专利名称：针对蛋白激酶基因的反义核酸的抑瘤作用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及抑制人体肿瘤细胞生长的寡核苷酸，具体地讲涉及抑制人体肿瘤细胞生长的针对PKC-α的反义寡聚脱氧核苷酸及含有所述寡核苷酸的组合物，以及将所述寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明所阐述的寡核苷酸，其碱基排列顺序与人体蛋白激酶C-同功酶(PKC-α)基因的一段序列互补，这些寡核苷酸可在细胞内特异地与人体PKC-α基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交，从而阻止PKC-α基因编码的PKC-α激酶的表达，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。
蛋白激酶C基因家族至少由十个功能相关的同功酶组成，他们是一组丝氨酸-苏氨酸激酶，与细胞表面起始的信号传导过程有关(Nishizuka，Y.Science，258607-614，1992.Asaoka，Y.Trends Biochem.Sci.17414-417，1992)激活多种多样的细胞内应答。
经典意义上的蛋白激酶C(α、βI、βII、γ)和新发现的蛋白激酶C(δ、ε、η、θ)由1，2-DAG(1，2-diacylglycerol)激活。而1，2-二酰基丙三醇由磷脂酶二酰基丙三醇酶解细胞膜磷脂而产生。磷脂酶是由很多生长因子和激素来调节的，因此，蛋白激酶C在调节正常细胞分化和增殖方面具有重要作用。
研究结果亦证明PKC在(如发生于肿瘤发生和细胞癌化过程中)细胞异常增殖中的作用，这些结论主要由研究小鼠模型得来。
如由phorobolester长期激活皮肤内的PKC基因表达导致角质化细胞快速生长，结果导致良性的鳞状上皮细胞癌。
另外，由激活的V-rasHa转染的角质化细胞，转化表型过程中需要PKC的功能参与，说明原癌基因ras的一些作用需要PKC信号通道介导(Dlugosz，A.Cancer Res，546413-6420，1994)。
在细胞株中稳定的过量表达不同亚型的PKC亦可引起不可调控的生长，正向和负向效应均有。例如将PKC-βI和PKC-γ转染成纤维细胞造成细胞生长速度加快，可不贴壁生长。而在大肠细胞株中表达PKC-β，则造成细胞生长抑制(Choi，P.L.Mol.Cell.Biol，104650-4657，1990)。在MCF-7乳腺癌细胞中过量表达的PKC-α导致产生一种侵润性更强的肿瘤类型，呈现更快的增殖速度，不贴壁生长，在裸鼠体内成瘤能力增强(Ways，D，K.J.Clin，invest，951906-1915，1995)，这些研究证实了不正常的PKC调控可对很多种细胞的生长转化造成深远影响。
人类肿瘤的证据也表明PKC在一些肿瘤的生长过程中起重要作用。据报道，依肿瘤类型的不同，PKC表达水平有增有减(Aflalo，E，Int，J.Cancer，50136-141，1992)。一种理论认为，糖尿病性肥胖通过1，2-二酰基丙三醇激活PKC表达，而与大肠癌的发生相关。其过程是特异的细菌在肠腔中将脂转化为1，2-二酰基丙三醇，1，2-二酰基丙三醇进入大肠上皮，导致激活PKC基因的表达。这可以导致大肠组织细胞长期的增殖速度加快。(Weinstein，B.I.Cancer Res.51(suppl)5080s-5085s，1991)。
以上关于PKC在肿瘤发生中所起作用的研究结果使人们设想将PKC基因作为发展肿瘤治疗用药的靶点。随后，为筛选发展该酶功能的抑制剂作出很多的努力。筛选出很多分子，其中大多数是作用于酶分子的活性部位或调节点位点，人们希望这些分子可以作为抗癌药物发挥与现存抗癌药不同的药物机理，希望这些分子可以产生细胞生长抑制而不产生细胞毒性，可是很大的不利点在于这些化合物虽然有时对PKC是特异的，但很少显示具有不同PKC亚型的选择能力。不同PKC亚型在肿瘤发生和生长调控方面的不同作用最近才开始被研究探索，结果揭示大多数PKC亚型同功酶在肿瘤发生过程中不起重要作用。因此，不加区分地抑制所有PKC同功酶的药物可能造成对与肿瘤发生无关的PKC同功酶的抑制，从而产生很多不希望产生的副反应。
有一种特异抑制某种酶产生的手段是采用反义核酸来抑制其活性。反义核酸通过与互补的mRNA杂交，由很多种机制抑制mRNA表达蛋白质。因为反义核酸可特异性的结合目标的mRNA，可以设计出一种反义核酸来抑制与肿瘤发生有关的某一种PKC亚型同功酶的mRNA。高度的特异性选择亦可使之不产生目前其它药物所产生的副作用。
本发明在培养细胞中筛选出对PKC-α特异的反义核酸，设计其结合于PKC-α亚型基因的mRNA的3’端非翻译区，显示出对PKC-αmRNA表达蛋白质的抑制，目前研究显示，其可抑制肿瘤生长。
本发明的目的之一是提供一种反义寡聚脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，其特征在于可特异性结合PKC-α基因mRNA的不同区域。
本发明的另一目的是提供含有本发明寡核苷酸的药物组合物。
本发明的另一目的是提供了本发明寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明设计了一系列可以结合于PKC-α基因的mRNA的不同区域的反义核酸分子，在培养细胞中筛选对PKC-α基因表达特异性抑制的反义核酸，培养细胞采用A549细胞设立阴性对照P23一个，阳性对照Pac14c、Pac47两个，所有进行筛选的反义核酸分子长度均为20个核苷酸残基，筛选结果表明，其中七个反义核苷酸均具有不同程度的抑制人体肿瘤细胞生长的特性，将它们分别定名为Pac40、Pac41、Pac42、Pac43、Pac44、Pac45、Pac46，其中Pac42具有最高的抑制人体肿瘤细胞生长的活性。
具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的PAC系列寡聚反义核酸碱基组成及顺序如下所示PAC405’-GAA AAC GTC AGC CAT GGT CC-3’20merPAC415’-AGG ATT CAC TTC CAC TGC GG-3’20merPAC425’-CAG ACA CAA GCC GTG GCC TT-3’20merPAC435’-CCT ACA ATT TTC AGG CCT CC-3’20metPAC445’-AGA GAG ACC CTG AAC AGT TG-3’20merPAC455’-CAC TAA GAT AAT GTI CTT GG-3’20merPAC465’-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3’20mer设立阳性对照两个，是PAC14c和Pac47，其序列如下所示PAC14c5’-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT-3’20merPAC47 5’-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3’20mer设立阴性对照一个为PAC23，其序列如下所示PAC235’-CAC GGT GCG TCG ACG CAC TA-3’20mer以上所设计的反义核酸均是长度为20个核苷酸残基并经过硫代修饰的寡聚核苷酸，攻击目标为人体蛋白激酶C-同功酶(PKC-α)基因的信使核糖核酸(mRNA)，这段反义核酸可以在细胞质中与PKC-α基因的信使核糖核酸(mRNA)特异性结合，阻止PKC-α的产生，从而阻断了PKC-α基因编码的PKC-α激酶的表达，最终达到抑制肿瘤生长的作用。所设计的反义核酸片断是通过与PKC-α(目标基因)的mRNA的特异性杂交来发挥其特有的生物学特性。从目前来看，核酸杂交中RNA与mRNA的杂交亲和力比DNA与mRNA杂交的亲和力要高，在医学药用价值上具有很高的地位，但是由于人工合成DNA又远远比合成RNA的成本要低的许多。根据医药市场的需要以及临床应用的成本要求，目前在临床应用试验的反义核酸药物均为寡聚脱氧核酸(DNA)。合成的RNA成本居高不下，可能在将来成本会有所降低，有希望在临床上应用合成的寡聚核糖RNA和核糖RNA单体与脱氧核糖DNA单体嵌合相连而成的反义核酸作为进行新药开发。
本发明设计的反义核酸药物，其序列具有特异性生物学活性，其对于某一基因互补的位点的反义核酸所互补的长度有很大关系，如互补的长些，则生物学活性则会高一些，治病的效果会好一些，但人工合成反义核酸的成本就会增加，这样就不符合反义核酸作为药用的目的，此发明均采用经过筛选的20个碱基长度的反义核酸序列，在增加或减少一个至数个碱基而互补于同一基因位点的反义核酸，同样也会具有不同程度的生物学活性，也可达到不同程度的治病作用。同时互补于相同基因位点附近的反义核酸结合部位有不同程度的重叠，这样可以认为具有不同程度的序列同源性，也同样具有不同程度的相同生物学活性。
现在反义核酸研究中，各种化学修饰方法很多，之所以采用硫代修饰的反义核酸，主要是硫代的反义核酸的药理学、药代动力学、毒理学等临床前研究是各种化学修饰反义核酸中研究最为全面的，硫代反义核酸在体内可以有效的防止人体内大量核酸外切酶对反义核酸的酶切而降解，从而使反义核酸失去应有的生物学活性。此外硫代反义核酸还可激发RNA酶的活性，降解与其杂交的RNA链，因此选用硫代修饰的反义核酸在临床试验中应用。在临床应用中，经过不同化学修饰的特定设计的反义核酸都具有不同程度的生物学活性。
综上所述，本发明所述的互补于PKC-α基因mRNA不同部位的反义核酸具有抑制人体肿瘤细胞株生长的特性，在临床上治疗肿瘤具有很广泛的应用价值。经过化学修饰筛选出不同长度和不同程度同源性的反义核酸序列，发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。可以将本发明的反义核酸与药用载体结合，用于动物(包括哺乳动物和人)。所用的药用载体可为磷酸盐缓冲液(PH7.4)以及其它常用的载体和缓冲液。图例说明
图1反义核酸Pac系列对PKC-α基因表达的抑制的核酸杂交(Northernblot)结果的照片。
将A549细胞株分为对照组(无处理)和反义核酸处理组，在含10％的胎牛血清HAM’s S/F-12培养液中培养，培养至细胞总数为10万时，将细胞培养液换成无血清培养液，除对照组外其余组加入20μg/ml的脂质体和终浓度为800nM的不同序列的硫代反义核酸处理5小时，再换成普通培养基，恢复20个小时，然后用RNAzol B提取细胞总的RNA进行PKC-α基因mRNA定量分析。用PKC-α基因的探针及G3PDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的探针与经电泳分离并转移到硝酸纤维膜上的细胞总RNA样品进行核酸杂交(Northern blot)分析，以G3PDH基因的mRNA作为内部参照，结果如图1所示。
图中一个(0)样品为无处理空白对照，23号样品为阴性对照，其他为不同的Pac系列的反义核酸样品，8.5k.b、4.0k.b分别表示PKC-α基因的两种转录产物。图中可见Pac系列反义核酸对PKC-α mRNA的不同的抑制活性，以Pac42的抑制程度最高。
图2反义核酸Pac系列对人体肿瘤细胞株A549生长抑制。
将A549细胞分为空白组、阳性对照组、阴性对照组和Pac系列反义核酸处理组。分别用含10％胎牛血清的HAM’s S/F-12培养液中培养至细胞总数为10万时，换成无血清培养液，除空白外，其余组均分别加入20μg/ml的脂质体和终浓度为800nM的各自不同的反义核酸处理5小时，换成正常含10％的胎牛血清的培养液，在37℃继续培养。48小时后进行细胞计数，用MTT法测定细胞生长程度。以空白组数值为100％，作出细胞生长抑制图，从图中可见，黑色柱体代表针对PKC-α基因的阳性对照反义核酸结果，浅黑色柱体为阴性对照反义核酸的结果，其余的浅灰色柱体为针对PKC-α基因的系列反义核酸的结果。其中，Pac47为针对PKC-α的基因的阳性对照反义核酸结果，图中的Pac系列的反义核酸对细胞生长均有不同程度的抑制，其中，以Pac42抑制程度最高。
实施例1反义核酸攻击靶位目标的确定及反义核酸的合成。
选择PKC-α基因的不同位点，设计反义核酸分子。
使用美国PE公司应用生物系统部(Applied Biosystems)制造的391-04型DNA-RNA合成仪。以亚磷酸酰胺固相合成硫代的所设计好的反义核酸。
合成原料购自美国Glen公司，主要原料有四种二异丙基β-氰乙基亚磷酰胺单体腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)。
四种控制孔径玻璃粉(CPG)固相合成柱(A、C、G、T)规模为10微摩尔。
盖帽物试剂盖帽试剂A乙酸酐、二甲基吡啶、四氢呋喃盖帽试剂B一甲基咪唑、四氢呋喃硫代反应试剂Beaucage试剂、乙腈脱三苯甲基试剂三氯乙酸、二氯甲烷液体试剂乙腈、三氯甲烷合成规模为10微摩尔，碱基单体溶于无水乙腈中，浓度为100毫摩尔，其它试剂浓度及用量均按照仪器手册进行。
合成过程仪器本身可以用程序控制。
合成产物用浓氨水(28％)切割下来收集在密封耐压的玻璃瓶中，于55℃处理15小时脱去反义核酸分子上各种碱基保护基团和氨基保护基团。脱保护结束后，挥发大部分脱去大部分氨气冻干得白色粉末状粗品，重新溶于缓冲液中，用Pharmacia Source 30Q层析柱及AKTA层析系统进行纯化，纯化样品用G-15分子筛葡聚糖凝胶层析柱除盐，冻干得白色絮状反义核酸纯品。储存于-30℃取少量样品进行如下分析1、用毛细管电泳法测其纯度及分子量；2、用高效液相层析法测其纯度；3、DNA测序法测定其序列准确度；4、P31NMR(核磁共振)法测定其硫代程度；毛细管电泳法及高效液相法纯度分析结果显示Pac系列反义核酸纯品纯度均大于90％。
序列测定证明Pac系列反义核酸序列与设计序列相同。
P31NMR分析显示Pac系列反义核酸硫代率大于98.5％。
实施例2针对PKC-α的Pac系列反义核酸在培养细胞中对PKC-α基因表达的抑制选用人体肺癌细胞株A549作为筛选实验用细胞株，参照Miwa.W等的文献(Miwa.W.et，al.1994 Biological Chemistry Lioppeseyler，375(10)705-709)。将试验分组为空白无处理组、阴性对照组、阳性对照组、反义核酸处理组每组细胞均接种在含10％胎牛血清的HAM’s S/F-12培养基中，培养至细胞总数至10万时，换为无血清培养基，除空白无处理组外，其余组加入浓度为20μg/ml的脂质体和终浓度为800nM的不同种的反义核酸，处理5小时，然后换成正常培养基继续培养20小时，用RNAzol提取细胞总RNA，进行电泳分离，用PKC-α基因的探针及G3PDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的探针与经电泳分离并转移到硝酸纤维膜上的细胞总RNA样品进行核酸杂交(Northern blot)分析(Sambrook.J，et.Al Molecular CloningA Loboratory Manual.2nd.ed ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。以G3PDH基因的mRNA作为内部参照。核酸杂交的结果由Pharmacia Image Master扫描仪定量得出。以无处理对照组细胞的PKC-α mRNA含量为100％，结果如图1所示，图中，一个(0)样品为无处理组，Pac23为阴性对照反义核酸，Pac14c和Pac47为针对PKC-α基因的为阳性对照反义核酸，其余为Pac系列的反义核酸，从图中可清楚地看到反义核酸Pac系列针对PKC-α基因的表达均具有不同程度的抑制活性，其中以Pac42的抑制活性为最高。
实施例3Pac42的化学组成结构参照Nucleic Acids Research.1995，Vol24，No2.P4219-4223的方法对Pac42进行序列测定，结果如下PAC425’-CAG ACA CAA GCC GTG GCC TT-3’与设计序列一致，以毛细管电泳法测定Pac42的分子量，结果为6363，与理论分子量6372近似相等。
Pac42是20个脱氧核苷以磷酸硫脂键相连的反义核酸，其攻击的靶向目标是PKC-α基因的mRNA。
实施4MTT法测定反义核酸Pac系列对人体肿瘤细胞株A549生长的抑制将A549细胞分为空白组、阳性对照组和Pac系列反义核酸处理组，分别在含10％的胎牛血清的HAM’s S/F-12培养液中培养至细胞总数为10万。换成无血清培养液，除空白组外，其余组均分别加入20μg/ml的脂质体和终浓度为800nM的各自不同的反义核酸处理5小时，换成正常含10％的胎牛血清的培养液，在37℃继续培养。48小时后进行细胞计数，用MTT法测定细胞生长程度。以空白组数值为100％，作出细胞生长抑制图，从图中可见，黑色柱体代表针对PKC-α基因的阳性对照反义核酸结果，深灰色柱体为阴性对照反义核酸结果，其余的浅灰色柱体为针对PKC-α基因的系列反义核酸结果，其中Pac47为针对PKC-α基因阳性对照反义核酸结果，图中的Pac系列反义核酸对细胞生长均有不同程度的抑制，其中Pac42抑制程度最高。
实施例5含反义核酸的药物组合物作为动物体内给药的反义核酸药物组合物组成如下反义核酸Pac42 10mg/ml一水合磷酸一氢钠 1.73mg/ml七水合磷酸氢二钠 14.33mg/ml氯化钠4.4mg/ml注射用水 适量本发明中其中几种反义寡聚核苷酸也采用同样配方。
勿用赘言，本发明的反义核酸具有很大的可能通过不同的化学修饰，采用不同的长度和不同程度同源性的序列发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。单独使用或与其它药物联合使用进行肿瘤病的治疗，这些对在本领域的普通技术人员看来是显而易见的。序列表(1).一般情况(iii).序列总数7(1).第1号序列情况(i).序列特征(A).长度20碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第1号序列Pac40GAA AAC GTC AGC CAT GGT CC20(2).第2号序列情况(i).序列特征(A).长度20碱基(B).类型核酸
(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第2号序列Pac41AGG ATT CAC TTC CAC TGC GG 20(3).第3号序列情况(i).序列特征(A).长度20碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第3号序列Pac42CAG ACA CAA GCC GTG GCC TT 20(4).第4号序列情况(i).序列特征(A).长度20碱基
(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第4号序列Pac43CCT ACA ATT TTC AGG CCT CC20(5).第5号序列情况(i).序列特征(A).长度20碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第5号序列Pac44AGA GAGACC CTGAAC AGTTG 20(6).第6号序列情况(i).序列特征
(A).长度20碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第6号序列Pac45CAC TAA GAT AAT GTT CTT GG20(7).第7号序列情况(i).序列特征(A).长度20碱基(B).类型核酸(C).链接单链(D).构型线性(ii).分子类型脱氧核酸(iv).是否反义核酸是(xi).序列说明第7号序列Pac46GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA20
权利要求
1.一种寡聚反义脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，其特征在于可特异性结合人体蛋白激酶C-α(PKC-α)基因的不同区域，所述寡核苷酸序列选自1.PAC405’-GAA AAC GTC AGC CAT GGT CC-3’2.PAC415’-AGG ATT CAC TTC CAC TGC GG-3’3.PAC425’-CAG ACA CAA GCC GTG GCC TT-3’4.PAC435’-CCT ACA ATT TTC AGG CCT CC-3’5.PAC445’-AGA GAG ACC CTG AAC AGT TG-3’6.PAC455’-CAC TAA GAT AAT GTT CTT GG-3’7.PAC465’-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3’及其同源序列。
2.权利要求1中的反义寡核苷酸，其中所述同源序列与序列1-7有至少70％的同源性。
3.权利要求1中的反义寡核苷酸，其中所述同源序列与序列1-7有至少80％的同源性。
4.权利要求1中的反义寡核苷酸，其中所述同源序列与序列1-7有至少90％的同源性。
5.含有权利要求1中的反义寡核苷酸序列及可药用载体的药物组合物。
6.权利要求1的寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。
全文摘要
本发明阐述用化学方法合成一系列特异的反义寡核苷酸,其碱基排列顺序与人体内PKC－α基因的一段序列互补。这些寡核苷酸可以在细胞内特异地与人体PKC－α基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交,从而阻止PKC－α基因编码的PKC激酶的表达,达到抑制肿瘤细胞生长的作用,这些反义寡核苷酸可用来发展成为抑制人体肿瘤生长的药物。
文档编号C07H21/00GK1268514SQ9910316
公开日2000年10月4日 申请日期1999年3月24日 优先权日1999年3月24日
发明者胡前进 申请人:杭州赛狮生物技术开发有限公司北京分公司