专利名称：低分子量透明质酸的制造方法
技术领域：
本申请将于2009年9月15日申请的韩国专利申请第10-2009-0087185号作为优先权，上述说明书是本申请的参考文献。本发明涉及保持高分子透明质酸的粘度和弹性及吸收水分等固有的特性而制造成低分子透明质酸的方法，具体涉及通过与透明质酸反应的分解媒介物种类和高效率的低分子生成条件的、便于在工业中适用的高品质的低分子透明质酸的生产方法。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronicacid (HA)、Hya Iuronan、(C14H20NNaO11) η (η > 1000))是存在于所有生物体的高分子，是被称为glycosaminoglycan的多糖类。是如[图I]的结构，β-1，3 结合的 D-glucuronic acid 和 N-acetylglucosamine 以一个单位(one unit)反复连接β -I，4结合的结构。是水溶性物质，有用的分子量达到1，000 13，000，OOODa (道尔顿、daltons)的广泛的直链结构。透明质酸是在1934年首次被Meyer和Palmer从牛眼的玻璃状液发现，多分布在皮肤、眼睛的玻璃状体、关节液、肌肉、胎盘、鸡冠等，因此也可从上述器官分离提取。据悉特别是多分布在胎盘或关节内，大部分的生产是从鸡冠提取。但从生物体生产透明质酸难以分离软骨素等高分子，并且也有很大动物来源的病原性物质的负担。透明质酸是盐结构，体现优秀的功效，并且保湿效果卓越，因此在物理性摩擦状态下起到强烈的润滑作用，因此功能非常优秀，具有防止细菌侵入效果等功效和有关物性的卓越的优点，因此最近流行开发很多应用透明质酸的产品。上述优点不仅可以起到医药品或化妆品的功能，还可以适用于医药部外品和生物材料及食品，并可持续以透明质酸为基础的新领域的开发。高分子透明质酸的功能性的方面是粘度上升或关节润滑作用及水分吸收及弹性能力等结合，作为医药品扩展到眼科用及膝关节注射液或滴眼液等领域，并且鉴于最近全球爆发性的透明质酸市场增大现象，可预测对开发衍生物的可能性。比起高分子透明质酸的功能，低分子不及高分子。但最近因对低分子的体内吸收能力的再度关注，低分子透明质酸作为被要求组织内吸收能力的化妆品或食品等的用途而逐渐受到瞩目。从而，需要开发低分子透明质酸，也需要维持透明质酸的固有功能的同时降低分子量的技术。关于降低高分子透明质酸的分子量的方法有很多通过论文或专利报道。首先有根据酸和碱的加水分解方法(日本特开63-57602、特开平1-266102、Y. Tokita et al.、Polymer Degradation and Stability、48、269_273、1995)。该方法除了增加新的工序之夕卜，还有处理后需要以PH规格内的值增加或减少的不便。不仅根据透明质酸的浓度pH的变化速度不同，在实际生产工厂也难以进行生产。并且确认了随着PH的调整发生增加杂质的现象，特别是增加内毒素的数值，因此增加了去除杂质的分离精制工序的费用。在适当的PH下用高温加热或利用超音波的分解方法，需要引进新设备，也在分离精制工序中发生不必要的费用增加。并且利用次氯酸等氧化剂的方法(日本特开平2-245193)、利用过氧化氢的方法(日本特开平2-22301)、利用过硫酸铵的分解能力的方法(韩国专利授权10-0369517)也可得到其加水分解能力的认证，但需要去除投入的分解材料，并且存在因内毒素或新的杂质的形成而导致品质下降的可能性。上述的将高分子透明质酸进行低分子化的方法，因为在分离精制工序途中为了调节分子量而新投入的分解促进剂，只存在分解作用。因停止分离工序中的改善原料品质的工序，并要考虑用于调节分子量的新设备的引进或费用的增加，因此效率低，其结果处理过程更加复杂，并且因工序的增加，需要的时间也增加，导致费用增加，因此大量生产的工业方面是极其非经济的因素。
发明内容
需要解决的课题由此，本发明者将高分子透明质酸进行低分子化的方法中，在研究能够同时解决去除杂质和调节分子量这两个因素的方法的过程中，发现在适当的条件下将透明质酸与与活性炭进行接触时，透明质酸的品均分子量减少，从而完成了本发明。本发明提供一种将高分子透明质酸进行低分子化时，解决公知方法中产生杂质而发生的品质低下的问题和随着增加复杂的工序而产生的费用增加等非效率性，从而节省高品质的低分子透明质酸的生产费用的方法。从而，本发明的目的是提供包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的低分子量的透明质酸的制造方法。并且，本发明的另一目的是提供包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的透明质酸的分子量减少方法。本发明的技术解决方案在于为了达到上述目的，本发明提供包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的低分子量的透明质酸制造方法。为了达到本发明的另一目的，本发明提供将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的透明质酸的分子量减少方法。本发明提供为了利用微生物培养或从鸡冠提取或其他方法获取的高分子透明质酸制作成一定分子量的低分子透明质酸，使用活性炭为反应媒介物的方法。本发明中使用的高分子透明质酸可通过微生物培养或从鸡冠提取或其他方法获取。下面介绍通过培养微生物高分子获取透明质酸的一例。链球菌内ID9102(KCTC11395BP)采纳为透明质酸的生产群组，葡萄糖40_100g/L、酵母X 2-5g/L、老蛋白胨10-20g/L、硫酸镁O. 5-lg/L、磷酸一氢钾l_5g/L、氯化钠2_10g/L、谷氨酸O. 1-lg/L、pH6. 0-7. 0、32_37°C、0. I-Ivvm的好气条件下在75L发酵槽培养时，在
4-6g/L范围内可维持透明质酸的生产性，并可生产平均分子量200万-400万Da的透明质酸。含有透明质酸的培养物用公知的方法即圆心分离或压滤机、厚度过滤器、薄膜过滤等除去菌体，并将其滤液用作本发明的高分子透明质酸。在本发明中，高分子透明质酸根据活性炭和其他低分子化反应条件被分解成具有、特定范围的平均分子量的低分子透明质酸。本发明提供包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的低分子量的透明质酸的制造方法。本发明的方法，其特征在于，包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤。本发明的透明质酸(Hyaluronicacid (HA)、Hyaluronan、(C14H20NNaO11) η (η >1000))是存在于所有生物体的高分子,是指叫做葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)的多糖类。本发明的透明质酸具有如[图I]的结构。本发明的透明质酸可从鸡冠等 生物体组织分离精制而获取，并且可从通过遗传工程学方法而形质转换的微生物生产。使用于本发明方法的材料的透明质酸可通过上述方法制作或购买商业性销售物。在本发明的方法中使用的透明质酸的平均分子量没有特别的限制。例如在本发明的方法中使用的透明质酸的平均分子量可为10万Da至1300万Da、100万 Da 至 1300 万 Da、350 万 Da 至 1300 万 Da、350 万 Da 至 1000 万 Da、350 万 Da 至 800 万Da，优选地，可为350万Da至1300万Da，更加优选地，可为350万Da至800万Da。本发明的一实施例中，将具有生产透明质酸能力的链球菌内ID9102(KCTC11395BP)作为透明质酸生产菌株，并在葡萄糖40-100g/L、酵母X 2-5g/L、老蛋白胨10-20g/L、磺酸镁O. 5_lg/L、磷酸一氢钾 l_5g/L、氯化钠 2-10g/L、谷氨酸 O. l-lg/L、pH6. 0-7. 0,32-37°C >O. 1-lvvm 的好气条件在75L发酵槽进行培养而获得了透明质酸。活性炭(activatedcarbon)是指吸附性强，并且大部分的构成物质为炭质的物质。其制造方法是将木材、褐煤、泥炭等用活性剂即氯化锌或磷酸等药品进行处理而使其干燥或将木炭用水蒸气进行活性化而制造。通常活性炭制造成粉末状态或颗粒状态，有时也将粉末状制造成颗粒状而使用。用途主要为吸附剂而使用于吸附气体或湿气，另外还可用于溶剂的回收剂和气体的净化用或脱色剂等广泛的用途。本发明的活性炭可亲手制造或购买商业中销售的而使用。本发明的方法中使用的活性炭，其种类没有特别的限制，例如，可为粒状活性炭、粉末活性炭、成型活性炭，优选地，可为粉末活性炭。粉末活性炭有水蒸气活性法活性炭和药品活性法活性炭，活性法没有特别的限制。上述接触的步骤其接触方法没有特别的限制，但优选地，以微生物培养方法而精制的含有透明质酸精制培养液或将透明质酸稀释于溶剂的透明质酸稀释液中投入活性炭而分散来完成制造。上述用于稀释透明质酸的溶剂没有特别的限制，但例如可为水或碳数I至6个的低级酒精和水的混合溶剂，优选地，可为水。上述含有透明质酸精制培养液或透明质酸稀释液中透明质酸的浓度没有特别的限制，例如可以是O. 01至90%、0. I至50%、0. I至30%或者O. I至10%。优选地，可以是O. I 至 10%。根据上述接触，透明质酸进行反应，其结果分子量减少。上述反应是指对应刺激而发生某种现象或物质之间发生的化学变化。本发明的制造方法可附加上述反应结束后从反应液中取得透明质酸的步骤。从上述反应液取得透明质酸的方法可为任何已知的分离及精制方法，通常为了解除活性炭等可进行圆心分离、过滤等，并可进行电泳及各种柱状色谱分离法等。.上述色谱法将离子交换色谱法、凝胶渗透色谱、HPLC、反相高效液相色谱-HPLC、亲和性柱状色谱分离法及超细过滤等技法单独或组合适用而取得透明质酸。本发明的方法具有减少透明质酸的分子量的效果。在本发明的方法中透明质酸与活性炭的比例没有特别的限制，但优选地，为I 2 6。本发明的方法中，将透明质酸与活性炭进行接触的温度及时间没有特别的限制，可根据与活性炭接触前透明质酸的分子量及要获得的透明质酸的分子量而不同，优选地，温度为25°C 45°C，更加优选地，为35°C 45°C。优选地，接触时间为3小时 18小时，更加优选地，为6小时 18小时。活性炭的比例或接触的温度越高，每小时透明质酸的分子量减少率越高，并且接触时间越长，接触之后制造的透明质酸的平均分子量就会越减少。根据本发明的方法制造的透明质酸的平均分子量可根据与活性炭接触之前透明质酸的分子量、活性炭的比例、接触温度及时间而不同，因此没有特别的限制，例如根据本发明的方法制造的透明质酸的平均分子量可为I万Da至300万Da、I万Da至10万Da、10万Da至50万Da、50万Da至100万 Da、100 万 Da 至 200 万 Da、200Da 万至 300 万 Da、300 万 Da 至 400 万 Da、400 万 Da 至 500万 Da、500 万 Da 至 600 万 Da、600 万 Da 至 700 万 Da、700 万 Da 至 800 万 Da、800 万 Da 至 900万Da。根据本发明的方法制造的透明质酸的平均分子量，优选地为I万Da至300万Da，更加优选地，为10万Da至200万Da。本发明的方法工序简单，透明质酸分子量减少率的控制因素为活性炭的量、温度及时间等极其容易控制的，并且因随着控制因素的变化透明质酸的分子量减少率比较规则地变化，因此对制造具有一定分子量的透明质酸很有用。并且通过微生物培养制造透明质酸时，具有去除在培养液中大量含有的内毒素的效果。根据本发明的制造方法通过简单的工序能够有效地生产具有特定分子量的透明质酸，并且通过调整活性炭的量、温度及时间容易并稳定地调整所生产的透明质酸的分子量。并且本发明提供包括使透明质酸与活性炭进行接触的步骤的透明质酸的分子量减少方法。透明质酸通过与活性炭的接触而分子量减少是通过本发明首次公开的。在本发明中，与活性炭接触的透明质酸及其分子量、活性炭及活性炭种类、透明质酸和活性炭的比例、接触方式、接触环境(溶剂、透明质酸的浓度等)、接触温度及时间、接触效果、与活性炭接触结果分子量减少的透明质酸的分子量及其他效果等有关的事项与在上述制造方法中记载相同。
上述本发明的特征可通过本发明的实施例详细了解。在本发明的一实施例中，培养链球菌内的透明质酸生产菌株而制造了透明质酸并精制之后，将各种比例的活性炭分散到精制的培养液中，在各种温度条件下进行不同时间的接触，之后回收透明质酸并测定了其分子量。在25度至45度的条件下接触3小时至18小时的结果，确认用350万Da的透明质酸可制造I万Da至300万Da的各种分子量的透明质酸。在本发明的另一实施例中，将从鸡冠分离、精制的透明质酸稀释并进行相同的试验而测定了其结果。其结果确认将从鸡冠分离、精制的透明质酸进行稀释使用时，与使用利用透明质酸生产菌株的培养物的情况相同，可制造分子量发生减少的透明质酸。从而确认，本发明的方法与透明质酸的制造方法或透明质酸与活性炭的接触环境无关而能够有效地减少透明质酸的分子量。在本发明的一实施例中，具有350万的平均分子量的透明质酸通过It培养生产，并在反应温度45°C下，与透明质酸重量的4倍的活性炭进行4小时反应，而制造平均分子量为200万Da的透明质酸。本发明的另一实施例中，在于上述实施例相同的条件 下，将反应时间设定为6，7小时或小时而制造了透明质酸并测定了其平均分子量。其结果根据反映时间分别可制造平均分子量为100万Da、50万Da及10万Da的透明质酸。从而本发明的方法可通过活性炭的比例、温度、反应时间等各种因素的调整，容易调整制造的透明质酸的分子量，并且确认了本发明的制造方法为便于在工业中适用的高品质的低分子透明质酸制造方法。本发明的技术效果在于根据本发明的高分子透明质酸的低分子化方法，比起需要pH处理的条件或各种反应催化剂及加热等复杂的附加处理条件的公知的方法，工序简便、没有为了去除投入的材质的再处理的不便，同时还具有去除杂质的效果，因此简便又经济，其能够生产低分子透明质酸。根据本发明的低分子化方法，可根据变更利用活性炭的反应条件，而调整低分子透明质酸的分子量。根据本发明生产的低分子透明质酸可保持透明质酸固有的特性的同时以适合医药品规格而制造，并且以适合化妆品或食品用的规格而制造。
图I为D-葡萄糖醒酸(D-glucuronic acid)和N乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)与β_1,3和β-1,4进行结合的透明质酸的反复单位的图。图2为在25°C之下，根据各种活性炭的种类和各自的浓度，透明质酸的分子量发生各种变化的图表。(2X、4X、6X :相对于透明质酸而投入的活性炭的量，分别表示2倍、4倍及6倍，CAUCGSP, CASP, CNU SX-PLUS, SX-ULTRA, DARCO KBB, DARCO A-51 :使用的活性炭的种类，分别表示 Norit CAU Norit CGSP、Norit CASP、Norit CNU Norit SX-PLUS, Norit SX-ULTRA,Norit DARCO KBB、Norit DARCO A-51).图3为在35°C下，根据各种活性炭的种类和各自的浓度，透明质酸的分子量发生各种变化的图表。(2X、4X、6X:相对于透明质酸投入的活性炭的量，分别表示2倍、4倍及 6 倍，CAl、CGSP、CASP、CNl、S-51HF、SA-SUPER、SX-PLUS, SX-1G、SX-ULTRA, PAC-200C、DARC0KBB、DARCO A-51 :使用活性炭的种类，分别表示 Norit CAU Norit CGSP, NoritCASP、Norit CNU Norit S-51HF、Norit SA-SUPER、Norit SX-PLUS, Norit SX-1G、NoritSX-ULTRA、Norit PAC-200C、Norit DARCO KBB、Norit DARCO A-51)图4为在45°C下，根据各种活性炭的种类和各自的浓度，透明质酸的分子量发生各种变化的图表。(2X、4X、6X:相对于透明质酸投入的活性炭的量，分别表示2倍、4倍及 6 倍，CAl、CGSP、CASP、CNl、S-51HF、SA-SUPER、SX-PLUS, SX-1G、SX-ULTRA, PAC-200C、DARCOKBB、DARCO A-51 :使用的活性炭的种类、分别表示 Norit CAU Norit CGSP, NoritCASP、Norit CNU Norit S-51HF、Norit SA-SUPER、Norit SX-PLUS, Norit SX-1G、NoritSX-ULTRA、Norit PAC-200C、Norit DARCO KBB、Norit DARCO A-51).
具体实施例方式以下详细说明本发明。本发明中溶液内存在的透明质酸的浓度根据咔唑方法(T. Bitter、Anal.Biochem.、1962、4、330-334)而得到了确认。透明质酸的平均分子量是通过凝胶过滤色谱法(Narlin B. Beaty et al、Anal. Biochem.、1985、147、387_395)而获取的。分析条件如下。柱使用了Toyo Soda TSK gel G6000PWXL，流动相是 150mM NaCl、3mM Na2HP04(pH7. 0),0.02%NaN3,检验(Detection)使用了折射率检测器(refractive index detector) (Shodex),标准物质是将聚环氧乙烧(polyethylene oxide)以2mg/ml浓度制造而使用的。内毒素使用了美国临床医药开发商查尔斯河试验室国际公司韩国分公司销售的LAL试剂(LALreagent)而定量。在不超过最大有效稀释倍数的范围内将稀释倍数定位3point而进行了稀释。确认了阴性对照组内未检测出内毒素，并通过积极的产品控制(positive product control)确认没有反应干扰因素。在以下实施例中更加详细地说明根据将从微生物中提取的高分子透明质酸和从鸡冠中提取制造的高分子透明质酸分别调节为一定浓度之后制造成低分子透明质酸的媒介物即活性炭和根据详细反应条件的变化的低分子透明质酸的生产方法和生成的低分子透明质酸的平均分子量的变化。但，下述的实施例只是例示本发明，本发明的范围并不限定为实施例。<实施例1>
_0] 利用CAl活性炭制造低分子透明质酸的方法本实施例中，生产低分子透明质酸的原料使用了将链球菌内ID9102(KCTC11395BP)作为生产菌株而培养获得的培养物中分离精制的调整物，并且在原料中包含的透明质酸的平均分子量为350万Da，内毒素的浓度远超过O. 5EU/mg。首先培养条件为如下。将链球菌内的ID9102(KCTC11395BP)作为透明质酸的生产菌株，葡萄糖40_100g/L、酵母X2-5g/L、老蛋白胨10-20g/L、磺酸镁O. 5-lg/L、磷酸一氢钾l_5g/L、氯化钠2_10g/L、谷氨酸O. 1-lg/L、pH6. 0-7. 0、32-37°C、0. 1-lvvm的好气条件在75L发酵槽中进行了培养。反应的基本条件如下。为了使通过超细过滤精制的透明质酸和Norit CAl (以下称为CA1，Norit社、荷兰，以下实施例中使用的带有Norit的活性炭的制造社为Norit社)活性炭具有适当的搅拌力和反应性，将透明质酸以2. 5gHA/L的浓度统一调整，在IL的玻璃烧杯分别分注300ml，CAl活性炭以相对于透明质酸浓度2倍、4倍、6倍的浓度投入玻璃烧杯内之后，将特氟龙材质的转子(直径5cm)以300rpm的速度旋转而维持一定的反应条件,到为了反应结束为止最大限度防止杂质的混入或反应液的蒸发等，除了转子旋转部分剩余的用盖密封。反应温度分别以25°C、35°C、45°C的条件而实施。3小时、6小时、18小时反应后，采取各样本，根据上述分析方法分析了内毒素、透明质酸浓度、平均分子量，并取得了如[表I]的结果。可确认随着反应温度的增加，CAl活性炭的分解能力增加，而使透明质酸低分子化的速度加快。在25°C、CA12X的条件下6小时可获取200万Da的透明质酸，18小时可获得150万Da的分子量。在25°C、CA14X下18小时可获得约100万Da的分子量，CA16X条件下6小时可分解为约100万Da、18小时可分解为约50万Da的分子量。35°C时，比起25°C在反应性低2X的浓度中，显现了与25°C同等水准的分子量分解能力。确认35°C、6X的条件下18时间即可制造13万Da的分子量。45°C时，比35°C时反应性低2X的浓度下也显现了同等水准的分子量分解能力。6X时确认可制造I. 5万Da的分子量。确认了在所有的反应条件下，内毒素为O. 5EU/mg以下，反应温度的增加将更加有效地减少更多的内毒素。并且透明质酸的浓度在整体反应条件下可维持92%以上的浓度，因此没有消失的危险。表ICAl活性炭与透明质酸溶液反应后结果
权利要求
1.一种包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的低分子量透明质酸的制造方法。
2.根据权利要求I所述的低分子量透明质酸的制造方法，其特征在于所述透明质酸与活性炭的比例为I : 2 6。
3.根据权利要求I所述的低分子量透明质酸的制造方法，其特征在于将所述透明质酸与活性炭进行接触的温度为25°C至45°C，将所述透明质酸与活性炭进行接触的时间为3小时至18小时。
4.一种包括将透明质酸与活性炭进行接触的步骤的透明质酸的分子量减少方法。
全文摘要
本发明涉及将通过链球菌内ID9102生产的高分子透明质酸制造成低分子透明质酸的方法。具体地，本发明涉及将高分子透明质酸和活性炭在一定分解条件下进行反应，维持透明质酸固有的特性的同时一定地减少透明质酸分子量的方法。根据本发明的高分子透明质酸的低分子化方法，比起需要pH处理的条件或各种反应催化剂及加热等复杂的附加处理条件的公知的方法，工序简便、没有去除投入的材质的再处理的不便，反而还具有去除杂质的效果，因此简便又经济，能够高纯度生产低分子透明质酸。根据本发明的低分子化方法，具有可根据变更利用活性炭的反应条件，而调整低分子透明质酸的分子量的优点。根据本发明生产的低分子透明质酸可保持透明质固有的特性的同时以适合医药品规格而制造，并且以适合化妆品或食品用的规格而制造。
文档编号C08B37/08GK102630231SQ201080041200
公开日2012年8月8日 申请日期2010年9月15日 优先权日2009年9月15日
发明者任种赫, 姜大中, 康在勋 申请人:一栋制药株式会社