专利名称：活性持续时间被增加的修饰抗体和抗体片段的利记博彩app
相关申请本申请是1998年11月3日提交的美国序列号09/185,151申请的部分继续申请，原申请的全部教导都通过在此引述而合并于本文。
血小板的止血和局部生理学功能，需要细胞的附着和聚集，通过血小板质膜受体与配体的相互作用来调节。这些受体(如GPIIb/IIIa)是通常与基质蛋白质(如，胶原质，纤连蛋白，血纤蛋白原，层粘连蛋白，玻连蛋白和von Willebrand因子)结合的受体整联家族的成员，并且除了与血小板功能外，与免疫功能和肿瘤转移有关。因此，某些整联蛋白(如GPII/bIIIa)的拮抗剂具有可作为治疗试剂的巨大可能。
对GPIIb/IIIa的几种拮抗剂已进行了研究，包括蛇毒液蛋白质，小型肽，肽聚拟态物，非-肽化合物和抗体[Cook，N.S.等人，未来药物，19135-159(1994)；Cox，D.，等人，医学研究评述，14195-228(1994)；Coller, B.S.，等人，血栓症和止血法，74(1)302-308(1995)]。结合GPIIb/IIIa(特异表达在血小板上)，αvβ3[表达在血小板，内皮细胞和多半平滑肌细胞上(Felding-Habermann，B.和Cheresh，D.A.，细胞生物学的当前观点，5864-868(1993))，和Mac-1(也称为CR3，CD11b/CD18，αMβ2，其表达在激活的白细胞上，如单细胞或粒性白细胞(Altieri，D.C.和Edigington，T.S.，免疫学期刊，1412656-2660(1988))]的人源化嵌合抗体的一个片段，c7E3 Fab(也称为“abciximab”或ReoPro)，已用来预防冠状动脉的突然关闭，减小冠状动脉干预过程后的缺血性并发症。然而，用来减轻或预防某些其他病理学上的事件的治疗需要长时间经常服用治疗试剂。由于患者的配合性问题这种治疗方法的效果不能令人满意。加之，经常服用治疗试剂(如蛋白质或肽)会引起结合试剂的抗体产生。因此，患者会产生免疫复合物-介导抗性和/或对具体治疗试剂过敏。
因此一直需要一种具有延长的活性持续时间的，较好地，具有低免疫原性的整联蛋白受体拮抗剂。
本发明具体涉及由有机组成共价附着修饰的抗体。本发明的修饰抗体与一种或多种从包括GPIIb/IIIa，αvβ3，和Mac-1的组中选取的整联蛋白受体结合。在具体实施方案中，本发明提供了抗体的修饰抗原结合片段(如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2)。在一个较好的实施方案中，修饰的抗体与GPIIb/IIIa和/或αvβ3结合，并拮抗血纤蛋白原与GPIIb/IIIa的结合及血小板的聚集。在其他实施方案中，本发明的修饰抗体与GPIIb/IIIa和/或αvβ3的结合竞争地受到7E3的抑制。较好地，本发明修饰抗体是7E3或人源化7E3。较好的人源化7E3是c7E3。
有机组成可以是亲水聚合物基团，脂肪酸基团，脂肪酸酯基团，脂质基团或磷脂基团。在具体实施方案中，亲水聚合物基团可具有分子量为约800到约120,000道尔顿，并可以是聚烷烃乙二醇(如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG))，碳水化合物聚合物，氨基酸聚合物或聚乙烯基吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基团可包括约八个到约四十个碳原子。
本发明的修饰抗体包括一个到约六个与抗体的羧基末端共价结合的和/或与抗体的半胱氨酰残基的硫原子共价结合的有机组成。因此，本发明提供了含有位点-特异的修饰的抗体。如，IgG的修饰Fab可以包括PEG组成，其与重链的羧基末端结合。
在一个具体实施方案中，修饰的c7E3 Fab’包括两个PEG组成，其每一个与包含在重链的绞链区域内的一个半胱氨酰残基的硫原子结合(绞链区域中的半胱氨酰残基在对应IgG或F(ab’)2中形成链间二硫键)。
在另一个具体实施方案中，通过非染色质肽酶的作用生成的修饰c7E3 Fab包括与重链的羧基末端结合的一个PEG组成。
本发明还提供了一种治疗或预防表达GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1的细胞(如，血小板，内皮细胞，白细胞)起到疾病病理学作用的疾病和或病变的方法。这样的疾病和病变包括，如血栓类病变包括心血管疾病(如动脉粥样硬化，心绞痛，冠状动脉疾病)，中风，局部缺血，和肿瘤血管化作用，肿瘤转移和炎性病况。这种方法包括给需要的人服用有效量的本发明的修饰抗体。这种方法还包括单独服用本发明的抗体或与有效量的一种或多种其他活性试剂一起服用。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种抑制人体内血小板调节转移的方法，包括给人服用有效量的本发明的修饰抗体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种抑制人体内通过配体与GPIIb/IIIa，αvβ3，或Mac-1结合调节的过程(即一种或多种)，包括给需要的人服用有效量的本发明的修饰抗体。GPIIb/IIIa特异地在血小板上表达，并结合几种配体(如血纤蛋白原，纤连蛋白，von Willebrand因子，凝血栓蛋白，玻连蛋白)。αvβ3玻连蛋白受体在细胞如内皮细胞和脉管平滑肌细胞上表达，并在较小程度上在血小板上表达，调节与多种细胞外基质蛋白质(如玻连蛋白，纤连蛋白，von Willebrand因子，血纤蛋白原，骨桥蛋白，凝血栓蛋白，胶原质，基底膜蛋白)的附着作用。Mac-1在活化的白细胞上表达，如单细胞和粒性白细胞，并结合多种配体(如C3bi，因子X，血纤蛋白原)。
本发明进一步涉及如本文所描述的应用在治疗(包括预防)或诊断中的修饰抗体或片段，涉及这样的修饰抗体或片段的制备治疗如本文所描述的具体疾病(如血栓病变，表达GPIIb/IIIa和/或αvβ3的细胞起到疾病病理学作用的疾病或病变)的药物的应用。
本发明附图的简述
图1演示了c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG5000)2对ADP-诱导(15μM ADP)血小板聚集(234,000/μL)的剂量依存性抑制作用。
图2演示了c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG20,000)2对ADP-诱导(20μM ADP)血小板聚集(250,000/μL)的剂量依存性抑制作用。
图3演示了在GPIIb/IIIa覆盖的板上125I-c7E3 Fab竞争地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG20,000)2与GPIIb/IIIa的结合。
图4演示了在αvβ3覆盖的板上125I-c7E3 Fab竞争地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG20,000)2与αvβ3的结合。
图5演示了在αvβ3覆盖的板上125I-c7E3 Fab竞争地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG5000)2与αvβ3的结合。
图6演示了在GPIIb/IIIa覆盖的板上125I-c7E3 Fab竞争地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG5000)2与GPIIb/IIIa的结合。
图7演示了在GPIIb/IIIa覆盖的板上125I-c7E3 Fab竞争地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’-PEG5000与GPIIb/IIIa的结合。
图8演示了在αvβ3覆盖的板上125I-c7E3 Fab竞争地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’-PEG5000与αvβ3的结合。
图9演示了c7E3 Fab’(PEG5000)2和c7E3 Fab’(NEM)2从鼠血清中澄清的速度。
图10演示了c7E3 Fab’(PEG20,000)2从鼠血清中澄清的速度。
图11演示了c7E3 Fab’(PEG5000)2和c7E3 Fab从田鼠血清中澄清的速度。
图12是柱状图，演示了用c7E3 Fab或c7E3 Fab’(PEG5000)2免疫接种的鼠产生的特异IgG抗体(抗-c7E3 Fab)的滴定度。
图13演示了c7E3 Fab，c7E3 Fab’(PEG2000)2或c7E3Fab’((PEG5000)2)2对血小板聚集的剂量依存性抑制作用。
图14演示了c7E3 Fab或c7E3 Fab’((PEG2000)4)2对血小板聚集的剂量依存性抑制作用。
图15演示了c7E3 Fab或c7E3 Fab’((PEG2000)2)2对血小板聚集的剂量依存性抑制作用。
本发明的详细描述本发明涉及特异地与一种或多种从包括GPIIb/IIIa，αvβ3和Mac-1的组中选取的人类整联蛋白受体结合的修饰抗体。在一个较好的的实施方案中，修饰抗体特异地结合表达在血小板的质膜上的GPIIb/IIIa，从而抑制血纤蛋白原与GPIIb/IIIa的结合和血小板的聚集。较好地，结合GPIIb/IIIa的抗体进一步特异结合人类整联蛋白受体αvβ3。
抗体可以是单克隆的或多克隆的，“抗体”包括多克隆和单克隆抗体。多克隆和单克隆是指抗体制备的均一性程度，不受到具体制备方法限制。本文所使用的“抗体”也包括抗体的功能片段，包括嵌合，人源化，灵长类源化，胶合或单链抗体。功能片段包括与从包括GPIIb/IIIa，αvβ3和Mac-1的组中选取的整联蛋白结合的抗原结合片段。如，能结合GPIIb/IIIa和/或αvβ3或其部分的抗体片段，包括但不限于，Fv，Fab，Fab’，和F(ab’)2片段包括在本发明的范围内。这样的片段可通过酶促裂解或通过重组技术制备，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶可分别产生Fab或F(ab’)2片段。其他具有必需底物特异性的蛋白酶也可用来制备Fab或F(ab’)2片段。在一个较好的实施方案中，Fab片段可通过非染色质肽酶裂解制备。也可使用其中一种或多种终止密码子已引入到天然终止位点的上游的抗体基因制备多种截短形式的抗体。如，编码F(ab’)2重链部分的嵌合基因可设计包括编码CH1域和重链绞链区域的DNA序列。单链抗体，和嵌合，人源化或灵长类源化(CDR-移植的)，或胶合抗体，以及嵌合，CDR-移植或胶合单链抗体，包括从不同物种衍生的部分，等等都包括在本发明和“抗体”的范围内。这些抗体的不同部分也可通过传统技术化学地结合在一起，或可使用基因工程技术制备成邻接蛋白质。如编码嵌合或人源化链的核酸可表达来制备邻接蛋白质，参看如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567；Cabilly等人的欧洲专利No.0,125,023 B1；Boss等人的美国专利No.4,816,397；Boss等人的欧洲专利No.0,120,694B1；Neuberger，M.S.等人的WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人等人的欧洲专利No.0,194,276 B1；Winter的美国专利No.5,225,539；Winter的欧洲专利No.0,239,400 B1；Queen等人的欧洲专利No.0,451,216 B1；和Padlan，E.A.等人，欧洲专利0,519 596 A1。也可参看，Newman，R.等人的生物技术，101455-1460(1992)，关于灵长类源化抗体，和Ladner等人的美国专利No.4,946,778和Bird，R.E.等人，科学，242423-426(1988)，关于单链抗体。
如本文所使用的，“人源化抗体”是指抗体或其抗原结合片段包括部分不同源的免疫球蛋白，其中至少一部分是人类源的。如，人源化抗体可以包括非人类源(如，啮齿动物)的抗原-结合区域和人类源(如人类构架区，人类恒定区(如CL，CH1，CH2，CH3，CH4))的恒定区。抗原结合区域可从具有必需特异性的非人类源的免疫球蛋白衍生。
在一个实施方案中，人源化抗体包括一种或多种免疫球蛋白链，包括非人类源(如从非人类源的抗体衍生的一种或多种CDR)的CDR和从人类源的轻或重链(如有或没有构架改变的CDR-移植抗体，包括单链抗体)衍生的构架区。在另一个实施方案中，人源化抗体包括(a)至少一种人源化轻链，轻链包括从具有必需特异性的非人类免疫球蛋白的轻链衍生的抗原结合区域，和人类轻链恒定区，和(b)至少一种人源化重链，重链包括从所说的非人类免疫球蛋白的重链衍生的抗原结合区域，和人类重链恒定区。在这个实施方案的一个方面中，人源化抗体是嵌合抗体，包括非人类源的抗体的一个轻链可变区域，和一个重链可变区域，和人类恒定区。
在一个较好的实施方案中，人源化抗体能与鼠科动物7E3单克隆抗体或嵌合7E3，或它们的抗原结合片段，竞争与人类GPIIb/IIIa，或人类αvβ3的结合。如，人源化抗体的抗原结合区域可从7E3单克隆抗体衍生。在这个实施方案的一个方面中，人源化免疫球蛋白包括鼠科动物7E3抗体的轻链和重链可变区域，和人类恒定区。在另一个方面中，人源化免疫球蛋白包括鼠科动物7E3抗体轻链的CDR1，CDR2和CDR3和重链的CDR1，CDR2和CDR3，和人类恒定区。
如本文所使用的，“嵌合抗体”还指包括不同源的部分免疫球蛋白的抗体或其抗原结合片段。不是包括嵌合抗体的部分免疫球蛋白都需要是人类源的。如嵌合抗体可包括非人类源(如，啮齿动物)的抗原结合区域和非人类灵长类源(如，黑猩猩构架区，黑猩猩恒定区(如CL，CH1，绞链区，CH2，CH3，CH4))的恒定区。
人源化或嵌合抗体可包括所需同种型的轻链恒定区(如，CK，Cλ)和重链恒定区(如，CH1，绞链区，CH2，CH3，CH4)，如IgG(如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgA(如，IgA1，IgA2)，IgM，IgE或IgD。在一个具体实施方案中，人源化或嵌合抗体可包括混合同种型的重链恒定区(如，IgG源的CH1和绞链区和IgA源的CH2和CH3)。较好地，人源化或嵌合抗体包括IgG重链恒定区。最好地，人源化或嵌合抗体包括IgG1重链恒定区。
人源化可使用标准方法通过合成或重组DNA技术或其他适合的技术制备。编码人源化可变区域的核酸(如cDNA)序列也可通过PCR诱变法改变编码人类或人源化链的DNA序列，如从预先人源化的可变区域获得的DNA模板来构建(参看如，Kamman，M.，等人，核酸研究，175404(1989)；Sato，K.，等人，癌症研究，53851-856(1993)；Daugherty，B.L.等人，核酸研究，19(9)2471-2476(1991)；和Lewis，A.P.和J.S.Crowe，基因，101297-302(1991))。使用这些或其他适合的方法，变体也可方便地制备。在一个实施方案中，克隆的可变区域可被诱变，编码具有所需特异性的变体的序列可被选取(如从噬菌体文库中；参看如，Krebber等人，美国专利5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，1993年4月1人公布)。
对人类GPIIb/IIIa，αvβ3或Mac-1特异的抗体可培养来抗适当的免疫原，如分离的和/或重组的GPIIb/IIIa，αvβ3或Mac-1或它们的一部分(包括合成分子，如合成肽)。抗体也可通过用表达GPIIb/IIIa的细胞，如血小板(参看如，Coller，美国专利No.5,440,020，其全部内容参考收入本篇)或表达αvβ3或Mac-1的细胞免疫接种适当的宿主(如鼠)来培养。此外，表达重组体GPIIb/IIIa，αvβ3或Mac-1的细胞如转染细胞，可用作为免疫原或用在结合受体的抗体筛查中(参看如，Chuntharapai等人，免疫学期刊，1521783-1789(1994)；Chuntharapai等人，美国专利No.5,440,021)。
制备免疫接种抗原，和多克隆和单克隆抗体生产可通过任何合适的技术实施。已公开多种方法(参看如，Kohler等人，自然，256495-497(1975)和欧洲免疫学期刊，6511-519(1976)；Milstein等人，自然，266550-552(1977)；Koprowski等人，美国专利No.4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，抗体实验室手册，(冷泉港实验室冷泉港，NY)；分子生物学的当前方案，2卷(增补本27，1994年夏)，Ausubel，F.M.等人编辑(John Wiley&Sons纽约，纽约州)，11章，(1991))。通常，通过将适当的无限增殖细胞系(如骨髓瘤细胞系，如SP2/0或P3X63Ag8.653)与产生抗体细胞融合制备杂交瘤。产生抗体细胞，较好地是脾脏或淋巴结产生抗体的细胞，可从用有兴趣的抗原免疫接种的动物中获得。融合细胞(杂交瘤)可通过选择性的培养条件来分离，并通过有限稀释来克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可通过适当的测试法(如，ELISA)来选取。
也可使用制备或分离具有必需特异性的抗体的其他适合的方法，包括如，从文库(如噬菌体文库)中选取重组体抗体的方法，或依赖于能产生人类抗体所有组成成分的转基因动物(如鼠)免疫接种的方法(参看如，Jakobovits等人，Proc，Natl，Acad.Sci.USA，902551-2555(1993)；Jakobivits等人，自然，362255-258(1993)；Lonberg等人，美国专利No.5,545,806；Surani等人，美国专利No.5,545,807；Lonberg等人，WO97/13852)。
如本文所使用的，当指抗体-抗原相互作用时，“特异抗体”或“特异”用来指抗体高亲和力结合具体抗原(如，KD小于约10-5M)，而不是指抗体仅结合一种抗原。
结合GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1的，较好地抑制纤连蛋白与GPIIb/IIIa的结合的并抑制血小板聚集的抗体可如本文所述进行修饰。在一个实施方案中，7E3(鼠科动物IgG1，K)或人源化7E3如本文所述进行修饰。较好的人源化7E3是c7E3，其包括鼠科动物7E3重链和轻链的抗原结合其他，和人类γ1和K恒定区(Knight，D.M.等人，分子免疫学，32(16)1271-1281(1995))。其他可包括人类源的其他恒定区和/或人类构架区的人源化抗体也可如本文所描述的进行修饰。在较好的实施方案中，修饰7E3或人源化7E3的功能片段(如，Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2)。对GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1具有与7E3或c7E3相似的表位特异性的其他抗体，包括在GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1上结合与7E3或c7E3所结合的表位相同的或功能等同的表位的抗体也可进行修饰。具有与7E3或c7E3相同或相似的表位特异性的抗体，包括能阻断7E3或c7E3或它们适当的抗原结合片段与GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1结合的抗体。在一个实施方案中，抗体7E3(鼠科动物杂交瘤7E3在美国VA20110-2209，Manassas，Blvd大学10801美国模式培养物保藏所，1985年5月30日沉积，在新填编号HB8 832下和获得)竞争地抑制本发明的修饰抗体与GPIIb/IIIa和/或αvβ3的结合。
如本文所描述的抗体修饰改善了抗体的药物代谢动力学属性。具体地，本发明的修饰抗体特点在于增加了体内血清的半衰期。在一个较好的实施方案中，修饰抗体进一步的特点在于与未修饰的抗体相比免疫原性减少。对血清半衰期和蛋白质和肽(如，抗体，修饰抗体)的免疫原性的测定可使用任何适当的方法实施。如修饰蛋白质可给动物服用(如，通过注射)，血清可在服用后特定时间(如，一分钟，小时，天，周，月等)从动物获取。血清可进行存在修饰蛋白质的测定，或进行结合修饰蛋白质的抗体的测定(如。通过ELISA)。
在一个较好的实施方案中，修饰作用没有显著地影响抗体的抗原结合属性。抗体的抗原结合属性可表示为抗原-抗体缔合率常数(ka)，和抗原-抗体解离率常数(kd)和亲和力(KD)。可使用任何适当的方法试验测定参数。(参看，如Berzofsky，等人，“抗体-抗原相互作用”，基础免疫学，Paul，W.E.，编辑，Raven出版纽约，纽约州(1984)；Kuby，Janis免疫学，W.H.Freeman和公司纽约，纽约州(1992)；和本文所描述的方法)。没有显著影响抗体的抗原结合属性的修饰不会改变(如，增加或减少)多于因数约100的抗体亲和力。这样的修饰抗体结合抗原，亲和力与相应的未修饰的抗体的亲和力基本上相同。如抗体可具有亲和力为2×10-9M，修饰抗体可具有亲和力在约2×10-11M到约2×10-7M。在一个较好的实施方案中，修饰不会改变多于因数约10的抗体亲和力。如果在不同条件下(如，盐的浓度，PH)测定，所测得的具体抗体-抗原相互作用可以是变化的。因此，测定抗原-结合参数(如，ka，kb，KD)较好地使用标准化的抗体和抗原溶液，标准化的缓冲液，如本文所描述的缓冲液来实施。
本发明的修饰抗体包括一种或多种直接或间接与抗体共价结合的有机组成，从而增加抗体的体内血清半衰期，较好地，与未修饰抗体相比减少免疫原性。如本文所使用的，“有机组成”是指线性的或支化的组成，从亲水聚合物基团，脂肪酸基团，脂肪酸酯基团，脂质基团(如二脂酰甘油基团，鞘脂类基团(如，神经酰胺))或磷脂基团(如磷脂酰乙醇胺基团)中选取。较好的脂质和磷脂基团分别由结构式I和II表示-O-CH2-CH(R)-CH2-R’ (I)-NH-CH2-CH2-O-P(O-)(O)-O-CH2-CH(R)-CH2-R’(II)在结构式I和II中，R和R’每个独立地是-OH，或是表示为-X-Y的基团，其中-X是-O-，-O-C(O)-，-S-，-O-S(O)2-O-，-NH-C(O)-或OCH＝CH-，Y是含有约6个到约40个碳原子的烃基团，其是饱和的或其含有一个或多个不饱和单元(如，烷基，链烯基，炔基)，只要R和R’不都是-OH。较好地，-X-是-O-C(O)-。因此，适合的脂质和磷脂基团包括，如，二脂酰甘油，醚磷脂，硫醚磷脂，溶血磷脂和缩醛磷脂。
与本发明的抗体结合的每种有机组成可独立地是亲水聚合物基团，脂肪酸基团，脂肪酸酯基团，脂质基团或磷脂基团。如本文所使用的，“脂肪酸”包括单-羧酸和二羧酸。
“亲水聚合物基团”，如本文所使用的，是指在水中比在辛烷中更具有溶解性的有机聚合物。如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更具有溶解性。因此，由聚赖氨酸共价附着修饰的抗体包括在本发明中。适合修饰本发明抗体的亲水聚合物可以是线性的或支化的，包括如，聚烷烃乙二醇(如PEG，单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)，PEG二胺，PPG等)，碳水化合物(如，右旋糖苷，纤维素，低聚糖，多聚糖等)，亲水氨基酸的聚合物(如，聚赖氨酸，聚精氨酸，聚天冬氨酸)，聚烷烃氧化物(聚乙烯氧化物，聚丙烯氧化物等)和聚乙烯基吡咯烷酮。修饰本发明抗体的亲水聚合物作为独立的分子实体可具有分子量约800到约150,000道尔顿。较好地，有机组成作为独立分子实体分子量为约2,000道尔顿或更大。如PEG5,000和PEG20,000，其中写在下面的数字是聚合物的平均分子量道尔顿，聚合物特别较好的是亲水聚合物。同样较好的是PEG2,000，PEG3,400，PEG10,000，PEG30,000和PEG40,000，其可以是线性的或支化的。支化的PEG(如，(PEG2,000)2，(PEG2,000)4，(PEG5,000)2，)可通过如Harris等人在美国专利No.5,932,462中所描述的制备，这些文献的全部内容都通过在此引述而合并于本文。
在一个实施方案中，亲水聚合物基团可被一个到约六个烷基，脂肪酸，脂肪酸酯，脂质或磷脂基团(如本文所描述的，如结构式I和II)取代。较好地，取代的亲水聚合物基团是线性的或支化的PEG。更好地，取代的亲水聚合物基团是末端被脂肪酸，脂肪酸酯，脂质或磷脂基团取代的线性PEG(如，PEG二胺)。被烷基，脂肪酸，脂肪酸酯，脂质或磷脂基团取代的亲水聚合物可通过适当的方法制备。如，如本文所描述的(实施例XIV和XV)，修饰试剂可通过将单保护的PEG二胺与活化的脂肪酸(如，软脂酰氯化物)反应制备。产物可进行解保护，可引入适当的活化试剂(如，maleimido)，产生的修饰试剂可用来制备含有末端被脂肪酸基团取代的PEG的修饰Fab’。也可使用多种其他适当的合成方案，如含有氨基基团的聚合物可与如本文所描述的脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸酯偶联，脂肪酸或脂肪酸酯上活化的羧酸酯(如，用N，N’-羰基二联咪唑活化的)可与聚合物上的羟基基团偶联。
适于修饰本发明的抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或可含有一个或多个不饱和单元。在一个较好的实施方案中，脂肪酸和脂肪酸酯包括约六个到约四十个碳原子，或约八个到约四十个碳原子。适于修饰本发明的抗体的脂肪酸包括，如n-十二烷酸酯(C12，月桂酸酯)，n-十四烷酸酯(C14，肉豆蔻酸酯)，n-十六烷酸酯(C16，棕榈酸酯)，n-十八烷酸酯(C18，硬脂酸酯)，n-二十烷酸酯(C20，花生酸酯)，n-二十二烷酸酯(C22，山嵛酸酯)，n-三十烷酸酯(C30)，N-四十烷酸酯(C40)，顺式-Δ9十八烷酸酯(C18，油酸酯)，所有的，顺式-Δ5，8，11，14二十碳四烯酸酯(C20，花生四烯酸酯)，辛二酸，十四烯二酸，十八烯二酸，二十二烯二酸，等等。适当的脂肪酸酯包括含有线性或支化小分子烷基基团的二羧酸的单酯。小分子烷基基团可以含有一个到约十二个，较好地含有一个到约六个碳原子。修饰本发明的抗体的适当的脂肪酸酯包括，十八烷酸甲酯，十八烷酸乙酯，十八烷酸丙酯，十二烷酸丁酯，sec-十二烷酸丁酯，tert-十二烷酸丁酯，十四烷酸新戊酯，十四烷酸己酯，顺式-Δ9十八烷酸甲酯，等等。
如本文下面所描述的抗体的修饰较好地使用一种或多种修饰试剂实施。本文所使用的“修饰试剂”，是指含有活化基团的亲水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯，脂质或磷脂的衍生物。“活化基团”是在适当的条件下，能与另一个化学基团反应从而在修饰试剂和另一个化学基团之间生成共价键的化学组成或功能基团。如，胺-活性活化试剂包括亲电子基团如甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，卤素(氯，溴，氟，碘)，N-羟基琥珀酰亚胺基酯(NHS)，酰基卤化物等等。可与硫醇反应的活化试剂包括，如，顺丁烯二酰亚胺，碘代乙酰基，丙烯酰基，吡啶基二硫化物，5-硫醇-2-硝基安息香酸硫醇(TNB-硫醇)，等等。醛功能基团可与含胺或含酰肼的分子偶联，叠氮基团可与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入到分子中的适当方法在此领域中是已知的[参看如，Hermanson，G.T.，生物偶联技术，学术出版社San Diego，CA(1996)]。活化基团可以直接或通过接头组成，如C1-C12的烃基基团结合亲水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯，脂质或磷脂。如本文所使用的，“烃基基团”是指其中一个或多个碳原子任意地被杂原子如氧，氮或硫替换的碳氢链。适当的接头组成包括，如三缩水四乙二醇，-(CH2)3-，-NH-(CH2)6-NH-，-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。
含有接头组成的修饰试剂可通过，如在存在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的情况下将单-Boc-烷基二胺(如，单-Boc-乙二胺，单-Boc-己二胺)与脂肪酸反应，在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键而制备。Boc保护基可通过用四氟乙酸(TFA)处理以暴露能与所描述的另一个羧酸酯偶联的伯胺从产物上除去，或可以与马来酸酐反应，产物环化产生活化的脂肪酸的maleimido衍生物。(参看如，Thompson，等人，WO92/166220，其全文参考收入本篇。)本发明修饰抗体可通过将适当的抗体(即，抗体或适当的抗体片段，如Fab’)与修饰试剂反应来制备，如本文所描述的。在一个实施方案中，通过使用胺-活性修饰试剂，如PEG的NHS酯，有机组成可以与抗体以非-位点特异方式结合。在一个具体实施例中，c7E3 Fab通过与NHS-PEG5,000以非-位点特异方式反应来进行修饰。如本文所演示的，这种类型的修饰显著地降低了Fab对GPIIb/IIIa的结合亲和力(实施例XXII，表6，比较c7E3 Fab和c7E3 Fab随机(PEG5,000))。因此，在较好的实施方案中，修饰抗体可以通过将适当的抗体与一种或多种修饰试剂反应，产生含有一个到约六个结合抗体上特异位点的有机组成的修饰抗体来制备，如(即一个或多个)羧基末端和/或(即一个或多个)半胱氨酰残基的侧链硫原子。在特别推荐的实施方案中，修饰抗体可以包括一个或两个结合抗体上特异位点的(如，形成链间二硫键的半胱氨酰残基，重链的羧基末端)大于2,000道尔顿的线性PEG组成。
在其中修饰抗体含有结合半胱氨酰残基的有机组成的实施方案中，较好地，有机组成结合在适当折叠(即，天然的)抗体中重链绞链区域内形成链间二硫键的的半胱氨酰残基。如本文所使用的，“链间二硫键”是指在适当折叠(即，天然的)抗体中结合两条重链的二硫键。
这种类型的修饰抗体可通过还原链间二硫键，从而产生包含重链和轻链的单价抗体来制备。适当的还原试剂包括，如，2-巯基乙醇(2ME)，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙胺(2-MEA)和半胱氨酸。这种单价抗体可通过适当的方法(如层析柱)分离提纯，提纯的抗体可与硫醇-活性修饰试剂反应，如O-(2-maleimido乙基)-O’-甲基聚乙二醇5000，制备本发明的修饰抗体。在一个实施例中，修饰抗体包括(如一种或多种)结合包含在重链绞链区域内形成链间二硫键的至少一个半胱氨酰残基的侧链硫原子的PEG组成。
在另一个实施例中，修饰抗体是Fab’，其包括结合形成链间二硫键的至少一个绞链区域半胱氨酰残基的侧链硫原子的有机组成。
在另一个实施例中，修饰抗体是Fab，其包括共价附着重链羧基末端的有机组成。这种类型的修饰抗体可通过将IgG木瓜蛋白酶裂解产生的Fab与，如含有胺活化试剂的PEG，在存在EDC的条件下反应制备。然而，胺-活化PEG可与抗体上的所有羧基基团反应，使提纯含有特异结合重链羧基末端的PEG的抗体很难进行。
制备修饰抗体的一种较好的方法是通过反向蛋白质水解在重链羧基末端引入独特的活化基团。“反向蛋白质水解”是此领域中的一个术语，其是指在特定条件下，某些蛋白酶可催化形成肽(酰胺)键。如由蛋白酶活性产生的提纯Fab可在适合反向蛋白质水解的条件下(如，碳酰肼相对Fab过量250-倍摩尔量)与所说的蛋白酶和碳酰肼混合，制备在重链羧基末端上含有独特酰肼官能的Fab。
含酰肼的Fab可通过与适当的修饰试剂反应来修饰。如，Fab可与含有醛官能基团的修饰试剂反应，制备含有通过腙键特异附着重链羧基末端的有机组成的修饰抗体。腙通过与适当的还原试剂(如，氰基硼氢化钠)反应进一步稳定化。
能酶切抗体产生所需片段的多种酶可用来通过反向蛋白质水解引入酰肼。反向蛋白质水解的条件对此领域中的技术人员是众所周知的，包括大量过摩尔量(如250倍)的碳酰肼和延长的反应时间。并且，反向蛋白质水解较好地在与蛋白质水解最优PH不同的PH下进行(Fisch等人，生物偶联化学，3147-153(1992)；Werlen等人，生物偶联化学，2；411-417(1994)；Kumaran等人，蛋白质科学，6(10)2233-2241(1997)；Itoh等人，生物组织化学，24(1)59-68(1996)；Capellas等人，生物技术生物工程，56(4)456-463(1997))。反向蛋白质水解的最优PH可使用标准方法试验确定。羧基末端修饰较好的酶是非染色质肽酶。
轻链的羧基末端也可通过反向蛋白质水解引入酰肼来修饰。在一个实施方案中，选取能酶切轻链但不显著影响抗体的抗原结合特性的蛋白酶，如所述进行轻链修饰。
在另一个实施方案中，使用重组DNA技术，非染色质肽酶或其他蛋白水解裂解位点能引入到克隆抗体的轻链中。这种类型的抗体能被非染色质肽酶或适当的酶所酶切，产生通过反向蛋白质水解能将酰肼基团引入到重链和轻链的羧基末端的Fab。
在其他实施方案中，重组DNA技术能用来引入或从克隆抗体的重链除去非染色质肽酶或其他酶切位点(如，通过诱变)。如，自然发生的非染色质肽酶的酶切位点可被除去并在不同的位置上引入新的酶切位点。因此，非染色质肽酶或其他适当的酶可用来产生本发明的多种修饰抗体。如，可以制备含有中重链的羧基末端和/或轻链的羧基末端的有机组成的Fv，Fab，F(ab’)2或Fab’片段。这样的片段可进一步包括结合半胱酰氨残基的侧链硫原子的一种或多种其他有机组成。
在一个具体实施方案中，修饰抗体是含有两个PEG5,000基团的c7E3 Fab’，其中每个PEG5,000基团与形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有两个PEG20,000基团的c7E3 Fab’，其中每个PEG20,000基团与形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有一个与重链羧基末端结合的PEG5,000基团的c7E3 Fab。在一个较好的方面中，Fab由非染色质肽酶酶切产生。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有一个与重链羧基末端结合的PEG20,000基团的c7E3 Fab。在一个较好的方面中，Fab由非染色质肽酶酶切产生。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有一个PEG5,000基团和一个C22脂肪酸基团并各自独立地与形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的c7E3 Fab’。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有一个与重链羧基末端结合的PEG5,000基团的c7E3 Fab，该PEG5,000基团与重链羧基末端结合，其中PEG5,000基团带有C22脂肪酸取代物。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有(一个或更多个)与在连接区形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的PEG20,00基团的c7E3 Fab’。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有(一个或更多个)与在连接区形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的PEG10,000基团的c7E3 Fab’。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有(一个或更多个)与在连接区形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的(PEG2,000)2基团的c7E3 Fab’。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有(一个或更多个)与在连接区形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的(PEG2,000)4基团的c7E3 Fab’。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有(一个或更多个)与在连接区形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的(PEG5,000)2基团的c7E3 Fab’。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有(一个或更多个)与在连接区形成链间二硫键的半胱氨酰残基的侧链硫原子结合的终端取代的PEG3,400基团的c7E3 Fab’，其中的终端取代是棕榈酰基团。
在另一个具体实施方案中，修饰抗体是含有重链羧基连接的C22脂肪酸基团的c7E3 Fab。
在另一个具体实施方案中，修饰了含有基因工程设计的半胱氨酰残基(如，通过重组DNA技术引入的半胱氨酰)的抗体。这种类型的抗体，包括如Fv，Fab，F(ab’)2或Fab’片段，可通过此领域中普通技术方便地制备。含有基因工程设计的半胱氨酰残基的抗体可与硫醇-活性修饰试剂反应，制备本发明的修饰抗体。含有基因工程设计的半胱氨酰残基的抗体可进一步包含非染色质肽酶或其他裂解位点，并在这个位点上如所述进行修饰。
如本文所描述的抗体的位点特异修饰(如，羧基末端的PEG化)提供了几个优点，包括增加了活性持续时间。并且，含有位点特异修饰的抗体不可预料地比相应的未修饰抗体免疫原性低。如，含有一个或两个低分子量的有机组成(如，PEG5,000)的Fab片段的位点特异修饰产生了具有增加的血清半衰期和显著降低的免疫原性的修饰Fab，其用与未修饰抗体基本上相同的亲和力结合GPIIb/IIIa或αvβ3(参看实施例IX，XI和XII)。有限修饰产生的显著降低免疫原性的没有预料到的益处可能是由于本文所描述修饰的位点特异性。
本发明的修饰抗体可通过使用此领域中的技术人员众所周知的方法提纯。适当的提纯方法包括，如，层析柱法(如，离子交换，凝胶过滤，疏水-相互作用，亲和柱)，制备天然电泳法，沉淀法和超滤法。较好地，如本文所述，修饰抗体通过疏水-相互作用层析法提纯。
如本文所使用的，“纯的”或“提纯的”是指制备品，其中本发明的修饰抗体占存在于制备品中的大分子的约75％。较好地，修饰抗体占存在于制备品中的大分子的约90％或95％。更好地，修饰抗体占约99％或基本上全部是存在于制备品中的大分子。
在其他实施方案中，本发明提供了一种治疗(如减缓疾病和病变的严重性或预防)其中在人体内表达GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1的细胞(如，血小板，内皮细胞，白细胞)起到疾病病理学作用的疾病或病变的方法。这样的病变包括，如，血栓病变如心血管疾病(如，动脉粥样硬化，冠状动脉疾病，心肌梗死)，深静脉血栓症，中风，局部缺血，肿瘤血管化(如，αvβ3-调节的血管生成)，肿瘤转移(如，血小板调节的转移)。表达GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1的细胞(如，血小板，内皮细胞，白细胞)也在炎性疾病和病况中起到疾病病理学作用，炎性疾病和病况包括，如，自身免疫疾病，成年呼吸不良应激综合症，同种异体移植排斥，脓血症，再灌注损伤(如，与移植有关的再灌注损伤，中风或心肌梗死患者中再灌注产生的损伤)，心肌梗死，血管成形术和外科手术。
本发明的方法还可用来在人体内有益地抑制血栓症，器官狭窄，心瓣手术后再狭窄和/或由配体与GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1结合调节的过程(如，附着，聚集，分泌(如，脱粒)，增殖，氧自由基的产生)。如修饰抗体发现可应用在要预防血栓形成或再形成或器官狭窄和/或心瓣手术后再狭窄的情况中，如在脉管干预过程期间或后，如，血管造影术，血管成形术(如，用气囊实施的atherectomy，激光血管成形术或其他适当的方法(有或没有rotablation和/或stent替换))，冠状动脉旁路手术，stent替换(如，冠状stent)，和/或其他脉管干预过程(如，脉管手术，脉管移植，外周stent展开，假体瓣膜或脉管插入(如，自体同源，非自体同源或合成脉管移植))。具体地，方法可用来在冠状动脉干预过程，如经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)期间或后有益地抑制血栓症。
该方法包括给人服用有效量的本发明的修饰抗体，预防或减缓其中血小板起到疾病病理学作用的疾病和/或病变的严重性，或抑制(减缓或预防)血栓症，器官狭窄，心瓣手术后再狭窄和/或由配体与GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1结合调节的过程。如，修饰抗体可在脉管干预过程(如，血管成形术)前，期间和/或后给人服用，预防脉管(再闭塞)的突然关闭，预防/或减缓急性局部缺血。
“有效量的”，如本文所使用的，是指足以获得所需治疗效果(如，抑制血栓症形成，预防脉管再闭塞，抑制器官狭窄和/或再狭窄，抑制炎症，炎症αvβ3调节的血管生成)的量。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种在人体内抑制血栓症的方法，包括给所说的人服用有效量的本发明的修饰抗体。
在另一个实施方案中，本发明的方法是一种在人体内脉管干预过程(如，冠状动脉干预过程如PTCA)后抑制器官狭窄和/或再狭窄的方法，包括给所说的人服用有效量的本发明的修饰抗体。
在另一个实施方案中，本发明的方法是一种在人体内减缓或预防局部缺血的方法，包括给所说的人服用有效量的本发明的修饰抗体。
在另一个实施方案中，本发明的方法是一种在人体内抑制肿瘤生长和/或转移的方法，包括给所说的人服用有效量的本发明的修饰抗体。
在另一个实施方案中，本发明的方法是一种在人体内抑制αvβ3-相关血管生成的方法，包括给所说的人服用有效量的本发明的修饰抗体。
在另一个实施方案中，本发明的方法是一种在人体内抑制由配体与GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1的结合调节的过程的方法，包括给所说的人服用治疗上有效量的本发明的修饰抗体。
本发明的方法包括单独服用一种或多种修饰抗体，或与有效量的一种或多种其他活性试剂，如，溶解血纤维蛋白试剂(如，Retavase)，溶解血栓试剂，如血纤维蛋白溶酶原激活剂(如，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，尿激酶，链激酶，重组血纤维蛋白溶酶原激活剂)，抗凝血剂(如，肝磷脂，hirulog，水蛭素，乙酰水杨酸)，或香豆素抗凝血剂(如，丙酮苄羟香豆素，ethyledine双香豆素)一起服用。本发明的修饰抗体也可与β-肾上腺素阻断剂(如，烯丙心安，醋丁酰心安，心得安)，钙通道阻断剂(如，硝苯吡啶，硫氮草酮，肉桂苯哌嗪，苄环烷)或血管扩张剂(如，硝化甘油，amotriphene，赤藻糖醇，双苯丙胺)一起服用。本发明的修饰抗体还可与刺激产生氮氧化物的试剂一起服用(参看如，Singh等人，美国专利No.5,811,437)。
可以使用多种服用途径。如本发明的修饰抗体可用与已经公开的其他治疗抗体相同的方式制备和服用(Faanes等人，美国专利No.5,695,760；Coller等人，WO95、12412；两篇文献参考收入)。有效量的本发明的修饰抗体可经非肠道服用(如，静脉内，动脉内，肌肉内，皮下)，如，通过注射到血管，肌肉或体腔(如，腹腔，胸腔)内。修饰抗体还可口服，局部用药，通过吸入(如，支气管内，鼻内，口吸入或鼻内滴液)，或直肠用药。较好地，修饰抗体通过静脉内服用。修饰抗体可以单一剂量，连续注入，或多剂量和/或注入(如，丸药剂量后连注入)服用。
服用抗体的配方根据所选取的服用方式变化(如，溶液，乳液，胶囊)。本发明的修饰抗体可以中性蛋白质或以生理上可接受的盐服用。“盐”意指蛋白质上带电基团(如，质子化胺，羧酸酯)与相反电荷的可交换的离子缔合。如，正电荷氨基基团(如，质子化胺)可与无机酸(如，盐酸，磷酸，甲烷磺酸)或有机酸(如，乙酸，乳酸，柠檬酸等)形成酸式加成盐，并含有抗衡离子离子如Cl-，CH3SO3-，乙酸酯，乳酸酯，柠檬酸酯等。羧酸盐可通过与适当的碱如氢氧碱(如氢氧化钠，氢氧化钾)反应形成，并含有抗衡离子如Na+，K+等。
修饰抗体可作为部分药物组合物服用，药物组合物包括修饰抗体和药物可接受的载体或赋形剂。适当的药物载体可含有不与修饰抗体相互作用的惰性组分。可使用标准药物配方技术，如在Remington药物科学，Mack出版公司，Easton，PA中所描述的。非肠道用药适用的药物载体包括，如，灭菌水，生理盐水，细菌抑制盐水(含有约0.9％毫克/毫升苄甲醇)，磷酸缓冲液盐水，Hank溶液，Ringer-乳酸盐等。抗体配方可含有其他添加剂母乳稳定剂(如，聚山梨醇酯80，USP/NP)。胶囊化组合物的方法(如，硬质凝胶或环糊精包裹)在此领域中是众所周知的[Baker等人，生物活性试剂的控释给药，John Wiley andSons，(1986)]。
给人服用的抗体的量可以取决于疾病的种类和严重性，以及人的特性，如通常的健康状况，年龄，性别和体重及对药物的耐受性。其还可以取决于疾病的种类，程度，严重性。根据这些和其他因素，此领域中的技术人员能确定适当的剂量。一般，尽管大些或小些量也可使用，但治疗上有效量的修饰抗体范围可在对每个丸药从约0.01毫克/公斤到约100毫克/公斤，及对每一次连续注入约0.001毫克/分钟到约1毫克/分钟。
实施例II 合成c7E3 Fab’(PEG20,000)2将7毫升c7E3(Fab’)2(5.2毫克/毫升，在磷酸缓冲液盐水中)用0.7毫升二硫苏糖醇(16毫克/毫升)处理，并在室温保持1小时。在溶液中溶解0.63克的硫酸铵，将Fab’溶液加入到TosoHass苯基-5PW柱中(21.5毫米×15厘米，13μm)，TosoHass苯基-5PW柱已用含0.6M硫酸铵的pH7.5的0.1M磷酸钠平衡过。经65分钟，流速6毫升/分钟，通过降低硫酸铵浓度到0洗脱Fab’。收集含Fab’部分，并在在Amicon搅拌细胞中浓缩到最终浓度为2.2毫克/毫升。获得总量22毫克的Fab’。然后用2毫升的O-(2-maleimido乙基)-O’-甲基聚乙二醇20000(57毫克/毫升；13eq总量)的水溶液(Shearwater聚合物，Huntsville，A1)处理Fab’。两个小时后，加入0.95克硫酸铵并溶解在Fab’溶液中，将溶液加入到用含0.6M硫酸铵PH7.5的0.1M磷酸钠平衡过的苯基柱中。经65分钟，流速6毫升/分钟，使用50％到100％梯度的PH7.5 0.1M磷酸钠洗脱PEG化的产物。收集纯组成获得13毫克产物。通过质谱法(MALDI-TOF)确定平均分子量为91078道尔顿。
实施例III 合成c7E3 Fab-PEG5,000在通过非染色质肽酶对c7E3 IgG作用制备的5毫升c7E3 Fab(7.3毫克/毫升)中加入1.0克碳酰肼。通过加入300μl的冰乙酸将pH调节到4.95。加入10,000个单位的非染色质肽酶，将产物溶液在环境温度下温育24小时。将溶液透析到10mM乙酸钠中，加入Ph4.5、0.875毫克的单甲氧基聚乙二醇醛(PEG5,000醛，MW＝5,000)(Shearwater聚合物，Huntsville，A1)，接着加入0.3毫克的氰基硼氢化钠。反应在环境温度保持过夜。加入硫酸铵以使最终溶液在硫酸铵中为0.6M。将TosoHass TSK 5PW苯基柱(21.5毫米×15厘米)用含有0.6M硫酸铵(缓冲液A)pH7.5的100mM磷酸钠平衡。反应混合物注入到苯基柱中，并经60分钟，流速6毫升/分钟，用缓冲液A到100mM磷酸钠，pH7.5(缓冲液B)的线性梯度洗脱。收集在约58分钟时的峰值洗脱，并通过用分子量排除为10,000的膜在40psi超滤浓缩到5毫升。将浓缩液透析到磷酸缓冲液盐水(PBS)中。将少量样品在PD-10柱上脱盐，用水洗脱。质谱分析获得集中在52,846道尔顿的一束峰值(由于PEG5,000醛的分子量分散)，对应加入碳酰肼和PEG5,000醛后的c7E3 Fab预计分子量。
实施例IV c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2对血小板聚集的抑制作用制备富含血小板血浆(PRP)和血小板数量调节所有研究使用从正常，非-药物治疗的人类供体获得的血小板实施。通过静脉穿刺从每个供体抽取血液到60毫升含40％柠檬酸三钠的1/100终稀释液的注射器中。PRP通过在室温下在600g离心4分钟制备。将PRP小心地移出，通过在室温下在2500g离心剩余血液20分钟制备贫血小板血浆(PPP)。在计数前可将PRP在室温下保持20分钟。使用Coulter T-80确定PRP血小板数量。使用自体同源PPP将血小板数量调节到每μl 200,000-250,000血小板。血小板聚集使用PAP-4D血小板聚集器实施血小板聚集测试。对每一项测试，在聚集器的备有搅拌棒的透明玻璃管内加入450μlPRP。将起始20μg/毫升(终浓度)或盐水(50μl)的连续稀释c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)，c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2加入到每个透明玻璃管中并在开始操作前在37℃温育10分钟。然后将玻璃管转移到聚集器通道中，将搅拌速度调节到1200rpm。在加入12-20μM腺苷二磷酸(ADP)前监测一分钟半到一分钟基线聚集。加入刺激剂后监测聚集作用4分钟，将仅用盐水处理的对照样品进行每项操作以确定最大刺激剂诱导血小板聚集。对聚集作用的抑制对聚集作用的抑制表示为在存在c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2的情况下，刺激剂刺激血小板最大化聚集的百分比。对于每种抗体，对聚集的抑制程度计算如下％抑制作用＝[1-％光透射抗体/％光透射盐水对照物]×100将c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2的终浓度数学转化到摩尔浓度并相对于％对聚集作用的抑制作用作图。c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2样品表现出相似的抑制ADP调节血小板聚集的能力，在两倍摩尔IC50浓度内。
图1和图2说明c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2在它们抑制血小板聚集的能力方面与c7E3 Fab相似，说明增加半衰期的化学修饰不影响活性。
实施例V c7E3 Fab’(PEG20,000)2与125I-c7E3 Fab竞争与提纯整联蛋白的结合将提纯的αvβ3[Smith等人，生物化学期刊，263(35)18726-18731(1988)]或GPIIb/IIIa[Pytela等人，科学，231(4745)1559-1562(1986)]稀释到含2mM氯化钙(TBS/Ca)的Tris-缓冲液盐水(TBS)中，浓度为0.5μg/毫升(αvβ3)或1.5μg/毫升(GPIIb/IIIa)。用αvβ3或GPIIb/IIIa覆盖96-培养皿的聚苯乙烯Immulon Removawell板(Dynex技术，Chantilly，VA)，将50μl适当的蛋白质溶液等分到每个培养皿中并在室温下温育板2.5小时。将板用1％牛血清清蛋白(BSA)的TBS/Ca溶液冲洗并用其在室温下阻断1小时。将c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)用Iodobeads(Pierce化学，Rockford，IL)碘化到约2μCi/μg。在TBS/BSA/Ca中制备2X终浓度的未标记c7E3 Fab’(PEG20,000)2和未标记c7E3 Fab的稀释液系列。将c7E3Fab’(PEG20,000)2或c7E3 Fab(起始于20μg/毫升终浓度)的稀释液与2X125I-c7E3 Fab(1μg/毫升终浓度)以1∶1混合并加入到板上。将板在37℃温育2小时。冲洗板，培养皿分离到试管中，在计数仪上计数的结合放射性。数据表示为在存在c7E3Fab’(PEG20,000)2或c7E3 Fab的情况下，最大125I-c7E3 Fab结合百分比，使用GraphPad Prism实施非线性回归分析。
图3和图4演示了从c7E3 Fab’(PEG20,000)2或c7E3 Fab分别与GPIIb/IIIa和αvβ3获得的数据，说明用来产生c7E3 Fab’(PEG20,000)2的衍生技术对其结合没有显著的影响。
实施例VI c7E3 Fab’(PEG5,000)2与125I-c7E3Fab竞争与提纯整联蛋白的结合将提纯的αvβ3[Smith等人，生物化学期刊，263(35)18726-18731(1988)]或GPIIb/IIIa[Pytela等人，科学，231(4745)1559-1562(1986)]稀释到含2mM氯化钙(TBS/Ca)的Tris-缓冲液盐水(TBS)中，浓度为0.5μg/毫升(αvβ3)或1.5μg/毫升(GPIIb/IIIa)。用αvβ3或GPIIb/IIIa覆盖96-培养皿的聚苯乙烯Immulon Removawell板(Dynex技术，Chantilly，VA)，将60μl适当的蛋白质溶液等分到每个培养皿中并在4℃温育板过夜。将板用1％牛血清清蛋白(BSA)的TBS/Ca溶液冲洗并用其在室温下阻断1小时。将嵌合7E3 Fab(c7E3 Fab)(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)用Iodobeads(Pierce化学，Rockford，IL)碘化到约2μCi/μg。在TBS/Ca中制备2X终浓度的未标记c7E3 Fab’(PEG5,000)2和未标记c7E3 Fab的稀释液系列。将c7E3 Fab’(PEG5,000)2或c7E3 Fab(起始于20μg/毫升终浓度)的稀释液与2X125I-c7E3 Fab(1μg/毫升终浓度)以1∶1混合并加入到板上。将板在37℃温育2小时。冲洗板，培养皿分离到试管中，在计数仪上计数的结合放射性。数据表示为在存在c7E3 Fab’(PEG5,000)2或c7E3 Fab的情况下，最大125I-c7E3 Fab结合百分比，使用GraphPad Prism实施非线性回归分析。
图5和图6演示了从c7E3 Fab’(PEG5,000)2或c7E3 Fab分别与GPIIb/IIIa和αvβ3获得的数据，说明用来产生c7E3 Fab’(PEG5,000)2的衍生技术没有不利地影响结合。
实施例VII c7E3 Fab’PEG5,000与125I-c7E3 Fab竞争与提纯整联蛋白的结合将提纯的αvβ3[Smith等人，生物化学期刊，263(35)18726-18731(1988)]或GPIIb/IIIa[Pytela等人，科学，231(4745)1559-1562(1986)]稀释到含2mM氯化钙(TBS/Ca)的Tris-缓冲液盐水(TBS)中，浓度为0.5μg/毫升(αvβ3)或1.5μg/毫升(GPIIb/IIIa)。用αvβ3或GPIIb/IIIa覆盖96-培养皿的聚苯乙烯Immulon Removawell板(Dynex技术，Chantilly，VA)，将60μl适当的蛋白质溶液等分到每个培养皿中并在4℃温育板过夜。将板用1％牛血清清蛋白(BSA)的TBS/Ca溶液冲洗并用其在室温下阻断1小时。将嵌合7E3 Fab(c7E3 Fab)(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)用Iodobeads(Pierce化学，Rockford，IL)碘化到约2μCi/μg。在TBS/Ca中制备2X终浓度的未标记c7E3 Fab’PEG5,000和未标记c7E3 Fab的稀释液系列。将c7E3 Fab’PEG5,000或c7E3 Fab(起始于20μg/毫升终浓度)的稀释液与2X125I-c7E3 Fab(1μg/毫升终浓度)以1∶1混合并加入到板上。将板在37℃温育2小时。冲洗板，培养皿分离到试管中，在计数仪上计数的结合放射性。数据表示为在存在c7E3 Fab’PEG5,000或c7E3 Fab的情况下，最大125I-c7E3 Fab结合百分比，使用GraphPad Prism实施非线性回归分析。
图7和图8演示了从c7E3 Fab’PEG5,000或c7E3 Fab分别与GPIIb/IIIa和αvβ3获得的数据，说明用来产生c7E3 Fab’PEG5,000的衍生技术没有不利地影响结合。
实施例VIII GPIIb/IIIa受体阻断(血纤蛋白原珠测试)在活化血小板上的GPIIb/IIIa复合物是血纤蛋白原的受体。配体结合的机理主要依据Arg-Gly-Asp(RGD)依赖过程，其中含RGD序列的肽阻断血小板聚集并抑制血纤蛋白原的结合。Coller等人观察到，血小板通过GPIIb/IIIa血纤蛋白原相互作用粘着血纤蛋白原覆盖的珠子。阻断GPIIb/IIIa受体的单克隆抗体可以预防配体和受体的相互作用，因此预防血纤蛋白原覆盖的珠子的粘着。
血纤蛋白原与珠子(羧酸酯化聚苯乙烯微型颗粒)的共价偶联将血纤蛋白原(酶研究，South Bend，IN)预温热到37℃并重新组建在温水中。在13,000-14,000g离心7分钟除去颗粒。除去上清液并测定其在OD280，E＝1.5处的吸光率。将血纤蛋白原溶液保持在室温直到准备使用。如所述准备珠子(蓝色羧酸酯化聚苯乙烯微型颗粒3μm直径，2.5％固体颗粒)([Coller等人，循环系统，95(4)860-867(1997)]。简单地，将珠子置于室温并剧烈振荡。将珠子(5毫升)放置在15毫升含0.1M，pH9.6的碳酸盐缓冲液的离心试管中，在室温下离心10分钟。将沉淀用碳酸盐缓冲液再一次冲洗，离心，将上清液除去。将沉淀重新悬浮到pH4.5，0.02M磷酸钠缓冲液中，剧烈振荡，在环境温度下离心10分钟。将上清液除去，在磷酸盐缓冲液中冲洗两次沉淀。通过将沉淀重新悬浮到6.25毫升磷酸盐缓冲液中并缓慢加入6.25毫升新鲜制备的2％碳化二亚胺溶液来实施珠子活化。在环境温度下在摇摆平台上混合珠子/碳化二亚胺3小时，然后离心10分钟。将上清液除去，用磷酸盐缓冲液冲洗三次沉淀，除去任何未反应的碳化二亚胺。一旦除去未反应的碳化二亚胺完成，将上清液除去。在这个时候，沉淀约为250μl。将沉淀重新悬浮到硼酸盐缓冲液中制备2％泥浆。将2％珠子泥浆在冰浴中冷却，并间歇移动，以振荡获得单一分散度。计算加入每毫升原料2.5％泥浆0.8毫克的血纤蛋白原所需要的血纤蛋白原贮存物的体积。将活化珠用硼酸盐缓冲液稀释到加入血纤蛋白原后获得终反应物密度为1％固体泥浆的浓度。将珠子用血纤蛋白原覆盖过夜并在室温下轻柔摇晃。第二天加入每毫升原料2.5％珠泥浆0.1毫升0.25M乙醇胺。将溶液在室温下轻柔混合30分钟以阻断珠子上未反应的部位。将珠子溶液在室温下离心10分钟。保留上清液进行蛋白质确定。为了确定珠子覆盖程度，从存在于上清液中的量将初始加入血纤蛋白原的量减去。将珠子沉淀重新悬浮成含有10毫克/毫升BSA的硼酸盐缓冲液的1％泥浆。再次确定单一分散度。将珠/BAS溶液在室温下混合30分钟，并轻柔摇晃，以阻断任何残留非特异蛋白质结合位点，并冲洗掉松散结合的血纤蛋白原。将珠/BAS溶液在室温下离心30分钟。重复BSA阻断和离心步骤。将沉淀重新悬浮成含有贮存缓冲液(PBS/1％BSA/0.1％叠氮化钠/5％甘油)的2.5％泥浆。在这时候，将珠子保存在4℃或使用血纤蛋白原珠测试中。测试方案将70μl血液(1/100柠檬酸钠，从7天没有接受药物治疗的人类供体获取的)和50μl不同浓度的抗体(室温下稀释在10mM Tris/0.1％BSA中)混合，并在室温下温育10分钟。将血液/抗体混合物加入到含有20μl血纤蛋白原-覆盖的测试珠子，105μl 10mM HEPES缓冲液，和20μM凝血酶受体活化肽(Coller等人，循环系统95(4)860-867(1997))的12×75毫米的玻璃测试试管中。将试管盖上并置于速度为8g的摇晃平台上4分钟。珠子粘着在血液中呈现为中度尺寸的蓝色簇。如上面所提及的，粘着意味着GPIIb/IIIa受体没有被测试抗体阻断。
用c7E3 Fab’(PEG5,000)2进行血纤蛋白原珠测试与c7E3 Fab比较依据上面描述的测试方案，在2-倍稀释液中测试抗体，起始浓度位50μg/毫升到0.5μg/毫升。在浓度从108-868nM c7E3Fab’(PEG5,000)2阻断珠子粘着，而c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，PA)在从131-1050nM阻断。
用c7E3 Fab’(PEG20,000)2进行血纤蛋白原珠测试与c7E3 Fab比较依据上面描述的测试方案，在2-倍稀释液中测试抗体(起始浓度位50μg/毫升到0.5μg/毫升)。在浓度从143-571nM c7E3Fab’(PEG20,000)2阻断GPIIb/IIIa受体，而c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，PA)在从263-1050nM阻断。实施例IX c7E3 Fab’(PEG5,000)2在鼠中的药物代谢动力学在第0天，将测试动物(CD-1雌性鼠，体重25-30克)分配到四个治疗组中的一组中，如表1中所示。
表1
所有动物在指定时间点放血。对于所有测试组，通过眼窝窦后取血收集所有取样时间点(除最后的样品)的250μl血液，最后的样品通过心脏穿刺取样。将血液在室温下保持30-60分钟，在2500rpm离心15分钟，将血清分离并保存在-70℃，直到实施药物代谢动力学测试。鼠血清中抗体测试将C295A(Centocor鼠科动物单克隆抗＝7E3-个体基因型抗体)稀释到PBS中，5μg/毫升，并涂覆在板上(灭菌的，96-培养皿ELISA板，Corning目录#25805-96)，50μl/培养皿，在4℃温育过夜。然后将板用冲洗缓冲液(0.9％氯化钠，0.02％Tween-20)冲洗三次，每次冲洗约使用200μl/培养皿。在37℃将板用阻断缓冲液/样品稀释液(1％BSA的PBS溶液，含0.1％2-氯乙酰胺)阻断1小时，然后密封保存在4℃，在使用前温热到室温。从实际测试物质(是c7E3 Fab’NEM2，或c7E3 Fab’(PEG5,000)2)及使用直接对应使用在动物测试组中的物质(NEM＝N-乙基顺丁烯二酰亚胺)制成的50μg/毫升贮存物制成标准物。标准曲线范围从1000ng/毫升到0.95ng/毫升(在1∶2连续稀释中)。将标准物稀释到阻断缓冲液/样品稀释液中。动物血清样品也稀释到阻断缓冲液/样品稀释液中。用根据剂量和时间点估计确定的起始稀释制备每种样品的五份1∶2连续稀释液。将阻断缓冲液/样品稀释液的板空白对照加入到每块板中，三份，50μl/培养皿。标准物和样品都加在板上，三份，50μl/培养皿，并在37℃温育1小时。然后将板如上描述冲洗。然后通过加入以50μl/培养皿稀释在阻断缓冲液/样品稀释液中生物素化的C281A单克隆抗体(不与C295A竞争的Centocor鼠科动物单克隆抗-7E3个体基因型抗体)，检测由板上的C295A单克隆抗体从标准物/样品中捕获的测试物质。将板在37℃温育1小时，然后如上冲洗。将链霉抗生物素蛋白标记的山葵过氧化物酶(Amersham，产品目录#RPN.1051)稀释到阻断缓冲液/样品稀释液中，并以50μl/培养皿加入到板上，将板在37℃温育1小时。在温育步骤结束前10分钟，将OPD(o-苯二胺)片剂(Sigma，产品目录#P-8412)溶解到OPD稀释液(柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，含0.03％过氧化氢和0.1％2-氯乙酰胺)中，到1毫克/毫升。然后将板如上冲洗，将OPD底物以200μl/培养皿加入，并在室温在黑暗中显影15分钟。通过加入50μl/培养皿的4NNH2SO4终止显影。读取用从所有培养皿减去的板空白对照值在四参数符合标准物的条件下评定的每块板和样品的OD490。最接近标准曲线中点的两个稀释液是每种样品稀释液的平均。没有稀释的样品，使用较高，或较低，适当的初始稀释液重复进行。
其他适合使用在所描述的测试中的抗-7E3-个体基因型抗体可通过已知的方式制备。如，适当的宿主动物(如，鼠)可用7E3免疫接种，制备杂交瘤，通过任何适当的技术筛查，如本文所描述的那些技术。
图9演示了相对测试物质时间的血清浓度，表现出比NEM-阻断的Fab’显著增加的c7E3 Fab’(PEG5,000)2半衰期。
实施例X 鼠中c7E3 Fab’(PEG20,000)2的药物代谢动力学在第0天，将测试动物(CD-1雌性鼠，体重25-30克)分配到两个治疗组中的一组中，如表1中所示。
表2
所有动物在指定时间点放血。对于所有测试组，通过眼窝窦后取血收集所有取样时间点(除最后的样品)的250μl血液，最后的样品通过心脏穿刺取样。将血液在室温下保持30-60分钟，在2500rpm离心15分钟，将血清分离并保存在-70℃，直到实施药物代谢动力学测试。如实施例IX实施测试c7E3 Fab’(PEG20,000)2的血清含量。
图10显示了在c7E3 Fab’(PEG20,000)2的血清中增加的持续性。实施例XI 田鼠中c7E3 Fab’(PEG5,000)2的药物代谢动力学体重约350克的雄性CD1田鼠分配到四个治疗组中的一组中，如在表3中所示。
表3
动物单独称重并计算测试物质剂量。将静脉内用导管插入到侧后部静脉中并轻敲到部位中。在用药血液取样前用戊巴比妥将动物麻痹，并且在整个血液取样过程中保持麻痹状态。依据上面表中的方案，使用含16μl 40％柠檬酸钠的3毫升注射器通过心脏穿刺收集血液样品。将血液样品在注射器中转移到1.5毫升的microfuge试管中，并以10,000rpm瞬时旋转(4-5秒)到微型离心器中。富含血小板血浆(PRP)从顶部移出，将剩余血液样品在微型离心器中以10,000rpm旋转5分钟以获得贫血小板血浆(PPP)。确定PRP样品的血小板数量，并使用Coulter计数仪ZM用自体同源PPP将血小板调节到200,000到300,000个血小板/μl之间。剩余的PPP冷冻用来确定游离Fab或Fab’(PEG5,000)2的浓度。
在同时可以评定用药前，用药后10分钟和60分钟每只动物的PRP样品聚集反应的四-通道Bio/DATA APA4Caggregometer上实施血小板聚集。对于每种样品，将250μl PRP转移到硅化aggregometer透明容器内上并在没有搅拌的情况下在37℃温育10分钟。监测基线聚集信号1分钟。在每个透明容器内加入ADP(10μM)，再监测聚集反应4分钟。记录每种PRP样品的最大反应(％光透射)。使用下列等式确定用药后PRP样品相对于用药前PRP样品的对聚集的抑制作用百分比其中C＝(A-B)/A×100C＝％PRP用药后样品的聚集抑制作用A＝％PRP用药前样品的光透射B＝％PRP用药后样品的光透射如在实施例VIII中所描述的，确定Fab或Fab’(PEG5,000)2的血清含量。
图11显示Fab’(PEG5,000)2的血清含量比相应的Fab要持久，结论性地显示延长的Fab’(PEG5,000)2半衰期。
在下列表中来自体内的聚集数据显示，在血清中Fab’(PEG5,000)2延长的持续性以增加的活性持续时间反应出来。使用Fab’(PEG5,000)2的小时时的聚集作用与使用c7E3 Fab在60分钟的聚集作用相似。
表4
实施例XII 确定c7E3 Fab，c7E3 Fab’，c7E3(Fab’)2或其他类似物的结合动力学使用NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺/N-乙基-N’(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)将山羊(Fab’)2抗-人类(Fab’)2(Jackson实验室)共价固定到BIAcore CM-5(羧甲基)片上。将片用40μl依据制造商指示以10μl/分钟制备的从BIAcore获得的偶联试剂1∶1混合物活化。将10μg/毫升的(Fab’)2的10mM乙酸钠溶液，pH4.8，以10μl/分钟流经片直到2,500RU被捕获。未反应的羧基基团用40μl 1M乙醇胺注射剂盖住。使用含有2mM氯化钙，2mM氯化镁，0.01％Tween-10和25μg/毫升BSA的10mM Tris缓冲液盐水，pH7.5的存在缓冲液，c7E3 Fab，c7E3 Fab’或c7E3(Fab’)2流经固定的抗-人类(Fab’)2，以捕获500-700RU。将250μl的GPIIb/IIIa或αvβ3(从2-10μg/毫升)溶液以30μl/分钟流经捕获抗体片段，之后是800秒的不中端的解离时间。将片用连续的15μl的含0.05％CHAPS的100mM磷酸再生。使用分析缔合(ka)和解离常数(kb)的BIA评定3.0(BIAcore)分析缔合和解离相。使用ka除以kb来计算KD。列在表5中的结合常数显示用来生产c7E3 Fab PEG5,000，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2的衍生技术没有不利地影响结合。
表5
实施例XIII 与c7E3 Fab相比c7E3 Fab’(PEG5,000)2的免疫原性动物和试剂将来自Charles河实验室的两组六周大Balb/c鼠(每组八只动物)通过腹腔内(IP)注射用稀释在生理盐水(Baxter)及乳化在等体积完全Freund辅剂的100μg c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)或c7E3 Fab’(PEG5,000)2免疫接种。随后用乳化在不完全Freund辅剂的100μg c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)或c7E3 Fab’(PEG5,000)2的注射在14天后实施。在第20天，在没有抗-促凝剂的情况下通过眼窝窦后穿刺给鼠放血。将血液在室温下1小时凝结成块，收集血清。
通过固相酶结合免疫测试(EIA)测定免疫反应来评定c7E3Fab和c7E3 Fab’(PEG5,000)2的免疫原性。将10μg/毫升10mM碳酸盐缓冲液，pH9.6的c7E3 Fab以50μl/培养皿涂在96-培养皿平底EIA板上，保持在4℃过夜。用0.15M盐水和0.02％(v/v)Tween20冲洗后，在室温下将培养皿用200μl/培养皿的1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)阻断1小时。立即使用板或将板冷冻在-20℃作将来使用。
将所有的血清以1∶50稀释到PBS中并在4℃保存直到测试。将二倍稀释免疫血清在室温下(RT)以50μl/培养皿在免疫原覆盖板上温育1小时。将板冲洗，然后在室温下用50μl/培养皿以1∶20,000稀释在BSA-PBS中的山羊抗-鼠IgG，Fc特异，山葵过氧化物酶标记的缀合物探查1小时。在室温下将板再次冲洗，将100μl/培养皿的柠檬酸盐-磷酸盐底物溶液[1.0M柠檬酸和0.2M磷酸钠，0.01％过氧化氢(Sigma)和1毫克/毫升苯二胺二氢氯化物]经15分钟加入。然后加入25μl/培养皿的终止溶液(4N硫磺酸)，在Dynatech MR5000自动板分光光度仪上读取490nm的光密度。
图12显示滴定度的几何平均倒数。C7E3 Fab’(PEG5,000)2显示出比c7E3 Fab显著小的免疫原性。
实施例XIV 合成N-maleimido乙酰基-N’-棕榈酰基-PEG3,400步骤1将棕榈酰氯(80.8毫克，0.2942mM)溶解在2毫升丙酮中，并滴加入到N-叔-丁氧基羰基-PEG3,400二胺(Shearwater聚合物有限公司)(500毫克，0.1471mM)的5.0毫升嘧啶溶液中，将产物反应混合物回流三小时。减压下将嘧啶蒸发，产物油用40毫升乙基醚处理，产生白色沉淀，通过过滤移出，用醚冲洗并在减压下干燥得到554毫克白色固体物质。粗制物质通过硅胶柱层析法(Baker硅胶，40μm，急骤层析填充，玻璃柱，2×30厘米)用氯仿∶甲醇(9∶1，v/v)洗脱提纯。将组分收集，蒸发到干燥并用乙基醚磨碎。过滤出白色沉淀，用醚冲洗，在减压下干燥得到266毫克N-叔-丁氧基羰基-N’-棕榈酰基-PEG3,400[MH+3770.15(簇)]。步骤2在环境温度下，将227毫克N-叔-丁氧基羰基-N’-棕榈酰基-PEG3,400与25毫升三氟代乙酸∶二氯甲烷(1∶1，v/v)15分钟。减压蒸发溶剂，在剩余物中加入乙基醚(100毫升)。过滤出产物白色沉淀，用醚冲洗，减压干燥得到141毫克三氟代乙酸N-棕榈酰-PEG3,400胺酯。步骤3将三氟代乙酸N-棕榈酰-PEG3,400胺酯(350毫克，0.0925mM)溶解在3.5毫升四氢呋喃中，将二异丙基乙基胺(40毫升)加入调节pH到约8.0(用湿润的指示纸测定)。搅拌约10分钟后，将maleimido乙酸N-羟基琥珀酰胺酯(48毫克，0.185mM)(分子生物科学，Lot 11158)加入，将混合物再搅拌约4小时。加入二乙基醚(90毫升)产生白色固体沉淀，分离并在减压下干燥得到330毫克N-Maleimido乙酰基-N’-棕榈酰基-PEG3,400(MH+3806.89(簇))。
实施例XV 合成c7E3 Fab’(棕榈酰基-PEG3,400)2将c7E3 (Fab’)2(43.6毫克溶解于9毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入135μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反应混合物在30℃保持30分钟。加入硫酸铵(714毫克)，将反应混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸钠/0.05％EDTA，pH6.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应c7E3 Fab’的峰值。向其中加入28毫克N-maleimido乙酰基-N’-棕榈酰基-PEG3,400，反应轻柔搅拌约30分钟，得到标题化合物[MH+56,362.4(簇)]。
实施例XVI 合成c7E3 Fab’(PEG3,400)2将c7E3(Fab’)2(28.8毫克溶解于9.5毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入182μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反应混合物在30℃保持30分钟。加入硫酸铵(761毫克)，将反应混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸钠/0.05％EDTA，pH6.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应c7E3 Fab’的峰值。加入46.2毫克甲氧基-顺丁烯二酰亚胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中并在环境温度下轻柔搅拌约15小时。将反应混合物浓缩到10毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩得到9毫克产物(MH+69,832(簇))。
实施例XVII 合成c7E3 Fab’[(PEG2,000)4]2将c7E3(Fab’)2(40.1毫克溶解于9.5毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入163μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反应混合物在30℃保持30分钟。加入硫酸铵(777毫克)，将反应混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸钠/0.05％EDTA，pH6.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应c7E3 Fab’的峰值。加入50.2毫克(PEG2,000)4-顺丁烯二酰亚胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在环境温度下轻柔搅拌约2小时。将反应混合物浓缩到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(50-70％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩得到13.5毫克产物(MH+65,942(簇))。
实施例XVIII 合成c7E3 Fab’[(PEG2,000)2]2将c7E3(Fab’)2(54.3毫克溶解于10毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入342μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反应混合物在30℃保持30分钟。加入硫酸铵(756毫克)，将反应混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸钠/0.05％EDTA，pH6.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应c7E3 Fab’的峰值。加入39.3毫克[(PEG2,000)2]2-顺丁烯二酰亚胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在环境温度下轻柔搅拌约2.5小时。将反应混合物浓缩到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(50-70％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩得到15.6毫克产物[MH+57,313.5(簇)]。
实施例XIX 合成c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2将c7E3(Fab’)2(54.3毫克溶解于10毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入342μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反应混合物在30℃保持30分钟。加入硫酸铵(756毫克)，将反应混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸钠/0.05％EDTA，pH6.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应c7E3 Fab’的峰值。加入104毫克[(PEG5,000)2]2-顺丁烯二酰亚胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在环境温度下轻柔搅拌约2.5小时。将反应混合物浓缩到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(50-70％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩得到14.2毫克产物[MH+71,194(簇)]。
实施例XX 合成c7E3 Fab’(PEG2,000)2将c7E3(Fab’)2(40.1毫克溶解于9.5毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入163μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反应混合物在30℃保持30分钟。加入硫酸铵(756毫克)，将反应混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸钠/0.05％EDTA，pH6.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应c7E3 Fab’的峰值。加入20毫克PEG2,000-顺丁烯二酰亚胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在环境温度下轻柔搅拌约2.5小时。将反应混合物浓缩到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(0-100％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分钟的流速，进行60分钟的0.1M磷酸钠/0.6M硫酸铵，pH7.5到0.1M磷酸钠，pH7.5的线性梯度(50-70％)洗脱。收集对应标题化合物的的峰值，浓缩得到10.4毫克产物[MH+52,817(簇)]。
实施例XXI 对血小板聚集的抑制作用如在实施例IV中所描述的，测试c7E3，c7E3 Fab’(PEG2,000)2，c7E3 Fab’[(PEG2,000)2]2，c7E3 Fab’[(PEG2,000)4]2和c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2对血小板聚集抑制活性。这些试验的结果在图13-15中图示演示，说明增加半衰期的c7E3的化学修饰没有影响活性。
实施例XXII 确定修饰抗体的结合动力学测定结合动力学，与GPIIb/IIIa结合的速度常数和亲和力如实施例XII中计算得到。表5(实施例XII)和表6中列出的速度常数和亲和力是至少两个和多达约七个独立确定值的平均值。表5中列出的用来计算速度常数和亲和力的数据与其他数据一起来计算在表6中列出的速度常数和亲和力。表6中列出的速度常数和亲和力进一步说明，在没有不利地影响结合的情况下，可实施c7E3的位点特异修饰，而随机的修饰大大地降低了亲和力。
表6 结合常数
实施例XXIII 鼠的药物代谢动力学使用与在实施例IX和X中所描述的相同的方案实施药物代谢动力学测试。给鼠静脉内服用测试物质。在预定的时间点抽取血液，确定测试物质的血清浓度。使用3-5只鼠实施七项独立的试验。每项试验服用不同的测试物质，如下试验1，以剂量20毫克/公斤服用c7E3 Fab；试验2，以剂量20毫克/公斤服用c7E3 Fab’PEG5,000；试验3，以剂量0.6毫克/公斤服用c7E3Fab’[(PEG2,000)2]2；试验4，以剂量0.65毫克/公斤服用c7E3Fab’PEG20,000；试验5，以剂量0.56毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG2,000)2；试验6，以剂量0.75毫克/公斤服用c7E3Fab’[(PEG5,000)2]2；试验7，以剂量0.74毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG10,000)2。每项试验的结果列在表7中，显示出在静脉内服用后保留在血清中的c7E3 Fab’PEG5,000，c7E3 Fab’[(PEG2,000)2]2，c7E3 Fab’PEG20,000，c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2和c7E3 Fab’(PEG10,000)2比未修饰的c7E3 Fab保留时间长。这些试验结果还说明了c7E3 Fab’(PEG2,000)2在血清中的保留时间约与未修饰的c7E3 Fab一样长。
表7
Nd-没有确定实施例XXIV 在短尾猴体内的药效使用2-4只短尾猴实施七项独立的试验。每只动物装配有血管通路口(VAP)以获取血液样品。在安置VAP时，获取初始血液样品，并测定血小板聚集。每只动物通过静脉内注射服用单剂测试物质。每项试验服用不同的测试物质，如下试验1，以剂量0.4毫克/公斤服用c7E3 Fab；试验2，以剂量1.050毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG5,000)2；试验3，以剂量0.6毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG10,000)2；试验4，以剂量0.6毫克/公斤服用c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2；试验5，以剂量1.4毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG20,000)2；试验6，以剂量0.74毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG2,000)2。在服用测试物质前，和预定时间点收集血液，以测定血小板功能，血液学和药物代谢动力学。如在实施例IV中所描述的测定血小板聚集。如在实施例VIII中所描述的评定测试物质的血清浓度。试验的结果在表8a和表8b中列出。
试验显示，在服用c7E3 Fab后1小时血小板聚集受到96％的抑制，之后抑制作用下降迅速。一小时后在血清中测得的c7E3的量也迅速下降，与血小板聚集的抑制作用相应。当服用c7E3Fab’(PEG2,000)2时获得相似的结果，说明与未修饰的Fab相比，分子量2,000的两个线性PEG链的修饰没有增加血清持续性。相反，服用用分子量大于2,000的PEG链修饰的Fab’片段，产生延长的对血小板聚集的抑制作用和缓慢下降的抑制活性，相似地，服用一小时后，在血清中测得的用分子量大于2,000的PEG链修饰的Fab’片段的量高于未修饰的Fab’，并且血清含量下降速度较慢。
表8a 猴子体内的药效
Nd-没有确定表8b 猴子体内的药效
Nd-没有确定实施例XXV c7E3 Fab’PEG20,000如实施例III中所描述的制备标题化合物，除了用PEG20,000醛替换PEG5,000醛。
虽然本发明已进行了具体地演示及有关其较好的实施方案的描述，此领域中的技术人员会理解到，在不背离如所附权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种形式和细节的变通。
权利要求
1.一种修饰抗体或修饰抗原结合片段，其特异地结合一种或多种从下列组中选取的抗原，包括GPIIb/IIIa，αvβ3，和Mac-1，该修饰包括一个或多个与所说的抗体或抗原结合片段共价结合的有机组成。
2.依据权利要求1的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的修饰包括一个到约六个有机组成，它们每个独立地是亲水聚合物基团，脂肪酸基团，脂肪酸酯基团，脂质或磷脂。
3.依据权利要求2的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与所说的抗体或抗原结合片段的至少一个羧基末端共价结合。
4.依据权利要求3的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab。
5.依据权利要求4的修饰抗原结合片段，其中所说的Fab是非染色质肽酶片段。
6.依据权利要求3的修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成与重链的羧基末端结合。
7.依据权利要求3的修饰抗体或修饰抗原结合片段，进一步包括每个独立地与半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合的一个到约四个其他有机组成。
8.依据权利要求7的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中重链包括所说的半胱氨酰残基。
9.依据权利要求2的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与至少一个半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合。
10.依据权利要求9的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中重链包括所说的半胱氨酰残基。
11.依据权利要求9的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab’，所说的有机组成与形成链间二硫键的至少一条重链半胱氨酰残基的硫原子结合。
12.依据权利要求2的特异结合GPIIb/IIIa的修饰抗体或修饰抗原结合片段，抑制血纤蛋白原与GPIIb/IIIa的结合，抑制血小板聚集。
13.依据权利要求12的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中说的抗体或抗原结合片段特异结合αvβ3。
14.依据权利要求13的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或抗原结合片段与GPIIb/IIIa和/或αvβ3的结合受到7E3竞争地抑制。
15.依据权利要求14的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或抗原结合片段的特点在于，与未修饰抗体或抗原结合片段相比具有增加的体内血清半衰期。
16.依据权利要求15的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或抗原结合片段用与未修饰抗体或抗原结合片段基本上相同的亲和力结合GPIIb/IIIa和/或αvβ3。
17.依据权利要求16的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或抗原结合片段特点在于，与未修饰抗体相比具有降低的免疫原性。
18.依据权利要求16的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
19.依据权利要求18的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的人源化7E3或其抗原结合片段是嵌合7E3抗体或其嵌合抗原结合片段。
20.依据权利要求16的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成是亲水聚合物基团。
21.依据权利要求20的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的亲水聚合物基团是线性或支化聚烷烃乙二醇链，碳水化合物链，氨基酸链或聚乙烯基吡咯烷酮链，其中所说的亲水聚合物基团具有分子量约800到约120,000道尔顿。
22.依据权利要求21的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的亲水聚合物基团是线性或支化聚烷烃乙二醇链，具有分子量大于2,000道尔顿。
23.依据权利要求20的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的亲水聚合物基团是线性或支化聚烷烃乙二醇链，或是被烷基基团，C6-C40脂肪酸基团，C6-C40脂肪酸酯基团，脂质基团或磷脂基团取代的线性或支化取代聚乙二醇链。
24.依据权利要求23的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的亲水聚合物基团是末端被烷基基团，C6-C40脂肪酸基团，C6-C40脂肪酸酯基团，脂质基团或磷脂基团取代的线性或支化聚烷烃乙二醇链。
25.依据权利要求24的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的取代基是棕榈酰基。
26.依据权利要求23的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
27.依据权利要求23的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与所说的抗体或抗原结合片段的至少一个羧基末端共价结合。
28.依据权利要求27的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab。
29.依据权利要求28的修饰抗原结合片段，其中所说的Fab是非染色质肽酶片段。
30.依据权利要求27的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的羧基末端是重链的羧基末端。
31.依据权利要求30的修饰抗体或修饰抗原结合片段，进一步包括每个独立地与半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合的一个到约四个其他有机组成。
32.依据权利要求31的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中重链包括所说的半胱氨酰残基。
33.依据权利要求26的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与至少一个半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合。
34.依据权利要求33的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中重链包括所说的半胱氨酰残基。
35.依据权利要求34的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab’，所说的有机组成与形成链间二硫键的至少一条重链半胱氨酰残基的硫原子结合。
36.依据权利要求16的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成是线性或支化C6-C40的脂肪酸。
37.依据权利要求36的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
38.依据权利要求37的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与所说的抗体或抗原结合片段的至少一个羧基末端共价结合。
39.依据权利要求38的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab。
40.依据权利要求38的修饰抗体或修饰抗原结合片段，进一步包括每个独立地与半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合的一个到约四个其他有机组成。
41.依据权利要求37的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成与至少一个半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合。
42.依据权利要求41的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab’，所说的有机组成与形成链间二硫键的至少一条重链半胱氨酰残基的硫原子结合。
43.依据权利要求16的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成是线性或支化C6-C40的脂肪酸酯。
44.依据权利要求43的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
45.依据权利要求44的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与所说的抗体或抗原结合片段的至少一个羧基末端共价结合。
46.依据权利要求45的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab。
47.依据权利要求45的修饰抗体或修饰抗原结合片段，进一步包括每个独立地与半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合的一个到约四个其他有机组成。
48.依据权利要求44的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成与至少一个半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合。
49.依据权利要求48的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab’，所说的有机组成与形成链间二硫键的至少一条重链半胱氨酰残基的硫原子结合。
50.依据权利要求16的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成是脂质或磷脂。
51.依据权利要求50的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成分别由下列结构式表示，包括-O-CH2-CH(R)-CH2-R’和-NH-CH2-CH2-O-P(O-)(O)-O-CH2-CH(R)-CH2-R’；其中，R和R’每个独立地是-OH，或是表示为-X-Y的基团，其中-X是-O-，-O-C(O)-，-S-，-O-S(O)2-O-，-NH-C(O)-或-O-CH＝CH-，Y是饱和或不饱和的C6到约C40的烃基基团团，其中R和R’不都是-OH。
52.依据权利要求51的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
53.依据权利要求52的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中有机组成与所说的抗体或抗原结合片段的至少一个羧基末端共价结合。
54.依据权利要求53的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab。
55.依据权利要求53的修饰抗体或修饰抗原结合片段，进一步包括每个独立地与半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合的一个到约四个其他有机组成。
56.依据权利要求52的修饰抗体或修饰抗原结合片段，其中所说的有机组成与至少一个半胱氨酰残基的侧链硫原子共价结合。
57.依据权利要求56的修饰抗原结合片段，其中所说的抗原结合片段是Fab’，所说的有机组成与形成链间二硫键的至少一条重链半胱氨酰残基的硫原子结合。
58.一种抑制患者血栓症的方法，包括给所说的患者服用有效量的权利要求12的修饰抗体或修饰抗原结合片段。
59.依据权利要求58的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段的特点在于，与未修饰抗体或抗原结合片段相比具有增加的体内血清半衰期。
60.依据权利要求59的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段进一步特异结合αvβ3。
61.依据权利要求60的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段特点在于，与未修饰抗体相比具有降低的免疫原性。
62.依据权利要求60的方法，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
63.一种抑制人体内脉管干预过程后器官狭窄和/或再狭窄的方法，包括给所说的人服用有效量的权利要求12的修饰抗体或修饰抗原结合片段。
64.依据权利要求63的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段的特点在于，与未修饰抗体或抗原结合片段相比具有增加的体内血清半衰期。
65.依据权利要求64的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段进一步特异结合αvβ3。
66.依据权利要求65的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段特点在于，与未修饰抗体相比具有降低的免疫原性。
67.依据权利要求65的方法，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
68.一种预防人体内局部缺血的方法，包括给所说的人服用有效量的权利要求12的修饰抗体或修饰抗原结合片段。
69.依据权利要求68的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段的特点在于，与未修饰抗体或抗原结合片段相比具有增加的体内血清半衰期。
70.依据权利要求69的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段进一步特异结合αvβ3。
71.依据权利要求70的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段特点在于，与未修饰抗体相比具有降低的免疫原性。
72.依据权利要求70的方法，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
73.一种抑制人体内肿瘤生长和/或转移的方法，包括给所说的人服用有效量的权利要求12的修饰抗体或修饰抗原结合片段。
74.依据权利要求73的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段的特点在于，与未修饰抗体或抗原结合片段相比具有增加的体内血清半衰期。
75.依据权利要求74的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段进一步特异结合αvβ3。
76.依据权利要求75的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段特点在于，与未修饰抗体相比具有降低的免疫原性。
77.依据权利要求75的方法，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
78.依据权利要求75的方法，其中所说的修饰抗体抑制αvβ3调节的血管生成和/或血小板调节的转移。
79.一种抑制人体内由配体与表达在细胞质膜上的GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-I的结合调节的过程的方法，包括给所说的人服用有效量的权利要求2的修饰抗体或修饰抗原结合片段。
80.一种抑制人体内血管生成的方法，包括给所说的人服用特异结合αvβ3的有效量的修饰抗体或修饰抗原结合片段，修饰包括与所说的抗体或抗原结合片段共价结合的一个或多个有机组成。
81.依据权利要求80的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段的特点在于，与未修饰抗体或抗原结合片段相比具有增加的体内半衰期。
82.依据权利要求81的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段进一步特异结合GPIIb/IIIa。
83.依据权利要求82的方法，其中所说的修饰抗体或修饰抗原结合片段特点在于，与未修饰抗体相比具有降低的免疫原性。
84.依据权利要求83的方法，其中所说的抗体或片段是从下列组中选取的，包括7E3，人源化7E3，和它们的抗原结合片段。
全文摘要
公开了具有改善药物代谢动力学属性的修饰抗体。抗体与一种或多种从包括GPIIb/IIIa，α
文档编号C07K16/28GK1406138SQ99815156
公开日2003年3月26日 申请日期1999年11月2日 优先权日1998年11月3日
发明者乔治·A·海维讷, 罗伯特·W·威伯 申请人:塞恩托科公司