用亲电子基团修饰的大分子及其制备和使用方法

专利名称：用亲电子基团修饰的大分子及其制备和使用方法
用亲电子基团修饰的大分子及其制备和使用方法
背景技术：
在药物应用中，大分子的使用已受到相当多的关注。有时，需要偶联两 种以上的大分子来制备具有多重活性的新的大分子骨架。然而，用于偶联两 种以上大分子的现有的技术存在很多困难。例如，制备具有高的机械强度的 水凝胶所需要的碱性条件或高温麻烦而且苛刻。尽管使用交联剂来制备大分 子骨架已获得了一些成功，但交联剂通常是相对小的、细胞毒素的分子，且 所得到的骨架必须进行提取或广泛地洗涤以除去痕量的未反应的反应物和
副产物(Hennink， W. E.; van Nostrum, C. R爿A. Z>wg Z)e/. i ev. 2002, 54， 13-36)，因此排除了在许多医学应用中的使用。在作为有用的治疗辅助物前， 需要能以直接的方式制备的生理上相容的大分子骨架。

发明内容
本文描述了用亲电子基团修饰的大分子及其制备和使用方法。更具体地 说，为了制备"无交联剂"的水凝胶，本文描述了HA的巯基反应性的亲电 子衍生物的制备。本文描述了在温和的条件下能偶联两种以上分子(如大分 子)的化合物和方法。具体公开了在大量存在于HA聚合物上的羟基上引入 反应性的溴乙酸酯官能团和碘乙酸酯官能团。
本文描述的化合物和组合物具有许多应用，包括但不限于药物输送、小 分子输送、伤口愈合、烧伤愈合、组织再生/组织工程、细胞培养、和生物人 造材料。
本发明的有益之处将在随后的描述中部分地阐明，且该描述中部分阐明 的有益之处将是显而易见的，或者通过下面描述的方面的实践可以认识到本 发明的有益之处。借助于随附的权利要求书中特别指出的要素和组合，可以认识到并获得下面描述的有益之处。可以理解的是，前面的概括描述和下面 的详细描述都仅仅是示例性的和说明性的而不是限制性的。


结合于本说明书内并构成本说明书的一部分的

了下面描述的 几个方面。
图l:溴乙酸酯衍生的HA的合成示意图。
图2:在D20中HA-BA的！H-NMR谱。
图3:通过芬克尔斯坦反应(Finkelstein reaction)而合成碘乙酸酯衍生 的HA的示意图。
图4:在D20中HA-IA的ifi-NMR谱。
图5:透明质酸衍生物的SAMSA衍生化。A—SAMSA荧光素的结构。
B —在UV光下，SAMSA衍生的化合物的荧光。C一A495nm数据。D—结合
了 SAMSA的化合物的紫外/可见光(UV/VIS)扫描。
图6:在卤代乙酸酯HAs存在下，T31成纤维细胞的生存能力。黑条一 未处理的对照物；白条一HABA处理；灰条一HAIA处理(*p< 0.005、 ** p < 0.5和*** p > 0.05，与未处理的对照物对比)。柱表示平均值士标准偏差 (S.D.)， n=6。
图7:含有HA卤代乙酸酯的水凝胶的示意图。A. HA卤代乙酸酯与 CMHA-S的交联提供了非细胞粘着(non-cytoadhesive)的水凝胶。B. HA卤 代乙酸酯与CMHA-S和Gtn-DTPH的交联提供了细胞粘着(cytoadhesive)
的水凝胶。
图8:由MTS比色分析所测定的在卤代乙酸酯HA水凝胶上培养的成纤 维细胞的生存能力。白条一没有Gtn-DTPH的水凝胶；灰条一有Gtn-DTPH 的水凝胶(*p< 0.001、 ** p< 0.05禾口***口> 0.05，与用黑条表示的对照物相比)。插图一在无Gtn-DTPH的卤代乙酸酯HA水凝胶上培养的成纤维细 胞的A49o值的放大(*p<0.05，与CMHA-S相比)。所表示的数值为平均值 士标准偏差(S.D.)， n=6。
图9:在存在或不存在HAse (225 U/mL)的条件下，水凝胶的降解速 率。每个数据点表示平均值士标准偏差(S.D.)， n=3。
具体实施例方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物和/或方法前，需要理解的是， 下面所描述的方面并不限制于具体的化合物、合成方法、或者用途，因为这 些当然可以变化。还可以理解的是本文所使用的术语是仅仅出于描述特定的 方面的目的，并非出于限制的目的。
在本说明书和随后的权利要求书中，将提到定义为具有下列含义的很多
术语
必须提到的是，在说明书和所附的权利要求书所使用的单数形式"一 个"、"一种"和"该"包括复数的所指之物，除非上下文明确表示其它含义。 因此，例如，"一种药物载体"的含义包括两种以上这样的载体的混合物等。 "任选的"或"任选地"表示随后描述的事件或情况能或者不能发生， 并且该描述包括该事件或情况发生的实例和不发生的实例。例如，短语"任 选取代的低级烷基"表示该低级烷基能或者不能被取代，并且该描述包括未 被取代的低级烷基和被取代的低级烷基两种。
在组合物或制品中特定要素或组分的"重量份"表示在该组合物或制品 中该要素或组分与其它任何要素或组分的重量关系，对于该组合物或制品来
说，表达了按重量计的一份。因此，在含有2重量份组分X和5重量份组分 Y的化合物中，X和Y以2: 5的重量比存在，且不管在该化合物中是否含 有另外的组分都是以这个比例存在。除非特别有相反的陈述，组分的重量百分比是基于含有该组分的制剂或 组合物的总重量。
化学物类的"残基"表示这样的部分，所述部分是在特定的反应方案或 者后续制剂或化学产物中的该化学物类产生的产物，不管该部分是否实际上 获得自该化学物类。例如，含有至少一个-OH基团的多糖可以用式Y-OH表 示，其中Y为多糖分子的残余部分(即残基)。
在整个申请中使用的变量如RLR5、 A'、 A1、 A2、 G'、 L、 o、 R、 R'、 X、 X'、 Y、 Y'、和Z为与以前定义的相同的变量，除非有相反的陈述。
本文所使用的术语"烷基"为1-24个碳原子的支链或非支链的饱和烃 基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、 己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十垸基、二十四垸基等。 "低级烷基"基团为含有一至六个碳原子的垸基。
本文所使用的术语"全氟烷基"或"氟代烷基"表示1-24个碳原子的 支链或非支链的饱和烃基团，其中至少一个氢原子用氟取代。全氟垸基还可 以表示该烷基的所有的氢原子被氟取代。
本文所使用的"芳基"为任何碳基的芳族基团，包括但不限于苯、萘等。 术语"芳族"还包括"杂芳基"，它被定义为具有至少一个被引入至芳族基 团的环内的杂原子的芳族基团。杂原子的例子包括但不限于氮、氧、硫和磷。 所述芳基可以为取代的或未取代的。所述芳基可以被一个或多个基团取代， 所述基团包括但不限于烷基、炔基、链烯基、芳基、卤化物、硝基、氨基、 酯、酮、醛、羟基、羧酸、或垸氧基。
本文所使用的术语"卤素"为氟、氯、溴或碘。
本文所使用的术语"聚亚垸基"(polyalkylene group)或"聚链烯基" (polyalkdenyl group)为具有两个以上互相键连的CH2基团的基团。聚亚烷 基可以用式-(CH2)n-表示，其中n为2-25的整数。本文所使用的术语"聚醚基"为具有式-[(CHR)nO]m-的基团，其中R为
氢或者低级垸基，n为l-20的整数，且m为1-100的整数。聚醚基的例子包 括聚氧化乙烯、聚氧化丙烯和聚氧化丁烯。
本文所使用的术语"聚硫醚基(polythioether group)"为具有式 -[(CHR)nS]m-的基团，其中R为氢或低级烷基，n为l-20的整数，且m为1-100
的整数。
本文所使用的术语"聚亚氨基"(polyimino group)为具有式 -[(CHR)nNR]m-的基团，其中每个R独立地为氢或低级垸基，n为l-20的整 数，且m为1-100的整数。
本文所使用的术语"聚酯基"为通过具有至少两个羧酸基团的化合物与
具有至少两个羟基的化合物之间的反应而制备的基团。
本文所使用的术语"聚酰胺基"为通过具有至少两个羧酸基团的化合物 与具有至少两个未取代的或单取代的氨基的化合物之间的反应而制备的基团。
短语"用……取代"(如在"用X取代"中)表示例如垸基的基团，如 -013基团，其中一个或多个氢原子"用基团X取代"或"用基团X置换" 并且形成基团-CH2-X。
实施方式的详细描述
合成并表征了两种具有卤代乙酸酯基团的新型HA衍生物。当添加到正
常的细胞培养基中时，在高剂量下两种物质都引起细胞毒素作用。当使上述 两种新的聚合物与CMHA-S (—种巯基修饰的HA衍生物)反应时，所得到 的水凝胶不支持细胞附着并且还引起轻微的细胞毒素作用。相反，CMHA-S 加Gtn-DTPH与HA卤代乙酸酯的共交联得到了支持细胞附着和生长的水凝 胶。因此，HA卣代乙酸酯平台为获取细胞粘着材料或用于细胞附着的细胞 相容性的隔离物(barrier)均提供了途径。此外，含HA卤代乙酸酯的水凝胶显示了很慢的HAse-媒介降解速率(HAse-mediated degradation rate),这
使它们适合于体内的应用。总之，我们的结果表明新材料用于医学应用特别 是用于防止粘连和医疗装置涂料的适应性和潜能。
HABA由HA和溴乙酸酐直接制备，但对于HAIA，由于在所使用的碱 性条件下氢氧化物竞争碘化物的亲核取代，因此避免使用碘乙酸酐。作为代 替，通过由碘化物对溴化物的简单SN2取代而由HABA制备HAIA。如预期 的，所述HA卤代乙酸酯显示出剂量依赖性的细胞毒素作用，并用培养的 T31人气管瘢痕成纤维细胞(human tracheal scar fibroblast)测试。对于体内 的研究，这些初级的人体细胞更相关，然而仍然捕获了成纤维细胞系的应答， 所述成纤维细胞系的应答通常应用于体外的生物相容性实验和体外的3-D 细胞相容性实验。
HA卤代乙酸酯与亲核大分子的反应提供了可细胞相容的水凝胶。依赖 于组成，该水凝胶可以防止或促进细胞粘着、扩散和增殖。然而，对于大多 数3-D细胞的封装方案来说，延长含HA卤代乙酸酯的水凝胶的凝胶化时间 使该水凝胶不实用。然而，该水凝胶可以用于将细胞接种在水凝胶上部的假 3-D培养物。
同样，在高水平的透明质酸酶的存在下，化学修饰的HA水凝胶3天内 在体外完全降解。那些皮下植入的凝胶在体内的滞留时间测定为超过2周。 依此类推，可以外推在相似的酶条件下得到的我们的降解数据，推理出含有 HA卤代乙酸酯的水凝胶具有近4周的滞留时间。用于这些体外分析的透明 质酸酶的浓度比生理酶单位(在血清中约2.6U/mL)高约100倍。
对于非粘着的HA卤代乙酸酯水凝胶的一个潜在的应用可以为防止粘 连。诸如肠梗阻、盆腔疼痛(pelvic pain)甚至不孕的状况可能是不希望的 手术后粘连的结果。已经配制了一些HA水凝胶来处理此问题。例如，负载 了药物的水凝胶(如丝裂霉素-C交联的水凝胶)用于防止粘连已试验成功。已经临床试验了 Seprafilm (—种碳二亚胺修饰的HA/羧甲基纤维素基的材 料)并证明成功地降低了妇科治疗后粘连的形成。通过预防疤痕和基于ECM 的发音困难，已经显示Carbylan -SX (PEGDA交联的CMHA-S水凝胶) 在声襞修复中有效。另外，此复合物用于防止手术后腹内粘连和盆腹腔 (abdominopdvic)粘连。基于HA卤代乙酸酯的材料还可以进一步用于改
进当前可用的抗粘连生物材料的性能。
医疗装置涂料是能从HA卤代乙酸酯型生物材料的使用中受益的另一个
领域。吸附、离子偶合、交联、光化学固定、共价连接或生物专一固定是用 于医疗装置的HA涂料的普通的步骤。例如，用于经皮冠状动脉介入 (percutaneous coronary interventions)的腔内金属支架(endoluminal metallic stents) —般用生物相容性材料涂覆，因为在接受了未涂覆的支架的患者中支 架内再狭窄(in-stentrestenosis)的发病率相当高(在外科手术介入后6个月 内为20-40%)。以前将碳、碳化硅、金或磷酸胆碱涂覆的支架用于防止新生 内膜增生(neointimalhyperplasia)。还开发了含有肝磷脂(抗血栓形成)、地 塞米松(抗炎)或紫杉酚(抗增生(anti-prolifemtive))的药物涂覆的支架。 制备这些涂覆的材料，防止或减轻血栓形成、炎症性反应以及异常的细胞粘 着和增生。尽管有前途，但许多涂覆材料在外科手术介入后几个月或者甚至 几年引起新生内膜增生，导致再狭窄和过度的炎症性反应。
基于HA卤代乙酸酯的涂料材料的使用可以提供用于预防再狭窄的备用 解决方案(awaited solution)。已经表明未修饰的HA可以粘着到许多支架上， 因此，我们想到HA卤代乙酸酯恰好可以很轻松地固定在通常使用的外科支 架(surgical scaffold)上。另外，基于HA卤代乙酸酯的生物材料的组合物 容许外科手术后纤维化反应的调节。它们的"活的"结构进一步使得这些材 料以专一应用(application-specific)的方式进行化学修饰和调整。
I、交联剂及其制备该交联剂包括式I，
<formula>formula see original document page 19</formula>
其中，
Y'为选自由低聚核苷酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋 白、糖脂、多糖和蛋白质组成的组中的大分子的残基； X'为-O-、 -S-、 -NH-、或-NR"-;
R'为氢、垸基、全氟垸基、芳基、杂芳基(heteroaryl)、或卤素；
R"为氢或CL5垸基；并且
A'为离去基团。
所述大分子是具有至少一个亲核基团的任何化合物，该亲核基团可以取 代离去基团并形成新的共价键。亲核基团的例子包括但不限于羟基、巯基、 和取代的或未取代的基团。参见式I， X'为-O-、 -S-、 -NH-、或-NR"-。另一 方面，X'为-O-或-NH-。
另一方面，X'为亲核基团的残基。当亲核基团为羟基或氨基时，所述羟 基或氨基为游离羟基或游离氨基或者分别衍生自羧酸或酰胺。 一方面，所述 大分子为低聚核苷酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋白、或 糖脂。另一方面，所述大分子为多糖或蛋白质。另一方面，所述大分子为合 成的聚合物。本文所使用的代谢稳定的类似物指这样的类似物，在该类似物 中通过化学修饰将对酶降解或非酶降解不稳定的特定官能团改变为在体内 和体外更稳定的不同的官能团，从而延长该类似物的生物半衰期
在本文描述的方法中有用的多糖具有至少一个亲核基团，例如羟基。一 方面，该多糖为糖胺聚糖(GAG)。糖胺聚糖可以是硫酸化的或未硫酸化的。
本文描述了亲电子的交联剂。 一方面，GAG是具有许多交替的亚单位的一个分子。例如，HA是(GlcNAc-GlcUA隱)x。其它GAGs是在不同的糖上硫酸化的。 一般地，GAG由式A-B-A-B-A-B表示，其中A为糖醛酸，且B为O-硫酸化的氨基糖或N-硫酸化的氨基糖，其中关于差向异构体含量或硫酸盐化作用，A单位和B单位可以是不均匀的。可以使用含有糖醛酸的任何天然的或合成的聚合物。 一方面，式I中的Y'是硫酸化的GAG。
有许多具有通常熟知的结构的不同类型的GAGs，例如在已公开的组合物中，如硫酸软骨素、皮肤素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮肤素、和硫酸乙酰肝素。本领域已知的任何GAG都可以用于本文所描述的任何方法中。褐藻酸、果胶、壳聚糖、和羧甲基纤维素是其它在本文所描述的方法中有用的多糖。
另一方面，式I中的多糖Y'为透明质酸(HA)。 HA是未硫酸化的GAG。透明质酸是已知的、自然产生的、水溶性的多糖，由两种交替键合的糖，D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成。在比较低的溶质浓度下水溶液中，该聚合物是亲水的并且是高度粘性的。它经常作为钠盐(透明质酸钠)天然存在。制备商业上可利用的透明质酸及其盐的方法是已知的。透明质酸可以从Seikagaku Company 、 Novozymes Biopolymer、 Novomatrix、 Pharmacia Inc,、Sigma Inc.和其它供应商商购得到。对于高分子量透明质酸，通常为100-10,000个二糖单位。另一方面，透明质酸分子量的下限为10,000、20,000、30,000、 40,000、 50,000、 60,000、 70,000、 80,000、 90,000或100,000，且上限为200,000、 300,000、 400,000、 500,000、 600,000、 700,000、 800,000、 900,000或1,000,000，其中任何下限都可以与任何上限组合。
一方面，式I中的Y'还可以为合成的聚合物。所述合成的聚合物具有至少一个亲核基团。 一方面，式I中的该合成的聚合物残基包括聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚丙二醇、多元醇、聚胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的三嵌段聚合物、聚乙二醇的星形聚合物、或者聚乙二醇的树枝状聚合物。
另一方面，式I中的Y'是蛋白质。本文中有用的蛋白质包括但不限于胞外基质蛋白质、化学修饰的胞外基质蛋白质、或者胞外基质蛋白质的部分水解的衍生物。所述蛋白质可以是天然存在的或者拥有细胞相互作用区域的重组多肽。所述蛋白质还可以为蛋白质的混合物，其中一种以上的蛋白质是修饰的。蛋白质的具体例子包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、饰胶蛋白聚糖、层粘连蛋白或纤连蛋白。
式I中的R'包括氢、烷基、全氟垸基、芳基、杂芳基或卤素。 一方面，R'为氢。另一方面，R'为甲基。
式I中的A'含有离去基团。离去基团是可以由亲核体取代的任何基团。
几种离去基团是本领域已知的。例子包括但不限于卤素、醇盐、活性酯等。
一方面，式I中的A'为氯、溴或碘。
一方面，Y'包括N-乙酰-葡糖胺的残基，其中N-乙酰-葡糖胺残基的至少一个C-6伯羟基被基团-C(0)CH(R)(A')取代(或者连接到该基团上)。另一方面，Y'包括N-乙酰-葡糖胺的残基，其中N-乙酰-葡糖胺残基的至少一个C-6伯羟基被基团-C(O)CH(R)(A')取代，并且至少 一 个仲羟基被基团-C(O)CH(R')(A')取代。在更进一步的方面，Y'包括N-乙酰-葡糖胺的残基，其中N-乙酰-葡糖胺残基的至少一个C-6伯羟基被基团-C(O)CH(R')(A')取代，并且其中N-乙酰-葡糖胺残基的一个C-6伯羟基至约100。/。或者基本上所有的C-6伯羟基被基团-C(O)CH(R')(A')取代。另一方面，Y'是透明质酸的残基，其中至少一个羟基被-C(0)CH2Ci、 -C(0)CH2Br、或-C(0)CH21取代。
本文描述了用于制备具有式I的化合物的方法。 一方面，该方法包括含有至少一个亲核基团的大分子与包括式XV的化合物反应，R'包括氢或烷基；并且
A1和A2含有相同或不同的离去基团。具有式xv的化合物包括可以与大分子反应的许多不同的分子。例子包括但
不限于活性酯、酰卤、酸酐等。
一方面，式XV中的R'为氢。另一方面，式XV中的八1形成式乂￥1的化合物，
R'包括氢或烷基，其中两个R'为相同的基团；且AZ含有如上所述的相同的离去基团。
式XVI包括对称的酸酐；然而，如以上所讨论的，可以考虑混合的酸酐(例如其中的R'和/或AS不是相同的)。 一方面，式XVI中的R'为氢。另一方面，XVI中的AZ含有卤素(例如氯、溴、或碘)。在更进一步的方面，含有式XV的该化合物为氯乙酸酐、溴乙酸酐、或者碘乙酸酐。
本文描述的任何大分子都可以与具有式XV的化合物反应以制备亲电子的大分子。在某些方面，存在于该大分子上的亲电子基团为羟基、或者取代的氨基或未取代的氨基。 一方面，该大分子包括糖胺聚糖，例如透明质酸。
其中，另一方面，该大分子为透明质酸，且具有式XV的化合物为氯乙酸酐、溴乙酸酐、或碘乙酸酐。
该大分子与具有式XV的化合物之间的反应可以在各种反应温度和时间下进行，依据所选择的起始原料而变化。溶剂的选择也随着起始原料的溶解
性而变化。在某些方面，希望在大于7的pH下进行该反应。例如，当该大分子具有一个或多个羟基时，可以需要碱性介质来使一定数量的羟基去质子化，并促进该大分子与具有式XV的化合物之间的反应。
本文描述的任何化合物可以是其药学上可接受的盐或酯。 一方面，药学上可接受的盐通过用适量的药学上可接受的碱来处理游离酸而制备。代表性的药学上可接受的碱为氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化亚铁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铝、氢氧化铁、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。 一方面，在约0-10(TC下，如室温下，该反应在单独的水中进行，或在水与惰性的、水混溶性的有机溶剂的组合中进行。在某些可应用的方面，选择本文描述的化合物与使用的碱的摩尔比来提供任何特定的盐所需要的比例。例如，为了制备游离酸起始原料的铵盐，可以用约一当量的药学上可接受的碱来处理该起始原料以获得中性
i卜
另一方面，如果该化合物拥有碱性基团，那么该化合物可以用如HC1、HBr或H2S04的酸质子化，以制备阳离子盐。 一方面，在约0-100'C下，如室温，该化合物与酸或碱的反应在单独的水中进行，或在水与惰性的、水混溶性的有机溶剂的组合中进行。在某些可应用的方面，选择本文描述的化合物与使用的碱的摩尔比以提供任何特定的盐所需要的比例。例如，为了制备游离酸起始原料的铵盐，可以用约一当量的药学上可接受的碱来处理该起始原料以获得中性盐。通常制备酯衍生物作为该化合物酸形式的前体。 一般地，这些衍生物可以为低级垸基酯，如甲基、乙基等。可以通过含有羧酸的化合物与氨或取代
的胺的反应来制备酰胺衍生物-(CO)NH2、 -(CO)NHI^n-(CO)NR2，其中R为如上所定义的烷基。II、大分子的偶联
具有式I的化合物为亲电子的，且可以与拥有亲核基团的一个或多个大分子反应以偶联该大分子。 一方面，用于偶联两个以上大分子的方法包括使含有式I的第一大分子与含有至少一个亲核基团的第二大分子反应。可以预计的是含有式I的第一大分子可以具有多个亲电子基团，且第二大分子可以具有多个亲核基团。因此，可能产生不同大分子的矩阵(matrix)或网络。
一方面，所述第二大分子具有式n，
Z为大分子的残基，且
L为聚亚垸基、聚醚基、聚酰胺基、聚亚氨基、芳基、聚酯或聚硫醚基。所述大分子残基Z可以为上面描述的任何大分子。 一方面，该第二大分子可以为具有至少一个巯基的蛋白质。在此方面，该蛋白质可以为自然存在的或合成的。 一方面，该蛋白质包括胞外基质蛋白质或化学修饰的胞外基质蛋白质。另一方面，该蛋白质包括胶原蛋白、弹性蛋白、饰胶蛋白聚糖、层粘连蛋白、或纤连蛋白。 一方面，该蛋白质包括具有附加的巯基的遗传工程蛋白质(如半胱氨酸残基)。在更进一步的方面，该蛋白质包括合成的多
肽，所述合成的多肽可以为具有附加的巯基(如半胱氨酸残基)的支链的合成的多肽(如树枝状聚合物)或线形的合成的多肽。
24另一方面，式II中的L为聚亚垸基团。另一方面，式II中的L为-CH2-
或C2-C2Q的聚亚烷基团。另一方面，式II中的L为012012或CH2CH2CH2。一方面，Z为透明质酸的残基，且式II中的L为CH2CH2或CH2CH2CH2。在更进一步的方面，Z为明胶的残基，且式II中的L为CH2CEb或CH2CH2CH2。 一方面，式II中的L独立地为CH2CH2或CH2CH2CH2。另一方面，Z为透明质酸的残基。
一方面，所述第二大分子含有式XX，
<formula>formula see original document page 25</formula>
其中，
Y为大分子的残基；
X为O、 NH、或亲核基团的残基；且
R包括取代的或未取代的C2或C3垸基。
一方面，X为O或NH，或者其中X为羟基或氨基的残基。
式XX中的大分子Y可以为本文描述的任何大分子。 一方面，该大分子包括低聚核苷酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋白、糖脂、或药学上可接受的化合物。 一方面，Y包括糖胺聚糖的残基。另一方面，Y包括透明质酸的残基。在更进一步的一方面，Y包括N-乙酰-葡糖胺的残基，其中N-乙酰-葡糖胺残基的至少一个C-6伯羟基被基团-RSH取代。此方面更进一步，至少一个仲羟基也被-RSH取代。另一方面，N-乙酰-葡糖胺残基的一个C-6伯羟基至100%的C-6伯羟基被基团-RSH取代。
另一方面，式XX中的R为CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2CHR5、CHR5CHR5、C(R5)2CHR5、或C(R5)2C(R5)2，其中115为烷基。 一方面，式XX中的Y为透明质酸的残基，其中至少一个羟基被-CH2CH2SH取代。
具有式XX的第二大分子可以通过本文描述的方法合成。 一方面，该方法包括使含有至少一个亲核基团(例如羟基或氨基)的大分子与包括式XVII的化合物反应，
s
XVII
R2 R4
其中，R1、 R2、 R3、和W独立地为氢、烷基、全氟烷基、芳基、或杂芳基， 且o为1或2。
一方面，式XVII中的o为1。另一方面，式XVII中的o为1，并且R'-R4 为氢。另一方面，该第二大分子包括透明质酸与具有式XVII的化合物之间 的反应产物，其中o为l，并且W-I^为氢。
所述大分子与具有式XV的化合物之间的反应可以在各种反应温度和时 间下进行，将依赖于起始原料的选择而变化。溶剂的选择也随该起始原料的 溶解性而变化。在某些方面，希望在大于7的pH下进行该反应。例如，当 该大分子具有一个或多个羟基时，可以需要碱性介质来使一定数量的羟基去 质子化，并促进该大分子与具有式XVII的化合物之间的反应。
一方面，所述第一大分子与第二大分子的偶联可以在7-12、 7.5-11、 7.5-10、或7.5-9.5的pH下、或者8的pH下进行。 一方面，使用的溶剂可 以为水(单独)或者含有有机溶剂的水溶液。 一方面，当使用混合的溶剂体 系时，可以使用诸如伯胺、仲胺、或叔胺的碱。 一方面，相对于第二大分子， 使用过量的具有式I的第一大分子，以确保在反应过程中消耗所有的第二大 分子。依赖于所述第一大分子和第二大分子的选择、反应的pH、和选择的 溶剂，偶联可以在几分钟至几天的时间内发生。
本文描述的化合物具有包括式VII的至少一个片段，
26VII
其中，
Y'为第一大分子的残基； X'为-O-、 -S画、画NH画、或醫NR"画；
R"为氢或Q.5垸基； R'包括氢或烷基；且 G'包括第二大分子的残基。
本文使用的术语"片段"指整个分子本身或者较大的分子的一部分或链 段。例如，式VII中的Y'可以为高分子量多糖，所述高分子量多糖与另一个 多糖、合成聚合物、或者巯基化的聚合物交联以制备偶联的化合物。该化合 物具有式VII中图示的最小的一个单位，该单位代表至少一个第一大分子与 第二大分子之间的反应产物。
与具有也是亲电子的丙烯酸酯基团的其它大分子相比，具有式I的化合 物拥有具有许多优势的亲电子基团。例如，丙烯酸酯基团为光活性的且能与 拥有丙烯酸酯基团的其它大分子反应。具有式I的化合物互相不反应且不受
约束地与其它大分子(例如巯基化的大分子)反应。此外，由于存在于式 I中的离去基团，该化合物通常为可水解的。这是在生理条件下特别需要的， 在此条件下，具有式I的该化合物可以在一段时间内被受试者水解，产生毒 性很小的或根本没有毒性的化合物。 III、药物组合物
一方面，由上述方法制得的任何化合物可以进一步含有至少一种药学上 可接受的化合物(或生物活性剂)。得到的药物组合物可以提供用于持续不
27变地、连续地输送药物和其它生物活性剂至临近施用部位或远离施用部位的 组织的系统。所述生物活性剂能在被施用的生物系统中提供局部的或全身的 生物的、生理的或治疗的作用。例如，该试剂可以产生控制感染或发炎、增
进细胞生长和组织再生、控制肿瘤生长、作为止痛药、促进抗细胞(anti-cell) 附着并增进骨骼生长以及其它功能的效果。另外，本文描述的任何化合物可 以含有两种以上药学上可接受的化合物的组合。
一方面，该药学上可接受的化合物可以包括能预防生物系统内的全身的
感染或缺陷部位的局部感染的物质，例如抗炎剂，例如但不限于毛果芸香 碱、氢化可的松、脱氢皮质甾醇、可的松、双氯酚酸钠、吲哚美辛、6cx-甲 基-脱氢皮质甾醇、皮质甾酮、地塞米松、泼尼松等；抗菌剂包括但不限于 青霉素、头孢菌素、杆菌肽、四环素、强力霉素、庆大霉素、氯喹、阿糖腺 苷等；止痛剂包括但不限于水杨酸、扑热息痛、布洛芬、萘普生、炎痛喜康、 氟比洛芬、吗啡等；局部麻醉剂包括但不限于古柯碱、利多卡因、苯佐卡因 等；用于激发抗体预防肝炎、流行性感冒、麻疹、风疹、破伤风、脊髓灰质 炎、狂犬病等的免疫原(疫苗)；肽包括但不限于醋酸亮丙瑞林(leupmlide acetate)(—种促黄体生成激素释放激素兴奋剂(LH-RH agonist))、那法瑞 林等。所有的化合物都可以商购得到。
一方面，所述药学上可接受的化合物可以为生长因子。能促进细胞与组 织的生长和生存或者加强细胞机能的任何物质或代谢前体作为生长因子是 有用的。生长因子的例子包括但不限于神经生长促进物质，如神经节苷脂、 神经生长因子等；硬组织或软组织生长促进剂，如纤连蛋白(FN)、人生长 激素(HGH)、集落刺激因子、骨形态发生蛋白、血小板衍生的生长因子
(PDGF)、胰岛素衍生的生长因子(insulin-derived growth factor) (IGF-I， IGF-II)、转化生长因子-d (TGF-oO、转化生长因子-P (TGF-卩)、表皮生长因 子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素-1 (IL-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)、骨骼衍生的骨骼材料 (例如脱矿质的骨基质)等；以及抗肿瘤剂，如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、
阿霉素、长春花碱、顺氯氨铂、结合至毒素的肿瘤特异抗体、肿瘤坏死因子 等。
在整体结合于此作为参考的美国专利No. 6,534,591 B2中公开的任何生 长因子都可以用于此方面。 一方面，所述生长因子包括转化生长因子 (TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板衍生生长因子(PDGFs)、 表皮生长因子(EGFs)、结缔组织活化的肽(CTAPs)、成骨因子以及这些生 长因子的生物活性类似物、片段和衍生物。转化生长因子(TGF)超基因家 族的成员是多功能的调节蛋白。TGF超基因家族的成员包括(3转化生长因 子(例如TGF-卩1、 TGF-卩2、 TGF-(33);骨形态发生蛋白(例如BMP-1、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP陽7、 BMP陽8、 BMP-9);肝 素结合性生长因子(例如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、 血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF));抑制素(例如
抑制素A、抑制素B);生长分化因子(例如GDF-1);以及激活素(例如
激活素A、激活素B、激活素AB)。
生长因子可以从例如哺乳动物细胞的天然的或自然的来源中分离，或者 可以合成制备，如通过重组DNA技术或通过各种化学方法。另外，只要它 们显示出天然分子的至少一些生物活性，就可以使用这些因子的类似物、片 段或衍生物。例如，可以通过由位点特异性诱变或者其它遗传工程技术改变 的基因的表达来制备类似物。
其它有用的物质包括激素，如黄体酮、睾丸素、和促卵泡激素(FSH) (节育、生育促进)、胰岛素等；抗组胺剂，如盐酸苯海拉明等；心血管剂， 如罂粟碱、链激酶等；抗溃疡剂，如异丙碘铵等；支气管扩张剂，如硫酸异 丙喘宁(metaprotemal sulfate)、氨茶碱等；血管扩张剂，如茶碱、烟酸、米
29诺地尔等；中枢神经系统剂，如安定药、B-肾上腺素能阻断剂、多巴胺等；
精神抑制剂，如利培酮(risperidone);麻醉药拮抗剂，如环丙甲羟二羟吗啡 酮、纳洛酮(naloxone)、叔丁啡(buprenorphine);以及其它类似物质。所 有的化合物都可以商购得到。
使用本领域已知的技术可以制备所述药物组合物。 一方面，通过使本文 描述的化合物与药学上可接受的化合物混合来制备该组合物。术语"混合" 定义为将两种组分混合在一起以便没有化学反应或物理相互作用。术语"混 合"还包括该化合物与该药学上可接受的化合物之间的化学反应或物理相互 作用。在所述化合物上可以进行共价键合至反应性治疗药物，例如那些具有 亲核基团的药物。第二，在交联的多糖中，药物活性剂的非共价包载也是可 能的。第三，静电的或疏水的相互作用可以促进药学上可接受的化合物在修 饰的多糖中的保留。
可以认识到的是，在具体情况中，活性化合物的实际优选量可以根据所 使用的具体化合物、配制的特定组合物、施用的形式、和被治疗的特定的部 位与治疗者而变化。用于给定受体的剂量可以使用常规的需要考虑的因素来
确定，例如通过目标化合物和己知药剂的特异活性的通行性比较，例如 依靠适当的常规的药理学实验方案。在本领域中熟悉确定药物化合物剂量的
医师和配方师根据标准推荐(Physicians Desk Reference (药师台式手册)， Barnhart Publishing (1999))可以毫无问题地确定剂量。
本文描述的药物组合物可以在生物系统或实体可以耐受的任何赋形剂 中配制。这些赋形剂的例子包括但不限于水、生理盐水、林格溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液、汉克溶液(Hank's solution)、以及其它含水的生理 平衡的盐溶液。还可以使用非水的赋形剂，例如不挥发性油、植物油(如橄 榄油和芝麻油)、甘油三酯、丙二醇、聚乙二醇以及可注射的有机酯(如油 酸乙酯)。其它有用的剂型包括含有增粘剂的悬浮液，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖。赋形剂还可以含有少量的添加剂，如增强等渗性和化 学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和三羟
甲基氨基甲烷缓冲液(Tris buffer),而防腐剂的例子包括乙基汞硫代水杨酸 钠(thime腦l)、甲酚、福尔马林和苯甲醇。
药物载体是本领域技术人员已知的。最典型的药物载体可以为施用于人 体的标准载体，包括溶液如无菌水、生理盐水、和生理pH下的缓冲溶液。
用于药物输送的分子可以配制在药物组合物中。除了选择的分子，药物 组合物可以包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。 药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉 剂等。
依赖于是否需要局部或全身治疗以及治疗的范围，可以以许多方式施用 所述药物组合物。给药可以是局部的(包括眼的、阴道的、直肠的、鼻内的)。
用于给药的制剂包括消毒的水溶液或非水溶液、悬浮液、和乳状液。非 水载体的例子包括水、醇/水溶液、乳状液和悬浮液，包括生理盐水和缓冲介 质。如果需要间接的使用公开的组合物和方法，肠胃外的赋形剂包括氯化钠 溶液、林格葡萄糖(Ringer's dex加se)、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐林格(lactated Ringer，s)、或不挥发性油。如果需要间接的使用公开的组合物和方法，静脉 内的赋形剂包括液体的和有营养的补充物、电解质补充物(如基于林格葡萄 糖的电解质补充物)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、 抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。
局部给药的剂型可以包括软膏、洗液、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、 液体和粉剂。常规的药物载体、水溶液、粉末或油状的基质(oilybase)、增 稠剂等可以是必要的或希望的。
给药剂量是依据所治疗状况的严重程度和响应度，但正常地为每天一剂 以上，疗程持续几天至几个月或者直到本领域的普通技术人员确定给药应该
31停止。普通技术人员可以很容易地确定最佳的剂量、给药的方法和重复速率。 一方面，任何化合物和药物组合物都可以含有活的细胞。活的细胞的例
子包括但不限于干细胞、成纤维细胞、肝细胞、软骨细胞、干细胞、骨髓、
肌细胞、心肌细胞、神经元细胞、或者胰岛细胞。 IV、使用方法
本文描述的化合物和药物组合物(例如具有式I的化合物和由具有式 I的化合物衍生的偶联的大分子)可以用于涉及药物输送、小分子输送、伤 口愈合、烧伤愈合、和组织再生/组织工程的多种用途。所公开的组合物对于 受益于含水的、细胞周的环境的情况有用，在该环境中，其它基质组分的聚 集、生长和分化因子的表达、细胞迁移、或者组织再生是需要的。
本文描述的化合物和组合物可以改善需要改善伤口愈合的受试者体内 的伤口愈合，包括使受试者的伤口与权利要求的一种或多种化合物接触。由 于本文描述的化合物和药物组合物由生物相容性的材料组成，该化合物和药 物组合物可以直接放置于任何生物系统之内或任何生物系统之上而无需净 化。该化合物可以放置的部位的例子包括但不限于软组织，如肌肉或脂肪； 硬组织，如骨骼或软骨；组织再生的区域；没有填满的空间(void space), 如牙周囊(periodontal pocket);外科手术切口或其它方式形成的囊或腔；自 然的腔，如口腔、阴道腔、直肠腔或鼻腔、眼睛的盲管等；腹膜腔和包含于 其中的器官，以及该化合物可以放置于其中或之上的其它部位，包括皮肤表 面缺陷，如切口、擦伤或烧伤区域。由于损伤或退化的生理状况或二中择一 的状况下，预计组织会受到损害，本文描述的化合物和组合物可以施用于未 受损害的组织以防止损伤到该组织。本发明的化合物可以是可生物降解的并 且自然存在的酶可以产生随时间而降解它们的效果。该化合物的组分可以为 "可生物吸收的"，因为该化合物的组分可以被分解并被例如细胞、组织等 吸收至生物系统内。另外，该化合物，特别是没有再水化的化合物可以应用于生物系统以吸收来自于关注的区域的液体。
本文描述的化合物和组合物可以向需要输送药学上可接受的化合物的 患者输送至少一种药学上可接受的化合物，包括使能接收所述药学上可接受 的化合物的至少一个组织与本文描述的一种或多种的组合物接触。本文描述 的化合物可以用作很多种类的可释放的生物活性物质的载体，所述生物活性 物质对于对人类或非人类的动物具有医疗或治疗价值。能被该化合物负载的 这些物质的许多在上面讨论过。适合于引入至本发明的凝胶中的所包括的生 物活性材料为治疗药物，例如抗炎剂、退热剂、用于抗炎用途的甾族的和 非甾族的药物、激素、生长因子、避孕剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗真菌剂、 止痛剂、催眠药、镇静剂、安定药、抗痉挛剂、肌肉松弛药、局部麻醉剂、 镇痉药、抗溃疡药、肽兴奋剂、拟交感神经剂、心血管剂、抗肿瘤剂、低聚 核苷酸及其类似物等等。以药学上的活性量来添加生物活性物质。
一方面，本文描述的化合物和组合物可以用于输送活的细胞至受试者。 本文描述的任何活的细胞都可以用于此方面。
一方面，所述化合物和组合物可以用于输送生长因子和与生长因子相关 的分子。例如所述生长因子可以为神经生长促进物质，如神经节苷脂、神 经生长因子等；硬组织或软组织生长促进剂，如纤连蛋白(FN)、人生长激
素(HGH)、集落刺激因子、骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子(PDGF)、 胰岛素衍生生长因子(IGF-I， IGF-II)、转化生长因子-a (TGF-a)、转化生 长因子-P (TGF-P)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、 白细胞介素-1 (IL-1)。优选的生长因子是bFGF和TGF-(3。还优选血管内皮 生长因子(VEGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
另一方面，可以使用抗炎药，如布洛芬、萘普生、酮洛芬和吲哚美辛。 其它的生物活性物质为肽，所述肽是自然存在的、非自然存在的或合成的多 肽或者它们的等构物，如小的肽激素或激素类似物以及蛋白酶抑制剂。还可
33以使用杀精子剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗增殖剂，如氟脱氧尿嘧
啶(fluorodeoxyuracil)和阿霉素。这些物质在本领域内是已知的且可以商购 得到。
本文使用的术语"治疗药物"旨在包括在联邦食品、药品和化妆品法案 (Federal Food, Drug and Cosmetic Act)中定义的治疗药物。美国药典(the United Sates Pharmacopeia, USP)禾卩国家处方集(National Formulary, NF)
是最普通的药物产品的药效和纯度的公认的标准。
一方面，药学上可接受的化合物为毛果芸香碱、氢化可的松、脱氢皮质 甾醇、可的松、双氯酚酸钠、吲哚美辛、6oc-甲基-脱氢皮质甾醇、皮质甾酮、 地塞米松和泼尼松。然而，还提供了方法，其中药学上可接受的化合物的输 送是出于医疗目的。医疗目的的例子包括但不限于输送避孕药剂、治疗外科 手术后的粘连、促进皮肤生长、防止留下疤痕、敷裹伤口、进行粘弹性外科 (viscosurgery)、进行粘弹性补充(viscosupplementation)、禾卩制备组织。
药物输送的速率依赖于所释放的分子的疏水性。当化合物在含水的环境 中溶胀时，疏水的分子(如地塞米松和泼尼松)缓慢地从该化合物中释放， 而亲水的分子(如毛果芸香碱、氢化可的松、脱氢皮质甾醇、可的松、双氯 酚酸钠、n引哚美辛、6oc-甲基-脱氢皮质甾醇和皮质甾酮)则快速释放。该化 合物的保持缓慢地、持续不变地释放甾族抗炎剂的的能力使本文描述的化合 物对于外伤或外科手术介入后的伤口愈合非常有用。另外，该化合物可以用 作促进细胞生长和组织再生的屏障系统。
在某些方法中，实现了涉及血管发生(angiogenesis )和血管化 (vascularization)的分子或试剂的输送。公开了用于输送如刺激微血管化 (microvascularization)的VEGF的试剂的方法。还公开了用于输送能抑制 血管发生和血管化的试剂的方法，例如那些对于此目的有用的化合物和试 剂，所述化合物和试剂公开于但不限于美国专利Nos 6,174,861 "Methods ofinhibiting angiogenesis via increasingWw concentrations of endostatin protein (通过提高体内内皮抑制素蛋白浓度来抑制血管发生的方法)"；6,086,865 "Methods of treating angiogenesis隱induced diseases and pharmaceutical compositions thereof (治疗血管发生诱导的疾病的方法及其药物组合物)"； 6,024,688 "Angiostatin fragments and method of use (制管张素片段和使用方 法)"；6,017,954 "Method of treating tumors using O-substituted fbmagillol derivatives (使用O-取代的烟曲霉醇衍生物治疗肿瘤的方法)"； 5,945,403"Angiostatin fragments and method of use (制管张素片段和使用方 法)"；5,892,069 "Estrogenic compounds as anti-mitotic agents (作为抗有丝分 裂剂的雌激素化合物)"；5,885，795"Methods of expressing angiostatic protein (表达制管张素蛋白的方法)"；5，861，372"Aggregate angiostatin and method of use (聚合制管张素以及使用方法)"；5，854，221"Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use (内皮细胞增殖抑制剂及使用方法)"； 5，854,205"Therapeutic antiangiogenic compositions and methods(治疗抗血管发 生的组合物及方法)"；5,837,682"Angiostatin fragments and method of use (制 管张素片段及其使用方法)"；5,792,845"Nucleotides encoding angiostatin protein and method of use (核苷编码的制管张素及使用方法)"； 5,733,876"Method of inhibiting angiogenesis (抑制血管发生的方法)"； 5，698,586"Angiogenesis inhibitory agent (血管发生抑制剂)"； 5，661，143"Estrogenic compounds as anti-mitotic agents (作为抗有丝分裂齐U的 雌激素化合物)"；5，639,725"Angiostatin protein (制管张素蛋白)"； 5，504,074"Estrogenic compounds as anti-angiogenic agents (作为抗血管发生齐U 的雌激素化合物)"；5,290,807"Method for regressing angiogenesis using o-substituted flimagillol derivatives (使用O-取代的烟曲霉醇衍生物来退化血 管发生的方法)"以及5,135，919"Method and a pharmaceutical composition for
35the inhibition of angiogenesis (用于抑制血管发生的方法及药物组合物)"，涉 及用于抑制血管发生的分子的材料的这些专利结合于此作为参考。
本文描述了通过使本文描述的任何化合物或药物组合物与需要改善伤 口愈合的受试者的伤口接触，来改善需要这种改善的受试者体内的伤口愈合 的方法。还提供了通过使本文描述的任何化合物或药物组合物与能接收所述 药学上可接受的化合物的至少一个组织接触，将至少一种药学上可接受的化 合物输送给需要这种输送的患者的方法。
所公开的组合物可以用于治疗受试者体内的很多种类的组织缺陷，例 如具有空隙的组织(如牙周囊)、浅的或深的皮肤伤口、外科手术切口、 骨骼或软骨缺陷等。例如本文描述的化合物可以为水凝胶膜的形式。所述水 凝胶膜可以应用于骨骼组织内的缺陷(如手臂或腿骨内的骨折)、牙齿内的 缺陷、关节内的软骨缺陷、耳朵、鼻或咽喉等。通过提供一个表面，细胞可 以在该表面之上生长或者通过该表面生长，由本文描述的化合物组成的水凝 胶膜还可以起到用于引导组织再生的屏障系统的作用。为了增进如骨骼组织 的硬组织的再生，优选水凝胶膜为新生的细胞生长提供支撑，所述水凝胶膜 可以代替基质，因为该水凝胶膜可以逐渐被体液吸收或侵蚀。
由本文描述的化合物组成的水凝胶膜可以输送至细胞、组织、和/或器 官之上，例如通过注射、喷雾、喷射、刷、涂、包被等。输送也可以通过插 管、导管、有或没有针的注射器、压力敷贴器(pressure applicator)、泵等。 可以以膜的形式将该化合物应用至组织之上，例如提供一种敷裹在组织的表 面上的和/或将组织粘着至另一个组织或水凝胶膜的膜，以及其它应用。
一方面，本文描述的化合物通过注射给药。对于许多临床应用，当该化 合物为水凝胶膜的形式时，可注射的水凝胶因三个主要原因而优选。第一， 可注射的水凝胶可以在创伤部位形成任何需要的形状。因为最初的水凝胶可 以为溶胶或可模压的油灰状粘性材料，因此该系统可以以复杂的形状定位，且随后交联成符合需要的尺寸。第二，在凝胶形成的期间水凝胶可以粘附在 组织上，且产生于表面微微糙的机械联锁可以强化组织-水凝胶界面。第三， 引入原位可交联的水凝胶可以使用针或通过腹腔镜方法来完成，由此将外科 手术技术的侵入力最小化。
本文描述的化合物可以用于治疗牙周的疾病，可以切除覆盖在牙齿根部 的齿龈组织以形成封套或洞，并将所述组合物输送至该洞中并紧靠着暴露的 牙根。通过做一个经过齿龈组织的切口以暴露牙根，也可以将化合物输送至 牙齿缺陷，然后通过放置、刷、喷射、或其它方式将材料经过切口施用至牙 根表面之上。
当用于治疗皮肤或其它组织上的缺陷时，本文描述的化合物可以为能放 置在需要的区域之上的水凝胶膜的形式。在此方面，所述水凝胶膜是有延展 性的且可以被调整以符合组织缺陷的轮廓。
可以理解的是所公开的组合物和方法可以应用于需要组织再生的受试 者。例如，可以将细胞引入用于植入的本文描述的化合物中。 一方面，所述 受试者是哺乳动物。所述组合物和方法施用的哺乳动物优选是小鼠、家鼠、 母牛或牛、马、绵羊、山羊、猫、狗、白鼬、和灵长类，所述灵长类包括猿、 黑猩猩、猩猩、和人类。另一方面，本文描述的化合物和组合物可以施用于 鸟类。
当用于涉及组织再生(如伤口或烧伤愈合)的区域时，所公开的方法和 组合物消除对于一种或多种有关的已接受的治疗的需要的不必要的。可以理 解的是，通过接受公开的组合物或方法所获得的恢复时间的縮短或恢复质量 的提高已经获得一些益处。还可以理解的是， 一些公开的组合物和方法可以 用于防止或降低作为创伤(如外科手术)的伤口的闭合的结果而发生的纤维 化粘连。还可以理解的是由公开的组合物和化合物提供的间接效果是希望的 但不是必要的，例如改善抗菌性或减轻疼痛等。一方面，本文描述的化合物可以用于修复受试者体内的受损的弹性组 织，包括使受损的组织与本文描述的一种或多种化合物接触。受损组织的来 源可以是由于损伤或通过退化的生理状况。弹性组织的例子包括但不限于声 带、心血管组织、肌肉、腱、韧带、膀胱组织、尿道内的组织、括约肌、或 者胃肠道内的肌肉。
本文描述的化合物可以用作生长和分化细胞的基质。例如，本文描述的 化合物和组合物可以形成层压材料、凝胶、珠子、海绵体、膜、网状物、电 纺的纳米纤维、编织的网状物、或者非编织的网状物。 一方面，本文描述了 使多个细胞生长的方法，该方法包括(a)将母体细胞沉积在本文描述的基 质上，以及(b)对具有沉积的细胞的基质进行培养以促进细胞的生长。
另一方面，本文描述了使细胞分化的方法，该方法包括(a)将母体细 胞沉积在本文描述的基质上，以及(b)培养该集群(assembly)以促进细胞 的分化。
使用本文描述的基质可以生长和/或分化很多类型的细胞，所述可以生 长和/或分化的细胞包括但不限于干细胞、定型的干细胞、分化的细胞、和肿 瘤细胞。干细胞的例子包括但不限于胚胎干细胞、骨髓干细胞和脐带干细胞。 用于各种实施方式中的细胞的其它例子包括但不限于成骨细胞、成肌细胞、 成神经细胞、成纤维细胞、成胶质细胞、生殖细胞、肝细胞、软骨细胞、上 皮细胞、心血管细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、结缔组织细 胞、神经胶质细胞、上皮细胞、内皮细胞、激素分泌细胞、免疫系统的细胞、 和神经元。
本文中有用的细胞可以在体外(invitro)培养、由天然源衍生、遗传制 造、或者通过任何其它的方式来制成。可以使用原核细胞或真核细胞的任何 天然源。还可以预计的是细胞可以先体外后体内(exvivo)培养。
本文还可以使用非典型的或变态的细胞，如肿瘤细胞。在本文描述的基
38质上培养的肿瘤细胞可以提供更精确的用于评估药物治疗的机体内的固有 的肿瘤环境的表达。考虑到在类似于体内的环境中开发特异性地以肿瘤为目 标的药物，在本文描述的基质上的肿瘤细胞的生长可以促进肿瘤的生物化学 的途径和活性的表征，包括基因表达、受体表达、和多肽产生。
本文中还可以使用遗传制造的细胞。所述制造包括编排细胞以表达一种 或多种基因、抑制一种或多种基因的表达、或者两者都有。例如，遗传工程 可以包括添加遗传物质到细胞上或从细胞上除去遗传物质、改变现有的遗传 物质、或者两者都有。其中细胞被转染或者以其它方式制造以表达基因的实 施方式可以使用瞬时或永久转染基因、或者两者都有。基因序列可以是全部 或者部分长度、克隆的或者自然存在的。
另一方面，本文描述了使组织生长的方法，该方法包括(a)将母体细 胞沉积在本文描述的基质上，所述细胞是该组织的前体，以及(b)对具有 沉积的细胞的基质进行培养，以促进组织的生长。还可以预计的是能存活的 细胞可以沉积在本文描述基质上，并在促进组织生长的条件下培养。预计采 用本文描述的基质可以由上述任何细胞生长(即制造)组织。本文描述的载 体可以支撑许多不同种类的前体细胞，并且所述基质可以引导新组织的发 展。组织的产生在伤口愈合中具有众多应用。使用本文描述的方法可以在体 内或先体外后体内进行组织生长。
本文描述的化合物可以应用于可植入的装置，例如缝合线、夹钳、假
体、导管、金属螺钉、骨骼托(boneplate)、钉、绷带(如纱布)等，以提 高在植入部位内的可植入装置与机体的组织的相容性和/或性能或功能。所述 化合物可以用来涂覆所述可植入的装置。例如，通过提供生物相容性的光滑 的表面降低由粗糙边缘与邻近组织接触而产生的磨损的发生，所述化合物可 以用于涂覆可植入装置的粗糙表面，以促进该装置的相容性。所述化合物还 可以用于提高可植入装置的性能或功能。例如，当所述化合物为水凝胶膜时，该水凝胶膜可以应用于纱布绷带，以提高与它所应用的组织的相容性或粘附 力。所述水凝胶膜还可以应用于通过切口插入身体内的的装置(例如导管 或结肠造口术中使用的装置)的周围，以便有助于确保该导管/结肠造口术中 使用的装置在适当位置和/或填充该装置与组织之间的空隙，并形成紧密的密 封以降低细菌感染和体液的损失。
还可以预计的是本文描述的化合物可以用作生物人造材料，所述生物人 造材料在受试者体内可以用作可植入装置。在此方面，该生物人造材料可以 模制成任何需要的形状。 一方面，该生物人造材料含有由具有式I的一种或 多种化合物与含有至少两个巯基的大分子反应而得到的产物。 一方面，该大
分子包括具有至少两个巯基的类似弹性蛋白(elastin-like)的肽。另一方面， 一种或多种生物人造材料可以用于制备假器官装置。 一方面，该装置可以为 活的假器官装置，其中该装置促进组织生长。依赖于生物人造材料的组成， 该装置可以为可变形的，以适合受试者的特别需要。
可以理解的是所公开的组合物和方法的任何给定的特定方面都可以很 容易地与本文公开的具体实施例和实施方式进行比较，包括在实施例中讨论 的基于非多糖的试剂。通过进行这种比较，可以很容易地确定每个特定实施 方式的相对功效。在本文的实施例中公开了特别优选的组合物和方法，且可 以理解的是这些组合物和方法可以用本文公开的任何组合物和方法来实现， 而没有必要限制。
实施例
提出下列实施例以向本领域的普通技术人员提供怎样制备和评价本文 描述和要求的化合物、组合物和方法的完整的公开和描述，并且下列实施例 出于纯粹的示例的目的且并不是出于限制发明人视为其发明的范围的目的。 关于数字(例如数量、温度等)，已经作出努力以确保精确性，但一些误差和偏差应该作出解释。除非另有说明，份为重量份，温度为x:或者在环境温
度下，且压力为在大气压下或接近大气压。存在很多反应条件的变化和组合， 例如组分浓度、需要的溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其它可以用于最优 化获得自所描述的过程的产品的纯度和产率的反应范围和条件。为最优化这 样的过程条件，仅仅需要合理和常规的试验。 原料和方法
原料和分析仪器。高分子量透明质酸(HA， MW=824 kDa)购自Contipro CCo， Czech Republic (捷克共和国)。溴乙酸酐(BA)、来自牛睾丸的透明 质酸酶型I-S (HAse， 451 U/mg固体)购自Sigma-Aldrich Chemical Co.， Milwaukee (密尔沃基)，WI (威斯康星州)。磷酸盐缓冲生理食盐水10X
(PBS)、氢氧化钠(NaOH)、盐酸12.1N (HC1)、碘化钠(Nal)、七水合磷 酸氢二钠(Na2HP04 7H20)和SpectraPor渗析管MWCO 10.000购自Fisher Scientific, Hanover Park, IL (伊利诺斯州)。SAMSA荧光素(5-((2-(和-3)-S-乙酰巯基)琥珀酰基)氨基)荧光素)混合的异构体购自Molecular Probes Inc., Eugene (尤金)，OR (俄勒冈州)。T31人气管瘢痕成纤维细胞来自Dr. S. L. Thibeault (Division of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Department of Surgery, University of Utah, Salt Lake City, UT (耳鼻喉-头部和颈部外科组， 外科学系，犹他州大学，盐湖城，犹他州)；Division of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Department of Surgery, University of Wisconsin, Madison, WI
(耳鼻喉-头部和颈部外科组，外科学系，威斯康星大学，麦迪逊，威斯康 星州))。
iH-NMR光谱数据是使用Varian INOVA 400在400MHz下获得的。 UV/VIS光谱和测试在Palo Alto， CA的Hewlett-Packard 8453 UV-可见光谱仪 上进行。凝胶渗透色谱(GPC)分析是使用下列部件获得的Waters 486可 调吸光度检测器、Waters 410差示折射计、Waters 515 HPLC泵和Ultrahydrogel
411000柱(7.8x300 mm) (Waters Corp., Milford (米尔福德)，MA (马萨诸 塞州))。GPC的流动相由0.2MPBS缓冲液/甲醇(体积比为80: 20)组成。 用于校准该系统的HA标准购自Novozymes Biopolymers, Bagsvaerd, Denmark (丹麦)。OPTIMax酶标仪(microplate reader) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)用来测定用于细胞生存能力分析的490 nm吸光度值。
溴乙酸酯衍生的透明质酸(HABA)的合成。将透明质酸(6.0g)溶解 在600mL蒸馏水(1%重量/体积的溶液)中。通过添加1MNaOH调节该溶 液的pH至9.0。然后向该溶液中滴加溴乙酸酐(40 g， 153mmol)并且该反 应在4r下搅拌24小时。相对于N-乙酰葡糖胺残基的C-6伯羟基的数量， 溴乙酸酐的量相当于10当量。然后将该反应混合物向蒸馏水渗析3天。接 着冻干并分析该样品。通过'H-NMR和GPC来测定该样品的纯度，并用 SAMSA荧光素衍生化来测定取代度(SD) (SD 18%)。 'H-NMR (D20); 对应于取代基的化学位移5 = 3.84 ppm (COCH2Br)。
碘乙酸酯衍生的透明质酸(HAIA)的合成。将HABA (2.15 g)溶解在 215 mL蒸馏水中(1%重量/体积的溶液)并与10当量的NaI反应。该反应 在室温下搅拌过夜。接着，将反应混合物渗析3天(MWCO 10000)并随后 冻干。通过iH-NMR和GPC测定修饰的透明质酸的纯度，通过SAMSA荧 光素衍生化来计算取代度(SD 19%)。 ^-NMR(D20);对应于取代基的化 学位移S = 3.7ppm(COCH2I)。
SAMSA荧光素衍生化。将SAMSA荧光素(25 mg)溶解在2.5 mL 0.1M 的NaOH中并在室温下放置15分钟。然后添加6 N的HC1 (35 pL)，接着 添加0.5 mL pH7.0的NaH2P04 H20。 HA-BA与HA-IA (各5 mg)与活化 的SAMSA荧光素在室温下反应30分钟。然后将该反应混合物在用具有40 kDa的额定排除极限(nominal exclusion limit)的Bio-Gel P-30 Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA ) 土真充的 Econo-Pac Bio-Rad 柱 (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)上分离以证实共价连接。为了测定卤代乙酸酯 HAs的衍生度，将SAMSA荧光素-卤代乙酸酯HA反应混合物向dH20 (蒸 馏水)(MWCO3500)渗析3天，然后借助光谱方法测定A494。
HA卤代乙酸酯的细胞毒性分析。将T31人气管瘢痕成纤维细胞在 DMEM/F12 +10%新生小牛血清+2111]^1^-谷氨酰胺中，以1(^细胞/mL(100 )al/孔)的密度接种在96孔板中，并在37。C/5。/。 C02下培养24小时。在无血 清、无L-谷氨酰胺的生长介质中制备1.5%的HABA、 HAIA和HA( 120 kDa) 的储备溶液(stock solution),并且使用0.1 M NaOH调节溶液的pH至7.5-8。 然后通过0.45 pm的针头式过滤器单元(syringe driven filter unit)来过滤溶 液以确保无菌。然后除去生长介质，并用IOO pL的无血清、无L-谷氨酰胺 的介质洗涤细胞两次。将工作溶液(在IOO pL无血清、无L-谷氨酰胺的介 质中各自为1.5%、 1%、 0.6%、 0.2%和0.1%)添加至细胞上，并且再培养该 板24小时。未处理的细胞用作对照。将四唑化合物MTS (Cell-Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI)还原成 有色的甲臜(formazan)产物来评定细胞生存能力。还原的盐在可以用光谱 方法监控的490 nm下具有吸光度最大值，且颜色的强度与孔中的能生存的 细胞的数量成比例。
凝胶化研究。在IX PBS缓冲液中，在7-8的pH下制备1.5% HABA和 HAIA溶液。pH 7-8的IX PBS中的3%的DTPH修饰的甲基化的HA(CHMA) 和明胶-DTPH溶液用于交联。CHMA的合成在国际公布No. WO 2005/056608 中有公开，在此引入该国际公布作为参考。卤化的HA衍生物和交联剂 (CHMA或明胶-DTPH，两者均为含有巯基的化合物)溶液以不同的体积比
(1: 1、 1: 2、 2: 1、 1: 3禾tl 3: 1)混合并在室温下放置。最快的交联发
生在明胶-DTPH/HAIA混合物(体积比为3: 1)中。亲电体衍生的HA含量 较高不适合于交联。结果总结在表1中。
43表1.用于HA-BA和HA-IA水凝胶的凝胶化条件。
原料体积比(v/v) (摩尔比)1: 1 (1.52: 1)1: 2 1: 1.322: 1 (3: 1)1: 3 (1: 2)3: 1 (4.5: 1)
凝胶化时间(小时)CHMA/HABA24_9一9
C画A/HAIA8.5226.5—6
明胶DTP願ABA8.5455一4
明胶DTP應AIA22265454
用于凝胶化测试的工作溶液是在IX PBS中2%重量/体积的CMHA-S， 2%重量/体积的HABA和2%重量/体积的HAIA溶液，通过添加1 M NaOH 调节pH为7.0、 8.0、 9,0、 10.0、 11.0禾卩12.0。通过使用3: l摩尔比的亲核 体与亲电体来获得含有卤代乙酸酯HA的水凝胶。通过暴露于空气，仅 CMHA-S的水凝胶(对照物)通过二硫键交联。通过试管倒置方法测定溶液 (可流动的液体)至凝胶(非流动的水凝胶)的转变时间。该试验重复三次， 具有一致的结果。
非粘着的水凝胶。在无菌过滤后，通过溶解CMHA-S、 HABA和HAIA (1XPBS， pH至9.0)的2%重量/体积的溶液并以3: l摩尔比的亲核体与 亲电体使它们混合来获得由CMHA-S和卤代乙酸酯HAs组成的水凝胶。通 过暴露于空气，仅CMHA-S的水凝胶(对照物)通过二硫键交联。然后， 该复合物被浇注于96孔组织培养板中，并使其于室温下在罩中凝胶并固化。 细胞粘着的水凝胶。通过向上述非粘着的水凝胶中添加巯基修饰的明胶 (Gtn-DTPH)来获得细胞粘着的水凝胶。简言之，将Gtn-DTPH (1XPBS， pH 9.0)的2%重量/体积的溶液与2%重量/体积的CMHA-S (9: 1体积/ 体积)混合，然后在无菌过滤后，在3: 1的摩尔比的亲核体与亲电体下与
442%重量/体积的卤代乙酸酯HA溶液(1XPBS， pH9.0)反应。通过暴露于 空气，CMHA-S与Gtn-DTPH水凝胶(没有卤代乙酸酯HAs)通过二硫键交 联。当具有非粘着的凝胶时，该复合物被浇注于96孔组织培养板中，并使 其于室温下在罩中凝胶并固化。含有Gtn-DTPH的生物材料的凝胶化时间与 非粘着的水凝胶相似。
水凝胶细胞毒性分析。用在pH 9.0下制备的50 ^ CMHA-S、 CMHA-S + HABA、 CMHA-S + HAIA、 CMHA-S + Gtn-DTPH、 CMHA隱S + Gtn-DTPH + HABA和CMHA-S + Gtn-DTPH + HAIA水凝胶来涂覆组织培养板(96孔)， 并使其在罩中固化过夜。未涂覆的孔用作对照。然后用200 p介质
(DMEM/F12+10%新生小牛血清+2 111^41^谷氨酰胺+青霉素/链霉素) 洗涤凝胶三次，接着将相同介质中的细胞(3.5 x 1(^细胞/mL)接种在每个 孔中(100pl/孔)。随后细胞在37。C/5。/。C02下培养48小时。将上面描述的 比色分析用于评估能存活的细胞的存在。使用Olympus CKX41显微镜 (Olympus America Inc., Melville, NY)用显微镜的方法来验证细胞附着。
水凝胶降解。为了测定在牛睾丸HAse (225 U/mL)存在下水凝胶的酶 降解速率，将0.5 mL凝胶浇注于17 x 60 mm的玻璃瓶(Fisher Scientific) 中并使其固化过夜。接着，凝胶用600 ^illXPBS， pH 7.4 ± HAse覆盖并放 置于37'C下的150转每分(rpm)的培养箱中。在预定的时间间隔下，取出 300 pLPBS ± HAse并用分光光度法来评估Aw值(低聚糖的吸光度范围为 200-240nm)。对于每一个时间点，用新鲜的1XPBS， pH 7.4 (士HAse，如 果需要的话)替换为了分析而取出的上层清液。将完全分解后的那一天记录 的吸光度值设定为100%，且将先前几天所读出的吸光度值外推为百分比。
统计学分析。使用t检验(Student's t-test) (2尾(2-tailed))来比较由 平均值士标准偏差(S.D.)所表示的数值，p〈0.05统计学上认为是有效的， 而p < 0.005或p < 0.001认为是高度有效的。溴乙酸酯衍生的HA (HABA)的合成及表征。通过在碱性的反应条件 下用溴乙酸酐处理HA来获得HABA(图1)。由于溴乙酸酐和HA之间形成 混合的酸酐，该混合的酸酐可以快速水解，恢复HA葡糖醛酸的羧酸基团， 因此需要反应物摩尔数过量。而副反应不会对HABA的总的生物活性引起 任何干扰，该副反应消耗了酸酐试剂并减少了伯羟基的总的溴乙酸酯修饰。 接着，将反应混合物渗析以除去水解的溴乙酸酐副产物、溴乙酸钠和乙二醇 酸钠。通过冻干冻结的渗析后的溶液，以78"/。的产率获得最终产物(HABA)。
通过在020中的^-NMR来确定HABA的结构。与原料(HA)的光谱 图(图2A)相比较， 一个新的宽的共振出现在3.84ppm处，对应于溴乙酸 酯基团的亚甲基质子(COCH2Br)(图2B)。 HABA的纯度和分子量分布通 过GPC来测定(数据未示出)。通过折射率和UV两者来检测GPC图并确 定该化合物的纯度。该化合物的分子量确定为MW 120 kDa (多分散指数 2.58)，且分子量的降低(与原料相比较)可以归因于反应和提纯过程中的碱 性的水解或酸性的水解。最终的HABA产物完全可溶解于水中。定义为溴 乙酸酯基团每IOO个二糖单位的取代度通过荧光染料衍生化评估为约18%。
碘乙酸酯衍生的HA (HAIA)的合成及表征。将获得的HABA分成二 等份。 一份用于进一步的化学和生物表征。第二份用作合成HAIA的原料。 在纳米纯水(nanopure water)中，使用改进的芬克尔斯坦反应(modified Finkelstein reaction)(图3)来使HABA与Nal反应，并且将该溶液渗析并 冻干以97%的产率得到HAIA。与起始的HABA的'H-NMR光谱图(图2B) 相比较，对应于卤代乙酸酯基团的亚甲基质子的峰(COCH2X，5 = 3.84)向 高磁场移动至3.70 ppm (图4)。使用GPC来评估HAIA的纯度和分子量分 布(数据未示出)。该化合物的分子量确定为MW 160 kDa (多分散指数 2.45)。由于^-NMR峰由5 = 3.84向高磁场移动至5 = 3.70 ppm，因此推测 取代度与HABA相同。
46HA卤代乙酸酯的SAMSA荧光素衍生化。两种HA卤代乙酸酯衍生物 的大致的结构通过iH-NMR来测定。然而，由于聚合物质子光谱的复杂性， 使用另外的测量方法来测试成功的化学改变。SAMSA荧光素为一种含有巯 基的荧光试剂，通常用于分析蛋白质的马来酰亚胺和碘乙酰胺部分(图5A)。 由于新的活性基团的特性，因而选择SAMSA荧光素衍生化来评估新的部分
(对于HABA为溴乙酸酯和对于HAIA为碘乙酸酯)的存在以及活性。如 在原料与方法中所描述的，HA衍生物与SAMSA荧光素结合并渗析后，将 该溶液在UV光下拍照以在视觉上评估荧光强度(图5B)。荧光部分与HA 卤代乙酸酯的共价连接进一步用色谱方法确认(结果未示出)。此试验的结 果表示了想法的证实并显示了 HA聚合物的成功的化学改变。
HA卤代乙酸酯的细胞毒性。将初级人气管瘢痕T31成纤维细胞在96 孔板中培养，并用作模型系统以评价HABA和HAIA对非无限增殖的
(non-immortalized)初级细胞的影响。所述细胞最初在含有血清的介质中培 养以确保适当的生长。接着，用无血清的介质洗涤细胞，并将位于无血清的 介质中的浓度为1.5%、 1%、 0.6%、 0.2%禾卩0.1%重量/体积的HABA或HAIA 添加至细胞。仅用无血清的介质处理的细胞用作对照。48小时后，如描述的， 使用MTS分析用比色的方法评估细胞生存的能力。如对于巯基反应性的亲 电子种所预期的，两种HA卤代乙酸酯聚合物在高浓度下都是细胞毒素的。 然而，在低浓度(0.1%重量/体积)下，这些敏感的细胞可以很好地耐受它 们(图6)。
HA卤代乙酸酯交联的水凝胶。图7说明了由HA卤代乙酸酯制备的两 种根本上不同的水凝胶。因此，图7A说明了严格地基于两种化学修饰的HA 衍生物一一一种亲电子的和一种亲核的非细胞粘着的水凝胶的制备。图7B 显示了通过引入巯基修饰的明胶衍生物，亲电子的和亲核的HA衍生物可以 共交联成细胞粘着的水凝胶。为了测定含有卤代乙酸酯HA的生物材料的凝胶化时间，通过使
CMHA-S与HABA或HAIA以3: 1的摩尔比混合而制得水凝胶。紧接着研 究了凝胶化时间的pH依赖性。在pH为7.4的IX PBS中制备CMHA-S与 HABA或HAIA的溶液(2%重量/体积)，并将该溶液的pH调节至pH 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0。如预期的，最快凝固的溶液为pH为9.0和10.0 的溶液(表l)。所得到的凝胶是透明的且不溶于水溶液中(数据未示出)。 含有卤代乙酸酯HA的水凝胶的凝胶化过程是通过导致硫醚形成的亲核取代 反应而进行的。CMHA-S的巯基具有近似于9的pKa值，这说明为什么该 反应的最佳的pH为9-10。在较低的pH值下，所述巯基大部分以其质子化 的形式存在，而当pH提高时，阴离子的亲核体的相对量增加。高于10的 pH下，氢氧化物开始置换碘化物或溴化物，导致难以获得碘化物或溴化物 来形成硫醚。
水凝胶的细胞毒性。通过使pH9.0的CMHA-S的2%重量/体积的溶液 与pH9.0的HA卤代乙酸酯的2%重量/体积的溶液以3: 1的摩尔比的混合 来制备非细胞粘着的水凝胶(图7A)。然后将混合的溶液用于涂覆96孔板 的孔并使其在罩中凝胶过夜。在细胞接种前，用含有血清的介质洗涤水凝胶、 然后接种3.5 x 104细胞/mL (100 (al/ L)并在37°C/5% C02下培养48小时。
前面的研究显示了基于HA的水凝胶如CarbylanTM-SX不能促进细胞粘 着，而含有共价交联的明胶衍生物的基于HA的凝胶支持细胞粘着和增殖。 为了客观地评价含有卤代乙酸酯HA的水凝胶的细胞毒性，未涂覆的孔和用 具有共价交联的明胶(Gtn-DTPH)的凝胶涂覆的孔用作对照(图7B)。 24 小时后，用显微镜研究细胞。在无Gtn-DTPH的材料上接种的细胞团簇在一 起、成圆形并且没有粘着，而仅在塑料上生长的细胞或在含有Gtn-DTPH的 材料上生长的的细胞分散开并得到典型的纺垂形的形态。细胞的生存能力是 通过细胞接种后48小时的MTS比色分析来评估的。不存在Gtn-DTPH时，细胞不能粘着。甚至较少的细胞存在于含有卤代乙酸酯HA的凝胶上，与这 些材料的细胞毒性作用一致(在水凝胶中，最终的卤代乙酸酯HA的浓度为
0.67%重量/体积，因为以1: 3的摩尔比将2%重量/体积的储备溶液加入到 该聚合物溶液中)(图8)。与对照水凝胶(仅CMHA-S)相对，含有卤代乙 酸酯HA的无Gtn-DTPH的水凝胶在细胞粘着/生存能力方面显示出17% (HABA)至30% (HAIA)的降低(见图8的插图)。
HA卤代乙酸酯水凝胶的降解。用于医疗目的或任何其它体内的应用的 HA卣代乙酸酯水凝胶的用途依赖于在透明质酸酶作用下的凝胶降解的速 率，所述速率转变成涂覆材料实际上可以在体内存在的时间。为了估算水凝 胶的降解速率，用IX PBS, pH 7.4士HAse (225 UmL)来培育无Gtn-DTPH的 水凝胶。我们的结果显示通过二硫键交联的CMHA-S水凝胶比含有HA卤 代乙酸酯的材料水解得更快(图9)。到第3天，CMHA-S水凝胶全部降解。 相反，到第5天，含有HABA的水凝胶呈现为全部降解，而CMHA-S/HAIA 水凝胶降解得稍微慢些(至第6天)。不存在酶时，含有HA卤代乙酸酯的 水凝胶以非常慢的速率水解。仅CMHA-S的水解速率不能测定，因为这种 生物材料具有与含有卤乙酸酯HA的水凝胶不同的行为，并且在添加上清液 时溶胀。
贯穿本申请，参考了各种公开文本。将将这些公开文本的公开整体结合 于本申请中作为参考，以更全面地描述本文所述的化合物、组合物和方法。
可以对本文所述的化合物、组合物和方法进行各种修改和变化。通过说 明书的描述和本文公开的化合物、组合物和方法的实践，本文所描述的化合 物、组合物和方法的其它方面将变得明显。说明书和实施例应该视为示例性 的。
权利要求
1、一种包括式I的化合物，其中，Y′为大分子的残基，该大分子选自由低聚核苷酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋白、糖脂、多糖和蛋白质所组成的组中；X′为-O-、-S-、-NH-、或-NR＂-；R′为氢、烷基、全氟烷基、芳基、杂芳基、或卤素；R＂为氢或C1-5烷基；并且A′为离去基团。
2、 根据权利要求1所述的化合物，其中，所述大分子选自由多糖和糖 胺聚糖所组成的组中。
3、 根据权利要求2所述的化合物，其中，所述多糖包括透明质酸、硫 酸软骨素、皮肤素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、褐藻酸、 果胶、壳聚糖、或羧甲基纤维素。
4、 根据权利要求1所述的化合物，其中，所述大分子选自由合成的聚 合物所组成的组中，所述合成的聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙二 醇、聚丙二醇、多元醇、聚胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的三嵌 段聚合物、聚乙二醇的星形聚合物、和聚乙二醇的树枝状聚合物。
5、 根据权利要求1所述的化合物，其中，所述大分子为蛋白质，该蛋 白质选自由自然存在的蛋白质、重组蛋白质、胞外基质蛋白质、化学修饰的 胞外基质蛋白质、遗传工程的蛋白质、以及胞外基质蛋白质部分水解的衍生 物所组成的组中。
6、 根据权利要求1所述的化合物，其中，Y'包括透明质酸的残基。
7、 根据权利要求1所述的化合物，其中，Y'包括N-乙酰-葡糖胺残基， 其中该N-乙酰-葡糖胺残基的至少一个C-6伯羟基被基团-C(O)CH(R')(A')取代。
8、 根据权利要求7所述的化合物，其中，所述N-乙酰-葡糖胺残基的至 少一个仲羟基被基团-C(O)CH(R'XA')取代。
9、 根据权利要求7所述的化合物，其中，所述N-乙酰-葡糖胺残基的 1%的C-6伯羟基至约100%的C-6伯羟基被基团-C(O)CH(R')(A')取代。
10、 根据权利要求1所述的化合物，其中，X'为-O-、或-NH-。
11、 根据权利要求1所述的化合物，其中，R'为甲基或氢。
12、 根据权利要求1所述的化合物，其中，A'为卤素。
13、 根据权利要求1所述的化合物，其中，Y'为透明质酸的残基，其中 至少一个羟基被-C(0)CH2Cl、 -C(0)CH2Br、或-<:(0)0121取代。
14、 一种制备化合物、或其药学上可接受的盐的方法，该方法包括使含 有至少一个亲核基团的大分子与包括式XV的化合物反应，其中，R'为氢或烷基；并且Ai和A^虫立地为相同或不同的离去基团。
15、 根据权利要求14所述的方法，其中，所述大分子包括糖胺聚糖。
16、 根据权利要求14所述的方法，其中，所述大分子包括透明质酸。
17、 根据权利要求14所述的方法，其中，R'为氢。
18、 根据权利要求14所述的方法，其中，八1形成式乂￥1的化合物，R'为氢或烷基，其中每个R'为相同的基团；并且每个八2为相同的离去基团。
19、根据权利要求18所述的方法，其中，入2为卤素。
20、 根据权利要求18所述的方法，其中，所述大分子为透明质酸，且 包括式XV的化合物选自由氯乙酸酐、溴乙酸酐、和碘乙酸酐所组成的组中。
21、 一种用于偶联两个以上大分子的方法，该方法包括使包括权利要求 1中的式I的第一大分子与含有至少一个亲核基团的第二大分子反应。
22、 根据权利要求18所述的方法，其中，所述大分子为透明质酸，且 包括式XV的化合物为酰卤、酸酐、或羧酸酰胺。
23、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子选自由低聚 核苷酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋白、和糖脂所组成的 组中。
24、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括具有至 少一个SH基团的多糖。
25、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括具有至 少一个SH基团的糖胺聚糖。
26、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子选自由具有 至少一个SH基团的硫酸软骨素、皮肤素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮肤素、 硫酸乙酰肝素、褐藻酸、果胶、壳聚糖、羧甲基纤维素、和透明质酸所组成 的组中。
27、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括式II，<formula>formula see original document page 6</formula>其中，Z为大分子的残基，并且L选自由聚亚烷基、聚醚基、聚酰胺基、聚亚氨基、芳基、聚酯基、和 聚硫醚基所组成的组中。
28、 根据权利要求27所述的方法，其中，所述大分子选自由低聚核苷 酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋白、糖脂、多糖、蛋白质、 和糖胺聚糖、或者药学上可接受的化合物所组成的组中。
29、 根据权利要求27所述的方法，其中，Z为透明质酸的残基，且L 为CH2CH2或CH2CH2CH2。
30、 根据权利要求27所述的方法，其中，Z为明胶的残基，且L为CH2CH2 或CH2CH2CH2。
31、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第二大分子包括式XX，Y-X画R匿SH XX其中，Y为大分子的残基；X为-O-、 -S-、 NH、或-NR"-;R"为氢或d.5烷基；并且R为取代的或未取代的C2或C3亚垸基。
32、 根据权利要求31所述的方法，其中，所述大分子选自由低聚核苷酸、核酸或核酸的代谢稳定的类似物、多肽、糖蛋白、糖脂、多糖、蛋白质、 和合成的聚合物、糖胺聚糖、或者药学上可接受的化合物所组成的组中。
33、 根据权利要求32所述的方法，其中，所述多糖选自由硫酸软骨素、 皮肤素、乙酰肝素、肝素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、褐藻酸、果胶、壳 聚糖、透明质酸、或羧甲基纤维素所组成的组中。
34、 根据权利要求31所述的方法，其中，所述大分子选自由合成的聚 合物所组成的组中，所述合成的聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙二 醇、聚丙二醇、多元醇、聚胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的三嵌 段聚合物、聚乙二醇的星形聚合物、和聚乙二醇的树枝状聚合物。
35、 根据权利要求31所述的方法，其中，所述大分子是蛋白质，该蛋 白质选自由自然存在的蛋白质、重组蛋白质、胞外基质蛋白质、化学修饰的 胞外基质蛋白质、遗传工程的蛋白质、以及胞外基质蛋白质部分水解的衍生 物所组成的组中。
36、 根据权利要求31所述的方法，其中，X为-O-、或-NH-。
37、 根据权利要求31所述的方法，其中，R为CH2CH2、 CH2CH2CH2、 CH2CHR5、 CHR5CHR5、 C(R5)2CHR5、或C(R5)2C(R5)2，其中R5为烷基。
38、 根据权利要求31所述的方法，其中，R为CH2CH2。
39、 根据权利要求31所述的方法，其中，Y为透明质酸的残基，其中至少一个羟基被-CH2CH2SH取代。
40、 一种由权利要求21所述的方法制备的化合物。
41、 一种化合物、或其药学上可接受的盐，该化合物、或其药学上可接 受的盐具有包括式VII的至少一个片段，其中，Y'为第一大分子的残基；X'为-O-、 -S-、 -NH-、或-NR"-;R'为氢或烷基； R"为氢或C,.5烷基；并且 G'包括第二大分子的残基。
42、 一种药物组合物，该药物组合物含有药学上可接受的化合物和一种 或多种如权利要求1所述的化合物。
43、 一种药物组合物，该药物组合物含有药学上可接受的化合物和一种 或多种如权利要求41所述的化合物。
44、 一种药物组合物，该药物组合物含有活的细胞和一种或多种如权利 要求l所述的化合物。
45、 一种药物组合物，该药物组合物含有活的细胞和一种或多种如权利 要求41所述的化合物。
46、 一种在需要改善伤口愈合的受试者体内改善伤口愈合的方法，该方法包括使所述受试者的伤口与一种或多种如权利要求1所述的化合物接触。
47、 一种在需要改善伤口愈合的受试者体内改善伤口愈合的方法，该方 法包括使所述受试者的伤口与一种或多种如权利要求41所述的化合物接触。
48、 一种向需要输送药学上可接受的化合物的患者输送至少一种药学上 可接受的化合物的方法，该方法包括使至少一个能接收该药学上可接受的化 合物的组织与权利要求42所述的组合物接触。
49、 权利要求1所述的化合物作为生长因子、抗炎剂、抗癌剂、止痛剂、 抗感染剂、或者抗细胞附着剂的用途。
50、 权利要求41所述的化合物作为生长因子、抗炎剂、抗癌剂、止痛 剂、抗感染剂、或者抗细胞附着剂的用途。
51、 一种含有一种或多种如权利要求1所述的化合物的基质。
52、 一种含有一种或多种如权利要求41所述的化合物的基质。
53、 根据权利要求51所述的基质，其中，所述基质包括层压材料、凝 胶、珠子、海绵体、膜、网状物、电纺的纳米纤维、编织的网状物、或者非 编织的网状物。
54、 一种使多个细胞生长的方法，该方法包括(a)将母体细胞沉积在 权利要求51所述的基质上，以及(b)对具有沉积的细胞的基质进行培养以促进所述细胞的生长。
55、 一种使细胞生长的方法，该方法包括使所述细胞与一种或多种如权 利要求1所述的化合物接触。
56、 一种使细胞生长的方法，该方法包括使所述细胞与一种或多种如权 利要求41所述的化合物接触。
57、 根据权利要求54所述的方法，其中，所述细胞包括干细胞。
58、 根据权利要求55所述的方法，其中，所述细胞包括干细胞。
59、 一种修复受试者体内的受损伤的弹性组织的方法，该方法包括使所 述受损伤的组织与一种或多种如权利要求1所述的化合物接触。
60、 一种修复受试者体内的受损伤的弹性组织的方法，该方法包括使所 述受损伤的组织与一种或多种如权利要求41所述的化合物接触。
61、 根据权利要求58所述的方法，其中，所述组织包括声带、心血管 组织、肌肉、腱、韧带、膀胱组织、尿道内的组织、括约肌、或者胃肠道内 的肌肉。
62、 一种生物人造材料，该生物人造材料含有由一种或多种如权利要求 1所述的化合物与含有至少两个巯基的大分子反应而得到的产物。
63、 一种生物人造材料，该生物人造材料含有由一种或多种如权利要求41所述的化合物与含有至少两个巯基的大分子反应而得到的产物。
64、 根据权利要求62所述的生物人造材料，其中，所述大分子包括具 有至少两个巯基的类似弹性蛋白的肽。
65、 一种假器官装置，该假器官装置包括一种或多种如权利要求62所 述的生物人造材料。
全文摘要
本文描述了用亲电子基团修饰的大分子及其制备和使用方法。为了制备“无交联剂的”水凝胶，描述了HA的巯基反应性的、亲电子的衍生物的制备，以及能在温和的条件下偶联两种以上分子(如大分子)的化合物和方法。具体公开了在大量存在于HA聚合物上的羟基上引入反应性的溴乙酸酯官能团和碘乙酸酯官能团。所描述的“无交联剂的”水凝胶具有众多的应用，包括但不限于药物输送、小分子输送、伤口愈合、烧伤愈合、组织再生/组织工程、细胞培养和生物人造材料。
文档编号C08B37/08GK101511876SQ200780032676
公开日2009年8月19日 申请日期2007年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者G·D·普雷斯特维奇, M·谢尔班 申请人:犹他大学研究基金会