浓度的粗多糖、FSP-I、FSP-2、FSP-3溶液。每种样品分为4组，第I组加入DMEM培养基，为正常对照组；第II组到第IV组分别加入5 μ g/mL、25 μ g/mL和50 μ g/mL的多糖溶液，每组设4个平行。(3)将96孔板置于5% C02、37°C培养箱培养20h后，每孔加入10 μ LCCK-8溶液，室温震摇lOmin，继续培养4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。巨噬细胞増殖率计算公式如下巨噬细胞増殖率=A1Atl，其中A1为样品组平行试验的吸光值，Atl为正常对照组平行试验的吸光值。金针菇菇根多糖及其纯化组分对巨噬细胞増殖率的影响如图3所示，除了 FSP-3夕卜，粗多糖、FSP-I和FSP-2对巨噬细胞的增殖率都大于1，说明粗多糖、FSP-I和FSP-2能够促进巨噬细胞増殖。表I Box-Behnken试验设计各因素的试验水平及编码
编码及水平
因素符号-
-I O +1超声功率X1440 560 680 超声时间 X2 10 15 20
_ —水料比X310 20 30表2 Box-Behnken试验设计及其响应值
权利要求
1.一种从金针菇菇根废料中提取具有细胞免疫活性多糖的方法，其中金针菇菇根为金针菇加工过程中，作为废料被切除的根蒂部分，包括 1)称取金针菇菇根超微粉，加入85%乙醇室温下静置2h以除去部分色素及杂质，离心取沉淀,再加入去离子水,去离子水的用量为10 50mL/g，利用恒温超声提取机，以200 680W超声提取5 25min,离心取上清液；上清液采用Sevag法去蛋白，8000r/min条件下离心IOmin取上清； 2)使用旋转蒸发仪将上清浓缩，向浓缩液中加入4倍体积无水乙醇，4°C下醇沉12h，5000r/min离心15min取沉淀,于60°C烘箱烘干得到金针燕燕根粗多糖粉末； 3)将制得的粗多糖粉末用去离子水配成10mg/mL溶液，使用DEAE-纤维素-52层析柱，依次用去离子水、0. 1,0. 3mol/L NaCl溶液梯度洗脱，依次获得3个组分；并通过小鼠巨噬细胞RAW264. 7培养实验，发现金针菇菇根粗多糖及其纯化产品具有免疫调节活性。
全文摘要
本发明涉及一种从金针菇菇根中提取具有细胞免疫活性多糖的方法，属于生物医药领域。金针菇菇根是金针菇加工过程中，作为废料被切除的根蒂部分，将金针菇菇根烘干、粉碎，制得金针菇菇根超微粉。先将粉碎后的超微粉，加适量85％乙醇室温下浸泡2h，离心取沉淀，以原料为基准，按水料比28mL/g加去离子水，于680W超声处理19.8min，离心取上清液，上清液旋转蒸发浓缩至适量，浓缩液加4倍体积无水乙醇，4℃下沉淀12h，离心取沉淀，沉淀物置60℃烘箱烘干，即得到金针菇菇根粗多糖。采用超声波提取技术，多糖得率为16.20％，与传统的热水浸提相比，得率提高了70％，时间缩短了92％。
文档编号C08B37/00GK102702378SQ20121021969
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者傅亚欣, 安辛欣, 方勇, 杨文建, 杨方美, 林德祥, 胡秋辉, 赵立艳, 辛志宏, 郑惠华, 陈坤, 马宁 申请人:南京农业大学, 南京财经大学