中药何首乌有效成分的提取分离方法

文档序号:3524954阅读:5501来源:国知局
专利名称:中药何首乌有效成分的提取分离方法
技术领域
本发明是关于中药何首乌有效成分的提取分离方法,具体说是关于中药何首乌中的有效成分2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙(2,3,5,4’-tetrahydroxystiblene-2-O-β-D-glucoside,以下简称二苯乙烯甙)的提取分离方法,属于中药领域。
何首乌是一种常用中药,对于何首乌的研究已有许多文献报道,其中对何首乌有效成分的提取分离方法,也有一些文献记载。由于二苯乙烯甙是何首乌的主要有效成分之一《药物分析杂志》,何首乌的质量研究,1987,7(4),第238-239页,因此,常将二苯乙烯甙作为含何首乌药物的质量控制指标《药物分析杂志》,何首乌的质量研究,1984,4(1),第28-31页。为此,实际工作当中需要提取分离纯度高的二苯乙烯甙作为对照品。特别是在含何首乌的药物开发研究当中,如何提高何首乌当中有效成分二苯乙烯甙的提取分离纯度,简化提取工艺,是制剂工艺研究过程的关键环节之一。尽管已有文献报道过何首乌中二苯乙烯甙的提取方法《中草药》,何首乌化学成分的研究,1993,24(3),115-118,但是,该方法使用的是低压柱,要求有一定的设备。由于以往的提取工艺路线复杂,对设备要求较为严格,不适合于工业化大规模生产。
本发明目的是提供一种分离何首乌有效成分的新工艺,即提取分离何首乌有效成分2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙(即二苯乙烯甙)的新工艺。
本发明的工艺方法步骤如下1.总提取物的提取取何首乌块根25Kg,粉碎机磨成细粉,加入浓度为60-90%(浓度以70%为最好)的乙醇20000ml,浸泡48小时后,滤取药液。药渣加入浓度为60-90%(浓度以70%为最好)的乙醇13000ml,浸泡12小时后滤取药液。用同样的方法先后进行5-8次(以5次为最好),提取药液合并,药渣弃去。提取液水浴加热,减压浓缩,水浴温度60-90℃(以80℃为最好)。每日将浓缩物取出一次,合并浓缩液80℃水浴,挥至无醇味,得稠膏3300g。
2.二苯乙烯甙粗品的制备(乙酸乙酯部分)可用以下两种方法制备二苯乙烯甙粗品
(1)取稠膏100g,加水600ml,80℃水浴加热搅拌分散,放冷后抽滤,滤液加入500ml乙醚萃取一次。水层用乙醚-乙酸乙酯(9∶1)萃取8次,前两次为500ml,后六次为300ml,各次萃取液合并浓缩,得到固体物3.5g,主要含二苯乙烯甙,可供继续分离纯品。水层继续用乙酸乙酯萃取四次,每次300ml,萃取液合并,无水Na2SO4脱水,减压浓缩至干,得到乙酸乙酯提取部分共14.6g。
(2)将稠膏加水分散后,直接用乙酸乙酯进行萃取,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯提取部分。
以上的两种方法均可以获得何首乌有效成分的乙酸乙酯提取部分,优选使用第二种方法,该方法较简便。
3.二苯乙烯甙的分离初步分离方法硅胶干柱层析。硅胶用青岛海洋化工厂生产的粗硅胶160-200目,100℃活化2小时,干后装柱,用量1.5Kg。取乙酸乙酯提取物9.35g,用少量溶剂(丙酮、甲醇、乙酸乙酯等溶剂均可,以丙酮-甲醇3∶2为最好)溶解,再用5倍量的硅胶拌匀,挥干溶剂,干法上样。洗脱剂乙酸乙酯-甲醇(8∶2或9∶1或单-乙酸乙酯,以8∶2为最好)进行干柱层析,待溶剂前沿到达底部时,放干溶剂进行切割(等分切割或按色带切割),我们按色带由下至上切割共十份,各份用甲醇或丙酮洗脱(以甲醇为最好),洗脱物用薄层层析检查,薄层条件乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1),其中第3份和第4份含二苯乙烯甙量较高,合并,洗脱液浓缩减压至干,得到二苯乙烯甙粗品3.6g,为微黄色粉末4.二苯乙烯甙的精制采用如下方法对微黄色二苯乙烯甙粗品进行精制减压柱层析(简称VLC)吸附剂为粒度小于200目的硅胶,以薄层硅胶H为最好(生产厂家青岛海洋化工厂)。用量70g。用少量丙酮溶解二苯乙烯甙粗品3.6g,4倍量160-200目硅胶拌匀,挥干上样。洗脱剂依次采用不同浓度的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,每份200ml,减压抽干。我们采用的梯度为50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70、25∶75、20∶80、15∶85、10∶90、5∶95、0∶100,以上梯度为最好,把第10份、第11份洗脱液减压浓缩,抽干得到淡黄色粉末2.93g。
5.纯度及结构测定用高效液相法检查纯度。仪器Waters510泵,U6k进样阀,490E可变波检测器,745型积分仪。SGE公司25μl可调进样器,检测灵敏度0.05AUFS,Φ12mm、Φ0.45mm微孔滤膜(有机系,大连化物所),乙腈为色谱纯试剂,其余试剂均为分析纯。色谱柱Bondclone C18 3.9mm×300mm,10μm。流动相甲醇-乙腈-水(5∶1∶9),紫外检测λmax 323nm,进样量20μg,出峰时间(RT)7min,停止时间20min,纯度为98.48%。
紫外光谱,用日本日立公司U-2000型紫外分光光度计测定,λmaxnm(Logε)(EtOH)215(4.36),311(4.41),323(4.42)。
旋光测定,用PE-241旋光仪测定,〔α〕D19℃=+54(C,0.705mg/ml,Me2CO)。
质谱用GAB HS质谱仪测定,FAB-MS M/Z 407(M+1)。
红外用Nicolet FTIR-5DX型红外光谱仪测定,IRνcm-1:3402,1697,1605,1510。
核磁共振用VIRIAN GEMINI 300核磁共振仪测定,1HNMR(300MHz(CD3)2CO)δ3.4-3.8(6H,m,糖上H),4.5(1H,d,J=7.5Hz,糖上C1-H),6.28(1H,d,J=2.8Hz,C4-H),6.63(1H,d,J=2.8Hz,C6-H),6.83(2H,d,J=8.6Hz,C2’,6’-H),6.92(1H,d,J=16.5Hz,β-H)7.50(2H,d,J=8.6Hz,C3’,5’-H),7.76(1H,d,J=16.5Hz,α-H)。
13NMR(75MHz(CH3)2CO)δ62.06(C-6”),70.63(C-4”),75.05(C-2”),77.54(C-5”),77.62(C-3”),102.12(C-1”),103.37(C-4),107.74(C-6),116.26(C-3’,5’),121.58(C-1),128.96(C-2’,6’),129.49(C-1’),130.16,133.23,(C-α,β),151.61(C-3),155.83(C-5),158.12(C-4’)。
以上波谱数据与文献报道一致,结构如下;
本发明方法与以往的提取方法相比具有如下优点1、本发明方法快速简便提取何首乌,自分离出乙酸乙酯部位后,通过快速层析,当天即能达到纯品分离。而以往文献报道均在两次以上不同吸附剂反复层析,有的用低压柱,要求有一定的设备。本发明方法基本上可作到产业化生产。
2、本发明方法制备的产品纯度高,98%以上可作定量分析的对照品,以往文献报道的方法中均未涉及纯度,有的文献报道中描述的产品形状为淡褐色,可见其纯度甚差。
实施例取何首乌块根25Kg,粉碎机磨成细粉,加入浓度为70%的乙醇20000ml,浸泡48小时后,滤取药液。药渣加入浓度为70%的乙醇13000ml,浸泡12小时后滤取药液。用同样的方法先后进行5次,提取药液合并,药渣弃去。提取液水浴加热,减压浓缩,水浴温度80℃。每日将浓缩物取出一次,合并浓缩液80℃水浴,挥至无醇味,得稠膏3300g。
将稠膏加水分散后,直接用乙酸乙酯进行萃取,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯提取部分。
用青岛海洋化工厂生产的粗硅胶160-200目,100℃活化2小时,干后装柱,用量1.5Kg。取乙酸乙酯提取物9.35g,用少量丙酮-甲醇(3∶2)溶解,再用5倍量的硅胶拌匀,挥干溶剂,干法上样。洗脱剂乙酸乙酯-甲醇(8∶2)进行干柱层析,待溶剂前沿到达底部时,放干溶剂进行等分切割,我们按色带由下至上切割共十份,各份用甲醇洗脱,洗脱物用薄层层析检查,薄层条件乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1),其中第3份和第4份含二苯乙烯甙量较高,合并,洗脱液浓缩减压至干,得到二苯乙烯甙粗品3.6g,为微黄色粉末。
减压柱层析(简称VLC)吸附剂为粒度小于200目的薄层硅胶H(生产厂家青岛海洋化工厂),用量70g。用少量丙酮溶解二苯乙烯甙粗品3.6g,4倍量160-200目硅胶拌匀,挥干上样。依次采用梯度为50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70、25∶75、20∶80、15∶85、10∶90、5∶95、0∶100的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂,进行梯度洗脱,每份200ml,减压抽干。把第10份、第11份洗脱液减压浓缩,抽干得到淡黄色粉末2.93g。经检测为目标物2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙,纯度为98.48%。
权利要求
1.何首乌有效成分的分离提取方法,其特征在于该方法包括如下步骤a、乙醇提取何首乌,得到何首乌的醇提物稠膏;b、将稠膏加水溶解,用乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,得到乙酸乙酯提取部分;c、以柱层析法初步分离二苯乙烯甙;d、以减压层析法精制二苯乙烯甙;得到有效成分2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于所说的乙醇提取何首乌是以60-90%的乙醇提取5-8次。
3.根据权利要求1的方法,其特征在于步骤b中将稠膏加水溶解后先分别用乙醚和乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,水层继续用乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯提取部分。
4.根据权利要求1的方法,其特征在于步骤c中采用硅胶干柱层析,洗脱剂为乙酸乙酯-甲醇。
5.根据权利要求4的方法,其特征在于洗脱剂的浓度比为8∶2。
6.根据权利要求4的方法,其特征在于进行干柱层析时,待溶剂前沿到达底部时,放干溶剂进行等份切割十份,各份用甲醇洗脱。
7.根据权利要求6的方法,其特征在于洗脱物用薄层层析检查,薄层条件为乙酸乙酯-甲醇-水以20∶2∶1洗脱,保留第3和第4馏份。
8.根据权利要求1的方法,其特征在于步骤d中的吸附剂为粒度小于200目的硅胶。
9.根据权利要求8的方法,其特征在于所说的洗脱剂梯度浓度为50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70、25∶75、20∶80、15∶85、10∶90、5∶95、0∶100。
10.根据权利要求1的方法,其特征在于步骤d中的洗脱剂采用不同浓度的石油醚-乙酸乙酯,进行梯度洗脱。
全文摘要
本发明公开了何首乌有效成分2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖甙的提取分离新工艺,该方法是对何首乌进行提取,自分离出乙酸乙酯部位后,通过快速层析,当天即能达到纯品分离,所得产品纯度高,98%以上可作定量分析的对照品。本发明方法基本上可作到产业化生产。
文档编号C07H15/203GK1215728SQ98120290
公开日1999年5月5日 申请日期1998年10月14日 优先权日1998年10月14日
发明者陆蕴茹, 邓巧红, 刘斌 申请人:北京中医药大学
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