专利名称：一种甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的简易制备方法
技术领域：
本发明属于有生物活性的寡糖的制备技术领域，特别是涉及能用于药物的筛选的甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的简易制备方法。
寡糖，多糖及糖缀合物(糖蛋白，糖脂)是生物体内重要的信息物质，参与所有细胞的接触过程，细胞表面的寡糖在细胞之间的通讯，识别和相互作用，胚胎发生，转移，在信号传递，细胞运动与黏附，以及病原与宿主细胞的相互作用方面起着重要作用。最新的研究表明，寡糖不仅以它们的缀合物在起作用，很多寡糖本身就有重要的生理功能，有的寡糖能激发植物的免疫系统，有的寡糖能诱导根瘤菌的固氮作用；有的寡糖可以与入侵的微生物上的糖蛋白相结合而阻止这些微生物对人体正常细胞的侵袭，而一些寡糖则具有肝素(haparin)的功能，血型决定族寡糖更是很有希望的防治癌症的药物。寡糖在农业，医药业方面有广泛的应用前景。而寡糖和多糖直接做为药物使用，去除疾病，增进健康，将引起防治疾病观念的更新，也是生命科学的一大进展。新兴的“糖工程”(以糖类为基础的药物研制)正处于蓬勃发展的新起点，据“生物工程新闻”(Biotech News)1995，14(4)，7报导，糖类药物的市场份额将从1993年的13％增加至2000年的24％。
甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6都是存在于细胞壁多糖的成分，它们是多糖的活性部位，对某些皮肤病是关键的致病因子，合成它们并进一步制备疫苗，就能制成医治皮肤病或其它由念珠菌引起的病的新药。
甘露多糖抗原因子4的结构为α-D-Man-1→3-(α-D-Man-1→6)-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-D-Man而甘露多糖抗原因子6的结构为α-D-Man-1→3-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-α-D-Man-1→2-D-Man，至今尚未见这两个抗原因子的合成的报道。
本发明的目的在于采用全新的思路，提供一种步骤简单，省时省力的、以糖的原酸酯为起始物的、制备这两个抗原因子的方法。
本发明的目的是这样实现的以最简单的溴代酰基甘露糖为原料，首先将其转化为苯甲酰化的原酸酯，然后在三氟甲磺酸酯催化下缩合，得到1-2连接的双糖，经简单的化学转化使其转化为四糖受体与三糖受体，前者与1-3连接的甘露双糖供体偶联，再脱保护即得到抗原因子6，而后者与3，6支化的甘露三糖供体偶联，再脱保护即得到抗原因子4。本发明的合成方法在于以溴代乙酰基甘露糖1为原料，制备出甘露糖的原酸酯2，在甲醇钠-甲醇中脱掉乙酰基得到3，用吡啶-苯甲酰氯苯甲酰化，得到苯甲酰化的原酸酯4。如下图所示 4在三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)或三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)作用下缩合，得到α1-2连接的双糖5。如下图所示 5选择性脱掉1位R基，然后活化得到双糖供体6，而5选择性脱掉乙酰基得到双糖受体7。如下图所示 7与6偶联，得到四糖8，而7与单糖供体9偶联，得到三糖10。如下图所示 8选择性脱乙酰基得到四糖受体11；而10选择性脱乙酰基得到三糖受体12。如下图所示 上述结构式中R＝烷基或芳基 Bz＝苯甲酰基 X＝卤素或三氯乙酰亚胺酯11与双糖供体13偶联，得到六糖14；而12与三糖供体15偶联，得到六糖16。如下图所示 上述结构式中R＝烷基或芳基 R′＝酰基或烷基 Bz＝苯甲酰基 X＝卤素、酰基或三氯乙酰亚胺酯用常规方法脱掉14的保护基，即得到甘露多糖抗原因子6(17)；用常规方法脱掉16的保护基，即得到甘露多糖抗原因子4(18)。如下图所示 上述结构式中R＝H、烷基或芳基所述的偶联反应在Lewis酸催化下进行，所用的Lewis酸为银盐、三氟化硼、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)。
下面结合实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1苯甲酰化的原酸酯4(3，4，6-tri-O-benzoyl-β-D-mannopyranose 1，2-allylorthoester)制备 溴代乙酰甘露糖(tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl bromide)(1，8220毫克，20毫摩尔)溶于40毫升烯丙醇(allyl alcohol)中，向此溶液中加入2，4-二甲基吡啶(2.3毫升，20毫摩尔)，反应在室温、搅拌下进行，用薄层色谱分析监测，反应完成后，将反应物浓缩致干得到粗产物2，将2悬浮于20毫升无水甲醇中，加入甲醇钠(0.4毫升，2摩尔/升)，溶液在搅拌下室温过夜，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液浓缩致干得到34.7克，产率90％，将3溶于30毫升吡啶中，慢慢滴加苯甲酰氯(8.2毫升，70毫摩尔)，反应在搅拌、室温下进行，用薄层色谱分析监测，3小时后完成，用常规方法对反应物进行处理，得到的残余物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的糖原酸酯410克，产率97％。熔点142℃比旋度[α]D-12°实施例2α1-2连接的双糖5(All 2-O-acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制备 将4在真空下干燥2小时，然后溶于80毫升干燥的二氯甲烷中，在-40℃下，加入TMSOTf 100微升，反应物在搅拌下自然恢复到室温，1小时后，反应完成，用三乙胺中和反应液，减压下浓缩，用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的双糖56.72克，产率66％。
实施例3双糖供体6(2-O-Acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate)的制备将5(2100毫克，2 mmol)加入到90％醋酸(20 mL)，再加入醋酸纳590毫克(6毫摩尔)及PdCl20.18毫克(1毫摩尔)，反应在室温下搅拌12小时后完成，将混合物用60毫升二氯甲烷稀释，用水和饱和碳酸氢纳水溶液洗涤，有机相在减压下蒸干，用硅胶柱层析法分离得到1位为游离羟基的双糖2-O-acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-D-mannopyranose(1820毫克)，将此双糖溶于20毫升二氯甲烷中，然后加入CCl3CN 0.4ml(8毫摩尔)及DBU(56μL，0.72毫摩尔)，反应在室温下搅拌2小时后完成，浓缩反应物，柱层析分离后得到结晶的双糖供体6 1890毫克，两步产率82％m.p139-142℃；[α]D-1.5°(c 1.1，CHCl3)实施例4双糖受体7(Allyl 3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制备将双糖5(2100毫克，2毫摩尔)加入到60mL无水甲醇中，向此溶液中在0℃下加入乙酰氯.1.8毫升，室温下搅拌10小时，再加入乙酰氯1.2毫升，用TLC检测反应，直至反应完成。溶液用Et3N中和至中性，浓缩至干，柱层析分离得到7(1870毫克，93％)熔点147-150℃；[α]D-3.6°(c 1.4，CHCl3)；实施例5四糖8(Allyl 2-O-aeetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制备将双糖供体6(1150毫克，1毫摩尔)及双糖受体7(1010毫克，1毫摩尔)在真空下一起干燥2小时，然后溶于60毫升无水二氯甲烷中，向此溶液在-42℃、氮气保护、搅拌下加入.TMSOTf(20微升，0.10毫摩尔)，反应进行3小时，并自然升温，TLC显示反应完成，溶液用Et3N中和至中性，浓缩至干，柱层析分离得到8(1700毫克，85％)熔点140-145℃；[α]D-2.2°(c 1.3，CHCl3)；13C NMRδ168.96，，166.25，166.18，166.00，165.69，165.61，165.44，165.36，165.29，165.23，165.18，165.10，164.93，117.89，100.74，100.46，99.22，98.02，77.18，76.27，70.91，70.83，70.71，69.65，69.58，69.38，69.35，69.15，68.88，68.68，67.76，67.29，67.13，67.13，63.75，63.75，63.54，62.95；实施例6三糖10(Allyl 2-O-acetyl-3，46-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制备按6与7缩合的条件，进行单糖供体2-O-acetyl-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate(9，747毫克，1.1毫摩尔)与双糖受体7(980毫克，1毫摩尔)的缩合，得到10 1217毫克，产率88％。
实施例7四糖受体11(Allyl 3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-mannopyranoside)的制备按由5制备7的条件，由四糖8(1000毫克，0.5毫摩尔)制得四糖受体11 890毫克，产率91％m.p137-141℃；[α]D-0.4°(c 1.2，CHCl3)；实施例8三糖受体12(Allyl 3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→2)-3，4，6-tri-O-benzoyl-α-D-mannopyranoside)的制备按由5制备7的条件，由三糖10(1220毫克，0.5毫摩尔)制得三糖受体12 1112mg，86％熔点132-134C；[α]D-1.7°(c 1.0，CHCl3)；实施例9双糖供体13(2，3，4，6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-，2，4，6-tri-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate)的制备由2，3，4，6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate(1290毫克，2毫摩尔，其制备见R.R.Schmidt，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.，Vol 50，1994，21-124)与4，6-O-benzylidene-1，2-O-ethylidene-β-D-mannopyranose(560毫克，2毫摩尔，其制备见王为 孔繁祚Carbohydr.Res.，151，1999，117-226)按标准条件缩合得到双糖2，3，4，6-Tetrα-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-4，6-O-benzylidene-1，2-O-ethylidene-β-D-mannopyranose 1570毫克，产率90％m.p 128-132℃；[α]D-1.5°(c 1.0，CHCl3)；，将得到的双糖1310毫克(1.5毫摩尔)用90％F3CCOOH(5毫升)在室温下处理1小时，将反应液浓缩，残余物用吡啶(5mL)、乙酸酐(3mL)在室温下，2小时完成乙酰化，按常规方法处理反应液，将得到的残余物与碳酸钾(207毫克，1.5毫摩尔)溶于10毫升DMF中，在室温下搅拌12小时，用常规方法处理反应液，有机相浓缩，柱层析分离，所得到的1位为游离羟基的双糖粗产物溶于二氯甲烷(20毫升)中，然后加入CCl3CN(0.3毫升，3毫摩尔)及DBU(42微升，0.3毫摩尔)。反应混合物在室温下交班小时后完成，浓缩反应物，柱层析分离得到双糖供体13 960毫克，四步总产率62％m.p125-127℃；[α]D-0.9°(c 1.2，CHCl3)；实施例10全保护的抗原因子6六糖14的制备按6与7缩合的条件，使双糖供体13(103毫克，0.1毫摩尔)与四糖受体11(195毫克，0.1毫摩尔)缩合，得到抗原因子六糖14，212mg，产率75％mp142-146℃；[α]D-2.9°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ8.05-7.26，6.34，6.29，6.14，6.00-5.70，5.62，5.56，5.48，5.30，5.28，5.23，5.15，5.13，5.05，4.92，4.75-4.70，4.68-4.50，4.48，4.45，4.42-4.26，3.88-3.84，3.69-3.64，3.59-3.55，2.35，2.24，2.04.
实施例11全保护的抗原因子4六糖16的制备首先用已知的方法(王为 孔繁祚Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，38，1999，1247-1249.)由1，2-乙叉基甘露糖和苯甲酰化的甘露糖Schmidt试剂制备出3，6支化的甘露三糖(2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl(1-3)-[2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl[1-6]]-1，2-O-ethylidene-β-D-mannopyranose)其熔点为141-144℃；[α]D-1.4°(c 1.1，CHCl3)；将这样得到的三糖1毫克分子用90％三氟乙酸在室温下处理2小时，除去乙叉基，然后用吡啶-乙酸酐定量乙酰化，再选择性脱除1位乙酰基，然后用三氯乙睛-DBU活化，得到了三糖供体15(2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl(1-3)-[2，3，4，6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl[1-6]]-2，4-di-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl trichloroacetimidate)1048毫克，对四步反应总产率68％mp125-127℃；[α]D-2.2°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ8.97，8.07-7.26，6.37，6.22，6.13，5.89，5.80，5.69，5.64，5.54，5.52，5.42，5.11，4.69-4.65，4.64-4.60，4.52-4.47，4.26-4.22，4.02-3.98，3.77-3.74，2.38，2.30.
按6与7缩合的方法，使三糖供体15(313毫克，0.2毫摩尔)与三糖受体12(29l毫克，0.2毫摩尔)缩合，得到抗原因子六糖16437毫克，产率77％mp126-129℃；[α]D-3.8°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ8.08-7.24，6.36，6.12，6.00-5.68，5.61，5.48，5.41，5.09，5.08，5.06，4.98，4.85-4.79，4.61-4.40，4.32-4.27，4.25，4.13，4.02-3.98，3.92，3.85-3.81，3.72-3.68，3.62-3.58，2.27，2.04.
实施例12抗原因子6六糖苷17、抗原因子6六糖17a及抗原因子4六糖苷18的制备14(1410毫克，0.5毫摩尔)或16(1432毫克，0.5毫摩尔)溶于用氨饱和的甲醇15毫升中，室温下反应6天，将溶剂在减压下抽干，用乙酸乙酯洗涤残余物，由14得到乳白色粉末状的抗原因子6六糖苷17410毫克，产率79％[α]D＋75°(c 1.l，D2O)；1HNMRδ5.90，5.42，5.34，5.10；质谱分析m/z对C39H66O31理论值1030；实测值m/z1053(M＋钠)；由16得到乳白色粉末状的抗原因子4六糖苷18 414毫克，产率80％[α]D＋62°(c 2.3，D2O)；1H NMRδ5.20，4.98，3.41；质谱分析m/z对C39H66O31理论值1030；实测值m/z 1053(M＋钠)。
将14(1410毫克，0.5毫摩尔)加入到90％醋酸(10毫升)，再加入醋酸纳150毫克(1.4毫摩尔)及PdCl20.06g(0.3毫摩尔)，反应在室温下搅拌12小时后完成，脱除掉了1位的烯丙基，将反应混合物用20毫升二氯甲烷稀释，用水和饱和碳酸氢纳水溶液洗涤，有机相在减压下蒸干，用硅胶柱层析法分离得到1位为游离羟基的六糖，将其溶于用氨饱和的甲醇15毫升中，室温下反应6天，将溶剂在减压下抽干，用乙酸乙酯洗涤残余物，得到乳白色粉末状的游离的六糖17a 362毫克，产率73％质谱分析m/z对C36H62O31理论值990；实测值m/z1013(M＋钠)
权利要求
1.一种甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的简易制备方法，其特征在于(1)以溴代乙酰基甘露糖1为原料，制备出甘露糖的原酸酯2，在甲醇钠-甲醇中脱掉乙酰基得到3，用吡啶-苯甲酰氯苯甲酰化，得到苯甲酰化的原酸酯4。如下图所示 (2)4在三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)或三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)作用下缩合，得到α1-2连接的双糖5。如下图所示 (3)5选择性脱掉1位R基，然后活化得到双糖供体6，而5选择性脱掉乙酰基得到双糖受体7。如下图所示 (4)7与6偶联，得到四糖8，而7与单糖供体9偶联，得到三糖10。如下图所示 (5)8选择性脱乙酰基得到四糖受体11；而10选择性脱乙酰基得到三糖受体12。如下图所示 上述结构式中R＝烷基或芳基 Bz＝苯甲酰基 X＝卤素或三氯乙酰亚胺酯(6)11与双糖供体13偶联，得到六糖14；而12与三糖供体15偶联，得到六糖16。如下图所示 上述结构式中R＝烷基或芳基 R′＝酰基或烷基 Bz＝苯甲酰基 X＝卤素、酰基或三氯乙酰亚胺酯(7)用常规方法脱掉14的保护基，即得到甘露多糖抗原因子6(17)；用常规方法脱掉16的保护基，即得到甘露多糖抗原因子4(18)。如下图所示 上述结构式中R＝H、烷基或芳基
2.如权利要求1所述的一种甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的简易制备方法，其特征在于所述的偶联反应在Lewis酸催化下进行，所用的Lewis酸为银盐、三氟化硼、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三乙基硅三氟甲磺酸酯(TESOTf)。
全文摘要
本发明涉及甘露多糖抗原因子4及甘露多糖抗原因子6的简易制备。以甘露糖的原酸酯为原料,将其缩合可直接得到α1－2连接的甘露双糖,由此双糖可制备出α1－2连接的四糖及三糖,前者与α1－3连接甘露双糖偶联即得到甘露多糖抗原因子4,后者与3,6支化的甘露三糖偶联即得到甘露多糖抗原因子6。
文档编号C08B37/00GK1336378SQ00120950
公开日2002年2月20日 申请日期2000年8月2日 优先权日2000年8月2日
发明者孔繁祚, 朱玉亮 申请人:中国科学院生态环境研究中心