专利名称：一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素及其制备方法。
背景技术：
硫酸乙酰肝素是存在于各种动物细胞基质和细胞膜中的糖胺聚糖，是目前自然界结构最复杂的生物大分子之一。硫酸乙酰肝素糖是以己糖醛酸(葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)与乙酰氨基葡萄糖二糖单位重复组成，由于其糖链中的氨基和羟基不同程度地被硫酸基取代，导致其结构的多样性。其二糖单位就有32种组合方式，由10个单糖组成的硫酸乙酰肝素可能有上百万种结构序列。从而使硫酸乙酰肝素成为携带生物信息密度最大的生物分子。
由不同动物和组织来源以及采用不同提取分离方法所得的硫酸乙酰肝素在化学组成、结构和活性等方面明显不同。目前，制备硫酸乙酰肝素的原料种类较少，主要是利用牛肺、胰、脾和猪十二指肠粘膜。因此，所获得的硫酸乙酰肝素种类少，结构缺乏多样性，抗凝性低，大大限制了对硫酸乙酰肝素的研究和应用。至今，未见有关来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素及其制备方法，它能弥补现有技术的上述不足。
一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素，其特征在于含有0.1-6％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS6S、1-15％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS、0.1-0.5％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、40-80％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、1-25％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、0.1-10％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、0.1-15％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、5-20％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc，硫酸基与二糖总量比例为0.1-2，分子量为5000-20000。
上述的硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于将鼠组织绞碎均质后，脱脂，用蛋白酶水解，再用碱水解，脱蛋白，离心取清液，透析，透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀，用核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解，再用离子交换柱分离。
制备本发明的硫酸乙酰肝素所用的原料独特，得到的产品组成与结构特异，抗凝性强，而且具有较强的抗辐射作用，极大地丰富了硫酸乙酰肝素种类，可为药物的分子模拟提供有用的模型结构信息，可用于与蛋白质的相互作用研究等。
具体实施例方式
实施例1.
将100克鼠肝组织绞碎均质后，依次以1倍体积的体积比为2∶1、 1∶1、1∶2的氯仿和甲醇脱脂。干燥后粉碎；将所得鼠肝粉混悬于100mL0.1mol/L Tris-的盐酸和水组成的缓冲液中，用0.05mol/L的碳酸钠水溶液调水解液pH至9.0，加入2.7单位链霉蛋白酶50℃下水解40h，4℃下离心取清液；该清液在含有50mmol/L硼氢化钠的200mL 0.2mol/L的氢氧化钠水溶液中45℃水解8h，加5％(重量百分浓度，下同)高氯酸水溶液，4℃下离心取清液，用蒸馏水透析1天(MWCO，3500)；向所得透析液加50mL 10％的氯化十六烷基吡啶水溶液，4℃下放置3h，离心收集沉淀，所得沉淀用0.1％的氯化十六烷基吡啶水溶液冲洗1次，将所得沉淀溶解于100mL2.5mol/L的氯化钠水溶液中，加入4倍体积的甲醇，4 ℃下放置过夜，离心收集沉淀，用蒸馏水透析1天，冷冻干燥；将所得粗硫酸乙酰肝素溶于100mL 0.2mol/L的氯化钠水溶液中，通过强碱型阴离子交换柱Dowex(5×30cm)，依次以3个柱体积的蒸馏水、2个柱体积的50％甲醇水溶液、3个柱体积的3％和16％的氯化钠水溶液洗脱，所得组分加入4倍体积的无水乙醇进行沉淀，冷藏1天后离心，冷冻干燥；将上述粗硫酸乙酰肝素再悬浮于含有20mL 2mmol/L的氯化镁的20mmol/L的Tris-盐酸和水组成的缓冲液中(pH8)，加入2500单位核糖核酸酶和2单位硫酸软骨素酶ABC，37℃下水解8小时，加入氯化钠至其浓度为16％，加入4倍体积的甲醇，离心收集沉淀，用蒸馏水透析1天(MWCO，3500)，冷冻干燥，得0.1克硫酸乙酰肝素。
得到的硫酸乙酰肝素通过毛细管电泳、核磁共振波谱、高效凝胶色谱和化学分析确定，其中含有5.2％(摩尔百分数，下同)ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS6S、10.5％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS、0.1％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、59.5％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、1.1％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、6.6％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、8.8％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、8.3％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc，硫酸基与二糖总量的比例为0.63，分子量为11000。
实施例2.
将50克鲜鼠脾组织绞碎均质后，依次以10倍体积的体积比为2∶1、1∶1、1∶2的氯仿和甲醇脱脂。干燥后粉碎；将所得鼠脾粉混悬于50mL0.1mol/L的Tris-醋酸和水组成的缓冲液中，用0.05mol/L的碳酸钠水溶液调水解液pH至8.6，加入1.5单位碱性蛋白酶40℃下水解20h，10℃下离心取清液；该清液在含有50mM硼氢化钠水溶液的100mL0.2mol/L氢氧化钠水溶液中40℃水解16h；加15％高氯酸的水溶液，10℃下离心取清液，用蒸馏水透析3天(MWCO，3500)；向所得透析液加25mL10％的氯化十六烷基吡啶水溶液，10℃下放置6h，离心收集沉淀，将所得沉淀用0.1％的氯化十六烷基吡啶水溶液冲洗3次，将沉淀溶解于50mL2.5mol/L氯化钠水溶液中，加入5倍体积的甲醇，10℃下放置过夜，离心收集沉淀，用蒸馏水透析3天，冷冻干燥；将所得粗硫酸乙酰肝素溶于50mL0.2mol/L氯化钠水溶液中，通过碱型阴离子交换柱DEAE-Sephadex，依次以蒸馏水、0.5mol/L、1.0mol/L和1.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，所得组分加入5倍体积的无水乙醇沉淀，冷藏2天后离心，冷冻干燥；将上述粗硫酸乙酰肝素再悬浮于10mL含有2mmol/L氯化镁水溶液的20mmol/L Tris-醋酸钠和水组成的缓冲液中(pH 7.4)，加入1250单位核糖核酸酶和1单位硫酸软骨素酶ABC，40℃下水解20小时，加入氯化钠至其浓度为16％，加入5倍体积的甲醇，离心收集沉淀，用蒸馏水透析3天(MWCO，3500)，冷冻干燥，得0.05克硫酸乙酰肝素。
得到的硫酸乙酰肝素通过毛细管电泳、核磁共振波谱、高效凝胶色谱和化学分析确定，其中含有0.2％(摩尔百分数，下同)ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS6S、10.0％ΔUAp2S-(1 →4)-α-D-GlcNpS、0.1％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、47.8％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、2 1.2％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、5.6％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、4.4％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、10.8％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc，硫酸基与二糖总量的比例为1.05，分子量为10200。
本发明所述的鼠组织为鼠的肝、脾、肺、肾、眼、心、脑、皮肤或肠；所述的脱脂为依次以1-10倍体积的体积比为2∶1、1∶1、1∶2的氯仿和甲醇脱脂；所述的蛋白酶为链霉蛋白酶、碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶，用该酶进行水解时所用的缓冲液为Tris-盐酸或Tris-醋酸，水解温度为30-70℃，水解时间为3-60小时；所述的碱水解采用的碱溶液是含有硼氢化钠的氢氧化钠水溶液，水解温度为30-70℃，水解时间为8-24小时；所述的脱蛋白采用的溶剂为高氯酸；所述的透析采用截留分子量3500的透析膜，溶剂为蒸馏水，透析时间为1-3天；所述的透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀为向透析液加氯化十六烷基吡啶，离心，所得沉淀溶解于氯化钠溶液，加入甲醇，离心收集沉淀，用蒸馏水透析1-3天，冷冻干燥，所述的离子交换柱为碱型阴离子交换柱Dowex、Q Sepharose FF、Q-Sepharose XL、DEAE-Sepharose、Q Sepharose、QAE Sephadex或DEAE-Sephadex，所述的洗脱液依次为蒸馏水、50％甲醇水溶液、3％-16％氯化钠水溶液或依次为蒸馏水、0.5-2.0mol/L氯化钠水溶液；所述的核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解为采用含有氯化镁的Tris-盐酸缓冲液或含有氯化镁的醋酸钠缓冲液进行水解，水解温度为30-70℃，水解时间为4-80小时。
权利要求
1.一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素，其特征在于含有0.1-6％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS6S、1-15％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpS、0.1-0.5％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、40-80％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、1-25％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、0.1-10％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpAc6S、0.1-15％ΔUAp-(1→4)-α-D-GlcNpS、5-20％ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNpAc，硫酸基与二糖总量比例为0.1-2，分子量为5000-20000。
2.权利要求书1所述的硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于将鼠组织绞碎均质后，脱脂，用蛋白酶水解，再用碱水解，脱蛋白，离心取清液，透析，透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀，用核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解，再用离子交换柱分离。
3.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的鼠组织为鼠的肝、脾、肺、肾、眼、心、脑、皮肤或肠。
4.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的脱脂为依次以1-10倍体积的体积比为2∶1、1∶1、1∶2的氯仿和甲醇脱脂。
5.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白酶水解所用的酶为链霉蛋白酶、碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶，用该酶进行水解时所用的缓冲液为Tris-盐酸或Tris-醋酸水溶液，水解温度为30-70℃，水解时间为3-60小时。
6.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的碱水解采用的碱溶液是含有硼氢化钠的氢氧化钠水溶液，水解温度为30-70℃，水解时间为8-24小时；
7.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的脱蛋白采用的溶剂为高氯酸；所述的透析采用截留分子量3500的透析膜，溶剂为蒸馏水，透析时间为1-3天；所述的透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀为向透析液加氯化十六烷基吡啶，离心，将所得沉淀溶解于氯化钠水溶液，加入甲醇，离心收集沉淀，用蒸馏水透析1-3天，冷冻干燥。
8.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的离子交换柱为碱型阴离子交换柱Dowex、Q Sepharose FF、Q-Sepharose XL、DEAE-Sepharose、Q Sepharose、QAE Sephadex或DEAE-Sephadex，所用的洗脱液依次为蒸馏水、40％-60％的甲醇水溶液、3％-16％的氯化钠水溶液或依次为蒸馏水、0.5-2.0mol/L的氯化钠水溶液。
9.如权利要求书2所述的制备方法，其特征在于所述的核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解为采用含有氯化镁的Tris-盐酸缓冲液或含有氯化镁的醋酸钠缓冲液进行水解，水解温度为30-70℃，水解时间为4-80小时。
全文摘要
一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素及其制备方法，制备时将鼠组织绞碎均质后，脱脂，用蛋白酶水解，再用碱水解，脱蛋白，离心取清液，透析，透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀，用核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解，再用离子交换柱分离。制备本发明的硫酸乙酰肝素所用的原料独特，得到的产品组成与结构特异，抗凝性强，而且具有较强的抗辐射作用，极大地丰富了硫酸乙酰肝素种类，可为药物的分子模拟提供有用的模型结构信息，可用于与蛋白质的相互作用研究等。
文档编号C08B37/10GK1817911SQ20061004449
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者毛文君 申请人:中国海洋大学