专利名称：肽基－脯氨酰顺反异构酶抑制剂及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及可用于治疗多种疾病的肽基-脯氨酰顺反异构酶抑制剂，包含这些抑制剂的药物组合物及其应用方法。本发明进一步描述了一个典型的肽基-脯氨酰顺反异构酶，Pin1，与一底物类似物复合或与一Pin1活性抑制剂复合的三维结构。本发明也考虑了采用这些三维结构以设计新抑制剂的合理药物设计方法。
背景技术：
随着所要抑制的酶的三维结构测定技术的出现，设计有效和特异的抑制剂的过程得到了改进。通常一个酶的三维模型是通过建立一个纯化酶的晶体形式，然后对该形式进行X线衍射和分析而产生的。虽然这一程序提供了某些可用于设计抑制剂的有价值的信息，但仍然缺乏对其氨基酸残基的了解，这些残基对于它们与底物或底物类似物的相互作用是重要的。为解决这些缺陷，最近将酶与底物、底物类似物或已知的酶活性抑制剂进行共结晶化，因此可以确定重要的相互作用(见，如，Mohammadi等，Science 276:955-960,1997；Lee等，Biochemistry36:13180-13186,1997；Brzozowski等，Nature 389:753-758,1997)。
肽基-脯氨酰顺反异构酶(PPIase)，或旋转异构体，是一个在蛋白质折叠、装配和运输中有重要作用的酶家族。它们作为催化剂促进肽基-脯氨酰键的异构化，该键能够对蛋白质功能有重要的作用。PPIase分为三类，cyclophilins、FK-506结合蛋白(FKBPs)和Pin1/小小霉素类。虽然cyclophilins和FKBPs因其分别与免疫抑制分子环孢菌素和FK-506结合的能力而得以区分，而Pin1/小小霉素类则与这些免疫抑制剂均不结合，且其结构与其他两类无关。已知的Pin1/小小霉素类成员包括Pins 1-3(Lu等，Nature 380:544-547,1996)、Pin-L(Campbell等，Genomics 44:157-162,1997)、小小霉素(Rahfeld等，FEBS Letts352:180-184,1994)、dodo(Maleszka等，Proc Natl Acad Sci USA93:447-451,1996)和Ess1/Pft1(Hanes等，Yeast 5:55-72,1989；和Hani等，FEBS Letts 365:198-202,1995)。
最近的研究证明Pin1/小小霉素类物质是细胞周期，特别是有丝分裂的基本调节者。Lu等，Nature 380:544-547,1996(引入作为参考)报道，在酵母或人细胞中去除Pin1/Ess1导致有丝分裂阻滞，进而凋亡，表明此类酶在细胞分裂和增殖中具有重要的功能。
设计新的、高度特异性的抗有丝分裂剂是药物工厂的重要需要。这种药剂可作为有效的化疗药，用于治疗以异常细胞增生为主要特征的各种疾病，包括癌症和感染性疾病。在此公开的发明解决了这一问题和相关的需求，正如将在规范综述和附加权利要求中所显现的。
发明的简要说明根据本发明，提供了抑制肽基-脯氨酰顺反异构酶，也称PPIase的方法和化合物。尤其是，发明的化合物抑制PPIase的Pin1/小小霉素类成员的活性，该类成员在细胞周期，特别是有丝分裂期中呈现重要的功能。因此，本发明的化合物可被用在药物组合物中，以治疗以异常细胞增生为特征的疾病(如癌症)和感染性疾病(如细菌感染、真菌感染)等。
在此还提供了Pin1，即一种特异的肽基-脯氨酰顺反异构酶的三维晶体结构，以及应用此结构设计Pin1活性的特异性抑制剂，及PPIase小小霉素亚家族其他成员抑制剂的方法。
插图的简要说明
图1是Pin1晶体的带状图示。
图2是Pin1晶体与底物类似物H3N+-AlaPro-COO-结合的活性部位的特写图示。
发明的详细描述根据本发明，提供了PPIase，特别是PPIase的Pin1/小小霉素亚家族成员的抑制剂。一般来说，本发明的抑制剂具有以下的结构ⅠA-X-R(Ⅰ)
其中A是一个类似磷酸丝氨酸和/或磷酸苏氨酸残基空间结构和电荷特性的基团，X是一个间隔基(spacer)，和R是一个至少与被一个亲水部分取代的四氢化吡咯环一样疏水的环状结构。
如本领域专业人员很容易认可的，多种间隔基可用在本发明的实施中，如间隔基X可选自 R可以是类似一个脯氨酰基空间结构和电荷特性的多种环状系统中的任何一个。因此，R可以是，如，环烷基、取代的环烷基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、杂环芳基、取代的杂环芳基、等。
结构Ⅰ的基团A可同样地选自类似一个磷酸丝氨酸和/或磷酸苏氨酸残基空间结构和电荷特性的多种基团。具有这些特性的合适基团的例子包括基团Ⅱ,Ⅲ，或Ⅳ，如下所示 其中Rx是一个具有分子量不超过大约250的有机基团，Ra是H、卤代或低级烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,其中每个Y均单独地选自-ORd,-COORc,-CF3,-P(O)(ORc)2,-OP(O)(ORc)2,-NH-P(O)(ORc)2,或NH-CH(CF3)2,其中每个Rc分别是氢或低级烷基，每个Rd分别是氢、低级烷基、烷基羰基，和m=1或2，或Rz-NH-(Ⅲ)其中Rz是烷基、取代的烷基环烷基、取代的环烷基、环链烯基、取代的环链烯基、环链二烯基、取代的环链二烯基、杂环、取代的杂环、单或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基，等，或Rb-取代Cy(het)-(Ⅳ)其中Cy(het)是一个5,6，或7元杂环，其中的杂环原子与结构Ⅰ的X相连，Rb如上定义。
在上述的部分Ⅱ中，有机基团Rx可以是多种取代基中的任何一个，所述取代基如烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基、环链烯基或取代的环链烯基、环链二烯基或取代的环链二烯基、杂环或取代的杂环、单或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基或取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，或Ry-Q-其中Ry是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、环链烯基、取代的环链烯基、环链二烯基、取代的环链二烯基、杂环、取代的杂环、单或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、或取代的杂芳基，和Q是-C(O)-NH-,-C(O)-O-,-C(O)-，或-O-。
特别是，当A是上面的结构Ⅱ时，Rx可以是氨基酸残基(如，一个亮氨酸基部分、脯氨酰基部分等)，也可以是 在上面的Ⅲ部分中，Rz的具体实例包括 其中Ra和Rb如上定义，或Ⅲ部分可以是(Rb,)Cy-其中Cy是环烷基、环链烯基、环链二烯基、杂环、单或多不饱和杂环、芳基或杂芳基，和Rb，是-(CRc2)0-4-CHmY3-m,其中每个Y分别为-ORd、-COORc、-CF3、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、-NH-CH(CF3)2，每个Rc分别为氢或低级烷基，每个Rd分别为氢、低级烷基或烷基羰基，和m=1或2。
目前打算用于本发明实施的优选的化合物包括以下部分A:-(CH2)2COOH；-(CH2)3COOH；-CH2CH(COOH)2；-(CH2)2CH(COOH)2；-(CH2)2CF3；-(CH2)3CF3；-CH2CH(CF3)2；-(CH2)2CH(CF3)2；-CH2COH(CF3)2；-(CH2)2COH(CF3)2；-CHCH3OPO3H2；-CHCH3NHPO3H2；-CHCH3CH2PO3H2；-CH2OPO3H2；-(CH2)2OPO3H2；-CH2NHPO3H2；-(CH2)2NHPO3H2；-(CH2)2PO3H2；或-(CH2)3PO3H2； R吡咯基，吡啶基，苯基或戊烷基。
在此所用的“烷基”是指具有高达12个碳原子的直链或支链烃基基团，“取代的烷基”包括进一步含有一个或多个取代基团的烷基基团，该取代基选自羟基、烷氧基(低级烷基的烷氧基)、巯基(mecapto)(低级烷基的巯基)、环烷基、取代的环烷基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、芳氧基、取代的芳氧基、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、硝酮、氨基、酰氨基、-C(O)H、酰基、氧酰基(oxyacyl)、羧基、氨基甲酸盐、磺酰基、磺胺、硫酰基，等。
在此所用的“链烯基”是指含有2到12个碳原子，而且含有一个或多个双键的直链或支链烃基，“取代的链烯基”包括进一步含有上述一个或多个取代基的链烯基。
在此所用的“炔基”是指含有2到12个碳原子，而且含有一个或多个三键的直链或支链烃基团，“取代的炔基”包括进一步含有如上所述的一个或多个取代基的炔基。
在此所用的“环烷基”是指含有大约3到13个碳原子的含环的环基基团，“取代的环烷基”是指进一步含有上面列出的一个或多个取代基团的环烷基。
在此所用的“杂环”是指具有3到14个碳原子的、含有一个或多个杂原子(如，N,O,S，等)作为环结构一部分的环状(即含环)基团，“取代的杂环”是指进一步含有一个或多个上面列出的取代基团的杂环基。
在此所用的“芳基”是指有6到14个碳原子的芳香基，“取代的芳基”是指进一步含有一个或多个上面列出的取代基团的芳基。
在此所用的“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子(如，N,O,S，或类似原子)作为其结构一部分、并含有3到14个碳原子的芳香基团，“取代的杂芳基”是指进一步含有一个或多个上面列出的取代基的杂芳基。
本发明的另一个方面包括使用PPIase活性物抑制剂的治疗方法。已知PPIase的Pin1/小小霉素类酶对有丝分裂是很重要的。这种酶已在细菌、真菌、昆虫和哺乳动物细胞中得到确认。因此本发明的化合物可以用于治疗涉及有丝分裂或细胞增殖的大量疾病。
计划采用本发明的化合物和在此公开的方法治疗的细胞增殖性疾病包括以有害的、不适当的或不受控制的细胞生长为特征的疾病。特殊的实例包括癌症、纤维变性疾病、非肿瘤性生长如良性前列腺肥大、子宫内膜异位、银屑病等。根据本发明考虑治疗的癌症包括，实体肿瘤和造血系统癌症如白血病和淋巴瘤。
采用本发明化合物和方法可以治疗的实体肿瘤包括癌、肉瘤、骨瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤等。预期治疗的特殊癌症包括乳癌、脑癌、肺癌(非小细胞和小细胞)、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、头颈部癌等。
纤维变性疾病一般是以非癌症性纤维母细胞的异常过度增生为特征的。实例包括纤维肌瘤、纤维化(囊性纤维化、肝纤维化、特发性肺纤维化、心包纤维化等)、心脏纤维瘤、纤维肌性增生、心瓣膜术后再狭窄、动脉粥样硬化、纤维肌炎，等。
另外本发明化合物还可以用于抑制病原生物的有丝分裂，因此可用于治疗感染性疾病。通过在此公开的方法可治疗的特殊感染性疾病包括细菌感染和真菌感染。
预期采用本发明化合物和方法治疗的细菌感染包括由革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的感染，包括由葡萄球菌、梭状芽胞杆菌、链球菌、肠球菌、双球菌、嗜血杆菌、奈瑟氏菌、丹毒丝菌(Erysipelothricosis)、李斯特杆菌、芽胞杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃希氏杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌、沙雷菌、变形杆菌、摩根氏菌、普罗威登斯菌、耶尔森菌、Camphylobacter、分支杆菌，等引起的感染。由这些生物体引起的感染可导致多种疾病，包括肺炎、腹泻和痢疾、炭疽、风湿热、中毒性休克综合征、乳突炎、脑膜炎、淋病、伤寒热、肠胃炎、布氏杆菌病、霍乱、黑死病、破伤风、结核、莱姆氏病，等。
预期用本发明化合物和方法治疗的真菌感染包括全身性真菌感染、皮肤癣病和生殖-尿道真菌感染。全身性真菌感染包括由组织胞浆菌、球孢子菌、隐球菌、芽生菌(blastocyces)、巴西类球孢子菌、念珠菌、曲霉菌、奴卡氏菌、孢子丝菌、酒曲菌、犁头霉菌、毛霉菌、单孢枝霉菌、瓶霉菌、鼻孢子虫属，等引起的感染。皮肤真菌感染包括由小孢子菌属、毛癣菌、表皮癣菌、念珠菌、糠秕癣菌属，等引起的感染。生殖-尿道真菌病包括由念珠菌、隐球菌、曲霉菌、zygomycodoides，等引起的感染。这些生物的感染可以引起许多疾病，如癣、鹅口疮、圣华金河热或球孢子菌病(山谷热)、Gilcrist氏病，等。这些感染在免疫系统抑制的病人如器官移植受者和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病人中可特别严重，甚至致命。
在本发明的另一个方面，本发明的化合物可被用作杀虫剂。本发明的化合物可阻止昆虫细胞的有丝分裂，因此可被用于控制多种虫害的生长和增殖。本发明的这个方面在农业中具有重要的用途，如在田地中、在农作物的储存中等。另外，本发明的化合物可用于控制人居住地的昆虫数量，如家庭、办公室等。
如这里所述的选作治疗用途的特定发明化合物可单独或以药物组合物给予患者，在药物组合物中，发明的化合物与合适的载体或赋形剂混合。在对患者的治疗中，给予有效治疗剂量(即活性组合物)的该化合物。有效治疗剂量是指产生症状改善或延长患者生存时间的活性组合物的量。
一个化合物的毒性和治疗效应可以通过标准的药学程序，在细胞培养或实验动物中确定。细胞培养实验和动物研究可用来确定LD50(半数致死量)和ED50(半数有效量)。毒性和治疗效应的剂量比例是治疗指数，可表述为LD50/ED50的比值。具有较大治疗指数的化合物是首选的。从这些细胞培养实验和动物实验中获得的数据可用来形成适用于人的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括ED50而很少或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内根据多种因素而变化，如所用的剂量形式、采用的给药途径、患者的状况等。
对在本发明方法中应用的任何化合物，治疗的有效剂量最初可以在细胞培养试验中通过确定IC50(即，达到PPIase活性最大抑制一半的检测物质的浓度)来估计。然后可以在动物模型中形成一个剂量，以达到包括在细胞培养中确定的IC50的循环血浆浓度范围。此信息可用来更准确的确定人的可用剂量。血浆中的水平可通过如HPLC以测定。实际的剂型、给药途径和剂量可由每个医生视病人的状况选择(见Fingl等1975在“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第一章pl)。
应该注意的是，主治医生应当根据毒性、器官功能障碍等知道何时和怎样中止、中断或调整给药。相反的，如果临床反应不够(排除毒性)，主治医生应当知道如何调整治疗到更高的水平。在目的疾病的处理中，给药剂量的程度，将根据要治疗情况的严重性、给药途径等而变化。例如，情况的严重性可部分通过标准的预后评价方法被估计。此外，剂量和可能的剂量使用频率也将根据年龄、体重和每个病人的反应而变化。一般，剂量将在大约1-10mg/kg体重间。给予儿童大约1mg到大约50mg，给予成人大约25mg到大约1000mg。与上述相似的程序可被用于兽药。
根据所要处理的特殊状况，这些药物可制成全身或局部制剂和用药。制剂和用药的技术可见于“Remington’s药物科学”1990，第18版，Mack Publishing Co.,Easton,PA。合适的给药途径包括口服、直肠、经皮、阴道、经粘膜或肠道给药；胃肠外给药，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，只列出了一些。
为注射用，本发明的化合物可配在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，如Hank’溶液、林格氏液、或生理盐水缓冲液。为经粘膜给药，剂型中采用适合所要穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂一般为本领域专业人员所熟知。
应用药学可接受的载体，以将在此公开的化合物制成适合全身应用的制剂，在本发明的范畴内。经过选择正确的载体和合适的制造方法，本发明的组合物，特别是那些制成溶液的制剂，可经胃肠外给药，如经过静脉注射。采用本领域专业人员熟知的药学可接受的载体，化合物可以容易地制成适合口服的剂型。这些载体能够使本发明的化合物制成片剂、丸剂、胶囊剂、糖衣片、液体、凝胶、糖浆、混悬液、悬液等，以供治疗的患者口服。
试图细胞内给药的药物可采用本领域普通人员已知的技术给药。如，这些药物可以包被在脂质体中，然后如上所述给药。脂质体是具有水内心的球形脂质双层体。在脂质体形成时，存在于水溶液中的所有分子掺入到水内心中。脂质体的内容物可被保护以避免外部微环境的破坏，而且因脂质体与细胞膜融合，可被有效地运输到细胞浆内。涉及脂质体的输送系统可见于国际专利出版物第WO91/02805号和国际专利出版物第WO91/19501号，以及美国专利第4,880,635 Janoff等。这些出版物和专利提供了对脂质体输送系统技术的有用的描述，并在此全部作为参考。
预期在本发明中应用的药学组合物包括其中含有效量活性成分的组合物，以达到所需的目的。确定有效的剂量是本领域专业人员能力所及的，特别是根据在此公开的细节。
除了活性成分，这些药物组合物可含有合适的药学可接受的赋形剂和辅剂，辅剂可促进活性化合物成为可药用制剂的过程。
本发明的药物组合物可以其本身已知的方式制备，如通过常规的混合、溶解、粒化、制备糖衣、研磨、乳化、密封、截留、冻干过程等。
胃肠外给药的药物剂型包括以水溶解形式的活性化合物的水溶液。另外，活性成分的悬液可以制备成适合的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油，如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬液可含有增加悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨醇、葡聚糖等。可选择的是，悬液也可含有合适的稳定剂或可以增加化合物溶解性的试剂，以可能制备高浓度的溶液。
用于口服使用的药学制剂可通过混合活性化合物与固体赋形剂获得，可选择地碾磨所得到的混合物，如果需要，加入合适的辅剂后，对颗粒的混合物进行加工以制成片剂或糖衣片核心。
特别地，合适的赋形剂是，填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄芪树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等，以及它们任何两种或两种以上的混合物。如果需要，可以加入分裂剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或它们的盐类，如海藻酸钠等。
糖衣片核心包以合适的被衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，可选择的包括阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羰乙烯胶、聚乙烯甘油、二氧化钛、紫胶漆溶液、合适的有机溶剂或溶剂混合物，等。染料或色素可以加入片剂或糖衣片被衣中，以区别或定特征于不同组合的活性化合物剂量。
可用于口服的药物制剂包括由明胶制成的推-拉式胶囊，以及由明胶和增塑剂，如甘油或山梨醇，制成的软的封口的胶囊。推-拉式胶囊可含有活性组合物，混合以填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁，和任意的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙烯乙二醇。另外，可加入稳定剂。
本发明的另一个方面包括Pin1结晶(单独或与肽基底物类似物AlaPro的复合体)，描述这个晶体的等位图和使用它们来设计PPIase活性物抑制剂的方法。Pin1晶体的产生在下面的实例中进行详述。得到的Pin1晶体每个不对称单位中含有一个Pin1分子，并属于间隔基团P43212。主要存在两种晶体形式；Ⅰ:a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90°；和Ⅱ:a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90°。晶体的等位图显示于图1和图2。
采用晶体结构数据设计酶活性抑制剂的方法在本领域中为人熟知。因此，在此提供的晶体结构数据可被用于设计新或改良酶抑制剂。如，Pin1的等位图可叠加在其他可获得的有抑制剂与其结合的类似酶的等位图上，以便得出这些和相关抑制剂可能与Pin1结合的方式。可选择的是，在合理药物设计的实践中使用的计算机程序可用来确定化合物，这些化合物可再现类似在Pin1与共结晶化底物类似物之间的相互作用。而且，对结合位点相互作用的本质的详细了解使得对化合物进行修饰，以改变或改善溶解性、药物动力学等等，而不影响结合活性成为可能。
计算机程序是广泛应用的，使得能够利用在此提供的晶体结构信息执行所必需的活动以设计化合物。实例包括，但不限于，列于下面的计算机程序Catalyst DatabasesTM-一个可访问化学数据库如BioByte Master File,Derwent WDI和ACD的信息检索程序；Catalyst/HYPOTM-产生化合物的模型并假设以用候选药物结构解释活性变量；LudiTM-通过鉴定和匹配互补极性和疏水基团将分子安装到蛋白质的活性位点上；LeapfrogTM-用一个创生计算法(genetic algorithm)采用使用者控制的下参数“生长”新的配体。
根据本发明，在Pin1底物相互作用和催化活性中重要的分子特征已被确定，这些特征已被引入本公开的化合物中。结构分析表明由Pin1残基Phe-134、Met-130和Leu-122组成的一个疏水小袋形成了底物脯氨酸疏水环侧链的结合位点，经历催化异构的肽基-脯氨酰键被Pin1残基Cys-113、His-59、His157和Ser-154的侧链所围绕。后面这些残基对称地分布在键的旋转轴周围，并在异构过程中与底物建立了构象特异的相互作用。在其他的作用中，这些相互作用在围绕肽基键的羰基碳进行旋转的过程中，帮助形成和稳定一个四面体的中间体。
最后，Pin1残基Lys-63、Arg-68和Arg-69在酶的活性部位的入口处形成一个基本的簇(cluster)。在活性位点的这些簇的空间接近于结合的二肽，表明这个阴离子识别位点优先地与底物上脯氨酸的酸性残基N末端结合。实际上，在AlaPro二肽的Ala上构型的一个谷氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸侧链将其各自的阴离子基重叠到在复杂的晶体结构中结合的硫酸盐离子上。
这些酶底物相互作用被用于选择性设计PPIase抑制剂的标准中。因此设计的本发明的化合物被包括四个基本特征1)与脯氨酸具有类似的疏水性，2)通过包含带电荷的酸性基团或三氟甲基基团代替优选的磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸，以维持酶的特异性，3)模拟在异构过程中由脯氨酰环氮设定的四面体状态，和4)维持旋转肽键的羰基部分的旋转性。
脯氨酰肽键的旋转性和几何结构已在本发明化合物中以几种方式进行了模拟。首先，为羰基取代一个次级乙醇在此部位引入了一个四面体的中心，并将化合物的羟基基团定位到结合在酶活性部位His-59或His-157上的有效氢。第二种方法利用了Cys-113假定反应性和His-157质子提供能力的优势。不象肽键有限的旋转，在此部位引入酮部分使得酮部分在酶的活性部位自由旋转。假定Cys-113和His-157侧链的定位靠近酮碳原子，有可能形成可反转的半酮缩硫醇，导致酶活性的稳定抑制。第三种方式应用了四面体模拟物，如磺胺、磷酸酯、和磷酸酰胺类似物，以代替羰基部分。
现在，本发明将参照下列非限制性的实例进行详述。
实例1-合成的方法本领域的专业人员认识到多种合成技术可以用来制备发明的化合物。如，醚可以通过采用合适的还原剂还原酯而成，还原剂如三氟化硼-三乙醚络合物或锂铝氢化物；可选择的是，醚可以通过用雷内镍还原硫代羰基酯而成；酯可通过缩合酰基卤化物和醇类而制成；醛可通过采用合适的氧化剂氧化醇类制成，氧化剂如Cu(Ⅰ)Cl加1,10-二氮杂菲；酮可通过用合适的Grignard试剂与Weinreb酰胺反应制备而成；等。
如其他的合成三氟甲基-取代化合物的实例，可容易地通过缩合一个氟化酮(如，全氟代丙酮)与胺，然后用一种合适的还原剂(如，硼氢化钠)还原得到的中间产物制备而成。
磷酸化的化合物可容易地通过用(tBuO)2PN(iPr)2加四唑处理醇或胺，然后使用合适的氧化剂，如rBu-OOH氧化得到的磷酸酯，最后用合适的酸，如三氟乙酸水解而制成。
实例2-Pin1活性抑制剂的体外实验本实例描述了三个可用于鉴定Pin1/小小霉素类酶活性的抑制剂的体外实验。
第一个实验采用从Heitman等(方法A Comparison to Methods inEnzymology 5:176-187,1993)和Kofron等(Biochemistry30:6127-6134,1991)的改进的方法，检测是否所检验的物质可以增强或抑制Pin1催化四肽底物异构作用的活性。
简单地说，在进行实验前立即将纯化的Pin1(见下面的实例4)稀释在实验缓冲液(50mM琥珀酸/二-Tris丙烷，pH7.5,100mM NaCl)中。900μl含有Pin1(终浓度为36mM)的鸡尾酒和20μM底物(琥珀酰-AlaGluProPhe-(p)-硝基苯胺，15μM(Bachem,Inc)Ala-磷酸化Ser-ProPhe-(p)-硝基苯胺(nitroanilide))和在合适稀释剂，如水、磷酸缓冲盐水(PBS)或二甲亚砜(DMSO)，中稀释的待检测物质在3.6℃下在分光光度计中平衡。加入冷却的糜蛋白酶(Sigma)溶液(100μl,1mM水溶液)，混合5秒，测定395nm处p-硝基苯胺的吸收度10分钟。含有待检测物质的实验混合物的相对吸收曲线与没有待检测物质的对照组和有抑制剂量(100～500μM)磷酸酯的对照组进行比较。
第二个实验测定被检测物质调节酵母有丝分裂的能力。这个实验描述于Lu等，Nature 380:544-547,1996中。简单说，一个单倍体essI-酵母菌株通过基因工程在Gall启动子控制下表达Pin1。此菌株在含有半乳糖的培养基(诱导培养基)中正常生长，但在含有葡萄糖的培养基(抑制培养基)中不生长，显示功能性Pin1对持续生长的绝对需要。在合适稀释剂中稀释的被检测物质以不同的浓度加入到生长在诱导培养基中的细胞中。对照细胞不加入被检测物质。经过一些时间后，检测细胞的总数量。相比对照细胞，细胞数量的减少表明被检测物质可能是Pin1抑制剂。
第三个实验测定被检测物质抑制转化细胞在软琼脂中生长的能力。实验采用转化的哺乳动物细胞，因此可以预测一种物质能用于治疗哺乳动物中细胞增殖异常，如癌症，的能力。本领域专业人员认识到，存在相似的广为人知的实验，以预测一种物质能被用作抗细菌剂或抗真菌剂的能力。
简单说，转化细胞，如卵巢癌细胞系SKOV-3(ATCC HTB77)，生长至融合(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM),20％FBS,2mM丙酮酸钠，4mM谷氨酰胺，20mM HEPES，非必需氨基酸)，胰酶消化，然后用PBS冲洗，并重新悬浮在DMEM 10％FBS,1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，10mM HEPES和非必需氨基酸中(实验培养基)。细胞然后悬浮在加0.8％SeaPlaque琼脂糖的实验培养基中，被检测物质在合适的稀释剂中稀释到不同的浓度。混合物置于一个有盖培养皿，或预铺一层加0.8％琼脂糖实验培养基底层的多孔塑料板的孔中。将细胞在100％湿度、10％CO2孵箱中孵育2-3周，之后计数大于60微米的集落数。与未加入被检测物质的细胞相比，集落数目减少表示被检测物质是Pin1抑制剂。
实例3-Pin1活性抑制剂的体内实验下面的实例描述了评价一个被检测物质抑制Pin1活性能力的体内实验。本领域专业人员应认识到，其他适合于特殊疾病的体内实验可被用来做进一步的评价。
肿瘤在无胸腺小鼠(如Balb/c,nu/nu)中生长为异种移植物的能力，为研究人类肿瘤对治疗的生物学反应提供了一种的有用的体内模型。许多种肿瘤已经成功地移植入无胸腺小鼠中(例如见Rygaard和PovlsenActa Pathol.Microbial.Scan.77:758-760,1969；Ward等，Int J Cancer49:616-623,1991)。简单说，肿瘤细胞皮下种植到5到6周的Balb/c nu/nu无胸腺雌鼠后腰。在合适媒介中的被检测物质以定期的剂量对动物给药(口服，静脉，腹膜内等等)。肿瘤细胞的生长随时间进行测量，并与没有接受任何被检测物质或仅接受媒介的动物进行比较。与对照动物相比，肿瘤大小减小提示该物质可以用作治疗细胞增殖性疾病的治疗药物。
实例4-Pin1晶体的制备和应用下面的实例描述了Pin1晶体的形成，说明了使用这些获得的信息设计Pin1/小小霉素类酶的抑制剂的方法。(也见Ranganathan等，Cell89:875-886,1997，在此以整体进行参考)。
N-末端His6标记的Pin1(Lu等，1996，前述)在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，在光密度为1.2(600nm)时，经过以0.4mMIPTG在极好的肉汤中诱导4小时后，在22℃下的表达。细胞离心成团状，在冰上重新悬浮在25mM Tris-HCL(PH8.0),500mM NaCl,10mM咪唑，10mMβ-巯基乙醇，和1％(v/v)吐温20中(超声缓冲液)。在4℃进行超声破碎作用后，可溶解的上清加载于Ni-NTA(Quiagen)柱上，并用去掉吐温20的超声缓冲液冲洗。His6-Pin被15倍床体积的去掉吐温20的超声缓冲液洗脱出，并加入250mM咪唑。洗脱出的His6-Pin1在50mMTris-HCl(PH8.0),150mM NaCl,5mMMgCl2,2.5mM CaCl2,1mM DTT,和10％(v/v)甘油4℃透析12小时的过程中用凝血酶(Sigma)消化，用苯甲脒-琼脂糖柱(Pharmacia)去除凝血酶，通过用10mMHEPES-Na+(PH7.5),100mM NaCl，和1mM DTT平衡的Superdex7516/60柱(Pharmacia)上凝胶过滤而分馏。含有Pin1的馏分用Centricon-10(Amicon)浓缩为20mg/ml并储存在-80℃。
通过混合5μl浓缩的Pin1(20mg/ml)与5μl由2.00-2.50M硫酸铵、100mMHEPES-Na+(pH7.5)、1％(v/v)PEG400(Sigma)和1mM二硫苏糖醇(DTT)(稳定剂)组成的储存液，晶体在4℃，悬浮的液滴中生长。稳定的晶体在100°K氮气的气流中冷冻。晶体每个对称单位含有一个Pin1分子，并属于间隔基团P43212。主要存在两种晶体形式；Ⅰ:a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90°；和Ⅱ:a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90°。Pin1和AlaPro二肽(APⅡ)的复合体通过将Ⅱ型晶体浸入40％(v/v)PEG400,50mM HEPES-Na+(PH7.5),50mM+H3N-AlaPro-COO-(Sigma)中4℃48小时获得。一个单一位点的TAMM(四(3-羟基-2-丁酮)甲烷，Strem Chemical,Inc)衍生物通过将Pin1晶体浸入以TAMM饱和的稳定剂(去除DTT)中4℃12小时获得。5位点PIP(二-μ-idodobis(乙二胺)-二铂(Ⅱ)硝酸盐，Strem Chemical Inc.)衍生物通过将Pin1晶体浸入添加10mMPIP的稳定剂(去除DTT)中4℃48小时获得。
晶体形式Ⅰ的天然(NatⅠ,2.05)和衍生物(2.5)数据在MacScience图象底片检测仪，DIP2020K(MacScience Corp.)上，用双重聚焦Pt/Ni-涂布的透镜和从MacScience M18XHF发生器上以4.5kW(50kV×90mA)运行产生的CuKαX线进行收集。晶体形式Ⅱ(APⅡ)的Pin1与AlaPro二肽复合体的数据在Stanford同步加速器放射研究室，beamline 7-1(λ=1.08)经MAR图象底片系统收集。数据用DENZO(Otwinowski，在数据收集和处理Data Collection andProcessing,pp55-62,1993)处理，并用SCALEPACK(Otwinowski，上面的)进行分级。TAMM衍生物的单一水银结合位点定位在同形差异Patterson图上，并用ML-PHARE进行加工。采用DM(Cowtan,Newsletteron Protein Crystallography 31:34-38,1994)来进行溶剂补偿、直方图的匹配、并采用Sayr’s方程以改善和将相位扩展到2.05的分辨率。模型的构建是用O(Jones等，Acta Crystallography A47:110-119,1991)进行，结构采用X-PLOR(Brunger,X-PLOR 3.1版X-线结晶学和NMR的系统(New Haven,Conn.:Dept.of Mol.Biophysics and Biochem.andHoward Hughes Med.Inst.,Yale University,1992))加工。初始的天然模型(NatⅠ，残基6-39,45-163)在使用6.0到2.05分辨率之间的所有数据(无sigma截止)部分解决构型(加入60个水分子)后进行加工。随后，Pin1:AlaPro复合体(APⅡ)采用NatⅠ模型作为在X-PLOR中刚性体加工的起始点来解决。在定位和模仿的退火加工后，208个水分子，2个PEGs分子，1个硫酸盐离子和一个顺式AlaPro二肽被构型，并用X-PLOR采用在6.0到1.35分辨率之间的所有数据进行加工。结晶学的数据在表1中进行总结。
表1．结晶学数据的总结数据收集的统计
用不规则散点统计的多种同形替代
精确统计
aRsym=3h｜Ih-<Ih>｜/3hIh，其中<Ih>是对其对称和Friedel等价物的反射h的平均强度bFriedel对未被合并。因此，单一和测定的反射数目反映了这种非等价性。
c相能=3｜Fhc‖/3‖Fpo｜exp(iφc)+Fhc｜-｜Fpho‖，其中Fhc=重-原子结构因子，并且｜Fpo｜和｜Fpho｜分别是蛋白质和重原子衍生物观察到的振幅，φc是实验相。
d指标数=｜P(φ)exp(iφ)dφ/｜P(φ)dφ，其中P是φ,pase角的概率分布。
eR因子=3h(｜Fo(h)-Fc(h)｜)/3hFo(h)，其中Fo(h)和Fc(h)分别是反射h的观察和计算的结构因子振幅。自由R因子是以类似的方式为从未用于求精的5％数据计算的。R因子是以剩余95％的测量数据进行计算的。两种值均是用无sigma截止计算的。
为了确定潜在的蛋白-蛋白相互作用的表面，第ⅰ个残基的有关保存的、暴露于溶剂的疏水性程度定量测定为参数aⅰ，定义如下aⅰ=(守恒指数)ⅰ(片断的溶剂可达到性)ⅰ(疏水指数)ⅰ。
因为其作为蛋白-蛋白相互作用表面的功能必要性，经常维持溶剂暴露的疏水片段的突出。对于来自序列的每一个Pin1残基的片断，根据其来源于酵母、Ess1的功能同源性，指定保留指数，这里指数取0为不保留，0.5为化学保留和1为同等。对于每个残基的溶剂可进入的表面区域采用CCP4程序RESAREA(Collaborative ComputationalProject,Number4 (1994) Acta Cryst.D5°,760-763,“CCP4Suite蛋白质结晶学的程序”)计算，并除以总表面积以给出片断溶剂进入性。疏水指数是在内部与表面(P/Po)发现一个给定残基的可能性的比例，并计算为 其中自由能进行标准化以使 (Miller 等，J.Mol Biol.196:641-656,1987；Creighton，蛋白质结构和分子特性，NY:W.H.Freemean and Co.1993)。aⅰ的值绘在一个彩色刻度上并采用GRASP(Nicholls等，Proteins 11:281-296,1991)显示在一个代表Pin1分子的表面上。
为进一步确定关键结合位点的相互作用，采用PCR为基础的技术引入位点的直接突变体并通过自动测序仪进行鉴定。相应的蛋白如上所述进行表达和纯化。PPIase的活性通过由Heitman等，方法酶学方法的比较5:176-187,1993和Kofron等，(1991)上面的，改良的方法进行测定。纯化的Pin1在进行动力学测定前立即用实验缓冲液(在指定PH值下的50mM琥珀酸/二-Tris丙烷，100mM NaCl)稀释。900μl含有Pin1和15-20μM底物的混合物在3.6℃在分光光度计上进行平衡。加入冷的糜蛋白酶(Sigma)溶液(100μl,1mM水溶液)，混合5秒，在2-10分钟内，每6秒测定P-硝基苯胺的吸收度(在395nm处)。总的吸收度在获取数据前立即调零，底物浓度调整到保留在仪器的线性范围之内。数据采用Excel7.0(Microsoft Corp.)和Origin4.1(Microcal Software)共同进行脱机分析。每根曲线的PPIase速率限制的部分很好的符合1-aebt的单指数衰减函数，其中a和b是自由参数。通过标准的x2分析可计算出吻合良好性。为进行无机磷酸抑制实验，加入1M储存液为指定浓度的磷酸钠缓冲液(PH7.0)。底物肽来自Bachem公司。
从这些实验中获得的数据用来构建一个Pin1底物结合的3维模型，并阐明Pin1特异性和活性的相互作用关键部位。这些信息反过来可用于抑制剂的设计。
尽管前面所述已经引用了本发明的特定实施方案，被本领域专业人员所认同的是对这些实施方案所作的改变并不脱离本发明的基本原则和精神，以及所附权利要求所确定的范围。
权利要求
1．一种抑制肽基-脯氨酰顺反异构酶活性的方法，所述的方法包括用有效剂量的具有下面结构的化合物与异构酶接触A-X-R(Ⅰ)其中A是类似一个磷酸丝氨酸和/或磷酸苏氨酸残基的空间和电荷特性的基团，X是一个间隔基团，和R是一个至少象由一个亲水部分取代的四氢化吡咯环一样疏水的环状结构。
2．根据权利要求1的方法，其中肽基-脯氨酰顺反异构酶是小小霉素/Pin1类的。
3．根据权利要求1的方法，其中肽基-脯氨酰顺反异构酶调节细胞周期的一部分。
4．根据权利要求3的方法，其中被调节的细胞周期部分是有丝分裂。
5．根据权利要求1的方法，其中肽基-脯氨酰顺反异构酶是哺乳动物的。
6．根据权利要求1的方法，其中的肽基-脯氨酰顺反异构酶是Pin1。
7．根据权利要求1的方法，其中结构Ⅰ的化合物类似四面体中间物，该中间物涉及Pin1介导的肽基-脯氨酰异构作用。
8．根据权利要求1的方法，其中结构Ⅰ中的A是具有以下结构的基团Ⅱ 其中Rx是一个分子量不超过大约250的有机基团，Ra是H、卤素或低级烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每个Y分别是-ORd,-COORc,-CF3,-P(O)(ORc)2,-OP(O)(ORc)2,-NH-P(O)(ORc)2,-NH-CH(CF3)2,每个Rc分别是氢或低级烷基，每个Rd分别是氢、低级烷基或烷基羰基，和m=1或2。
9．根据权利要求8的方法，其中Rx是烷基、取代烷基、环烷基或取代的环烷基、环链烯基或取代的环链烯基、环链二烯基或取代的环链二烯基、杂环或取代的杂环、单或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基或取代的芳基、杂芳基或或取代的杂芳基，或Ry-Q-其中Ry是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、环链烯基、取代的或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、或取代的杂芳基，和Q是-C(O)-NH-,-C(O)-O-,-C(O)-，或-O-。
10．根据权利要求9的方法，其中Rx是一个氨基酸残基。
11．根据权利要求10的方法，其中所述的氨基酸残基是一个亮氨酸基部分，或脯氨酰基部分。
12．根据权利要求8的方法，其中Rx是
13．根据权利要求1的方法，其中结构Ⅰ中的A是具有以下结构的基团ⅢR2-NH-(Ⅲ)其中Rz是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、环链烯基、取代的环链烯基、环链二烯基、取代的环链二烯基、杂环、取代的杂环、单一或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、或取代的杂芳基。
14．根据权利要求13的方法，其中Rz是 其中Ra是H，卤素或低级烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每个Y分别是-ORd、-COORc、-CF3、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、NH-CH(CF3)2，每个Rc分别是氢或低级烷基，每个Rd分别是氢、低级烷基或烷基羰基，和m=1或2。
15．根据权利要求13的方法，其中Rz是(Rb,)Cy-其中Cy是环烷基、环链烯基、环链二烯基、杂环、单或多不饱和杂环、芳基或杂芳基，和Rb，是-(CRc2)0-4-CHmY3-m，其中每个Y分别为-ORd、-COORc、-CF3、、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、-NH-CH(CF3)2，每个Rc分别为氢或低级烷基，每个Rd分别为氢、低级烷基或烷基羰基，和m=1或2。
16．根据权利要求1的方法，其中结构Ⅰ中的A是具有以下结构的基团ⅣRb-取代Cy(het)-(Ⅳ)其中Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每个Y分别是-ORd、-COORc、-CF3、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、NH-CH(CF3)2,每个Rc分别是氢或低级烷基，每个Rd分别是氢、低级烷基或烷基羰基，和m=1或2，和Cy(het)是一个5、6、或7元杂环，其中的杂环原子与结构Ⅰ的X相连。
17．根据权利要求1的方法，其中X选自
18．根据权利要求1的方法，其中的R是环烷基、取代的环烷基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基。
19．根据权利要求18的方法，其中R是一个5-7元的环。
20．一种具有以下结构的化合物A-X-R(Ⅰ)其中A是类似一个磷酸丝氨酸和/或磷酸苏氨酸残基的空间和电荷特性的基团，X是一个间隔基团，和R是一个至少象由一个亲水部分取代的四氢化吡咯环一样疏水的环状结构。
21．根据权利要求20的化合物，其中结构Ⅰ中的A选自如下的基团Ⅱ，Ⅲ或Ⅳ 其中Rx是一个分子量不超过大约250的有机基团，Ra是H、卤素或低级烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每个Y分别是-ORd,-COORc,-CF3,-P(O)(ORc)2,-OP(O)(ORc)2,-NH-P(O)(ORc)2,-NH-CH(CF3)2,每个Rc分别是氢或低级烷基，每个Rd分别是氢、低级烷基或烷基羰基，和m=1或2，或R2-NH-(Ⅲ)其中Rz是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、环链烯基、取代的环链烯基、环链二烯基、取代的环链二烯基、杂环、取代的杂环、单一或多不饱和杂环或取代的单或多不饱和杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、或取代的杂芳基，或Rb-取代的Cy(het)-(Ⅳ)其中Cy(het)是一个5、6、或7元的杂环，其中的杂环原子与结构Ⅰ的X相连，和Rb如上定义，X选自 R是环烷基、取代的环烷基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基、或取代的杂芳基。
22．一种药学组合物，包含根据权利要求20的化合物和一种药学可接受的载体。
23．一种治疗患病状态的生物体的方法，所述的方法包括给予所述的生物体有效剂量的根据权利要求22的组合物。
24．根据权利要求23的方法，其中所述的患病状态是真菌疾病。
25．根据权利要求24的方法，其中所述的真菌疾病是妇产科感染或皮肤科的感染。
26．根据权利要求25的方法，其中所述的感染真菌是酵母。
27．根据权利要求23的方法，其中所述的患病状态是细菌感染。
28．根据权利要求27的方法，其中所述的细菌感染是大肠杆菌感染或链球菌感染。
29．根据权利要求23的方法，其中所述的患病状态是细胞增殖性疾病。
30．根据权利要求29的方法，其中所述的细胞增殖性疾病是肿瘤细胞增殖性疾病或非肿瘤细胞增殖性疾病。
31．根据权利要求30的方法，其中所述的肿瘤细胞增殖性疾病是实体肿瘤、淋巴瘤或白血病。
32．根据权利要求30的方法，其中所述的非肿瘤细胞增殖性疾病是纤维化。
33．根据权利要求30的方法，其中所述的非肿瘤细胞增殖性疾病是良性的前列腺肥大、子宫内膜异位症或牛皮癣。
34．一种组合物，该组合物包含晶体形式的Pin1。
35．根据权利要求34的组合物，还包括Pin1的底物、底物类似物或抑制剂。
36．根据权利要求34的组合物，该组合物由如图1中列出的X射线等位图描述。
37．根据权利要求34的组合物，其中所述的晶体有单斜晶的间隔基团P43212，其单位晶格尺寸Ⅰ∶a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90；或Ⅱ∶a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90。
38．根据权利要求35的组合物，由如图2中列出的X射线等位图描述。
39．根据权利要求35的组合物，其中所述的晶体有一个单斜晶的间隔基团P43212,其单位晶格尺寸Ⅰ∶a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90；或Ⅱ∶a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90。
40．一个鉴定肽基-脯氨酰顺反异构酶抑制剂的方法，所述的方法包括a)确定在肽基-脯氨酰顺反异构酶和其底物或底物类似物之间相互作用的点；b)选择与所述的肽基-脯氨酰顺反异构酶有相似相互作用的化合物；和c)检测所选择的化合物抑制肽基-脯氨酰异构酶活性的能力。
全文摘要
本发明涉及肽基－脯氨酰异构酶(PPIase)活性抑制剂和含有这种抑制剂的药物组合物。这些化合物可用于治疗以异常细胞增生为特征的疾病。特别是这里所公开的化合物可抑制肽基－脯氨酰异构酶的Pinl/小小霉素族成员的活性。这些化合物是根据高分辨率X线得到的人Pinl酶晶体结构设计的。
文档编号C07F9/00GK1311671SQ99809376
公开日2001年9月5日 申请日期1999年6月4日 优先权日1998年6月9日
发明者J·P·诺埃尔, T·R·享特 申请人:索尔克生物学研究所