专利名称：地榆多糖的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种中药有效成分的分离方法，尤其涉及一种从中药地榆中分离纯化地榆多糖的方法。
背景技术：
地榆多糖是中药地榆的有效成分，是从中药地榆分离得到的一种多糖，地榆多糖是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，可用于糖尿病的治疗及减肥，对人体副作用小，与临床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物——阿卡波糖(Acarbose，商品名拜糖苹，为德国拜耳公司产品)相比活性更强。
α葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20；a-glucosidase)，是一类能够从含有α糖苷键底物催化水解葡萄糖基的酶的总称。在生理功能上主要从多糖、二糖的非还原端切下葡萄糖，人体对淀粉等食品的最终消化都依赖于小肠黏膜细胞刷状缘上α葡萄糖苷酶的作用。
α葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研究开发的一类口服降糖药物，其作用机理为竞争性抑制α葡萄糖苷酶，抑制来自双糖、多糖、低聚糖的消化、吸收，有效推迟并减轻糖尿病人餐后血糖升高尤其是并发症的发生，取得较好的治疗效果，至今仍广泛应用。
地榆多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用属竞争性抑制，故可根据服用者的需要选择不同剂量，对于目前的减肥大军，尤其青年女性可避免节食的痛苦，若能解决地榆多糖的制备和配方，将会大大方便减肥者的使用，扩大地榆的利用。
经检索，关于地榆多糖的分离纯化方法目前尚无公开报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种从中药地榆中分离纯化地榆多糖的方法。
本发明的地榆多糖的分离纯化方法，由下述步骤组成(1)将地榆粉碎至颗粒直径为200～300μm，与水以体积比计，按1∶4～5的量浸于蒸馏水中，50～65℃水浴15～30小时；(2)以3000～5000rpm离心10～16min，取上清液，以活性炭脱色，得地榆多糖水提物溶液；(3)用有机溶剂以常规方式去除地榆多糖水提物溶液中的蛋白；(4)选取内径和高度比为1∶25～50的层析柱；向柱内加入葡聚糖凝胶，加入量为柱体积的60％～90％；(5)凝胶过滤层析步骤(4)，洗脱液为蒸馏水，流速为0.3～0.6ml/min，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线有两个吸收峰，收集第二个峰洗脱液，即为地榆多糖的提取液
(6)以常规方法真空冷冻干燥地榆多糖的提取液，即得浅棕色的粉末——地榆多糖。
其中，步骤(1)所述水浴温度优选是60℃，水浴时间优选是20～25小时。
其中，步骤(2)所述离心速度优选是4000rpm，离心时间优选是10min。
其中，步骤(3)所述有机溶剂优选是乙醇。
其中，步骤(4)所述层析柱的内径和高度比优选为1∶30～40。
其中，步骤(4)所述向柱内加入的具有分子筛作用的物质量优选为柱体积的70％～80％。
其中，上述葡聚糖凝胶选用SephadexG-75～SephadexG-200。
其中，上述葡聚糖凝胶优选SephadexG-150。
其中，步骤(5)所述流速优选为0.4ml/min。
利用本发明提出的地榆多糖的分离纯化方法，可以制备出纯度达90％以上的地榆多糖，根本解决了地榆多糖分离难，纯度低，质量不稳定的不足，且本发明的方法设备及环境要求低，方法简便，成本低，灵活实用，利于推广、开发和应用。
采用本发明的分离纯化方法制备出的地榆多糖，经试验证实，对α葡萄糖苷酶活性有显著的抑制作用，试验结果表明本发明方法制备出的地榆多糖对α葡萄糖苷酶活性的抑制率达99.9％，而目前临床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物——阿卡波糖(Acarbose，商品名拜糖苹，为德国拜耳公司产品)对α葡萄糖苷酶活性的抑制率仅为81.5％，说明本发明的分离纯化方法已比现有方法有明显的提高，具备了商业应用和推广价值。
图1地榆多糖凝胶过滤层析的洗脱曲线图2大白鼠服用地榆多糖后的糖耐曲线具体实施方式
实施例1(1)将地榆粉碎至颗粒直径为200～250μm，与水以质量比计，按1∶4的量浸于蒸馏水中，50℃水浴20小时；(2)以4000rpm离心10min，取上清液，以活性炭脱色，得地榆多糖水提物溶液；(3)用有机溶剂以常规方式去除地榆多糖水提物溶液中的蛋白；(4)选取内径和高度比为1∶25的层析柱；向柱内加入SephadexG-100葡聚糖凝胶，加入量为柱体积的70％；(5)凝胶过滤层析步骤(4)，洗脱液为蒸馏水，流速为0.5ml/min，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线有两个吸收峰，收集第二个峰洗脱液，即为地榆多糖的提取液；(见图1)
(6)以常规方法真空冷冻干燥地榆多糖的提取液，即得浅棕色的粉末——地榆多糖。
实施例2(1)将地榆粉碎至颗粒直径为250～300μm，与水以质量比计，按1∶5的量浸于蒸馏水中，60℃水浴30小时；(2)以4000rpm离心16min，取上清液，以活性炭脱色，得地榆多糖水提物溶液；(3)用有机溶剂以常规方式去除地榆多糖水提物溶液中的蛋白；(4)选取内径和高度比为1∶40的层析柱；向柱内加入SephadexG-150葡聚糖凝胶，加入量为柱体积的80％；(5)凝胶过滤层析步骤(4)洗脱液为蒸馏水，流速为0.4ml/min；以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线有两个吸收峰，收集第二个峰洗脱液，即为地榆多糖的提取液；(见图1)(6)以常规方法真空冷冻干燥地榆多糖的提取液，即得浅棕色的粉末——地榆多糖。
实施例3(1)将地榆粉碎至颗粒直径为200～250μm，与水以质量比计，按1∶4的量浸于蒸馏水中，55℃水浴25小时；(2)以3000rpm离心15min，取上清液，以活性炭脱色，得地榆多糖水提物溶液；(3)用有机溶剂以常规方式去除地榆多糖水提物溶液中的蛋白；(4)选取内径和高度比为1∶50的层析柱；向柱内加入SephadexG-200葡聚糖凝胶，加入量为柱体积的85％；(5)凝胶过滤层析步骤(4)洗脱液为蒸馏水，流速为0.3ml/min，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线有两个吸收峰，收集第二个峰洗脱液，即为地榆多糖的提取液；(见图1)(6)以常规方法真空冷冻干燥地榆多糖的提取液，即得浅棕色的粉末——地榆多糖。
实施例4地榆多糖的活性测定α葡萄糖苷酶活性测定标准反应体系67mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)1.7ml，1mg/ml谷胱甘肽50ul，2mg/mla葡萄糖苷酶(Sigma公司产品)10ul，37℃保温10min，加入116mmol/L PNP 300ul，37℃ 10min，加入0.1mol/L碳酸钠10ml终止反应，400nm测释放的硝基酚量。
α葡萄糖苷酶活性单位pH6.8，37℃，每分钟释放1umol/L硝基酚为一活性单位；α葡萄糖苷酶抑制剂活性单位pH6.8，37℃，使一酶活性单位失活为一抑制单位；抑制率抑制剂活力÷酶活性单位经试验测定本发明方法制备出的地榆多糖对α葡萄糖苷酶活性的抑制率达99.9％。
实施例5大白鼠服用地榆多糖后的糖耐试验用本发明方法制备出的地榆多糖，以有效量200mg的量/次，对SD大鼠灌胃后，30分钟进食，分别测定餐后30分钟、60分钟、90分钟时大鼠血糖浓度，结果发明方法制备出的地榆多糖有明显的抑制双糖、多糖、低聚糖的消化、吸收，有效推迟并减缓餐后血糖升高的作用。见图2。
实施例6用本发明方法制备出的地榆多糖，以有效治疗量400mg的量/天/大鼠(220g)，对SD大鼠连续灌胃10天，第10天灌胃2小时处死，取小肠黏膜，检测小肠黏膜细胞刷状缘上α葡萄糖苷酶，测得地榆多糖组对α葡萄糖苷酶活性的抑制率是对照组(灌胃生理盐水)的40％。
在体外，用不同剂量的本发明方法制备出的地榆多糖作用于大白鼠α葡萄糖苷酶，结果见表1表1地榆多糖对大白鼠小肠粘膜α葡萄糖苷酶活性的抑制率
权利要求
1.一种地榆多糖的分离纯化方法，由下述步骤组成(1)将地榆粉碎至颗粒直径为200～300μm，与水以质量比计，按1∶4～5的量浸于蒸馏水中，50～65℃水浴15～30小时；(2)以3000～5000rpm离心10～16min，取上清液，以活性炭脱色，得地榆多糖水提物溶液；(3)用有机溶剂以常规方式去除地榆多糖水提物溶液中的蛋白；(4)选取内径和高度比为1∶25～50的层析柱；向柱内加入葡聚糖凝胶，加入量为柱体积的60％～90％；(5)凝胶过滤层析步骤(4)，洗脱液为蒸馏水，流速为0.3～0.6ml/min，以波长为280nm检测收集液，洗脱液曲线有两个吸收峰，收集第二个峰洗脱液，即为地榆多糖的提取液；(6)以常规方法真空冷冻干燥地榆多糖的提取液，即得浅棕色的粉末——地榆多糖。
2.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(1)所述水浴温度是60℃，水浴时间是20～25小时。
3.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(2)所述离心速度是4000rpm，离心时间是10min。
4.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(3)所述有机溶剂是乙醇。
5.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(4)所述层析柱的内径和高度比为1∶30～40。
6.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(4)所述向柱内加入的具有分子筛作用的物质量为柱体积的70％～80％。
7.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，所述葡聚糖凝胶选用SephadexG-75～SephadexG-200。
8.如权利要求7所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，所述葡聚糖凝胶选用SephadexG-150。
9.如权利要求1所述的地榆多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述流速为0.4ml/min。
全文摘要
本发明公开一种地榆多糖的分离纯化方法，由下述步骤组成将地榆粉碎，按1∶4～5的量浸于蒸馏水中，50～65℃水浴15～30小时；以3000～5000rpm离心10～16min，取上清液，以活性炭脱色，得地榆多糖水提物溶液；用有机溶剂以常规方式去除地榆多糖水提物溶液中的蛋白；选取内径和高度比为1∶25～50的层析柱；凝胶过滤层析，以波长为280nm检测收集液，真空冷冻干燥地榆多糖的提取液，即得地榆多糖。利用本发明制备的地榆多糖，纯度达90％以上，且本发明的方法设备及环境要求低，方法简便，成本低，灵活实用，利于推广、开发和应用。
文档编号C08B37/00GK1699427SQ20051004387
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月21日 优先权日2005年6月21日
发明者张莲英, 张建业, 胡晓燕, 赵元 申请人:山东大学