专利名称：一种多糖及其制法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种多糖，具体地说是涉及一种海洋真菌炭团菌多糖YCP及它的制法和用途。
背景技术：
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的、可以控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。真菌多糖作为药物研究始于50年代，在60年代以后成为免疫促进剂而引起人们的兴趣。真菌多糖是目前公认的有较高效应的免疫增强剂，许多真菌多糖制剂已广泛应用于临床，在自身免疫性疾病、免疫功能低下症以及肿瘤的治疗等方面取得了令人鼓舞的临床效果。但目前对陆生生物(动物、植物、微生物等)多糖的研究开始的较早，已从这些生物中分离纯化得到了多种多糖，并对它们的结构与功能进行了比较广泛的研究，例如目前已用于临床的香菇多糖、茯苓多糖、云芝多糖以及裂褶菌多糖等真菌多糖均来源于陆生，而对海洋生物多糖的研究多局限于已能规模养殖或易于采集的海洋生物的多糖。另外，海洋天然产物的研究目前多见于结构类型各异的中小分子，对绝大多数海洋生物富含的多糖尚未给予足够的重视，主要集中于甲壳素、藻类多糖等[参见Noda H，Amano H，Arashima K et al.Nippon Suisan Gakkaishi，1989，551265；Zhang EX，Yu LJ，XiaoX.Chinese J Mar Drugs，1994，131；Xue CH，Yu GL，Hirata T et al.Biosci Biotechnol Biochem，1998，62206；刘晓梅，张洪泉.螺旋藻多糖对荷瘤小鼠化疗后造血细胞增殖、凋亡及Bcl-2表达的影响，药学学报，2002，37616.]，而对海洋微生物产生的新活性多糖的研究报道极少。
多糖的结构可分为一级、二级、三级和四级结构。它的一级结构是指其单糖残基的组成、排列序列和连接方式等；二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合形成的各种聚合体，这只关系到其分子主链的构象，不涉及侧链的空间排布；三级结构是指由多糖中糖残基中的羟基、羧基、氨基及其它官能团间通过非共价作用而导致的有序、规则而粗大的空间构象；四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体。多糖的结构分析完整的多糖结构分析包括对多糖的一级结构和高级结构的分析。目前在多糖一级结构的分析中大多采用传统的化学方法与物理方法相结合，可基本阐明某一多糖的一级结构的大致特征[参见StroopCJ，Xu Q，Retzlaff M et al.Carbohydrate research，2002，337335；Shashkov AS，Torgov VI，Nazarenko EL et al.Carbohydrate research，2002，3371119；KolenderAA，Matulewicz MC.Carbohydrate research，2002，33757.Yang BY，Ding Q，Montgomery R.Carbohydrate research，2002，337731]。
近年来我们从一株海洋真菌(Hypoxylon sp.)菌丝体中经提取纯化获得了一种多糖(简称YCP)并对其理化性质、化学结构、生物学活性进行了比较广泛的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多糖，它的制法及在制备药物中的用途。
本发明的具体的技术方案如下一种多糖，它由葡萄糖和糖醛酸构成，不含蛋白质和核酸，分子量为1.6×106Da～2.6×106Da，端基碳为α-构型，旋光度[α]Dt＝+131.7°～+159.4°，多糖的基本骨架由1→4糖苷键连接的葡萄糖构成，每17个葡萄糖残基有一个侧链，侧链为一个葡萄糖分子或一个糖醛酸分子，葡萄糖和糖醛酸的比例为2∶1，均通过1→6糖苷键与主链葡萄糖相连接，每摩尔多糖中葡萄糖与糖醛酸的物质的量之比为53∶1，它有如下结构式 *侧链上GlcpA∶Glc摩尔比为1∶2一种上述多糖的制法，它由下列步骤组成步骤1.称取海洋真菌炭团菌湿菌体1000g，加水置组织捣碎器中捣碎，补足水至2000～4000mL，60～90℃水浴提取8～20小时，间歇搅拌，纱布滤去残渣，2000～4000r.p.m.离心去沉淀，步骤2.将步骤1所得的提取液浓缩至500～2000mL，加入浓缩液1/4～1/7体积的氯仿及1/15～1/30体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，反复萃取2～5次，步骤3.将步骤2所得的水溶液对自来水透析24～48小时，透析液浓缩至500～2000mL，逐步加入1～4倍量乙醇，4℃放置2～10小时，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖YCP粗品，步骤4.取多糖YCP粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-32)，先以50～300mL蒸馏水洗涤，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱层析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的多糖YCP。
本发明的多糖YCP对小鼠移植瘤Heps和S180有明显的抑制作用，因此本发明的多糖YCP可以应用于制备治疗肿瘤的药物。
四
图1多糖YCP的高效液相色谱纯度鉴定图谱；图2多糖YCP的单糖组分的薄层层析图谱，其中1.混合糖 2.鼠李糖 3.甘露糖 4.葡萄糖 5.半乳糖 6.YCP 7.糖醛酸；图3多糖YCP的甲基化分析步骤示意图；图4多糖YCP高碘酸消耗-时间曲线；图5多糖YCP的红外光谱分析图谱；图6多糖YCP的氢核磁共振光谱图；图7多糖YCP的碳核磁共振光谱图；图8多糖YCP与刚果红络合实验最大吸收波长曲线。
五具体实施例方式
实施例1.多糖YCP的提取、分离纯化、鉴定称取湿菌体1000g，加水置组织捣碎器中捣碎，补足水至2000mL，60℃水浴提取20小时。间歇搅拌，纱布滤去残渣，2000r.p.m.离心去沉淀。提取液浓缩至500mL，加入浓缩液1/4体积的氯仿及1/15体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层。反复萃取2次。所得溶液对自来水透析24小时。透析液浓缩至500mL，逐步加入等体积的乙醇，4℃放置2小时。离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖YCP粗品。
取多糖YCP粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-32)，先以50mL蒸馏水洗涤，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱(Sephacryl S-400)层析，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的多糖YCP。
HPLC纯度鉴定采用Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mm)高效液相色谱柱和示差折光检测器，流动相为H2O，YCF1mg/ml进样20μl，流速1ml/min。
结果见图1。HPLC纯度鉴定结果为一个对称峰，表明所得的多糖为单一组分。
实施例2.多糖YCP的提取、分离纯化、鉴定称取湿菌体1000g，加水置组织捣碎器中捣碎，补足水至3000mL，80℃水浴提取12小时。间歇搅拌，纱布滤去残渣，3000r.p.m.离心去沉淀。提取液浓缩至1000mL，加入浓缩液1/5体积的氯仿及1/25体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层。反复萃取4次。所得溶液对自来水透析36小时。透析液浓缩至1000mL，逐步加入3倍体积的乙醇，4℃放置6小时。离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖粗品。
取粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-32)，先以200mL蒸馏水洗涤，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得多糖YCP组分上分子筛柱层析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的多糖YCP，纯度与实施例1的相同。
实施例3.多糖YCP的提取、分离纯化、鉴定称取湿菌体1000g，加水置组织捣碎器中捣碎，补足水至4000mL，90℃水浴提取8小时。间歇搅拌，纱布滤去残渣，4000r.p.m.离心去沉淀。提取液浓缩至2000mL，加入浓缩液1/7体积的氯仿及1/30体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层。反复萃取5次。所得溶液对自来水透析48小时。透析液浓缩至2000mL，逐步加入4倍体积的乙醇，4℃放置10小时。离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得多糖粗品。
取粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-32)，先以300mL蒸馏水洗涤，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得多糖YCP组分上分子筛柱层析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的多糖YCP，纯度与实施例1的相同。
实施例4.YCP重均分子量测定采用高效液相色谱仪，GPC专用软件，色谱柱为测多糖的专用凝胶柱ShodexSUGAR KS-805(8mmID×300mm)，分离范围上限为500×104道尔顿，检测器为示差折光检测器。流动相为水柱温35℃流速1mL/min。取分子量不同的右旋糖酐分子量标准品适量，分别用流动相制成每mL中约含1mg的标准溶液，分别取上述标准溶液100μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。由GPC专用软件绘制标准曲线，得线性回归方程lgMw＝8.948-0.4333tR(Mw为标样的已知重均分子量；tR为标样的保留时间)。取YCP多糖1mg，溶于1mL水，上样100μL，记录色谱图。取3批样品分别进行测定。
测定结果见表1。YCP多糖的重均分子量为1.6×106Da～2.6×106Da。
表1.YCP分子量测定批次1 2 3分子量(×106Da)1.6 1.92.6单糖组分分析实施例5.多糖YCP的薄层层析(TLC)称取多糖样品5mg，置于干净的安瓿中，加入2mol/l三氟乙酸2mL，封管。100℃水解12小时后，将三氟乙酸蒸干，用甲醇洗4～5次后，用蒸馏水溶解，备用。精密称取鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸各20mg，分别溶于1mL蒸馏水中，从中各吸取0.2mL溶液混合均匀作为混合糖。量取0.75％CMC-Na溶液16mL于研钵中，分次加入6g硅胶G以及终浓度为0.3mol/L的NaH2PO4，研磨均匀后均匀涂铺在干净的玻璃板上(10×20cm)。静置晾干，使用前在105℃活化1小时。按正丁醇∶丙酮∶水＝4∶3∶1配成展开剂置于层析缸中，放入已活化好的板，饱和10分钟后，上行展开。展开完毕后，取出，以苯胺-邻苯二甲酸溶液为显色剂显色后，于110℃加热10min。
结果见图2。YCP完全酸水解后进行薄层层析，结果只显示清晰的葡萄糖斑点。
实施例6.多糖YCP中糖醛酸和葡萄糖含量的测定糖醛酸含量的测定精密量取标准糖醛酸溶液(60μg/mL)0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于带塞试管中，补足蒸馏水至0.5mL，在冰浴中预冷后逐滴加入1.5mL0.0125mol/L的四硼酸钠-浓硫酸溶液。振摇混合，在沸腾水浴中煮沸5min。以冰浴冷却至室温，每管加入25μL0.15％的间羟联苯-0.5％氢氧化钠溶液。摇匀后在530nm处测定光吸收，以“0”管作空白对照，绘制标准曲线。为避免样品中非己糖醛酸成份与四硼酸钠硫酸溶液反应的干扰，可作一样品对照，即以25μL0.5％氢氧化钠代替间羟联苯溶液，测得光吸收值从样品吸收值中扣除。取YCP多糖配成1mg/mL的溶液，吸取0.1mL，补足蒸馏水至0.5mL，余操作同标准曲线的制备，再由回归方程算出相应浓度。
葡萄糖含量的测定精确配置100μg/mL的标准糖醛酸溶液，分别吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准溶液置带塞试管中，补足蒸馏水至1mL，加入2mg/mL蒽酮试剂4mL，混匀，沸水浴煮10min。冷却后测定620nm处的吸光度。以“0”管作空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。
精确配置100μg/mL的标准葡萄糖溶液，分别吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准溶液置带塞试管中，补足蒸馏水至1mL，加入2mg/mL蒽酮试剂4mL，混匀，沸水浴煮10min。冷却后测定620nm处的吸光度。以“0”管作空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。
取YCP多糖配成1mg/mL的溶液，吸取0.1mL，补足蒸馏水至1mL，余操作同标准曲线的制备。
由于糖醛酸的存在对硫酸蒽酮法测定葡萄糖的含量存在一定的干扰，为此首先采用间羟联苯法(y＝0.0064x-0.0006，γ＝0.9997)测定糖醛酸的含量，再根据糖醛酸-硫酸蒽酮标准曲线(y＝0.0013x-0.0003，γ＝0.9998)得到糖醛酸吸光度值的贡献，总糖的吸光度与之的差值即为葡萄糖显色所致，再根据葡萄糖-硫酸蒽酮标准曲线(y＝0.0069x-0.0028，γ＝0.9993)计算出总糖中葡萄糖的含量。由实验可得总糖中葡萄糖为975μg/mgYCP，糖醛酸为12.7μg/mgYCP。
实施例7.多糖YCP的糖醇乙酰化衍生物的气相分析称取多糖10mg加2mol/L的三氟乙酸，于安瓿中封口，于100℃水解8h，水解产物于蒸发皿中蒸干后加入甲醇5～6次反复蒸干后溶于2mL水中，加入5mg硼氢化钠还原，3mg内标物肌醇，充分溶解后，65℃放置30min，水解液减压蒸干。然后加少量强酸型离子交换树脂732H+搅拌数分钟后，检查溶液呈酸性时过滤，树脂用少量水反复洗3次，合并滤液在水浴上蒸干，所得残余物加3mL甲醇溶解并蒸干，反复4次以上以除去硼化物，最后使还原产物于小安瓿管中彻底干燥。在上述还原产物中加入醋酐和无水吡啶各0.3mL，封口，于100℃水浴乙酰化20min，冷却，转移至蒸发皿中，加入0.5mL水，浓缩后反复加水2-3次直至蒸干，残渣用1mL三氯甲烷提取，提取液用1mL水洗，三氯甲烷溶液减压蒸干后，再用0.2mL三氯甲烷重溶。标准单糖(D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)按相同方法处理。
气相条件为惠普6890气相色谱仪，HP-55％苯甲基硅烷毛细管柱(30.0cm×0.25mm×0.25μm)。分流-不分流进样口，进样口温度260℃。程序升温110℃至190℃，3℃/min；190℃至206℃，2℃/min；206℃至280℃，20℃/min，保留2min。FID检测器，载气为N2，流速25.0mL/min，检测器温度300℃。
结果见表2。YCP酸水解产物的还原乙酰化产物进行气相色谱分析，YCP仅出现一个单峰，与标准单糖的保留时间对比，可认为YCP由葡萄糖组成。在气相色谱中未检出糖醛酸，这是因为糖醛酸含有羧基，在一般条件下不易被还原、乙酰化、气化出峰。
表2.GYCP气相色谱分析保留时间(min)23.981 24.35831.80732.12832.339D-鼠李糖 +D-阿拉伯糖 +D-甘露糖 +D-葡萄糖 +D-半乳糖 +YCP +相邻单糖基连接方式分析实施例8.甲基化分析称取20mg彻底干燥糖样，溶于6mL无水二甲亚砜(DMSO)充氮气封管，超声波振荡10分钟，加入200mg精细研磨的NaOH，充氮气密封，超声波振荡90min，放置90min，逐滴加入CH3I 2mL，超声波振荡30min，放置30min，减压蒸馏除去剩余的CH3I。
后续步骤见图3。
重复上述甲基化步骤一次，经红外光谱分析，在3500cm-1附近无吸收峰，表明多糖上的羟基已经完全甲基化。
上述甲基化样品中加入90％(V/V)甲酸3mL，封口，水解6h，减压蒸发至干，加入2mol/L的三氟乙酸，封口，于100℃水解8h，乙酰化，进行气相—质谱联用分析。
结果见表3。
表3.YCP甲基化反应气质联用结果甲基化糖 摩尔比 质谱主要碎片(m/z) 连接方式2，3，4，6-Tetra-O-Me-Glc 0.66 43，45，71，87，101，117，129，145，161，205Glc-(1→2，3，6-Tri-O-Me-Glc 1643，45，99，101，113，117，233 →4)-Glc-(1→2，3-Di-O-Me-Glc 1 43，101，117，205 →4，6)-Glc-(1→
根据GC保留时间(tR)及MS主要碎片(m/z)，显示反应产物中有1，5-二乙酰基-2，3，4，6-四甲基葡萄糖、1，4，5-三乙酰基-2，3，6-三甲基葡萄糖以及1，4，5，6-四乙酰基-2，3-二甲基葡萄糖，其摩尔比为0.66∶16∶1，表明1→4连接葡萄糖构成了多糖的基本骨架，每17个葡萄糖残基有一个6-O位分支，根据此结果还可以推断侧链上还存在因不易被还原、乙酰化而气化出峰的糖醛酸，并且侧链中的葡萄糖与糖醛酸的比例为2∶1，每摩尔多糖分子中葡萄糖与糖醛酸的摩尔比为53∶1，这与前述YCP多糖中葡萄糖与糖醛酸的比例相吻合。
实施例9过碘酸氧化与Smith降解将NaIO4配成15mmol/L溶液，稀释250倍，再稀释成10个不同浓度，于223nm处测吸收值，作标准曲线。
精确称取多糖YCP10mg，加10mLNaIO4置4℃暗处，间或振摇，间隔时间取样，稀释250倍，在223nm处测吸收值，直至数值不再下降为止。由标准曲线查出NaIO4消耗量。
量取0.1mol/L的NaOH储备液25ml加新煮沸过的冷蒸馏水定容至250ml。精密称取三份干燥恒重的邻苯二甲酸氢钾，每份30mg，分别加20ml新煮沸过的冷蒸馏水溶解，冷却后加酚酞指示液2滴，用NaOH标准溶液滴定至微红色为终点。
高碘酸反应终止后，以溴甲酚紫作为指示剂，用上述标定过的0.006576mol/L的NaOH溶液测定甲酸释放量。
YCP多糖经15mM高碘酸完全氧化后，加入适量乙二醇搅拌30min以还原剩余的高碘酸。装入透析袋，对流水透析48h，蒸馏水透析12h，于70-80℃减压浓缩至最小体积，用NaBH4于室温暗处还原12h，用0.1mol/L乙酸调节至pH5.5，以分解剩余的硼氢化物，对蒸馏水透析24h后冷冻干燥。将所得的多糖醇用2mol/L的三氟乙酸于100℃水解8h，水解液减压蒸干，进行薄层层析。
结果见图4。
YCP经高碘酸氧化，144h可反应完全，高碘酸的消耗达到稳定由NaIO4标准曲线(y＝0.0975x-0.0064，γ＝0.9997)测得每mol多糖消耗为1.03mol高碘酸量并有0.05mol甲酸生成，其结果与由甲基化结果计算的理论值1.06和0.06基本吻合，说明甲基化反应结果所得各残基间的摩尔比正确。
Smith降解产物经薄层层析主要产物为赤藓醇并有少量甘油，说明YCP以1→4糖苷键为主要连接方式，并有少量1→6连接的葡萄糖侧链，这也与甲基化和高碘酸反应结果相吻合。
端基碳构型分析实施例10.多糖YCP比旋测定将多糖YCP干燥失重后，精密称取25mg，定容至25mL，用0.8μm的滤膜过滤，取续滤液依法测定旋光度，由公式[α]Dt＝α/lc计算比旋[α旋光度；L玻管长度(dm)；c溶液浓度(g/mL)]。取5批样品分别进行测定。
测定结果见表4。多糖YCP具有较高的正性比旋(+131.7°～+159.4°)，表明YCP的端基碳为α-构型。
表4.YCP比旋测定批次 1 2 3 4 5比旋(°) +151.4+131.7+142.9+156.9+159.4实施例11红外光谱分析多糖YCP经干燥后称取1mg，用溴化钾压片法在Nicolet-170X型红外光谱仪上于4000～400cm区间扫描。
多糖YCP的红外光谱图如图5所示。在3600～3200cm-1出现一种宽峰，是O-H的伸缩振动。在3000～2800cm-1的一组峰是糖类C-H伸缩振动，1400～1200cm-1的一些峰是C-H的变角振动。这两组峰是糖类化合物的特征吸收。1000～1200cm-1间的吸收峰是由C-O的伸缩振动所引起。930cm-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的非对称环伸缩振动所引起。850cm-1的吸收是α-端基差向异构的的C-H变角振动的特征吸收，表明多糖YCP的端基碳为α-构型，这与比旋测定结果一致。761cm-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的对称环伸缩振动所引起。
实施例12核磁共振分析取纯化的多糖YCP15mg，溶于氘代水(D2O)，60℃于Varian 500兆核磁共振仪上进行分析。
结果见图6，图7。多糖YCP所测得的核磁共振信号如下1H-NMRδ5.37brs，4.98brs 3.97m，3.87m，3.70m，3.66m，3.43t(J＝8.6Hz).13C-NMRδ185.8*(C)，100.1-100.3(CH)，77.9-78.2(CH)，75.3-75.5*(CH)，73.6-74.0(CH)，73.1-73.4*(CH)，71.8-72.1(CH)，70.2-70.5*(CH2)，70.0-70.2*(CH2)，61.4-61.8(CH2)。(*弱峰)。归属见表5。
表5.YCP的13C-NMR and1H-NMR信号归属化学位移(ppm)残基C-1 C-2 C-3 C-4C-5 C-6H-1 H-2 H-3 H-4H-5 H-6Glc-(1→ 100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 70.2-70.5 71.8-72.1 61.4-61.84.983.663.973.70 3.87 3.87→4)-Glc-(1→ 100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 77.9-78.2 71.8-72.1 61.4-61.85.373.663.973.70 3.87 3.87→4，6)-Glc-(1→ 100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 77.9-78.2 70.2-70.5 70.0-70.25.373.663.973.70 3.87 overlap100.1-100.3 71.8-72.1 73.6-74.0 70.2-70.5 73.1-73.4 185.8GlcA-(1→ 4.983.663.973.70 overlap -根据以上结果推断多糖YCP的重复单元如下 *侧链上GlcpA∶Glc摩尔比为1∶2构象分析实施例13KI-I2反应配制浓度为1mg/mL的多糖YCP溶液1mL，加入碘试剂(含0.02％I2的0.2％KI溶液)0.6mL，测定200～700nm的电子吸收光谱。
多糖YCP与碘试剂呈阴性反应，UV检测于500nm以上无紫外吸收，说明该多糖不具有淀粉的α-螺旋结构，说明该多糖构象不同于直链淀粉。
实施例14刚果红实验将多糖溶液(浓度为2mg/mL)和刚果红溶液(浓度为12.2μmol/L)等体积混合，静置15min，依次测定混合液在0～0.4mol/L的NaOH溶液中最大吸收波长λmax的变化。以纯刚果红溶液为参比，手控波长扫描。
结果见图9。多糖YCP在刚果红实验中，与刚果红配合物的最大吸收波长没有发生红移，也未出现亚稳区，表明多糖YCP分子并不存在多股螺旋构象，提示多糖YCP在水溶液中可能以无规线团构象存在。
实施例15.多糖YCPiv对小鼠移植瘤Heps的抑制作用取ICR小白鼠(18～22g，雌雄各半)60只，按移植性肿瘤研究法接种Heps实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为6组，空白对照组与天地欣(5mg/kg)组、环磷酰胺(20mg/kg)组分别为阴、阳性对照组，多糖YCP组设高、中、低三个剂量组(9，3，1mg/kg)。接种24小时后给药，iv给药，每2天一次，共给药4次，于停药后第2天处死荷瘤小鼠称重，并分离瘤块称重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
结果见表6。与生理盐水对照组相比，多糖YCP(9，3mg/kg)组、天地欣组及Cy组皆有显著抑制Heps的肿瘤生长作用，其中多糖YCP组与天地欣组对小鼠体重增长无明显影响，而Cy组有显著的抑制小鼠体重增长作用。实验重复3次，结果相近。
表6 YCPiv对小鼠移植瘤Heps的抑制作用 (X±SD)(n＝10)剂量 小鼠体重(g)瘤重 抑瘤率批次 组别(mg/kg) 给药前 给药后 (g) (％)1空白对照 19.50±1.2827.9±2.47 1.92±0.29 0YCP1 19.40±1.0227.80±2.231.55±0.53 18.983 20.00±1.6127.90±2.701.29±0.44**32.599 19.20±1.1725.70±2.611.13±0.34**40.98天地欣 5 19.30±1.2726.40±2.241.22±0.44**36.65Cy 20 19.30±1.1023.00±1.34**0.62±0.19**67.942空白对照 19.30±1.1027.60±1.501.47±0.32 0YCP1 19.40±1.2027.70±1.491.21±0.47 17.593 19.20±1.6028.00±1.260.97±0.37**33.819 19.40±1.1127.70±1.100.83±0.35**43.29天地欣 5 19.50±1.0227.80±1.250.91±0.30**37.90Cy 20 19.30±1.1023.10±1.04**0.55±0.16**62.783空白对照 20.32±1.1227.70±2.101.78±0.27 0YCP1 19.78±1.0627.80±1.251.36±0.33**23.923 19.54±1.0427.30±1.101.10±0.24**38.079 19.75±1.0927.40±1.110.99±0.35**44.58天地欣 5 19.75±1.2127.00±1.001.08±0.46**39.53Cy 20 19.60±1.2023.30±1.42**0.59±0.17**67.15*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较实施例16多糖YCPiv对小鼠移植瘤S180的抑制作用取ICR小白鼠(18～22g，雌雄各半)60只，按移植性肿瘤研究法接种S180实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为6组，空白对照组与天地欣(5mg/kg)组、环磷酰胺(20mg/kg)组分别为阴、阳性对照组，YCP组设高、中、低三个剂量组(9，3，1mg/kg)。接种24小时后给药，iv给药，每2天一次，共给药4次，于停药后第2天处死荷瘤小鼠称重，并分离瘤块称重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
结果见表7。与生理盐水对照组相比，多糖YCP(9，3mg/kg)组、天地欣组及Cy组皆有显著抑制S180的肿瘤生长作用，其中多糖YCP组与天地欣组对小鼠体重增长无明显影响，而Cy组有显著的抑制小鼠体重增长作用。实验重复3次，结果相近。
表7.YCPiv对小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n＝10)剂量 小鼠体重(g) 瘤重抑瘤率批次组别(mg/kg) 给药前 给药后 (g) (％)1 空白对照 19.40±0.9227.50±1.691.88±0.75 0YCP 119.70±1.4928.20±2.991.61±0.52 14.53319.90±1.3727.50±3.041.29±0.28*31.40919.60±1.5026.80±2.321.14±0.58*39.49天地欣519.70±1.4226.90±2.741.20±0.35*36.24Cy20 19.60±1.2023.60±1.20**0.62±0.14**67.272 空白对照 19.95±1.2725.40±2.841.11±0.30 0YCP 119.90±1.3026.50±2.050.98±0.28 12.08319.30±1.1926.70±1.270.75±0.14**32.10919.60±1.1127.20±0.870.63±0.30**43.10天地欣519.70±1.0027.10±1.450.70±0.23**37.33Cy20 19.70±1.4922.00±1.18**0.41±0.10**63.213 空白对照 20.00±1.2627.80±1.831.64±0.44 0YCP 120.20±1.4027.50±1.631.24±0.47 24.34320.30±1.2727.70±1.621.06±0.36**35.35920.10±1.4527.80±1.940.87±0.21**46.97天地欣520.00±1.4127.50±1.631.02±0.32**37.80Cy20 20.20±1.2522.80±1.33**0.51±0.17**68.68*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较
权利要求
1.一种多糖，其特征是它由葡萄糖和糖醛酸构成，不含蛋白质和核酸，分子量为1.6×106Da～2.6×106Da，端基碳为α-构型，旋光度[α]Dt＝+131.7°～+159.4°，多糖的基本骨架由1→4糖苷键连接的葡萄糖构成，每17个葡萄糖残基有一个侧链，侧链为一个葡萄糖分子或一个糖醛酸分子，葡萄糖和糖醛酸的比例为2∶1，均通过1→6糖苷键与主链葡萄糖相连接，每摩尔多糖中葡萄糖与糖醛酸的物质的量之比为53∶1。
2.一种权利要求1所述的多糖的制法，其特征是它由下列步骤组成步骤1.称取海洋真菌炭团菌湿菌体1000g，加水置组织捣碎器中捣碎，补足水至2000～4000mL，60～90℃水浴提取8～20小时，间歇搅拌，纱布滤去残渣，2000～4000r.p.m.离心去沉淀，步骤2.将步骤1所得的提取液浓缩至500～2000mL，加入浓缩液1/4～1/7体积的氯仿及1/15～1/30体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，反复萃取2～5次，步骤3.将步骤2所得的水溶液对自来水透析24～48小时，透析液浓缩至500～2000mL，逐步加入1～4倍质量的乙醇，4℃放置2～10小时，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得本发明的多糖粗品，步骤4.取本发明的多糖粗品50mg，充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-32)，先以50～300mL蒸馏水洗涤，再以0～2mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱层析(Sephacryl S-400)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的多糖YCP。
3.根据权利要求所述的多糖在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
一种多糖，它由葡萄糖和糖醛酸构成，不含蛋白质和核酸，分子量为1.6×10
文档编号C08B37/00GK1546531SQ200310106520
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月4日 优先权日2003年12月4日
发明者高向东, 谭仁祥, 杨晓兵, 孙诚 申请人:中国药科大学, 南京大学