专利名称：：乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物的纯化及其纳米粒子的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物(Folate-conjugatedpullulanacetate,FPA)的纯化及其纳米粒子(Folate-conjugatedpullulanacetatenanoparticles,FPAN)的制备方法。
背景技术：
：纳米药物载体是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布，控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的纳米级别的体系，理想的药物输送载体具有以下特征(WimHDeJong,etal.，IntJNanomedicine.2008,3(2)133-149；S.M.Moghimi,etal.，FASEBJ.2005,19(3)311-330；KarinaR,etal.，AdvDrugDelivRev.2008,60(8):929_938)能对药物进行包封和很好地释放、结构稳定、生物相容性好、低毒性和具有生物分布和靶向能力以及作用，另外，还需要输送药物后很好的生物降解性。靶向的药物载体研究成为近年来研究的热点，肿瘤分子靶向治疗是指在肿瘤分子细胞生物学的基础上，利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性(或相对特异的)结构分子作为靶点，使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一类疗法。这种治疗方法具有较低的不良反应和良好疗效，能明显提高患者的生活质量，是现在肿瘤治疗领域的突破性和革命性的发展，代表了肿瘤生物治疗目前的最新的发展方向。叶酸是一种小分子量的维生索，其受体是一种糖蛋白，在人类癌症，包括卵巢、大脑、肾、乳房、脊髓细胞和肺等的恶性肿瘤，叶酸受体高于正常水平；而在绝大多数正常组织中，几乎不表达。利用叶酸对叶酸受体的高度亲和性，可用于将药物或载体材料与叶酸偶联，将药物靶向输送至肿瘤。以叶酸(或其类似物)为配体，从小分子放射性显像剂到大分子基因药物都可与叶酸高效结合，并被转运进入细胞，叶酸连接的载体材料对叶酸受体高表达的肿瘤细胞也具有明显的靶向作用。制备纳米药物载体的材料可以分为合成材料和天然材料，其中，多糖广泛存在于自然界，是比较容易得到的一类重要的天然材料，含有羟基(-0H)、羧基(-C00H)和氨基(-NH2)等亲水性基团，可反应基团较多，很容易被修饰和改性，生成很多种衍生物，已经被广泛用于纳米药物及纳米药物载体的研究(ZonghuaLiu,etal.，AdvDrugDelivRev.2008,60(15)1650-1662)。普鲁兰多糖(Pullulan)由于具有良好的耐酸碱性，可塑性强，成膜性好，透气性低，无吸湿性，水溶液粘度明显低于其它多糖溶液，近年来，科研人员逐渐认识到普鲁兰多糖的无毒，无致突变作用，良好生物相容性以及可生物降解性，可以作为一种良好的生物材料运用在药物、基因递送和组织工程等领域(RRMetal.,TrendsBiomaterArtifOrgans,2007,20(2)116-121；LeathersTD,etal.,ApplMicrobiolBiotechnol.2003,62(5-6)468-473；ShingelKI,etal.，CarbohydrRes.2004，339(3)447-460)。早在1986年，Motozato(MotozatoY，etal.,JChromatogra.1986,55:434_437)发现水溶性普鲁兰多糖经乙酰化改性可生成疏水性的乙酰普鲁兰多糖，这种物质容易通过溶剂挥发法制成微球。2003年，Jung等(JungSff,etal.，IntJPharm,2003,254(2)109-121)发现改变醋酐和吡啶的投料量可制备出不同取代度的乙酰普鲁兰多糖，用透析方法可制备出不同粒径的纳米粒子，荧光探针法研究证明纳米粒子是通过自组装方法形成，临界胶束浓度随乙酰取代度增加而减小，此纳米粒子包载疏水性药物后可延缓药物的释放。将乙酰普鲁兰多糖与氨苯磺胺偶联(PA/SDM)连接可形成pH敏感性纳米凝胶颗粒(NaK，etal.，JControlRelease.2003，87(1-3):3_13)，另外，本试验室还将乙酰普鲁兰多糖采用溶剂扩散法制备纳米粒子，并将其作为抗肿瘤药物载体进行了研究(ZhangH.Z,etal.，ColloidSurfB.2009,71(1)19-26)，体外采用MTT法考察了其对正常成纤维细胞和Hela癌细胞的毒性。乙酰普鲁兰多糖结构中残存的羟基还可以与配体结合形成靶向性载体材料，如引入生物素制成生物素受体靶向纳米载体(NaK，etal.，EurJPharmSci.2003，18(2):165-173)，对生物素受体高表达肿瘤细胞有特异靶向作用，细胞摄取纳米粒子的量随生物素取代度的增加而增加；我们的前期研究(Hui-zhuZhang,etal.,DrugDelivery,2010；17(1)48-57)也已经成功合成了叶酸乙酰普鲁兰多糖偶联物，并应用溶剂扩散法制备了纳米粒子，试验结果表明连接叶酸后的载药纳米粒子进入细胞主要通过叶酸受体途径，提示叶酸偶联纳米粒子通过叶酸受体途径进入细胞，可增加对肿瘤组织的选择性，增强抗肿瘤疗效，因而是一个很有发展前途的抗肿瘤药物载体，但是，这种材料的合成有两个步骤，如何将反应产物进行分离纯化至关重要，另外，当合成的材料乙酰基取代度较低、叶酸取代度较高时，采用溶剂扩散法制备纳米粒子，注入分散液中的针头会带有少量絮状物，所制备的纳米溶液乳光不强，纳米悬液中有可见悬浮颗粒，高速离心(20000转/分钟，4°C，15min)后，溶液仍有有较强黄色，所收集到的纳米粒子很少，大部分材料采用这种方法均不能成纳米粒子。CN200810052708.6公开了叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒子的制备。本发明在前期研究基础上将产物应用常规试剂无水乙醇进行沉淀，碳酸钠缓冲液进行透析来进行分离和纯化，另外，通过透析法将这种材料制备纳米粒子作为药物载体，以上研究均未见任何文献或专利报道。
发明内容本发明的目的是提供一种乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物的纯化方法及其纳米粒子的制备方法。采用无水乙醇为沉淀试剂，和沉淀试剂甲醇比较，毒副作用明显减小。对于叶酸取代度较高的乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物而言，采用用透析法制备纳米粒子显著提高纳米粒子的产率，形态规则，粒径均勻，纳米粒子表面所带电荷低，稳定性好。步骤少，操作简单，无需加入稳定剂、乳化剂等试剂。该材料具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性。本发明提供的一种乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物的纯化及其纳米粒子的制备方法包括的步骤1)将叶酸与乙酰普鲁兰多糖溶液在催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亚胺(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)类脱水剂作用下反应，反应温度为2528°C，反应时间为57天(根据需要合成产物的取代度选择)，使缩合成叶酸_乙酰普鲁兰多糖偶联物；所述的普鲁兰多糖分子量范围为4，000200，OOODa02)将反应中生成的1，3-二环己基脲(D⑶)沉淀过滤除掉，滤液滴加入过量无水乙醇(体积比为150150)中沉淀，离心(速度为30008000转/分钟，时间为520分钟和4°C)收集沉淀；3)用碳酸钠缓冲液透析2448h以除尽游离叶酸，去离子水透析24_48h除去其他的小分子。所述透析袋为截留分子量为8000-14000的透析袋。4)真空干燥或冻干，得黄色粉末。所述的乙酰普鲁兰多糖溶液为溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的溶液。所述的乙酰普鲁兰多糖叶酸DCCDMAP=10.350.361.50.170.6(摩尔比)。本发明提供的一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖纳米粒子制备方法乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物完全溶解于与水混溶的有机溶剂中(有机相)，将溶解液转移至透析袋中进行透析。有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚飒(DMSO)或者其他有机溶剂以及有机溶剂和水按照一定比例稀释的溶剂。所述透析时间为2448h，开始间隔12h换1次水，换4次后间隔46h换一次水。透析2448h后，可直接得到纳米粒子悬液。本发明提供的一种叶酸受体介导靶向乙酰普鲁兰多糖包载药物纳米粒子(EpirubicinloadedFPAN,EPI-FPAN)制备方法是以乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物为载体，包埋抗肿瘤药物，粒径为250500nm。所述的包载药物纳米粒子的制备方法是将药物和材料分别溶解于有机溶剂中，药物和材料按照一定的比例进行混合，充分混勻后转移至透析袋中进行透析。所述的抗癌药物与叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖纳米粒子的质量比为11050。所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚飒(DMSO)或者其他有机溶剂以及有机溶剂和水按照一定比例稀释的溶剂。所述透析袋为截留分子量为8000-14000Da的透析袋。所用透析液为去离子水或者重蒸水。所述透析时间为2448h，开始间隔12h换1次水，换4次后间隔46h换一次水。所述的包载药物为表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、全反式维甲酸、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱等。本发明所述的叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖纳米粒子形态呈球形，粒径分布范围小，电位绝对值小，纳米粒子和载药纳米粒子结构比较稳定，纳米粒子静脉注射给予动物后体内未见明显无毒副作用。该材料具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性，而且各种原料廉价易得，制备工艺简单，制备条件可控，是一种较好的具有肿瘤靶向的载体材料。图1为FPAN粒径分布图。图2为FPAN的Zeta电位测定图。图3为EPI-FPAN粒径分布图。图4为EPI-FPAN的Zeta电位测定图。图5为FPAN透射电镜照片。图6为EPI-FPAN透射电镜照片。图7为小鼠主要脏器的HE染色病理组织切片照片。具体实施例方式实施例1叶酸乙酰普鲁兰多糖偶联物的沉淀和纯化方法将Ig(2.27mmol)叶酸用15ml二甲基亚砜(DMSO)溶解，滴加5滴三乙胺，搅拌使完全溶解，加入0.9g(4.4mmol)N,N，-二环己基碳二亚胺(DCC)，0.25g(2.05mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌反应Ih后加入溶解于6.15mlDMSO中的0.615g乙酰普鲁兰多糖，电磁搅拌下避光反应5天。过滤除去D⑶沉淀，滤液滴加入250ml无水乙醇溶液中，离心(8000转/分钟，4°C，离心15min)收集黄色沉淀，碳酸钠缓冲液中透析24h，去离子水中透析48h，冻干或者真空干燥，得黄色粉末，即为叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖衍生物。所得叶酸偶联乙酰普鲁兰多糖衍生物的氢核磁光谱(1H-NMR)和本实验室前期合成产物基本一致(CN200810052708.6)。在FPA1H-NMR中δ6.75-8.77ppm处出现叶酸的特征峰，说明叶酸与乙酰普鲁兰多糖通过化学键相联(图略)。实施例2=FPA纳米粒子的制备准确称取48mg乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物溶解于4.8ml二甲基亚砜中，浓度为10mg/ml，将溶解液转移至透析袋进行透析，透析袋截留分子量为14000Da，透析液为去离子水，开始间隔12h换1次水，换4次后间隔46h换一次水，总共透析48h。最终溶液为带黄色乳光的溶液，转移至带刻度的离心管中，IOOW超声3分钟后即为最终纳米粒子悬液，最终浓度为所加入的材料(48mg)和最终纳米粒子溶液的体积(12ml)比，为4mg/ml。可根据实验需要用水或者其他溶液进行稀释至目的浓度，或者高速离心(18000转/分钟，4°C，离心15min)收集纳米粒子，加入水或者其他溶液进行重新分散至目的浓度。实施例3包载表阿霉素的FPA纳米粒子的制备准确称取乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物40mg，溶解于3.2ml二甲基亚砜中，使浓度为12.5mg/ml。表阿霉素IOmg溶解于2ml二甲基亚砜中，浓度为5mg/ml，加入4.9μ1三乙胺(2倍摩尔量)，室温条件下避光搅拌12h使表阿霉素脱盐酸。将药物/材料溶液按41体积比混合，将溶解液转移至透析袋进行透析，透析袋截留分子量为lOOOODa，透析液为去离子水，开始间隔12h换1次水，换4次后间隔46h换一次水，总共透析48h。最终溶液为带橘红色乳光的溶液，转移至带刻度的离心管中，100W超声3分钟后即为最终纳米粒子悬液，最终浓度为所加入的材料(40mg)和最终纳米粒子溶液的体积(7ml)比，为5.7mg/ml。可根据实验需要用水或者其他溶液进行稀释至目的浓度，或者高速离心(18000转/分钟，4°C，离心15min)收集纳米粒子，加入水或者其他溶液进行重新分散至目的浓度。实施例4纳米粒子粒径分布、Zeta电位和形貌观察采用激光粒度分析仪测定纳米粒子粒径分布及Zeta电位。将纳米悬液稀释成适当浓度(lmg/ml)放入比色杯中，将比色杯放入粒度仪样品池中进行测试，每个样品测试3次。将纳米悬液滴在碳支持膜上，自然干燥后用2%的磷钨酸(pH6.0)负染，干燥后在透射电镜下进行观察。将纳米粒子悬液滴在硅片上，自然干燥后进行不连续喷金3分钟，在扫描电镜下进行观察。实施例5=FPAN和EPI-FPAN稳定性的考察将纳米粒子溶液避光保存在2_8°C，每间隔一段时间采用激光粒度分析仪测定纳米粒子粒径分布及Zeta电位。结果见表1和表2。表IFPAN纳米粒子的粒径分布和Zeta电位(；±s,η=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2EPI-FPAN纳米粒子的粒径分布和Zeta电位η=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例6=FPAN体内毒性考察将ICR小鼠20只，4-6周龄，体重17_22g，分为两组，每组10只，雌雄各半，分别尾静脉注射FPA纳米溶液125mg/kg和0.9%氯化钠注射液，给药后观察动物的一般生理指标，食量和体重，连续观察14天，实验结束将动物进行剖检，若有肉眼可见病变做病理检查。结果见表3和表4。表3FPAN单次静脉注射125mg/kg对小鼠体重的影响([切，g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4FPAN单次静脉注射125mg/kg对小鼠食量的影响，g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物的纯化及其纳米粒子的制备方法，其特征在于它包括的步骤1)将叶酸与乙酰普鲁兰多糖溶液在催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亚胺脱水剂作用下反应，反应温度为25～28℃，反应时间为5～7天，使缩合成叶酸-乙酰普鲁兰多糖偶联物；2)将反应中生成的1，3-二环己基脲(DCU)沉淀过滤除掉，滤液滴加入体积比为1∶50～150的无水乙醇中沉淀，4℃下，3000～8000转/分钟离心，时间为5～20min，收集沉淀；3)用碳酸钠缓冲液透析24～48h以除尽游离叶酸，去离子水透析24-48h除去其他的小分子。4)真空干燥或冻干，得黄色粉末。2.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于所述的乙酰普鲁兰多糖叶酸DCCDMAP的摩尔比=10.350.361.50.170.6。3.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于所述的乙酰普鲁兰多糖溶液为溶解于二甲基亚砜中的溶液。4.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于所述的普鲁兰多糖分子量范围为4，000200，000。5.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于所述透析袋为截留分子量为8000-14000Da的透析袋。全文摘要本发明涉及乙酰普鲁兰多糖叶酸偶联物的纯化及其纳米粒子的制备方法。25～28℃下，叶酸、乙酰普鲁兰多糖溶液、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亚胺类脱水剂混合反应5～7天，把滤液滴加入过量无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀，用碳酸钠缓冲液透析24～48h，在去离子水中透析24-48h，冻干或真空干燥后得到材料。将材料溶解于二甲基亚砜(DMSO)或其他有机溶剂中，采用透析法制备纳米粒子。本发明步骤少，操作简单，重复性较好，不需添加其他稳定剂和乳化剂，纳米粒子呈球形，粒径均匀，电位绝对值低，稳定性好，单次静脉注射给予小鼠未见明显毒性。文档编号C08B37/00GK101831000SQ201010179030公开日2010年9月15日申请日期2010年5月21日优先权日2010年5月21日发明者刘玲蓉,周志敏,唐红波,张其清,张彤,李学敏,李磊,白永刚申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所