人源化抗人fas抗体的利记博彩app

专利名称：人源化抗人fas抗体的利记博彩app
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本发明涉及人源化抗人Fas抗体，该抗体能够识别Fas抗原及编码这种抗体的DNA。本发明还涉及制备含有这种抗体的药物，该药物可用于治疗特别包括自身免疫性疾病和风湿病在内的疾病，制备的药物还可选择性地含有一种生长抑制剂。此外，本发明涉及改进了的制备人源化抗体产品的方法。
免疫球蛋白(IgG)由分子量约为23，000KD的两条轻多肽链(L链)和分子量约为50，000KD的两条重多肽链(H链)组成，H链和L链均由一个重复区构成，该重复区由约110个保守氨基酸残基组成。这里将这一部分称作“区域”，并构成了IgG的基本三维结构单位。H链包括4个连续区域，L链包括2个连续区。
当比较抗体氨基酸序列时，发现H链和L链的氨基末端区比其它区域更易变化。因此称作可变区域(V区域)。H和L链的可变区通过互补性相互联系形成了IgG分子氨基末端的可变区。其它有关区域构成恒定区。对于特定种而言，恒定区的序列是特征性的。例如，鼠IgG的恒定区和人IgG恒定区是不同的，人的免疫系统将鼠IgG分子认作外源蛋白。用鼠IgG分子对人受试者给药会导致产生人抗鼠抗体反应(下文称作“HAMA”)[Schroff等(1985)，癌症研究，45，879-885]。因此，不能重复用鼠抗体对人受试者给药，为了用药的有效性，必须对抗体进行修饰以避免HAMA反应，但是仍要保持抗体的特异性。
对X射线晶体衍射数据的分析表明免疫球蛋白的折叠通常形成一个含有两层反向平行β-折叠的长柱状结构，每一层由3条或4条β链组成。在一个可变区内，H和L链可变区的三个环状结构聚集成簇以形成一个抗原结合位点。每一个环状结构被称作互补决定区(“CDR”)。CDR的氨基酸序列具有最大的可变性。可变区的非CDR部分被称作“构架区”(“FR”区)且通常起维持CDR结构的作用。
Kabat和同事们根据序列的保守性[E．A．Kabat等，免疫目的蛋白序列，第5版，NIH出版，No．91-3242]，对一些H和L链的可变区的一级序列进行了比较并确定了推定的CDR或构架区在分类学上的位置。而且，他们将拥有共同氨基酸序列的构架区分到几个亚型中。他们还鉴定了于小鼠和人序列之间相对应的构架区。
对IgG分子的结构特征进行研究，从而发现了制备不会引起HAMA反应的人源化抗体的方法，如下所述。
最初的建议是直接制备一种嵌合抗体，即通过把小鼠抗体的可变区连接到人抗体的恒定区上。[Morrison，S．L．，等，(1984)，美国科学院学报美国81，6851-6855页]。但这样的嵌合抗体仍然含有许多非人氨基酸残基，仍然能引起HAMA反应-特别是在给药的延长期更是如此。[Begent等，(1990)，海外癌症杂志，62，第487页以及下列等等]。
后来建议仅把CDR片断移植到人抗体中，以便进一步减少会引起HAMA反应的非人氨基酸序列的数目[Jones，P．T等，(1986)，自然，321，522-525]。但是，通常发现仅移植CDR区不能有效的保持免疫球蛋白抵抗抗原的活性。
根据X-射线晶体衍射数据，Chothia和同事们[Chothia等，分子生物学杂志，196，901-917]确定1) 一个CDR有一个与抗原结合有关的区域以及一个与保持CDR自身结构有关的区域。可根据CDR的三维结构特性将其分为几类(规范结构)；而且2) 规范结构的分类不仅由CDR序列而且由构架区特定位点的氨基酸性质来确定。
因此，建议CDR-移植技术也应涉及把构架区的某氨基酸残基移植到人抗体骨架中[Queen等，日本临时专利出版物No．4-502408]。
在上文中，由非人哺乳动物抗体中得到的用于移植的CDR在下文中称作‘供体’分子。待移植CDR到其中的人抗体在下文中称作‘受体’分子。
在实施CDR-移植的过程中，CDR区的结构应当完好的保留下来并且要保持免疫球蛋白分子的活性。因此，与下列因素有关1) 受体的亚组；和2) 从供体构架区转移的氨基酸残基的特性。
Queen和同事们[Queen等，日本临时专利出版物No．4-502408]提出了一种人源化抗体的方法，即将供体构架区的氨基酸残基随CDR序列一起移植到受体分子中，前提是这些残基靠近CDR，或者是受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置，而供体中的相应氨基酸被普遍发现于受体的那个位置。
免疫球蛋白M(“IgM”)通常由10个H链和10个L链以及位于分子中心的连结链(“J链”)组成。象IgG一样，鼠的IgM有恒定区，因此不能用它对人体重复给药。所以，如果将IgM分子作为人用药物制剂，那么移植CDR是必须的。
虽然一个IgM分子通常以五聚体和一个J链的形式存在，但它也能以没有J链的六聚体形式存在[Davis，等，生物化学杂志，(1992)，267，(25)，18002-18007]。据报道，这种没有J链的IgM六聚体的互补结合活性有所提高[Davis，等，欧洲免疫学杂志，(1988)18，1001-1008]。但是，以前认为J链的存在对于保持IgM的结构以及保持该分子的免疫球蛋白活性是必须的。目前知道没有J链的IgM分子仍保持了原来的活性。
已知在自然过程中活体细胞的生理死亡是细胞程序性死亡，与细胞的病理死亡-即坏死相区别[参见Kerr等，(1972)，海外癌症杂志。26，239以及下列等等]。细胞程序死亡是编程细胞死亡的一个例子，某些细胞被预先编程并在自然发生过程中在活体中死亡，好象这些细胞在执行预先确定的功能。细胞程序性死亡是以形态学的变化为特征的，如弯曲的细胞表面，还有凝聚的核染色质以及断裂的染色体DNA。
在T和B淋巴细胞分化的过程中，细胞程序死亡在除掉能够识别自身抗原的细胞时起了很重要的作用。所谓自身免疫性疾病的发生一般是由在淋巴细胞分化过程中未能发生细胞程序性死亡而导致出现自反应性淋巴细胞所引起的。[参见Keiichi Nakayama等，(1995)，Mebio 12(10)，79-86]。
Fas是一种与免疫竞争性细胞的细胞程序死亡有关的细胞膜分子[Itoh，N．，等，参见下文]。已经用小鼠单克隆抗体来生产人Fas抗原[Yonehara，S．，等，(1989)，实验医学杂志，169，1747]。这些抗人Fas抗体在人体细胞中有诱导细胞程序死亡细胞毒素活性的作用并且已经在治疗艾滋病和肿瘤等自身免疫性疾病中被建议用作有潜力的医疗制剂[日本临时专利出版物Nos．2-237935和5-503281]。
风湿症，特别是类风湿性关节炎被认为是滑膜细胞增生的结果，并伴随有各种各样的免疫学紊乱现象。滑膜细胞增生的典型特征是伴随有炎性细胞浸润和骨糜烂。急性类风湿性关节炎所累及的关节周围组织糜烂显然是由炎性滑膜细胞的细胞因子异常产生所引起的。检查风湿病人的关节会发现滑膜细胞的异常增殖，滑膜绒毛增生，多层状滑膜细胞等等。[参见Daniel J．McCarty(1985)，“类风湿性关节炎及相关症状，风湿病学教材”第10版，Lea和Febiger]。目前常用的治疗风湿症的方法包括用象类固醇和免疫调节剂一类的抗炎药物。任何能抑制滑膜细胞异常增生的制剂都可用于风湿症的治疗。
风湿症中，滑膜细胞并非以无限制的形式增生[参见Daniel J．McCarty(1985)，“类风湿性关节炎及相关症状，风湿病学教材”第10版，Lea和Febiger]，并且已经证明风湿症病人的滑膜细胞会发生细胞程序性死亡。Fas抗原在滑膜细胞膜上表达而且Nakajima等人[Nakajima，T等人(1995)，类风湿性关节炎。38，485-491]和Aono等人[日本风湿病学会第38届会议文摘(1994)，第487页，以及日本癌症学会1994年会议论文，(1994)，第388页]对细胞毒素抗人Fas抗体能否诱导风湿症病人异常增生滑膜细胞的细胞程序死亡进行了研究。与用含有来自患其它疾病而不是风湿症的患者的滑膜细胞所作的对照组相比较，这类抗体可高水平地诱导风湿症患者异常增生滑膜细胞的细胞程序死亡。
这样，抗人Fas抗体不仅能够选择性地诱导淋巴细胞的细胞程序死亡而且能够诱导异常增生的滑膜细胞的细胞程序死亡，所以可将抗人Fas抗体用作抗风湿症制剂。
已经获得了几种鼠抗人Fas单克隆抗体[例如，Yonehara，S．，等，(1989)实验医学杂志169，1747-1756；科学，(1989)，245，301-305]。而且，如上所述，据报道，这样的抗体可在体外诱导风湿症患者滑膜细胞的细胞程序死亡[参见日本风湿病学学会第38届会议(1994)文摘第487页，日本肿瘤学学会1994年年会(1994)会议论文第338页]。但是，对制备人源化抗人Fas抗体-不论是IgG或IgM都从未做过报道。而且，从未有过成功地制备没有J链但能够诱导细胞程序死亡的人源化抗人Fas免疫球蛋白的有关报道。
例如，为了人源化鼠抗人Fas单克隆抗体，必须选择要移植到人抗体受体中的可变区的氨基酸序列。该氨基酸序列理应包括推测的CDR序列以及FR序列的选择的氨基酸残基。
当设计一个人源化抗体时，选择一个受体中的亚型通常用两种方法中的一种1) 用来自于相同已知的人抗体重链和轻链，或2) 使用来自不同的人抗体的重链和轻链，它们与供体链具有高的序列同源性，或享有共有序列，而同时维持受体链亚型的组合。
由于天然发生的亚型组合的数量有限，所以以前一直用上述准则(2)。被认为对保持天然发生的组合是重要的。
本发明的目的是提供一种用于人类医疗的抗人Fas抗体。本发明的另外一个目的是提供一种使潜在的HAMA反应最大程度降低的抗体人源化的方法。
我们现在惊奇的发现，既没有必要保持亚型的天然结合，也没有必要用来自相同抗体的H和L链。对受体H和L链的选择可仅根据供体和受体构架区的同源性通过人抗体一级序列库获得而不考虑亚型的结合。这种选择方法已经成功地用于生产一种抗人Fas抗体。
因此，首先一方面本发明提供了一种生产含有至少一条轻链和一条重链的人源化抗体的方法，该方法包括的步骤有a 选择至少有一个CDR的非人抗体b 选择一条人抗体的重链c 选择一条人抗体的轻链d 至少将非人抗体重链的一个CDR引入人抗体重链，从而形成一条重组重链；并且e 至少将非人抗体轻链的一个CDR引入人抗体重链，从而形成一条重组轻链；其中对每一条人抗体的重链和轻链选择仅仅取决于其分别与非人抗体的重链和轻链的同源性。
本发明的其它目的，目标，方面和实施方案将在下面做清楚的说明。

图1所示为克隆编码CH11亚基的全长DNA而构建的cDNA文库。图2所示为对编码CH11亚基的全长DNA的克隆。图3所示为对H链测序的策略。图4所示为对L链测序的策略。图5所示为制备VL-KY和VL-KF DNA片断的第一步PCR。图6所示为制备VL-KY和VL-KF DNA片断的第一步PCR。图7所示为制备VL-KY和VL-KF DNA片断的第二步PCR。图8所示为pHκKY2-58和pHκKF2-19质粒的构建。图9所示为制备VL-RY和VL-RF DNA片断的第一步PCR。图10所示为制备VL-RY和VL-RF DNA片断的第二步PCR。图11所示为pHκKY2-10和pHκKF2-52质粒的构建。图12所示为MEC DNA片断的制备。图13所示为pMEC22质粒的构建。图14所示为制备VH1234 DNA片断的第一步PCR。图15所示为制备VH1234 DNA片断的第二步PCR。图16所示为制备VH1234 DNA片断的第三步PCR。图17所示为pMEHC20质粒的构建。图18所示为制备HUMFR5’DNA，HUMFR3’DNA，MOUFR5’DNA和MOUFR3’DNA片断的第一步PCR。图19所示为制备HUMFR2 DNA，MUFR2 DNA片断的第二步PCR。图20所示为pHFR3和pHFR4质粒的构建。图21所示为制备HHC123 DNA片断的第一步PCR。图22所示为制备HHC123 DNA片断的第二步PCR。图23所示为制备HHC123 DNA片断的第三步PCR。图24所示为质粒pMECW5的构建。图25所示为质粒pHCμH和pHCμM的构建。图26所示为制备FASAIC DNA片断的第一步PCR。图27所示为制备FASAIC DNA片断的第二步PCR。图28所示为phFas-AIC2质粒的构建。图29显示了用酶联免疫吸附法对Fas结合活性的测定。图30显示了用酶联免疫吸附法对Fas结合活性的测定。图31显示了对HPB-ALL细胞内细胞毒性的测定。
用本发明可构建最低限度引发HAMA反应同时仍有显著抗体效应子功能的的人源化抗体。
这里所用的术语‘序列同源性’是指DNA序列同源性或氨基酸序列同源性。术语‘同源性’是指两个序列的相似性，而且在现有技术中是有标准的。我们建议序列同源性为氨基酸序列同源性。可用多种方法中的任一种对氨基酸序列进行评估，通常涉及到用序列数据库的计算机检索。这些方法是本领域技术人员所公知的。我们也建议对同源性进行评估要涉及构架区的全长。
本文在涉及到抗体时所用的术语“人”，指的是任何预计基本不会或不会引发人受试者免疫原性反应的抗体，所说的受试者是个体或人群。
一般地，为了保持抗原决定部位结合区，建议最好将来自给定抗体的所有CDR的都移植到一个受体抗体中。但是，本发明也设想了需要或适于将少于全部CDR数目移植到供体中的情况。
我们特别建议将所有来自于非人抗体的CDR移植到人抗体中。而且，我们建议将构架区的某些部分掺入到受体抗体(这里也称作人抗体)中以保持非人识别位点的三维结构。根据下面的准则，象构架区一类的区域典型的含有选择出的对这些区域很重要的各个氨基酸残基。特别建议将那些在人体中稀有但是在相关的非人抗体中通常含有的残基，以及那些很可能直接和抗原决定部位或识别位点发生反应的残基与CDR的残基一同移植。
当移植CDR的残基时，通常的情况是非人CDR完全替代了一个相关的人CDR，特别是在两者的长度相同时。但是，有时也发生仅一部分人CDR被取代，或者仅一部分非人CDR被移植的情况，且两种情况通常同时发生。也有可能一个CDR比另一个大，但无论如何我们都极力主张保持构架区的完整性，而不是如上述进行取代。
也应理解，一般用非人抗体的CDR的残基替代人抗体的相应的CDR的残基。但是，有可能把已经去除了人抗体链CDR区的骨架人轻链或重链作为受体。这种情况下，可将人抗体的CDR区引入人链中以前被原有人CDR区残基占有的位置。
也应当清楚人重链和轻链既没有必要来自于相同的人抗体，甚至也没有必要来自相同的类。重要的是所选择的受体的序列要尽可能同非人抗体的序列相匹配。两条链(轻／轻或重／重)要相匹配的重要性在于使合成出来的抗体有一个尽可能与原来非人抗体识别位点相似的位点，从而保证最好的结合。这样，本发明也设想了用不是最接近的匹配序列的可能性，这时能合理的预见到所合成的重组抗体可满足要达到的目的。
应当理解，在这里所讨论的抗体的相似情况在适当的时候可用于编码突变体的任何核酸序列。
仅仅以序列同源性为基础而没有其它限制的选择方法使供体和受体在FR区至少拥有70％的相同氨基酸成为可能。同已知方法相比较，采用这种方法能够减少移植的供体氨基酸的数量，这样就能最少诱导HAMA反应的发生。
生于从抗体的一级序列来预测其三维结构的技术(本文以后称作“制作分子模型”)的精确性是有限的，所以应当理解那些很少在供体亚型中出现的氨基酸残基的作用是无法完全弄清楚的。已知的方法，比如Queen和同事们[Queen等，上文]所用的方法不能说明为何在这样的位置从供体或受体中选择氨基酸残基。仅以序列的同源性为基础对受体分子进行选择能够大大降低对这种选择类型的需求。
这里所用的术语“重组”指的是任何用遗传工程方法获得的物质，范围包括对原始物质进行了修饰的物质，或以不同的方式表达或者在不同于原始系统的系统中表达的物质。
这里所用的术语“抗体”是公知的现有技术，并且对本发明来说，抗体的性质不是十分重要的。如果蛋白实际上对应于一个抗体类型，抗体可相应于任何抗体类型。例如，该抗体可以是IgG，IgM，或IgE，并且类型可完全取决于例如给药途径等。可以预料抗体重链的可变区包括从一个抗体亚型得到的人序列，而轻链的可变区包括一个从不同的抗体亚型得到的序列。而且，本发明可提供一种不能自发产生的重链和轻链相结合的抗体。
虽然可预料到可将该抗体制成抵抗任何抗原的抗体，本发明中我们仍然优选有抗-Fas活性的抗体。我们特别优选的分子是一个有抗-Fas活性的IgM分子。实际上，我们也发现如果用形成5个重链和轻链对的五聚体抗体结构的一个没有J链的IgM型构建物，那么相对于有J链的分子，其细胞程序性死亡的活性会提高。
术语“重链”和“轻链”是现有技术中已知的。可以预料所用的这些术语未必指全长链，仅有的要求是本发明的重组抗体分子能够保持抵抗抗原的活性，优选的是抵抗Fas抗原的活性。
我们优选的从非人抗体中得到的氨基酸序列可使该抗体与某抗原发生交叉反应，而因此含有一个CDR区或一个相应于CDR区的区域。可以预料，可将一个或更多的CDR区与人抗体序列相连结。我们特别优选的是每一个重链和轻链含有3个从相同的非人抗体中得到的CDR区。
非人区抗原可从任何有可能产生抗体的来源中获得。虽然从小鼠中获得抗体最方便，但是从其它来源-如大鼠和兔子中也可获得。我们建议用从小鼠CH11中得到的与人Fas抗体反应的非人抗体作为主要的CDR区。
我们优选的从人抗体中得到的氨基酸区主要包括抗体的构架区(“FRs”)。另外，该抗体的恒定区或恒定区的一部分应当存在。
FR区存在于免疫球蛋白H或L亚基的可变区中。例如，FRH1指的是位于H链亚基可变区N端最末端的构架区，而FRL4指的是L链亚基可变区N端可变区的第四构架区。相似的，例如，CDRH1指的是H链亚基可变区N端最末端的CDR，而CDRL3指的是L链亚基可变区N端的第三构架区。FRs在任何轻链或重链CDR区的侧翼。
实质上，本发明的抗体不比人抗体在患者体内有更大的免疫源性。这主要是因为相当于抗体异源恒定区的部分不存在。因此本发明抗体可有一部分源于小鼠单克隆抗体的可变区，比如CH11，但是小鼠的恒定区已被去除。为了消除免疫原性，我们优选的是进一步减少从非人抗体得到的氨基酸数目，同时保持所需抗体的活性。这可通过如上所述的以序列同源性为基础而选择人抗体来实现。
另外，我们发现通过附加的选择步骤对本方法做进一步改进就可以用来鉴定从供体FR获得的氨基酸，这些氨基酸对保持供体CDR区的结构和功能都很重要。
一旦已为某链选择了人受体分子，那么可按照如下方法从供体FR中选择将要移植的氨基酸残基。
将受体和供体的氨基酸序列对准。如果对准的FR区氨基酸在任何位点上有所不同，那么就需要决定选择哪个残基。所选择的残基不能影响从供体中得到的CDR的三维结构或者对其仅有很小的影响。
Queen等，[日本临时专利出版物No．4-502408]提出了一种用来确定是否将来自供体FR的氨基酸残基与CDR序列一同移植的方法。按照这种方法，如果残基至少满足下述准则之一，那么就将来自于FR区的氨基酸残基同CDR序列一同移植到受体上。1) 受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置上，而供体中的相应氨基酸被普遍发现于受体的那个位置2) 该氨基酸位于一CDR个附近；和3) 根据免疫球蛋白的三维模型判断，在一个CDR的大约3埃范围内，该氨基酸有一个侧链原子，并且可能能够与抗原或人源化抗体的CDR相互作用。
由上述准则(2)所鉴定的残基通常表现了准则(3)的特性。因此，在本发明中，省略准则(2)同时引入两条新准则。因此，在本发明中，如果残基至少满足下述准则之一，那么就将来自于供体FR区的氨基酸残基同CDR序列一同移植a) 受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置上，而供体中的相应氨基酸被普遍发现于受体的那个位置；b) 根据免疫球蛋白的三维模型判断，在一个CDR的大约3埃范围内，该氨基酸有一个侧链原子，并且可能能够与抗原或人源化抗体的CDR反应；c) 发现该氨基酸所处位置涉及到确定CDR规范分类的结构；d) 发现该氨基酸的位点在轻链和重链的接触面上。
关于准则(a)，当某氨基酸在同一亚类的抗体的某位点出现的可能性为90％或以上时，那么该氨基酸被定义为“通常的”[Kabat等，见前文]。当氨基酸在同一亚类的抗体的某位点出现的可能性小于10％时，该氨基酸被定义为“稀有的”。
关于准则(c)，根据Chothia和同事们所提供的信息[Chothia等，见前文]，可清楚地确定对规范分类起决定作用的残基位点。
关于准则(b)和(d)，需要事先制作抗体可变区的分子模型。虽然可用任何商业上可获得的用于制作分子模型的软件，我们优选使用AbM软件[牛津分子有限公司]。
用制作分子模型所作预测的精度是有限的。因此，本发明中，通过将其与从不同抗体可变区得到的X射线晶体衍射数据进行比较来确定制作分子模型的预测结构。
当用通过运行制作分子模型(AbM软件)所得的结构模型时，如果两个原子之间的距离小于它们的范德华半径加0．5埃的总和时，则意味着两个原子通过范德华力相互作用。当极性原子-例如主链和侧链的酰胺态氮和羰基中的氧-之间的距离小于2．9埃时，即一个氢键的平均长度加0．5埃时，就意味着有氢键存在。而且当两个相反电荷原子间的距离小于2．85埃+0．5埃时，就意味着它们形成离子对。
根据从多种抗体可变区得到的X射线晶体衍射数据可以鉴定FR中经常同一个CDR连接的氨基酸的位置。确定这些位点时不考虑亚型。对于轻链，这些位点是1，2，3，4，5，23，35，36，46，48，49，58，69，71和88，对于重链，这些位点是2，4，27，28，29，30，36，38，46，47，48，49，66，67，69，71，73，78，92，93，94和103。上述氨基酸的编号依据是Kabat等的定义，[Kabat等，见前文]。下文将使用这一编号系统。当用制作分子模型时则显示出上面列出的氨基酸位点与三分之二所研究的抗体可变区CDR残基相连。
这些发现被用来定义上述准则(b)。具体地说，如果制作分子模型预测FR的某氨基酸位点同CDR相接触，并且通过X-射线衍射分析试验也常常发现其与CDR相接触，那么应优先考虑该供体氨基酸残基的移植。在任何其它情况下，不考虑准则(b)。
类似地，关于准则(d)，多种抗体可变区的X-射线晶体衍射的数据表明轻链中36，38，43，44，46，49，87氨基酸位点和98以及重链中37，39，45，47，91，103和108氨基酸位点常常涉及轻链和重链之间的接触。如果制作分子模型预测这些氨基酸中任一个都涉及重链和轻链的接触，那么应优先考虑该供体氨基酸的移植。在其任何他情况下，不考虑准则(d)。
可以预测，本发明也进一步提供了编码上述任一鉴定抗体的DNA和RNA，特别是DNA。同时也提供了编码轻链和重链的DNA和RNA。
可以预测，该DNA可以是任何适当的形式从而使其可以掺入载体-合适的表达载体中。也可以将是有关任何其它合适的序列，象前导序列或例如为使编码蛋白以融合形式表达的序列。
本发明进一步设计了一种按上述定义用载体转化的宿主细胞，以及一个表达本发明蛋白的系统，该系统由一个或多个含有上述DNA的表达载体所转化的宿主细胞组成。本发明的蛋白可通过用标准技术对该系统进行培养而获得。
下面是本发明的建议一些方面和实施例一种遗传工程免疫球蛋白M(IgM)蛋白，所述IgM蛋白不含J链蛋白而有诱导细胞程序性死亡的活性，其中IgM蛋白仅由一个含有序列表中所定义的SEQ ID No．78的氨基酸序列的轻多肽链蛋白，一条含有序列表中所定义的SEQ ID No．80的氨基酸序列的轻多肽链蛋白，一条含有序列表中所定义的SEQ ID No．82的氨基酸序列的轻多肽链蛋白，或一条含有序列表中所定义的SEQ ID No．84的氨基酸序列的轻多肽链蛋白以及一条含有序列表中所定义的SEQ ID No．86的氨基酸序列的重多肽链蛋白或一条含有序列表中所定义的SEQ ID No．88的氨基酸序列的重多肽链蛋白所组成。
可以预测有四条优选的轻链序列和两条优选的重链序列。可以将任何轻链序列同任何重链序列相组合。所以，优选的组合有由SEQ ID No．78所定义的轻链和Seq ID No．86所定义的重链。
由SEQ ID No．78所定义的轻链和Seq ID No．88所定义的重链。
由SEQ ID No．80所定义的轻链和Seq ID No．86所定义的重链。
由SEQ ID No．80所定义的轻链和Seq ID No．88所定义的重链。
由SEQ ID No．82所定义的轻链和Seq ID No．86所定义的重链。
由SEQ ID No．82所定义的轻链和Seq ID No．88所定义的重链。
由SEQ ID No．84所定义的轻链和Seq ID No．86所定义的重链。
由SEQ ID No．84所定义的轻链和Seq ID No．88所定义的重链。
本发明进一步提供了编码任一上述定义的八种蛋白的DNA。这些序列在序列鉴定号77，79，81，83，85，和87中给出，编码的蛋白质则分别在序列鉴定号78，80，82，84，86和88中给出。同这样的DNA进行杂交的DNA也是优选的，优选的条件是60-70℃和6倍的柠檬酸盐溶液。
另外的优选的是含有上述任一DNA的重组DNA载体，特别是重组DNA载体pHκKY2-58，pHκKF2-19，pHκRY2-10，pHκRF2-52，pHμH5-1和pHμH1-1。本发明还包括用这样的载体转化的细胞，特别是E．coli株pHκKY2-58(FERM BP-5861)，E．coli株pHκKF2-19(FERM BP-5860)，E．coli株pHκRY2-10(FERM BP-5859)，E．coli株pHκRF2-52(FERM BP-5862)，E．coli株pHμH5-1(FERM BP-5863)，E．coli株pHμH1-1(FERM BP-5864)。
一种优选的生产本发明的免疫球蛋白的方法包括在能够使载体内所含的编码免疫球蛋白H链和L链亚基表达的条件下，对上述DNA载体转化的细胞进行培养，并且从培养物中回收免疫球蛋白。
实质上，我们已成功地从由抗体生成杂交瘤细胞所制备cDNA文库中克隆了编码小鼠IgM抗-人Fas单克隆抗体的H链和L链的基因。已鉴定了该全长核酸序列。也确定了每一条链中CDR区的位置。选择包括这些CDR区的氨基酸序列以及来自构架区的氨基酸残基。将这些序列移植到人IgM免疫球蛋白H和L链中，以得到人源化抗-人Fas抗体的完整的H和L链。
把编码人源化H和L链的DNA克隆到表达载体中。H链表达载体和L链表达载体共转染到培养的动物细胞中可生成出一种有诱导细胞程序死亡活性且有抗-人Fas抗体功能的蛋白质。
获得本发明的DNA应首先由小鼠杂交瘤细胞生成的抗-人Fas单克隆抗体制备poly(A)+(多聚腺苷酸化的)RNA，比如CH11。然后用逆转录酶将poly(A)+RNA转化为cDNA，并且纯化编码抗体H和L链的cDNA。Yonehara等[(1989)，实验医学杂志，169，1714以及下列等等]通过融合已用二倍体成纤维细胞的细胞系FS-7免疫过的小鼠骨髓瘤细胞和小鼠淋巴细胞，获得了一个被称作CH11的抗-人单克隆抗体。Igaku-seibutsugakuKenkyujo，K．K．可以提供商品化的从杂交瘤得到的CH11。
poly(A)+RNA既可以通过首先制备总RNA然后用装有寡脱氧胸苷纤维素，寡脱氧胸苷乳胶颗粒等的亲和柱纯化而从总RNA中获得，也可以用如上所述的亲和材料从细胞裂解物直接纯化poly(A)+RNA。可以通过这样的方法制备总RNA，例如碱性蔗糖密度梯度超速离心法[参见Dougherty，W．G．和Hiebert，E．，(1980)，病毒学，101，466-474]；硫氰酸胍-酚法；硫氰酸胍-三氟铯法；以及酚-SDS法。但是，优选的方法是用硫氰酸胍和氯化铯法[参见Chirgwin，J．M．，等(1979)，生物化学，18，5294-5299]。
用逆转录酶得到的单链(ss)cDNA-如上所述，可以转化为双链(ds)cDNA。获得双链cDNA的合适的方法包括S1核酸酶法[参见Efstratiadis，A．，等(1976)，细胞，7，279-288]和Gubler-Hoffman法[参见Gubler，U．和Hoffman，B．J．，(1983)，基因，25，263-269]。但是，我们优选Okayama-Berg法[参见Okayama，H．和Berg，P．，(1982)，分子细胞生物学2，161-170]。
然后，可将上面得到的双链cDNA整合到克隆载体中，并可将所得到的重组载体用于转化合适的微生物体，例如E．coli。可用标准方法选择转化子，例如通过转化载体所编码的四环素抗性或青霉素抗性进行选择。如果用了E．coli，则可用Hanahan法完成转化[参见Hanahan，D．(1983)，分子生物学杂志，166，577-580]。或者，通过共同暴露于氯化钙及氯化镁或氯化铷将重组载体导人感受态细胞中。如果将质粒用作载体，那么很需要该质粒携带有如上所述的药物抗性基因以利于转化子的筛选。也可用人工选择，但不是优选的方法。虽然讨论的是质粒，但应当理解也可用其它克隆材料，如λ噬菌体。
选择含有所需DNA的转化子的方法包括如下步骤(1)用合成的寡核苷酸探针来筛选如果所需蛋白的部分或全部氨基酸序列已经描述清楚，那么也可将一段代表所需蛋白的短的连续序列用作构建寡核苷酸探针。该探针编码氨基酸序列，但是由于遗传密码子的兼并性，可制备出的探针数量较大。因此，通常选择一个只能由有限的寡核苷酸所编码的氨基酸序列。通过使用四个正常碱基中的任何一个取代肌苷可进一步减少生产所必需的寡核苷酸的数目。然后用如32P，35S或生物素适当标记探针，使所述探针与得自固定于硝酸纤维素滤膜的转化子的变性的经转化的DNA杂交。通过检测探针上的标记物显示出阳性株。(2)通过聚合酶链式反应来筛选如果所需蛋白的部分或全部氨基酸序列已经描述清楚，那么就可以合成相应于该氨基酸序列的分隔的非连续区的有义和反义寡核苷酸引物。然后将这些引物用在聚合酶链式反应技术中[参见Saiki，RK．，等(1988)，科学，239，487-491]以扩增编码小鼠抗-人Fas单克隆抗体亚单位的所需DNA片断。这里PCR中所用的模板DNA可以是例如通过逆转录由产生抗-人Fas单克隆抗体之杂交瘤的mRNA合成的cDNA，例如那些表达CH11的DNA。所以，可用例如商品试剂盒将这些DNA片断直接整合到质粒载体中，或用32P，35S或生物素进行标记然后用作菌落杂交或噬菌斑杂交的探针以得到所需的克隆。
单克隆抗体CH11是一种免疫球蛋白M(IgM)分子，是一种由H链(μ链)和L链和一条J链五个亚基组成的复合体。因此，为了描述该亚基的部分氨基酸序列，必须将亚基分离，这可以通过一些合适的技术，例如本领域技术人员公知的电泳、柱层析等技术来达到。一旦亚基被分离开，就可用自动蛋白质测序仪(例如，用Shimadzu的PPSQ-10)对其测序，从而至少确定出每个亚基N-端的氨基酸序列。然后可用这些知识来生产寡核苷酸／引物。
可用公知技术来回收编码上述得到的合适的转化子的抗-人Fas单克隆抗体的每一个亚基的DNA，例如Maniatis，T．等所描述的那些技术[在“分子克隆实验室手册”冷泉港实验室，纽约，(1982)]。例如，分离出已经确定含有所需质粒的转化子的相应于该转化子载体DNA的片断后，就可从质粒DNA中切割下编码所需亚基的的DNA区域。
如上面所描述，用含有编码CH11的重链和轻链的DNA的质粒制备转化了的E．coli DH5α，并已经根据布达佩斯条约的微生物保藏条款将所得到的两个转化子于1996年2月28日保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku KogyoGijutsu Kenkyujo(日本国立生命科学和人体技术研究所)，并分别分配了保藏号FERM BP-5427和FERM BP-5428。可直接用与培养不含这些质粒的E．coli DH5α相类似的方法来培养含有这些质粒的E．coli DH5α。所有保藏菌株都可通过氨苄青霉素抗性选出。因此，可从这些保藏物中得到本发明的DNA。这可通过培养保藏物并分离质粒，或用该质粒作模板进行聚合酶链式反应(PCR)而获得。
任何合适的地方，都可根据现有技术中公知的不同方法对DNA进行测序，例如，所包括的方法有Maxam-Gilbert化学修饰技术[参见Maxam，A．M．和Gilbert，W．(1980)的“酶学方法”中65，499-276]以及用M13噬菌体的双脱氧链终止法[参见Messing，J．And Vieira，J．(1982)基因，19，269-276]。近年来，另外一种测序方法到了广泛的接受，该方法涉及到用荧光染料替代双脱氧法中通常用的放射性同位素。全部的过程，包括电泳后读出核酸序列都已用计算机控制。适于这一过程的装置有Perkin-Elmer测序机器人“CATALYST 800”以及Perkin-Elmer的373A型测序仪。对这些技术的运用使DNA核酸序列的测定工作安全而高效。
根据所确定的核苷酸序列和相应的CH11的H链和L链的N-末端氨基酸序列的数据，就能确定CH11的H链和L链的全部氨基酸序列。
因此，根据这些确定了的编码CH11的H链和L链的序列，连同H链和L链的N-末端序列一起，就能确定CH11的H链和L链的全部氨基酸序列。
通过将H链和L链的氨基酸序列同Kabat所鉴定的免疫球蛋白氨基酸序列[Kabat等，见上文]相比较，从而确定了CH11的H链和L链的CDR区，FR区和恒定区。
可用多种方法制备编码本发明人源化抗-人Fas抗体的H和L链的可变区的DNA。
在一种方法中，可合成长度为60到70个核苷酸的多聚核苷酸来代表所需DNA的部分核苷酸序列。设计合成方法以使有义链片断末端同反义链的片断末端互相交替。将所得到的多聚寡核苷酸片断相互退火并用DNA连结酶连结。通过这种方法就可得到编码人源化抗-人Fas抗体的H链和L链的可变区的DNA。
或者，可从人淋巴细胞中分离出受体的全部可变区。可用定点诱变向编码供体CDR的区域引入限制性位点。然后用相应的限制性酶从受体中切割下CDR。然后用DNA连结酶合成编码供体CDR区的DNA并用DNA连结酶连入到受体中。
我们优选用重叠延伸PCR技术[Horton，等，(1989)，基因，77，61-68]来获取编码所需人源化抗-人Fas抗体的H和L链的可变区的DNA。
重叠延伸PCR可使两个编码所需氨基酸序列的DNA片断连结起来。为了举例，本文将两个片断命称作(A)和(B)。合成一个与(A)的5’端退火的20到40个核苷酸长的有义引物(C)，同时合成一个与(B)的5’端退火的含有20到40个核苷酸的反义引物(D)。也需要另外两个引物。首先是由一个(A)的3’端的20-30个核苷酸与一个(B)的5’端的20-30个核苷酸连结所形成的嵌合有义引物(E)。其次是需要一个与该有义引物互补的反义引物(F)。
用引物(C)和(F)加上含有片断A的DNA模板就可进行PCR反应。这样就能生产由(B)的5’端20-30个核苷酸与(A)的3’端连结起来的DNA产物。这个片断称作片断(G)。
类似地，用引物(D)和(E)加上含有片断B的DNA模板就可进行PCR反应。这样就能生产由(A)的3’端的20-30个核苷酸与(B)的5’端连结起来的DNA产物。这个片断称作片断(H)。
片断(G)和片断(H)带有分别同(G)的3’端的40-60个核苷酸和(H)的5’端的40-60个核苷酸互补的序列。用(G)和(H)片断的混合物作为模板就可进行PCR反应。在第一个变性步骤中，DNA成为单链。在接下来的退火步骤中，多数DNA又变为原来的形式。但是，由于(G)和(H)片断在序列重叠区退火，部分DNA会形成异源双螺旋。在接下来的延伸反应步骤中，突出的单链区被修复形成代表(A)和(B)的连结反应的嵌合DNA。本文以后将这一DNA片断称作(I)。可用引物(C)和引物(D)对片断(I)进行扩增。
在本发明的实施方案中，片断(A)和(B)应代表编码小鼠人源化抗-人Fas单克隆抗体的H和L链的CDR区的DNA，编码人免疫球蛋白IgM的FR区的DNA或者编码人免疫球蛋白IgM的分泌信号的DNA。
相应于所需氨基酸的密码子是已知的。为生产一种蛋白质而设计DNA时，可选择任何合适的密码子。例如，可根据宿主所使用的密码子来选择密码子。利用编码所需修饰的合成寡核苷酸引物，通过定点诱变技术完成对某核苷酸序列的部分修饰[Mark，D．F．等(1984)美国科学院学报美国81，5662-5666]。通过使用选择的引物引入特异性位点突变或突变，可够获得编码任何人源化抗-人Fas抗体的H和L链可变区的DNA。
将如本发明所获得的DNA整合到表达载体中可使原核宿主细胞或真核宿主细胞发生转化。这样的表达载体典型地含有合适的启动子，复制位点和涉及基因表达的序列，从而使该DNA在宿主细胞中表达。
根据布达佩斯条约，已经将四种携带编码人源化抗-人Fas抗体L链可变区DNA的质粒的转化子于1997年3月11日在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo(日本国立生命科学和人体技术研究所)做了保藏。这些菌株是E．coli pHκKY2-58，E．coli pHκKF2-19，E．coli pHκRY2-10和E．coli pHκRF2-52，保藏号分别是FERM BP-5861，FERM BP-5860，FERM BP-5859和FERM BP-5862。
根据布达佩斯条约，已经将两种带有编码人源化抗-人Fas抗体H链可变区DNA的质粒的转化子于1997年3月11日在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo(日本国立生命科学和人体技术研究所)做了保藏。这些菌株是E．coli pHμM5-1，E．coli pHμM1-1，保藏号分别是FERMBP-5863和BP-5864。
用这些保藏物可获得本发明的DNA。这可通过诸如培养保藏物并分离质粒，或通过用该质粒作为模板进行PCR反应。
举例来说，合适的原核宿主细胞包括，E．coli(Escherichia coli)和Bacillussubtilis。为了在这样的宿主中表达目的基因，应用带有复制子的质粒载体转化这些宿主细胞，所述复制子要选自与宿主细胞相匹配，特别地含有一个复制起点和一个启动子序列，比如lac UV5。这些载体优选地带有能够使转化的细胞带上选择表型的序列。
E．coli中适合的一株是衍生自E．coliK12的JM109株。合适的载体包括pBR322和pUC系列质粒。合适的启动子包括乳糖启动子(Lac)和色氨酸乳糖启动子(trc)。一般地，可以预见，本发明并不限于这里举例说明的象这样的宿主，载体，启动子等，可根据需要用任何合适的系统。
Bacillus subtilis中合适的优选菌株是207-25，而优选的载体为pTUB228[参见Ohmura，K．，等，(1984)生物化学杂志，95，87-93]。适宜的启动子为Bacillus subtilis α-淀粉酶基因的调节序列。如果需要，可将编码α-淀粉酶信号肽的DNA序列连结到本发明的DNA上以实现胞外分泌。
适宜的真核细胞宿主包括那些脊椎动物细胞，酵母细胞等。适宜的脊椎动物包括例如猴COS细胞系[参见Gluzman，Y．(1981)，细胞，23，175-182]。适宜的酵母细胞包括啤酒糖酵母和粟酒裂殖糖酵母。
一般地，对脊椎动物细胞适宜的表达载体的要求是它应包括一个通常位于需表达基因上游的启动子；一个RNA的剪接位点；一个聚腺苷酸化位点；以及一个转录终止序列等。如果需要，它们还可包括一个复制起点。一个适宜的质粒为一个含有SV40早期启动子pSV2dhfr[参见Subramani，S．，等，(1981)，分子细胞生物学，1，854-884]。
适宜的真核微生物为酵母，例如啤酒糖酵母，且对酵母合适的表达载体包括pAH301，pAH82和YEp51。适宜的载体含有例如乙醇脱氢酶基因的启动子[参见Bennetzen，J．L．和Hall，B．D．(1982)，生物化学杂志，257，3018-3025]或羧肽酶Y GAL10启动子[参见Ichikawa，K．，等，(1993)，生物科学，生物技术，生物化学，57，1686-1690]。如果需要，可将编码羧肽酶信号肽序列的DNA序列连结到要表达的DNA上以实现胞外表达。
在将COS细胞用作宿主的情况下，适宜的载体包括SV40一个使能够自我复制的复制起点，一个转录启动子，一个转录终止信号和一个RNA剪接位点。可通过任何适宜的方法用该表达质粒来转化这些细胞，例如用DEAE-葡聚糖法[参见Luthman，H，和Magnusson，G．(1983)，核酸研究，11，1295-1308]，磷酸钙-DNA共沉淀法[参见Graham，F．L．和van der Eb，A．J．(1973)，病毒学，52，456-457]以及电脉冲电穿孔法[参见Neumann，E．，等，(1982)，欧洲分子生物学协会杂志，1，841-845]。在一个优选的实施例中，COS细胞与两个各自分开的表达载体共转染，其中一个载体所含DNA编码的蛋白含有CH11重链可变区而另一个所含DNA编码的蛋白含有CH11重链可变区，这些载体同时表达以生产人源化重组抗-人Fas抗体。
可用常规方法来培养本发明的转化子，所需的蛋白质可在细胞外或细胞内表达。合适的培养基包括各种常用的培养基，通常根据宿主来进行选择。例如，对COS细胞合适的培养基包括RPMI-1640和Dulbecco改进的Eagle培养基，如有需要可添加肽牛血清(FBS)。培养温度可以是不显著抑制细胞合成蛋白质能力的任何适宜的温度，且优选的温度为32-42℃，最优选的为37℃，特别是对哺乳动物细胞来说更是如此。如果需要，也可在含有1-10％的二氧化碳的空气中进行培养。
根据该蛋白是进行细胞外或是细胞内表达以及该蛋白的物理和化学性质条件，可用各种公知的分离技术分离和纯化本发明转化子所表达的蛋白质。合适的特定分离方法包括用常用的蛋白质沉淀剂处理，比如超滤法，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析，离子交换层析，亲和层析以及高效液相层析(HPLC)等各种层析法，透析，及其联合。
通过用上面描述的方法，可获得高收率和高纯度的所需的蛋白质。即使它们没有J链，本发明的人源化抗-人Fas抗体也有相当或高于CH11的细胞毒性。
例如，可用酶联免疫吸附测定法[ELISA]来确定本发明蛋白质结合Fas抗原的特异性。该技术包括将试验抗原固定在一个96孔平皿的孔底表面上，然后向孔中引入测试样品。经过洗涤步骤，然后将能够特异性识别人IgM H链(μ链)的酶标抗体加入到各孔中。再次洗涤细胞，并检测了孔中残存的任何标记。以前曾经公开了编码人Fas人源抗体的cDNA及为了进行表达将其引入动物细胞所用方法[参见Itoh，N．，等，(1991)，细胞，66，233-243]。如Itoh所公开的(如上文)，上述ELISA法中所用的抗原可从被含有编码融合蛋白基因的表达载体所转化了的细胞培养物上清液中得到，所述融合蛋白包括人Fas抗原胞外区和小鼠白细胞介素3受体的胞外区。
例如，可以通过在已经加入或将要加入测试样品的培养皿中如培养人淋巴细胞系HPB-ALL或Jurkat(美国典型培养物保藏号No．TIB-152)细胞而确定本发明蛋白质诱导细胞程序死亡的能力(Morikawa，S．，等，(1987)国际癌症杂志21，166-170)。然后可用MTT分析法确定存活率(Green，L．M．等，(1984)免疫学方法杂志70，257-286)。
用本发明的DNA，可以生产基本上仅由H链和L链可变区的Fv片断或通过可变肽与H链和L链相连的单链Fv构成的Fv片断[‘scFv’，Huston，J．S．，等(1988)美国科学院学报美国85，5879]。
本发明也提供了用于治疗上文提到的疾病的方法以及治疗组合物。这样的组合物典型地含有与药物上可接受的载体混合有治疗上有效量的本发明的蛋白。可以将该混合物以任意适宜的方式给药，比如通过非肠胃，静脉内，皮下以及局部给药的方式。特别是当要治疗的疾病是局部的，那么最好将该蛋白在尽可能靠近该部位的地方给药。例如，严重的风湿疼痛主要发生在较大的关节上，那么就可以将该蛋白质对这些部位给药。将本发明蛋白用作全身给药时，特别优选的形式为一种无热源的，治疗上可接受的，特别是非肠胃可接受的水溶液。制备这种药物上可接受的蛋白质溶液所要考虑的诸如pH值，等渗性，稳定性等因素是本领域技术人员所公知的。而且，本发明的组合物可包括其它被认为是合适的成分，比如生长延缓剂以及其它药剂。
用本发明蛋白来治疗的不同疾病的用药方式对本领域技术人员来说是容易理解的，要考虑不同的因素，诸如患者的疾病，体重，性别以及饮食等，任何症状的严重性，时间，重复治疗的需要，以及任何其它适宜的临床因素。作为一个一般原则，每日的使用剂量典型地为每千克体重1-1000μg之间。
本发明的人源化抗-人Fas抗体能够结合到人Fas抗原上并有很好的诱导细胞程序性死亡的活性。因此，本发明所提供的抗体可用作抗-风湿制剂。另外，本发明所提供的抗-风湿制剂均涉及能够降低制剂潜在毒性的基因工程的人源化免疫球蛋白。
现在，根据下面的实施例对本发明进行详细描述，所描述的实施例是对本发明的说明而不是对本发明进行限制。这些实施例代表了本发明的具体实施方案。
如未做特别说明，任何方法，制剂，溶液等均可在‘分子克隆-实验手册’(见上文)中找到。除非做其它特殊说明，所有的溶液均为水溶液且均由无菌去离子水制备的。
参考实施例1克隆编码抗人Fas抗原的小鼠单克隆抗体CH11可变区的DNA(1-1)poly(A)+-RNA的制备按照Chirgwin和同事所描述的方法[Chirgwin，J．M．，等，(1979)生物化学，18，5294，以及下列等等]可从CH11生产的杂交瘤中[由Yonehara得到的，见Yonehara等，(1989)，实验医学杂志，169，1747以及列等等]制备总RNA。特别地，在含有10％(v／v)肽牛血清[Gibco]的ASF104培养基[Ajinomoto]中培养CH11生产的杂交瘤[Yonehara，S．，等(1994)，国际免疫学6，1849-1856]。通过离心并去除上清液得到大约6．7×108个细胞。立即将所得到的细胞沉淀同60ml 4M的硫氰酸胍溶液[Fluka]相混合。然后通过用装有21-号口径针头的注射器三次吸入细胞悬浮液并排出从而使所得悬浮液中的细胞裂解。将这样得到的细胞裂解物平铺在超速离心管[13PAHitachi Koki]中的3ml 5．7M氯化铯／0．1M EDTA溶液(pH 7．5)上并用日立RPS-40T离心机转头离心(13PA离心管，150，000xg，20℃下离心18小时)以沉淀RNA。将沉淀的RNA溶于水中，用氯仿／1-丁醇(4∶1，v／v)抽提然后用100％的乙醇再次沉淀。
接着用常规方法从上面得到的总RNA中纯化poly(A)+RNA[参见Sambrook，J．等，(1989)，“分子克隆实验手册”(第二版)，冷泉港实验室，7．26-7．28]。更具体地说，用的是装有100mg寡脱氧胸苷酸纤维素[Pharmacia，7型]的一次性聚苯乙烯柱(直径0．7cm)。将该柱用由20mM的tris-盐酸(pH7．6)，0．5M的氯化钠，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)和0．1％(w／v)十二烷基硫酸钠(SDS)组成的加样缓冲液平衡。然后将总RNA(约1．2mg)溶解在水中使总体积为400μl并在65℃下加热5分钟，接着向溶液中加入加样缓冲液(制成上述浓度两倍的浓度)400μl。将所得到的混合物冷却到室温然后灌入柱中。回收直接通过该柱的馏分并将馏分在65℃下再加热5分钟，再重新灌入柱中。
接着用10ml的加样缓冲液洗涤该柱，然后进一步用含有0．1M氯化钠的5ml加样缓冲液洗涤以去除未吸附物和非特异性吸附物。随后，将5ml洗脱缓冲液[10mM tris-盐酸(pH7．5)，1mM EDTA和0．05％(w／v)SDS]灌入柱中以洗脱特异性吸附物。所得到的洗脱物是从200μl的馏分中回收的。将第二次和第三次的洗脱分馏物200μl(共400μl)合在一起并与40μl 3M醋酸钠(pH4．0)以及1ml 100％的乙醇相混合。这样得到的混合物在-20℃下储藏过夜。第二天，将该混合物在离心机中离心(10，000xg，4℃下离心10分钟)以回收沉淀。这些沉淀物作为poly(A)+RNA样品并在-80℃下储藏备用。(1-2)克隆编码可变区的DNA可用‘RT-PCR’法，即逆转录(用逆转录酶-RT)和聚合酶链式反应(PCR)相结合的方法来克隆编码小鼠抗-Fas抗原(CH11)的H链和L链可变区的cDNA片断。联合这些技术的使从(1-1)中所制备的由CH11生产的杂交瘤中得到的poly(A)+RNA样品中的所需序列能够进行特异性扩增。
可从Ig-Prime[Novagen]产品系列中选出两个用于‘RT-PCR’反应的引物套。MuIgVH5’-B和MuIgMVH3’-1用于扩增H链的一个区域，而MuIgkVL5’和MuIgMVL3’-1用于扩增L链的一个区域。可用H链引物套和L链引物套分别实施RT-PCR反应。a)逆转录酶反应按照如下方法制备逆转录酶反应溶液(44μl)。把10mM tris-盐酸(pH8．3)，50mM氯化钾，0．1mM dGTP，0．1mM dCTP，0．1mM dTTP，1．5mM氯化镁，2．5pmol H链或L链的3’端引物，(1-1)中制备的poly(A)+RNA 50ng以及从莫洛尼鼠类白血病毒(MMLV)中得到20个单位的逆转录酶[BIOCHEMICALKOGYO CO．，LTD]混合起来，并将得到的混合物在42℃下温育1个小时。b)用PCR进行扩增把在a)中所制备的逆转录酶反应混合物同25pmol的H链或L链5’引物混合起来，在适当的时候加入Taq DNA聚合酶[Perkin Elmer日本公司提供的ampliTaq DNA聚合酶]，再加入试剂盒(除非特别说明，酶的缓冲液和溶液均是供应商的试剂盒提供的)使反应缓冲液的最终体积达到100μl。将得到的全部反应物在94℃下加热2分钟，然后须经热循环94℃下1分钟，50℃下1分钟且72℃下2分钟。重复该循环30次。然后将溶液在72℃下再保温10分钟。在整个PCR反应中用基因扩增仪PCR系统9600[日本Perkin Elmer公司]来控制反应温度。c)PCR产物的分析通过凝胶电泳在1．5％琼脂糖凝胶上[FMC Bioproducts]对部分b)中所制备的PCR反应混合物进行分析。每一条H链和L链的PCR反应产物的泳带位置相当于430bp。将其与在同一凝胶上走电泳的分子量标准参照物相比较就可以估计泳带大小。d)PCR产物的克隆用最初的TA克隆试剂盒[Invitrogen]将b)中得到的每种PCR产物连结到不同的质粒载体中。更具体的说，将50ng的pCRⅡ载体和4个单位的T4DNA连结酶(都包括在试剂盒中)加入到连结酶反应缓冲液中[6mM的tris-盐酸(pH7．5)，6mM的氯化镁，5mM的氯化钠，7mM的β-巯基乙醇，0．1mM的ATP，2mM的二硫苏糖醇(DTT)，1mM的亚精胺和0．1mg／ml的牛血清清蛋白]。该连结酶反应缓冲液还包括部分含有大约10ng(通过c)中的凝胶电泳所估计的)所需PCR产物的PCR反应混合物。将所得的混合物在14℃下温育15小时。
接下来，将50μl在前面已经通过加入2μl的0．5M的巯基乙醇而变成感受态的E．coli TOP10F’株(包括在试剂盒中)同2μl的连结酶反应混合物相混合。将所得到的转化混合物冰浴30分钟，42℃下加热30秒然后再冰浴2分钟。经过这次处理，将混合物加到500μl的SOC培养基[2％(w／v)的胰蛋白胨，0．5％(w／v)的酵母提取物，0．05％(w／v)的氯化钠，2．5mM的氯化钾，1mM的氯化镁，20mM的葡萄糖]中，将所得到的混合物转动振动培养1小时(37℃，110rpm)。然后将培养液在含有100μg／ml氨苄青霉素的L-肉汤琼脂培养皿[1％(w／v)的胰蛋白胨，0．5％(w／v)的酵母提取物，0．5％(w／v)的氯化钠，0．1％的葡萄糖，0．6％的细菌培养用琼脂(Difco)]中涂平板并在37℃的条件下静置培养过夜。
用铂接种针选择并挖出通过这一方法培养出的氨苄青霉素抗性菌落。将得到的氨苄青霉素抗性菌落在含有100μg／ml氨苄青霉素的5mlL-肉汤培养基中于37℃下分别培养过夜。然后用碱裂解法[参见Sambrook，J．，等，见上文]将培养物离心沉淀以制备细胞和质粒DNA。于是得到用于每一个H和L引物套的质粒，并被分别称作pVH4(含有用H链引物套所扩增片断的质粒)和pVL8(含有用L链引物套所扩增片断的质粒)。
参考实施例2CH11可变区的氨基酸序列和核酸序列的鉴定(2-1)CH11H链和L链可变区的N-末端氨基酸序列的鉴定a)CH11的制备由CH11生产的杂交瘤(见实施例1)在含有10％(v／v)牛血清[Gibco]的ASF104培养基[Ajinomoto]中细胞数长到2×108个，然后在37℃下，将所制备的细胞置于50ml无血清ASF 104培养基中培养5天。经过这次后，将培养物离心(Tommy Seiko’s No．4转头，15，000xg，4℃下离心5分钟)并收集上清液。用E-Z-Sep抗体纯化试剂盒[Pharmcia Biotech]可从培养物的上清液中得到CH11。b)把一部分相当于a)中所制备的100μl上清液中的纯化CH11加入到10μl含有10％(v／v)β-巯基乙醇和4％(w／v)SDS的100mM的tris-盐酸缓冲液(pH6．8)中。将所得到的混合物在95℃下加热5分钟使其变性。然后将变性的样品在12％(w／v)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后将凝胶浸在转移缓冲液中[25mM的tris-硼酸(pH9．5)，10％的甲醇(v／v)]并在室温下摇动15分钟。然后用半自动杂交仪[Iwaki Glass有限公司]在4℃且恒定电流为0．2安培下，处理1小时，把凝胶上的蛋白泳带转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上[NipponMillipore有限公司]。经过这次后，PVDF膜被0．1％的考马斯亮蓝溶液染色并用100％的甲醇去色。只能见到两个分别相应于H链和L链的较大蛋白质斑点。将这些蛋白质斑点离体并把这些含有它们的凝胶在室温下干燥。c)利用自动化Edman法[见Edman，P．，等，(1967)，欧洲生物化学杂志1，80页及其以下等等]用气相蛋白质测序仪[PPSQ-10；Shimadzu公司]对b)中转移到PVDF膜上的蛋白质的氨基酸序列进行分析。这样鉴定了CH11的H链可变区的N-端氨基酸序列，并分别如序列表中的SEQ ID NO．13和SEQ ID NO．14所示。(2-2)DNA核酸序列的鉴定通过分别对质粒pVH4和pVL8的插入片断进行测序(在实施例1中制备的)，鉴定了编码CH11L链和H链可变区的cDNA的全部核酸序列。
pCRⅡ载体有一个SP6启动子序列和一个T7启动子序列，这些序列可在插入cDNA的任一侧，这样就能够用相应于该序列的寡核苷酸引物[PerkinElmer，日本]来鉴定pVH4和pVL8的插入片断的序列。用于序列分析的样品可用这些引物和染料引物循环测序试剂盒[Perkin Elmer，日本]来制备。将质粒pVH4和pVL8的质粒DNA用作模板。用DNA测序仪[型号373，PerkinElmer，日本]来鉴定每一个cDNA插入片断。H链可变区cDNA的核酸序列如SEQ ID NO．15所示，L链可变区cDNA的核酸序列如SEQ ID NO．16所示。
在序列表中的SEQ ID NO．13的氨基酸号1-15所代表的CH11H链的N-末端氨基酸序列，完全对应于由SEQ ID NO．15的核苷酸号32-76所编码的氨基酸序列。因此，推断质粒pVH4含有编码CH11H链可变区的DNA。
在序列表中的SEQ ID NO．14的氨基酸号1-21所代表的CH11H链的N-末端氨基酸序列，完全对应于由SEQ ID NO．16的核苷酸号29-91所编码的氨基酸序列。因此，推断质粒pVL8含有编码CH11L链可变区的DNA。
参考实施例3克隆编码全部CH11的H链，L链和J链的DNA(3-1)cDNA文库的制备可用Okayama-Berg法[Okayama，H．等，(1987)，酶学方法154，3-28]制备cDNA文库。更具体地说，是将如实施例1-1(a)中由CH11生产的杂交瘤所制备的5μg poly(A)+RNA加入到30μl含有75个单位的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶[Seikagaku Kogyo有限公司]的反应混合物中[50mM tris-盐酸(pH8．3)，6mM氯化镁，40mM氯化钾，2mM dATP，2mM dGTP，2mM dCTP，2mM dTTP，2μg载体引物(3’-寡脱氧胸苷尾，pcDV-1)Pharmacia]。所得到的混合物在37℃下温育30分钟。
这样以后，再向反应混合物中加入石炭酸-氯仿(1∶1，v／v)并彻底混合。将所得到的混合物离心(10，000xg，室温下，5分钟)并回收上清液层(本文中以下将这一用石炭酸和氯仿抽提并回收上清液的方法称作“石炭酸-氯仿提取”)。向上清液层中加入35μl 4M的醋酸氨和140μl 100％的乙醇，将所得到的混合物在-70℃下冷却15分钟，然后离心(10，000xg，4℃下，15分钟)。用75％(v／v)的乙醇溶液洗涤沉淀物并减压干燥。
将干燥的沉淀溶解在13μl蒸馏水中，然后加入5．6μl的末端转移酶反应混合物[140mM二甲胂酸钠，30mM tris-盐酸(pH6．8)，1mM氯化钴，0．5mM二硫苏糖醇，0．3μg聚腺苷酸(polyA，Pharmacia)，0．2mM dCTP]并将所得反应混合物在37℃下温育5分钟。按照供应商的说明，再加入末端脱氧核苷酸转移酶[21个单位，Pharmacia]，反应可进行5分钟。然后用石炭酸-氯仿抽提反应混合物。再向回收的上清液层中加入20μl 4M醋酸氨和80μl 100％的乙醇，并将混合物在-70℃下冷却15分钟，然后离心(10，000xg，4℃下，15分钟)。用75％(v／v)的乙醇溶液洗涤沉淀物并减压干燥。
将这样得到的DNA沉淀物溶解于30μl的反应混合物中[10mM tris-盐酸(pH7．5)，60mM氯化钠，7mM氯化镁]，并向所得溶液中加入30个单位的限制酶HindⅢ。一般地，用到限制酶而没有说明缓冲液时，那么所用的缓冲液即是与酶同时提供的缓冲液。如果情况是两种酶消化DNA，那么是两种酶顺序进行消化反应的。第一次消化后，将其沉淀，重悬浮DNA后再用第二个酶消化。沉淀和重悬浮技术是本领域的公知技术[参见Sambrook等，见上文]。本实施例中所用的所有限制酶和缓冲液都是由Takara Schuza提供的。
在37℃下，将该DNA在消化溶液中消化过夜。接着，将反应混合物用石炭酸-氯仿抽提。然后，向回收的上清液层中加入35μl 4M的醋酸氨和140μl 100％的乙醇，并将混合物在-70℃下冷却15分钟。将混合物离心(10，000xg，4℃下，15分钟)以沉淀DNA，用75％(v／v)的乙醇溶液洗涤沉淀物并减压干燥。这样得到的沉淀DNA在接下来的步骤中用作cDNA样品。
类似地，用限制酶PstI消化载体pcDL-SRα296的质粒DNA[参见Takebe，Y等，(1989)，“JIKKEN IGAKU(实验医学)”，7，95-99页]。为了将寡脱氧鸟苷加到3’末端上，就用dGTP和末端脱氧核苷酸转移酶[Pharmacia]处理消化产物，如下将pcDL-SRα296DNA(100μg，50μl中)加入到10μl 10x的末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液中[1x缓冲液，1．4M二甲胂酸钠，0．3M Tris-HCl，(pH7．6)，10μl二硫苏糖醇(1mM)，20μl 0．1mM3H-dGTP(杜邦公司)和10μl末端转移酶(210 IU，Pharmacia)]。该混合物在37℃下温育40分钟，然后同等体积的TE-饱和石炭酸缓冲液相混合。静置后，除去上清液层后用石炭酸-氯仿抽提。经过石炭酸和石炭酸-氯仿抽提后，用100％乙醇沉淀DNA并用50μl的TE缓冲液重悬浮。
用限制酶HindⅢ消化总DNA沉淀物，并用1．8％(w／v)的琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。从凝胶中切除800bp的泳带，并根据生产商的说明，用GENECLEAN试剂盒[Funakoshi]进行提取。将得到的DNA溶解在100μl的TE缓冲液中，并加入100％乙醇。最终的DNA浓度为0．09μg／μl。
所得到的产物提供了一个连结区DNA，其中寡脱氧鸟苷与SRα启动子相连(参见图1，该图概要显示了构建一个cDNA文库使能克隆编码CH11每一个亚基全长序列的DNA。图2所示为克隆及扩增编码CH11的每一个亚基的全长DNA的步骤)。
将上面沉淀并干燥的cDNA样品溶解在10μl TE缓冲液中[10mM tris-盐酸(pH7．5)，1mM EDTA]。把所得溶液的一部分(1μl)加入到含有0．08pmol上面制备的连结区DNA的反应缓冲液中[10mM tris-盐酸(pH7．5)，1mM EDTA，100mM氯化钠]。将所得的混合物在65℃下加热5分钟，然后在42℃下温育30分钟。这样以后，再将10μl 10x的连结酶缓冲液[10mM ATP，660mMtris-HCl(pH7．5)，66mM氯化镁，100mM DTT]，76μl的蒸馏水以及1μl 10mMβ-辅酶I[NAD，Boehringer Mannheim]加入到反应混合物中，再将得到的混合物在冰浴下冷却10分钟。将E．coli DNA连结酶[8．4μg相当的，Pharmacia]加入到冷却的反应混合物中，并在12℃下温育过夜。
温育后，再向反应混合物中加入2μl核酸溶液[2mM dATP，2mM dCTP，2mM dGTP，2mM dTTP]，0．5μl 10mM NAD，42μg当量的E．coli DNA连结酶[Pharmacia]，4．1单位的DNA聚合酶以及5．5单位的核糖核酸酶H[Pharmacia]。然后将所得的混合物在12℃下温育1小时再在22℃下温育1小时。将这样制备的cDNA在-20℃下储藏以备用。(3-2)用PCR克隆a)引物的制备关于H链，将如实施例2中鉴定的CH11H链可变区的氨基酸序列同Kabat等所做的抗体氨基酸序列数据库进行比较[Kabat E．A．等，(1991)，“免疫目的蛋白的序列第二卷”，美国卫生部]。鉴定出CH11的H链(μ链)为2A亚类。因此，可合成一寡核苷酸引物以使它同编码小鼠H链，2a亚类DNA的5’非翻译区的一部分进行杂交。所选择的寡核苷酸引物含有序列5’-CTAAGGGAATTCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA-3’(H5-1；序列表中的SEQ ID NO．17)。
也设计了另-条可同CH11H链的3’非翻译区的一部分进行杂交的寡核苷酸引物。对该寡核苷酸的设计所根据的是Goldberg，等人报导的编码小鼠免疫球蛋白M链恒定区的DNA核酸序列[见Goldberg，I．G．，等，(1981)，基因15，33-42]，且所选择的序列为5’-TTTTACTCTA GAGACCCAAGGCCTGCCTGGTFGA-3’(H3-1；序列表中的SEQ ID NO．18)。
关于L链，将如实施例2中鉴定的CH11 L链可变区的氨基酸序列同Kabat和同事[见上文]所做的抗体氨基酸序列数据库进行比较。发现CH11 L链为κ2亚类。因此，设计出一寡核苷酸引物以使它同编码小鼠L链，κ2亚类DNA的5’非翻译区的一部分进行杂交。所选择的寡核苷酸引物含有序列5’-AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC-3’(L5-1；序列表中的SEQ ID NO．19)。
也设计了另一条可同CH11H链3’非翻译区的一部分进行杂交的寡核苷酸引物。对该寡核苷酸的设计所根据的是编码登记名称为MUSIGB1L1(登记号D14630)的小鼠免疫球蛋白κ链恒定区的DNA核酸序列。所用的序列为5’-ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT-3’(L3-1；序列表中的SEQ ID NO．20)。
关于J链，不存在可变区且编码J链的DNA序列以及J链的氨基酸序列均是已知的[参见Cann，G．M．，等，(1982)，美国科学院学报 美国，79，6656-6660]。根据这一发现，可合成能够与编码J链的5’和3’非翻译区的一部分DNA杂交的寡核苷酸引物。这些寡核苷酸拥有的序列为5’-TTGCGGAATTCCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT-3’(J5-1；序列表中的SEQ ID NO．21)以及5’-ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAC CT-3’(J3-1；序列表中的SEQ ID NO．22)。
这些寡核苷酸引物都是根据亚膦酰胺法[见Mattrucci，M．D．和Caruthers，M．H．(1981)，美国化学学会杂志，103，3185-3191]用380B型自动DNA合成仪[Perkin Elmer，日本]合成的。合成完成后，把每个引物从载体上切割下来并去保护，然后冷冻干燥。将得到的产物溶解在蒸馏水中并于-20℃保藏以备用。b)用PCR扩增靶基因制备PCR反应液[10mM tris-HCl(pH8．3)，50mM氯化钾，1．5mM氯化镁，2．5mM dATP，2．5mM dCTP，2．5mM dGTP，2．5mM dTTP]，并将如实施例4-1中描述的cDNA文库0．1μl，Taq DNA聚合酶[Perkin Elmer，日本]1个单位以及15pmol的寡核苷酸引物(3-2a中制备的)加入到100μl PCR反应液中并在94℃下加热1分钟。然后将所得混合物用热循环处理94℃下加热1分钟，55℃下加热1分钟并在72℃下加热2分钟。这一循环要重复30次。最后一次循环后，将溶液在72℃下再保温10分钟。在各个反应中所用的引物系统如下H5-1和H3-1(对于H链)；L5-1和L3-1(对于L链)；和J5-1和J3-1(对于J链)。c)对PCR产物的分析就H链来说，待b)中的PCR反应完成后，用0．8％(w／v)的琼脂糖凝胶电泳分析一部分反应混合物。对于L和J链来说，则用1．5％(w／v)的琼脂糖凝胶[琼脂糖是由FMC Bioproducts提供的]。 H链的PCR反应产物的泳带大约1900bp，L链为800bp而J链为650bp。对泳带大小的估算是通过同在相同凝胶上走电泳的分子量标准参照物进行比较而得出的。d)PCR产物的克隆用真核细胞TA试剂盒[Invitrogen]将b)中得到的每一个PCR产物连结到质粒载体中。更具体地说，将60ng pCR3载体(包含在试剂盒中)及4个单位的T4 DNA连结酶加入到含有一部分PCR反应混合物的反应缓冲液中[6mMtris-HCl(pH7．5)，6mM氯化镁，5mM氯化钠，7mM β-巯基乙醇，0．1mM ATP，2mMDTT，1mM亚精胺，0．1mg／ml牛血清清蛋白]。所选择的PCR反应混合物的体积应当含有大约10ng(用电泳分析估算的)所需PCR产物。将得到的混合物在14℃下温育15小时。
将一部分连结酶反应混合物(2μl)同50μl E．coli TOP10F’菌株(包含在试剂盒中)相混合，加入2μl 0．5M的β-巯基乙醇使菌株成为感受态。将得到的混合物冰浴30分钟， 42℃下加热30秒种，然后再冰浴2分钟。然后向混合物中加入SOC培养基(500μl，如上所述)，并将得到的混合物在37℃下旋转振动培养(110rpm)l小时。然后将培养液涂布在含有100μg／ml氨苄青霉素的L-肉汤琼脂培养平板上并在37℃下培养过夜。然后用铂接种针挖出生长的氨苄青霉素抗性菌落并用5ml含有100μg／ml氨苄青霉素的L-肉汤培养基于37℃下培养过夜。将这些培养物离心以得到细胞沉淀然后通过碱裂解法[Sambrook等，见上文]用于制备质粒DNA。
所得到的三种质粒称作pCR3-H123(该质粒含有编码H链的DNA)，pCR3-L103(该质粒含有编码L链的DNA)，pCR3-J1123(该质粒含有编码J链的DNA)。用pCR3-H123，pCR3-L103或pCR3-J1123转化感受态的E．coliDH5α株[Gibco]并于1996年2月28日将得到的转化子保藏在国立生命科学和人体技术研究所中，保藏号分别是FERM BP-5427，FERM BP-5428，FERM BP-5429。用公知方法可容易的从这些菌株中制备编码CH11H，L和J链的DNA。
参考实施例4编码CH11H链，L链和J链的cDNA的全部核酸序列的鉴定(4-1)DNA核酸序列的鉴定小鼠免疫球蛋白M链由含有大约110个残基的N-末端可变区和与可变区相邻的含有大约470个残基的恒定区构成。小鼠免疫球蛋白κ链由含有大约110个残基的N-末端可变区和与可变区相邻的含有大约107个残基的恒定区构成。预测编码CH11L链和H链的cDNA的全部序列应由编码已知恒定区的核酸序列和实施例2中所鉴定的、连结到编码该链可变区上的序列所组成[参见KabatE．A．等，见上文]。
推测编码CH11J链的核酸序列同已知的J链的序列相同。
根据这些推测的核酸序列，可合成长度为20个核苷酸的寡核苷酸引物，相应于H，L和J链的序列，以60-200bp编码的间隔区分开。这些引物可用作序列分析。合成的寡核苷酸引物的序列如下对于H链5’-TGGGGCCTCA GTGAAGATAT-3＇(SHF-2；序列表中的SEQ ID NO．23)5’-CAATGGTGGT ACTGGCTACA-3＇(SHF-3；序列表中的SEQ ID NO．24)5’-TGACATCTGA GGACTCTGCA-3＇(SHF-4；序列表中的SEQ ID NO．25)5’-TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT-3＇(SHF-6；序列表中的SEQ ID NO．26)5’-TCCTTCACCT GGAACTACCA-3＇(SHF-7；序列表中的SEQ ID NO．27)5’-TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG-3＇(SHF-8；序列表中的SEQ ID NO．28)5’-AGATCTGCAT GTGCCCATTC-3＇(SHF-9；序列表中的SEQ ID NO．29)5’-TCTAAACTCA TCTGCGAGGC-3＇(SHF-10；序列表中的SEQ ID NO．30)5’-GGTGACCATC GAGAACAAAG-3＇(SHF-11；序列表中的SEQ ID NO．31)5’-AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA-3＇(SHF-12；序列表中的SEQ ID NO．32)5’-TCCTTTGCCG ACATCTTCCT-3＇(SHF-13；序列表中的SEQ ID NO．33)5’-GTGTGTACTG TGACTCACAG-3＇(SHF-15；序列表中的SEQ ID NO．34)5’-AACTGAACCT GAGGGAGTCA-3＇(SHF-16；序列表中的SEQ ID NO．35)5’-AACTCTTGCC CCAAGAGAAG-3＇(SHF-17；序列表中的SEQ ID NO．36)5’-ATCCTGACTG TGACAGAGGA-3＇(SHF-18；序列表中的SEQ ID NO．37)5’-ACAAGTCCAC TGGTAAACCC-3＇(SHF-19；序列表中的SEQ ID NO．38)5’-AGGATATCTT CACTGAGGCC-3＇(SHR-1；序列表中的SEQ ID NO．39)5’-ATCCACTCAA GGCTCTTTCC-3＇(sHR-2；序列表中的SEQ ID NO．40)5’-ACTGCAGAGT CCTCAGATGT-3＇(SHR-3；序列表中的SEQ ID NO．41)5’-AGACGGTGAC TGAGGTTCTT-3＇(SHR-4；序列表中的SEQ ID NO．42)5’-CAGGTGAAGG AAATGGTGCT-3＇(SHR-5；序列表中的SEQ ID NO．43)5’-ATGCTCTTGG GAGACAGCAA-3＇(SHR-6；序列表中的SEQ ID NO．44)5’-CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG-3＇(SHR-7；序列表中的SEQ ID NO．45)5’-TGGCCTCGCA GATGAGTTTA-3＇(SHR-8；序列表中的SEQ ID NO．46)5’-CCTTTGTTCT CGATGGTCAC-3＇(SHR-9；序列表中的SEQ ID NO．47)5’-TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA-3＇(SHR-10；序列表中的SEQ ID NO．48)5’-ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA-3＇(SHR-12；序列表中的SEQ ID NO．49)5’-AGATCCCTGT GAGTCACAGT-3＇(SHR-13；序列表中的SEQ ID NO．50)
5’-AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA-3＇(SHR-14；序列表中的SEQ ID NO．51)5’-TGAAGCCACT GCACACTGAT-3＇(SHR-15；序列表中的SEQ ID NO．52)5’-AGTTCCATTC CTCCTCTGTC-3＇(SHR-16；序列表中的SEQ ID NO．53)5’-TGTGTCAGAC ATGATCAGGG-3＇(SHR-18；序列表中的SEQ ID NO．54)对于L链5’-TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG-3＇(SLF-1；序列表中的SEQ ID NO．55)5’-CTTGGAGATC AAGCCTCCAT-3＇(SLF-2；序列表中的SEQ ID NO．56)5’-GCTGAGGATC TGGGAGTTTA-3＇(SLF-3，序列表中的SEQ ID NO．57)5’-GATGCTGCAC CAACTGTATC-3＇(SLF-4；序列表中的SEQ ID NO．58)5’-CGACAAAATG GCGTCCTGAA-3＇(SLF-5；序列表中的SEQ ID NO．59)5’-ACGTTGACCA AGGACGAGTA-3＇(SLF-6，序列表中的SEQ ID NO．60)5’-ATCTGCAAGA GATGGAGGCT-3＇(SLR-2，序列表中的SEQ ID NO．61)5’-ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA-3＇(SLF-3；序列表中的SEQ ID NO．62)5’-CCGGAGGAAC ATGTGTACTT-3＇(SLF-4；序列表中的SEQ ID NO．63)5’-TCGTTCATAC TCGTCCTTGG-3＇(SLF-6；序列表中的SEQ ID NO．64)5’-CATCTCAGGA CCTTTGTCTC-3＇(SLF-7；序列表中的SEQ ID NO．65)对于J链5’-CACCTGTCCT GGGGTTATTT-3＇(SJF-1；序列表中的SEQ ID NO．66)5’-AGACAAGATG AAGACCCACC-3＇(SJF-2；序列表中的SEQ ID NO．67)5’-AAGCGACCAT TCTTGCTGAC-3＇(SJF-3，序列表中的SEQ ID NO．68)5’-ATATCTCTGA TCCCACCTCC-3＇(SIF-8，序列表中的SEQ ID NO．69)5’-GAAATGCGAT CCTGTGGAAG-3＇(SJF-5，序列表中的SEQ ID NO．70)5’-CTATACCACT ATGGTCCCAC-3＇(SJF-6；序列表中的SEQ ID NO．71)5’-AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT-3＇(SJR-2；序列表中的SEQ ID NO．72)5’-TAGAGGTAAC TCGGGTACAC-3＇(SJR-3；序列表中的SEQ ID NO．73)5’-AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA-3＇(SJR-8；序列表中的SEQ ID NO．74)5’-GGTGGCAGTA ACAACCTGAT-3＇(SJR-5；序列表中的SEQ ID NO．75)5’-CATGATACCT AAGTGGGACC-3＇(SJR-6；序列表中的SEQ ID NO．76)利用亚磷酰胺法用自动DNA合成仪[380B型Perkin Elmer，日本]合成各寡核苷酸引物。用质粒pCR3-H123的DNA制备用于H链序列分析的样品。用质粒pCR3-L103的DNA制备用于L链序列分析的样品。用质粒pCR3-J1123的DNA制备用于J链序列分析的样品。按下面描述的方法，用Prism Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing试剂盒[Perkin Elmer，日本]实施PCR反应。
将pCR3-H123(1．5μg)和4．8pmol的引物(SHF-2)混合于蒸馏水中使最终体积为16μl。将一部分预混合液pCR3-H123／物混合物(9．5μl)同10．5μl含有Taq DNA聚合酶的预混合液相混合。所用这些步骤均按照试剂盒中的说明书进行。将得到的混合物放入自动反应器[CatalystPerkin Elmer，日本]中。所进行的反应循环如下95℃下30秒，50℃下15秒以及60℃下4分钟，重复25次。
反应循环完成后，向所得溶液中加入80μl的灭菌水，并用石炭酸／氯仿法两次抽提所得混合物中的DNA。将回收的上清液层同15μl 2M的醋酸钠和300μl 100％的乙醇相混合，接着离心并回收沉淀。用70％(v／v)乙醇溶液洗涤沉淀并减压干燥，然后将其溶解在3μl的样品溶液[4μl 0．25M EDTA，100μl甲酰胺和15μl无菌水]中。
在DNA测序仪[373A型Perkin Elmer，日本]中进行对32个H链引物，11个L链引物和11个J链引物的测序反应和分析。
将得到的每一个引物的序列数据汇集起来以确定CH11 H链，L链和J链的全部核酸序列。序列表中的SEQ ID No．7，9和11分别表示每一个质粒插入片断的cDNA序列。这些核酸序列所对应的氨基酸序列则分别如序列表中的SEQ ID No．8，10和12所示。(4-2)CH11H链的一级结构发现如序列表中SEQ ID NO．15的第32到379个核苷酸所示的H链可变区的核酸序列，同SEQ ID NO．7的第58到405个核苷酸的序列是相同的。
当同抗体氨基酸序列数据库[Kabat E．A等，见上文]进行比较时，发现如SEQ ID NO．8中所示的第117到571个氨基酸序列同小鼠IgM的H链恒定区的氨基酸序列是相同的。
可以断定，SEQ ID NO．8的第-19到-1个氨基酸所示的序列是CH11H链的信号序列。
发现如SEQ ID NO．7的第406到1770个氨基酸所示的氨基酸序列同小鼠IgMH链的恒定区是相同的。
根据这些结果，就可确定全部核酸序列和氨基酸序列。(4-3)CH11L链的一级结构发现如序列表中SEQ ID NO．16的第29到364个核苷酸所示的可变区L链的核酸序列，同SEQ ID NO．9的第58到393个核苷酸的序列是相同的。
当同Kabat的抗体氨基酸序列数据库进行比较时，发现如SEQ ID NO．10中所示的第113到219个氨基酸序列同小鼠κL链恒定区的氨基酸序列是相同的。
可以断定，SEQ ID NO．10的第-19到-1个氨基酸所示的序列是L链的信号序列。
发现如SEQ ID NO．9的第394到714个氨基酸所示的氨基酸序列同小鼠κL链的恒定区是完全相同的。
根据这些结论，就可确定全部核酸序列和氨基酸序列。(4-4)CH11J链的一级结构将SEQ ID NO．12的第1到137个氨基酸所示的氨基酸序列同抗体氨基酸序列数据库进行比较，发现它同已知小鼠的J链的序列是相同的。
发现如SEQ ID NO．11的第67到第477个氨基酸所示的氨基酸序列同小鼠J链的序列是相同的。
可以断定，SEQ ID NO．12的第-22到-1个氨基酸所示的序列是CH11J链的信号序列。
根据这些结论，就可确定全部核酸序列和氨基酸序列。(4-4)对互补决定区(CDR)的鉴定通过同Kabat的抗体氨基酸序列数据库[见上文]进行比较，可验证上面所确定的CH11H链和L链可变区CDR的氨基酸序列和位置。该数据库表明如果亚型相同，而氨基酸序列又有一些共同特征，那么各种不同的抗体中可变区的构架区氨基酸链长度基本上是恒定的。但是，在这样的构架区之间的CDR区的序列对每一个抗体都是特异的。
通过将CH11L链可变区的氨基酸序列同小鼠μ2a亚型的序列进行比较，说明CH11H链CDR区是由SEQ ID NO．8的第31到35个氨基酸(CDRH1，对应于序列表中的SEQ ID NO．1)，SEQ ID NO．8的第50到66个氨基酸(CDRH2，对应于序列表中的SEQ ID NO．2)以及SEQ ID NO．8的第99到105个氨基酸(CDRH3，对应于序列表中的SEQ ID NO．3)所表示的。
通过将CH11L链可变区的氨基酸序列同小鼠κ2亚型的序列进行比较，说明CH11L链CDR区是由SEQ ID NO．10的第24到39个氨基酸(CDRL1，对应于序列表中的SEQ ID NO．4)，SEQ ID NO．10的第55到61个氨基酸(CDRL2，对应于序列表中的SEQ ID NO．5)以及SEQ ID NO．10的第94到102个氨基酸(CDRL3，对应于序列表中的SEQ ID NO．6)所代表的。
下面的实施例将对本发明做进一步说明，这些实施例只是对本发明的说明而不是对本发明的限制。
实施例1制作CH11可变区的分子模型用‘制作同源性模型’法[Andrew等，(1991)酶学方法，203，121-125页]来制作CH11可变区的分子模型。
已被X-射线晶体结构确定的人免疫球蛋白可变区的一级结构已在蛋白数据库中做了登记(下文称作“PDB”，化学部，Building 555，Brookheaven国家实验室，P．O．Box 5000，Upton，纽约11973-5000，美国)。通过将CH11构架区的序列同蛋白数据库中的序列进行比较，证实两种人免疫球蛋白-1NBV和1IGI，分别同CH11的L和H链有最高的同源性。
根据这些已知的人FR区的结构，建立了CH11构架区的三维结构模型。该模型在下文中称作“构架模型”。
用Chothia等的方法[Chothia等，分子生物学杂志，(1987)，901-917]对CH11的CDR进行了分类。用这种方法，CDRL1被分到标准分类4中，CDRL2被分到标准分类1中，CDRL3被分到标准分类1中，CDRH1被分到标准分类1中。CDRH2和CDRH3没有相应定义的标准分类。把CDRL1CDRL2，CDRL3及CDRH1的CDR环归因为其各自的规范类别所固有的构象，然后将其汇总到构架模式中。
如下所述，对CDRH2和CDRH3的构象进行了鉴定。首先，从PDB中选出与CDR序列具有较高同源性的序列。根据这些已知序列的构象来建立CDRH2和CDRH3构象模型。这些构象的建立是结合了能量计算结果，并构建了最大概率的CDR环构象而且将其汇集到构架模型中。最后，需进行能量计算以去除任何从能量角度上讲不合适的原子接触，从而确定CH11的分子模型。上述步骤是通过使用AbM建立分子模型软件来完成的[牛津分子有限公司]。
可用PROCHECK软件[Laskowski，R．A．J．，(1993)，Appl．Cryst．26，283-291]来测定所得的分子模型结构的精确度。用Lee-Richards法[Lee，B．，和Richards，F．M．，+分子生物学杂志，(1971)，55，379-400]来计算每个残基的外露程度以确定原子之间的接触程度。
实施例2受体的选择将CH11L链和H链的序列同人抗体不同亚组的共有序列进行比较。发现CH11的L链同人kappaⅡ亚型有83％是相同的而CH11的H链同人Ⅰ亚型有74％是相同的。根据序列的同源性，选择人抗体RPM16410’CL(κⅡ亚型)以及21·28’CL(亚型Ⅰ)作为L链和H链的受体分子。
实施例3从CH11中选择要移植到受体中的供体残基用‘ Cameleon’软件[牛津分子有限公司]将CH11L链和H链的氨基酸序列分别同受体分子的序列进行对比。如上所述，根据准则(a)到(d)设计出人源化序列。设计出4条轻链序列和2条重链序列用作生产人源化抗-Fas抗体的基础。这些氨基酸序列和相应的编码这些氨基酸序列的核酸序列列在下面。L链(κ链)多肽VL-KY(SEQ ID No．78)和编码它们的DNA序列(SEQ ID No．77)；多肽VL-KF(SEQ ID No．80)和编码它们的DNA序列(SEQ ID No．79)；多肽VL-RY(SEQ ID No．82)和编码它们的DNA序列(SEQ ID No．81)；多肽VL-RF(SEQ ID No．84)和编码它们的DNA序列(SEQ ID No．83)。H链(μ链)多肽HμH链(SEQ ID No．86)和编码它们的DNA序列(SEQ ID No．85)；多肽HμM链(SEQ ID No．88)和编码它们的DNA序列(SEQ ID No．87)。
实施例4克隆编码人H链和L链的全长DNA(分别含有可变区中的亚型Ⅰ和Ⅱ)及其序列测定1引物的制备a)H链将小鼠单克隆抗体CH11H链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No．89)同Kabat等建的抗体氨基酸序列数据库[Kabat E．A．，等，见上文]进行比较以鉴定出任何同源序列。发现CH11H链(μ链)可变区的构架区氨基酸序列与人抗体亚组I的H链同源。这样，合成了可同数据库中编码人免疫球蛋白H链亚型I的DNA 5’-非翻译区的一部分序列杂交的寡核苷酸引物HVHI5-1；(SEQID No．90)。
Dorai和Gillies报导了编码人免疫球蛋白H链恒定区的DNA核酸序列[(1989)，核酸研究，17，6412]。据此，合成了可同3’非翻译区的一部分核酸序列杂交的寡核苷酸引物HCμ3-1；(SEQ ID No．91)。b)L链将小鼠单克隆抗体CH11L链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No．92)同Kabat等建的抗体氨基酸序列数据库[见上文]进行比较以鉴定出任何同源序列。发现CH11L链(κ链)可变区的构架区氨基酸序列与人抗体亚组Ⅱ的L链同源。这样，合成了同数据库中编码人免疫球蛋白L链亚组Ⅱ的DNA5’-非翻译区的一部分序列杂交的寡核苷酸引物HVKⅡ5-4；(SEQ ID No．93)。
Hieter等报导了编码人免疫球蛋白L链恒定区的DNA核酸序列[Hieter，P．A．，等(1980)，细胞22，197及后页]。据此，合成了可同3’非翻译区的一部分核酸序列杂交的寡核苷酸引物HKCL3-3；(SEQ ID No．94)。
上述寡核苷酸引物均是用380B型自动DNA合成仪[Perkin Elmer，日本]通过亚磷酰胺法[Mattrucci，M．D．，和Camthers，M．H．(1981)美国化学学会，103，3185及后页]合成的。合成后，把每个引物从载体上解离下来并去保护，然后低压冻干。将引物溶于100μl的无菌水中在-20℃下贮藏以备用。2)用聚合酶链式反应(PCR)扩增靶基因H链用PCR将编码人IgM H链的DNA片断扩增并分离。将人淋巴细胞cDNA文库用作DNA的原始来源。
具体地说，首先将限定如下的反应溶液在94℃下加热2分钟。然后再用这样的热循环加热样品94℃下1分钟，55℃下1分钟以及72℃下2分钟。循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。反应溶液的组成人淋巴细胞cDNA文库[Life Technologies]，25ng；寡核苷酸引物HVHI5-1，50pmol；寡核苷酸引物HCμ3-1，50pmol；25mM dNTPs混合物，10μl；100mM Tris-HCl缓冲液(pH8．5)，10μl；1M氯化钾[KCl]，5μl；25mM氯化镁[MgCl2]，10μl；Taq DNA聚合酶[Perkin Elmer 日本]，1个单位。
加入重蒸馏水将最终的体积调整到100μl。‘25mM dNTPs’指的是含有浓度均为25mM的dATP(脱氧腺苷三磷酸)，dCTP(脱氧胞苷三磷酸)，dGTP(脱氧鸟苷三磷酸)以及dTTP(脱氧胸苷三磷酸)的“dNTPs”混合物。L链用聚合酶链式反应将编码人IgML链的DNA片断扩增并分离。将人淋巴细胞cDNA文库用作DNA的起始来源。
具体地说，首先将限定如下的反应溶液在94℃下加热2分钟。然后再用这样的热循环加热样品94℃下1分钟，55℃下1分钟以及72℃下2分钟。循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。反应溶液的组成反应溶液的组成人淋巴细胞cDNA文库[Life Technologies]，25ng；寡核苷酸引物HVKⅡ5-4，50pmol；寡核苷酸引物HKCL3-3，50pmol；25mM dNTPs混合物，10μl；100mM Tris-HCl缓冲液(pH8．5)，10μl；1M氯化钾[KCl]，5μl；25mM氯化镁[MgCl2]，10μl；Taq DNA聚合酶[Perkin Elmer 日本]，1个单位。加入重蒸馏水将最终的体积调整到100μl。3)PCR产物的鉴定PCR扩增后，用琼脂糖凝胶电泳分析每个产物。将上面第(2)部分描述的反应溶液的等分试样，相当于200ng的DNA，在0．8％(w／v)琼脂糖凝胶中电泳。同与样品平行走电泳的分子标记泳带的迁移率相比较可估计出PCR产物的大小。发现人免疫球蛋白H链片断的大小大约是2，000个碱基对(下文中缩写为“bp”)，而人免疫球蛋白L链的大小大约是800bp。4)PCR产物的克隆用真核细胞TA克隆试剂盒[Invitrogen]将上面描述的第3部分中PCR产物连结到质粒载体中。
更具体地说，将60ng pCR3载体DNA(包含在试剂盒中)及4个单位的T4DNA连结酶加入到含有一部分PCR反应混合物的连结酶反应缓冲液中[6mMtris-HCl(pH7．5)，6mM氯化镁(MgCl2)，5mM氯化钠(NaCl)，7mMβ-巯基乙醇，0．1mM ATP，2mM DTT，1mM亚精胺，0．1mg／ml牛血清清蛋白]。所选择的PCR反应混合物的体积应当含有大约10ng所需PCR产物。将得到的混合物在14℃下温育15小时。
将一部分连结酶反应混合物(2μl)同50μl E．coli TOP10F’菌株(包含在试剂盒中)相混合，加入2μl0．5M的β-巯基乙醇使菌株成为感受态。将得到的混合物冰浴30分钟，然后加入500μl SOC培养基(包括在试剂盒中)，并将得到的混合物在37℃下摇床培养1小时。然后将培养液涂布在含有100μg／ml氨苄青霉素的L-肉汤琼脂培养基上[1％(w／v)细菌培养用胰蛋白冻(Difco)，0．5％(w／v)细菌培养用酵母提取物(Difco)，1％(w／v)葡萄糖，0．5％(w／v)NaCl，1．2％(w／v)细菌培养用琼脂(Difco)]并在37℃下培养过夜。
然后用铂环挖出出现的氨苄青霉素抗性菌落，并分别用5ml含有100μg／ml氨苄青霉素的液体L-肉汤培养基[1％(w／v)细菌培养用胰蛋白冻(Difco)，0．5％(w／v)细菌培养用酵母提取物(Difco)，0．5％(w／v)NaCl]于37℃下摇床培养过夜。然后离心这些培养物并回收细胞，用碱裂解法[Sambrook等，见上文]从回收细胞中制备质粒DNA。
将这样制备的质粒DNA用限制酶EcoR1消化，所用缓冲液是该酶提供的。在下文中的所有限制性消化反应所用的缓冲液都是该酶[Takara Shuzo]提供的。在复消化的情况下，则用一种对两种酶都适用的限制缓冲液。用0．8％(w／v)的琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。通过与在相同凝胶上走电泳的分子标记相比较，证实了质粒含有分别对应于人免疫球蛋白H链和L链的约2000bp和约800bp的DNA插人片断。选出含有这些片断的质粒。
具体地说，选出了下述两种质粒质粒pHH1-5，含有编码人免疫球蛋白H链的DNA片断的。具体地说，该质粒包含编码含有亚型Ⅰ可变区的人免疫球蛋白H链的cDNA插入片断。
质粒pHL15-27，含有编码人免疫球蛋白L链的DNA片断的。具体地说，该质粒包含编码含有亚型Ⅱ可变区的人免疫球蛋白L链的cDNA插入片断。5)对克隆的编码人免疫球蛋白H和L链的cDNA全长核酸序列的鉴定人免疫球蛋白H链由大约110个残基的N-末端可变区和相邻的大约510个残基的恒定区构成。另一方面，人免疫球蛋白L链由大约110个残基的N-末端可变区和相邻的含有大约107个残基的恒定区构成。
因此，推测上面第(4)部分克隆的编码人免疫球蛋白H链的cDNA核酸序列是由一个可变区和一个恒定区构成的。推测该可变区同亚型Ⅰ人免疫球蛋白H链的序列有高度的同源性[例如，克隆21／28’CL；Kabat E．A．，等(1991)，见上文]。编码人免疫球蛋白恒定区的核酸序列是已知的[Kabat E．A．，等(1991)，见上文]。
推测上面第(4)部分克隆的编码人免疫球蛋白L链的cDNA核酸序列是由一个可变区和一个恒定区构成的。推测该可变区同亚型Ⅱ人免疫球蛋白H链的序列有高度的同源性[例如，克隆PRMI 1604’CL；Kabat E．A．，等，见上文]。编码人免疫球蛋白恒定区的核酸序列是已知的[Kabat E．A．，等，见上文]。
为了进行序列分析，合成了20个核苷酸的寡核苷酸引物。这些引物是根据可变区的构架区的已知的保守序列和已知的恒定区的序列而设计的。这些引物被设计成相应于被100到200bp间隔所分开的序列，并已经同引物HVHI5-1，HVKⅡ5-4以及HKCL3-1(上文第2部分)一起在PCR中使用。
用于对H链进行序列分析所合成的寡核苷酸引物的序列如下SHHF-1；(SEQ ID No．95)；SHHF-2；(SEQ ID No．96)；SHHF-3；(SEQ ID No．97)；SHHF-4；(SEQ ID No．98)；SHHF-5；(SEQ ID No．99)；SHHF-6；(SEQ ID No．100)；SHHF-7；(SEQ ID No．101)；SHHF-8；(SEQ ID No．102)；SHHF-9；(SEQ ID No．103)；SHHF-10；(SEQ ID No．104)；SHHF-11；(SEQ ID No．105)；SHHF-13；(SEQ ID No．106)；SHHF-14；(SEQ ID No．107)；SHHF-15；(SEQ ID No．108)；SHHR-1；(SEQ ID No．109)；SHHR-2；(SEQ ID No．110)；SHHR-3；(SEQ ID No．111)；SHHR-4；(SEQ ID No．112)；SHHR-5；(SEQ ID No．113)；SHHR-6；(SEQ ID No．114)；SHHR-7；(SEQ ID No．115)；SHHR-8；(SEQ ID No．116)；SHHR-9；(SEQ ID No．117)；SHHR-10；(SEQ ID No．118)；SHHR-11；(SEQ ID No．119)；SHHR-12；(SEQ ID No．120)；SHHR-13；(SEQ ID No．121)；SHHR-14；(SEQ ID No．122)；和SHHR-15；(SEQ ID No．123)；图3显示了各引物所结合的位点。
用于对L链进行序列分析所合成的寡核苷酸引物的序列如下SHKF-1；(SEQ ID No．124)；SHKF-2；(SEQ ID No．125)；SHKF-4；(SEQ ID No．126)；SHKF-5；(SEQ ID No．127)；SHKF-6；(SEQ ID No．128)；SHKF-11；(SEQ ID No．129)；SHKF-12；(SEQ ID No．130)；SHKR-1；(SEQ ID No．131)；SHKR-2；(SEQ ID No．132)；SHKR-3；(SEQ ID No．133)；SHKR-4；(SEQ ID No．134)；SHKR-6；(SEQ ID No．135)；以及SHKR-13；(SEQ ID No．136)。
图4显示了各引物所结合的位点。
用上述引物和Prism Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing试剂盒[Perkin Elmer，日本]制备用于序列分析的样品。用上面第4部分描述的由质粒pHH1-5DNA或质粒pHL15-27DNA得到的质粒DNA作为模板。
具体地说，用4．8pmol某合适的引物同纯化的质粒DNA(1．5μl)相混合，并用蒸馏水将最终体积调节为16μl(这种溶液下文称作“质粒DNA／引物混合物”)。将一部分相当于每个引物的质粒DNA／引物混合物(9．5μl)加入到10．5μl由含有Taq DNA聚合酶的试剂盒所提供的预混合液中。将反应液放入自动反应仪中[Catalyst；Perkin Elmer，日本]。所用的反应循环如下95℃下30秒种，50℃下15秒种，60℃下4分钟，重复25次。
反应循环完成后，将80μl的蒸馏水加入到所得溶液中并用石炭酸-氯仿法[Sambrook等，见上文]两次提取所得溶液中的DNA。将回收的上清液层同15μl 2M的醋酸钠以及300μl 100％乙醇相混合，接着离心并回收DNA沉淀。用70％(v／v)的乙醇洗涤沉淀并减压干燥，然后溶解在3μl样品溶液中[4μl 0．25 M EDTA，100μl甲酰胺和16μl蒸馏水]。
在DNA测序仪[373A型；Perkin Elmer日本]中分析并进行测序反应。用30个样品分析人免疫球蛋白H链并用17个样品分析人免疫球蛋白L链。
分析结果证明质粒pHH1-5含有一DNA插入片断，所述DNA插入片断编码含有有亚型I可变区的人免疫球蛋白H链。另一方面，质粒pHL15-27一DNA插入片断，所述DNA插入片断编码含有有亚型Ⅱ可变区的人免疫球蛋白L链。
质粒pHH1-5和质粒pHL15-27所携带的DNA插入片断的核酸序列分别如SEQ ID No．137和SEQ ID No．138所示。
实施例5构建CH11L链人源化形式的表达载体的1)引物的制备下列DNA片断是用PCR法合成的编码VL-KY多肽链(SEQ ID No．78)的DNA(SEQ ID No．77)，编码VL-KF多肽链(SEQ ID No．80)的DNA(SEQ ID No．79)，编码VL-RY多肽链(SEQ ID No．82)的DNA(SEQ ID No．81)，编码VL-RF多肽链(SEQ ID No．84)的DNA(SEQ ID No．83)，下列合成的引物是用于PCR反应的VL1P；(SEQ ID No．139)；VL1N；(SEQ ID No．140)；VL2P；(SEQ ID No．141)；VL2N；(SEQ ID No．142)；VL3TYRP；(SEQ ID No．143)；VL3TYRN；(SEQ ID No．144)；VL3PHEP；(SEQ ID No．145)；VL3PHEN；(SEQ ID No．146)；VL4P；(SEQ ID No．147)；VL4N；(SEQ ID No．148)；VL5P；(SEQ ID No．149)；VL50RP；(SEQ ID No．150)；VL50RN；(SEQ ID No．151)；或VLTERM；(SEQ ID No．152)。2)构建质粒pHκKY2-58和质粒pHκKF2-19a)第一步PCR图5所示为第一步PCR的主要步骤。VL1制备出了编码分泌信号序列，CDRL1和FRL1区的氨基末端部分(下文称作“N-末端”)的DNA片断。该序列这里称作“VL1 DNA片断”。PCR反应条件如下反应液的组成质粒pHL15-27DNA，1μg；寡核苷酸引物VL5P，80pmol；寡核苷酸引物VL1N，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10xPfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。加入重蒸馏水将最终体积调整为200μl。10x的Pfu缓冲液是由Pfu聚合酶提供的。具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL2制备出了编码FRL1区羧基末端部分(下文称作“C-末端”)，CDRL1区和FRL2区N-末端的DNA片断。该序列在这里称作“VL2 DNA片断”。其PCR反应条件如下反应液的组成质粒pCR3-L103 DNA，1μg；寡核苷酸引物VL1P，80pmol；寡核苷酸引物VL2N，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10xPfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL3Y制备了编码CDRL2区，FRL3区(第87位的氨基酸残基被酪氨酸残基所代替)和CDRL3区的DNA片断。在本实施例和其它实施例中，对氨基酸的编号是根据Kabat给出的[Kabat等，见上文]该片断这里称作“VL3Y DNA片断”。其PCR反应条件如下反应液的组成质粒pHL15-27DNA，1μg；寡核苷酸引物VL2P，80pmol；寡核苷酸引物VL3TYRN，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL3F制备了编码CDRL2区，FRL3区(第87位的氨基酸残基被苯丙氨酸残基所代替)和CDRL3区的DNA片断。在本实施例和其它实施例中，对氨基酸的编号是根据Kabat给出的[Kabat等，见上文]该片断这里称作“VL3YF DNA片断”。其PCR反应条件如下反应液的组成质粒pHL15-27DNA，1μg；寡核苷酸引物VL2P，80pmol；寡核苷酸引物VL3 PHEN，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL4制备了编码CDRL3区，FRL4区和Ck区(恒定区的一部分)。该片断这里称作“VL4DNA片断”。其PCR反应条件如下反应液的组成质粒pHL15-27 DNA，1μg；寡核苷酸引物VL4P，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的VL1，VL2，VL3Y，VL3F和VL4 DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。用5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶对该DNA(约20-30μg)进行电泳分析。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割下来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。通过离心(7，500xg)1小时浓缩洗脱下的DNA，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。b)第二步PCR图6所示为第二步PCR的主要步骤。VL1-2用PCR制备上述VL1 DNA片断和VL2 DNA片断的融合片断。该片断在下文中称作“VL1-2 DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的VL1 DNA溶液，10μl第一步PCR制备的VL2 DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL5P，80pmol；
寡核苷酸引物VL2N，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL3Y-4用PCR制备上述VL3YDNA片断和VL4 DNA片断的融合片断。该片断在下文中称作“VL3Y-4DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的VL3YDNA溶液，10μl第一步PCR制备的VL4DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL2P，80 pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL3F-4用PCR制备上述融合的VL3F DNA片断和VL4 DNA片断。该片断在下文中称作“VL3F-4 DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的VL3F DNA溶液，10μl第一步PCR制备的VL4 DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL2P，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；
10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的VL1-2，VL3Y-4和VL3F-4 DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。用5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶对该DNA(约20-30μg)进行电泳分析。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割下来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。通过离心(7，500 xg)1小时浓缩洗脱下的DNA，接着用乙醇沉淀。每种情况中，将最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。c)第三步PCR图6所示为第一步PCR的主要步骤。VL-KY用PCR制备上述VL1-2 DNA片断和VL3Y-4 DNA片断的融合片断。该片断在下文中称作“VL-KYDNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第二步PCR制备的VL1-2 DNA溶液，10μl第二步PCR制备的VL3Y-4 DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL5P，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL-KF用PCR制备上述VL1-2 DNA片断和VL3F-4 DNA片断的融合片断。该片断在下文中称作“VL-KF DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第二步PCR制备的VL1-2 DNA溶液，10μl第二步PCR制备的VL3F-4 DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL5P，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的VL-KY和VL-KF DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。用5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶对该DNA(约20-30μg)进行电泳分析。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割下来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。
图8概要显示了携带VL-KY或VL-KFDNA的质粒的构建。
用石炭酸进一步纯化这样得到的VL-KY和VL-KF DNA，接着用乙醇沉淀。然后在37℃下，用10个单位的限制酶Xhol和Xbal消化一部分DNA(约1μg)，所用的合适的缓冲液由这些酶提供。
一部分(1μg)质粒pME18S DNA[Hara，T．和Miyajima，A．，(1992)，胚胎学杂志，11，1875]也被限制酶Xhol和Xbal所消化。用牛小肠碱性硫酸酶(下文中缩写为“CIP”，Takara Shuzo)处理所得DNA以去除任何5’磷酸基团。将一部分(100ng)去磷酸化的pME18S质粒DNA连接到0．5μg Xbal和Xhol所消化的每一个VL-KY和VL-KF DNA片断上。用连接试剂盒[Tara Shuzo]进行连接反应，并用电穿孔法将连接反应产物转化到E．coli菌株DH5α[Gibco-BRL]中。
具体地说，将50μl感受态细胞解冻并与5μl连结反应混合物混合。把混合物转入电穿孔仪的样品池[BioRad]中。所用脉冲为25μF，1．8kV，200Ω。脉冲后，将细胞再次悬浮于1ml SOD培养液中。细胞悬浮物被转入无菌试管并在37℃下温育1小时。所得到的细胞在含有50μg氨苄青霉素的LB培养基上涂平板。
对转化子菌落所含的DNA进行限制性分析以鉴定出含有目的DNA插入片断的质粒。具体地说，质粒DNA是通过实施例4第4部分所提供的方法从转化子细胞的过夜培养物制备出的。用原来的限制酶(本实施例中的Xho 1和Xba 1)消化质粒DNA以确保克隆的DNA大小合适。
除非有特殊的说明，下文中所有具体的连接反应，转化作用和转化子的分析均是用上述方法进行的。
已证实质粒pHκKY2-58含有VL-KY DNA片断而质粒pHκKF2-19含有VL-KF DNA片断。两种情况下，片断均以正确取向插入到pME18S启动子SRα的下游以表达免疫球蛋白产物。3)构建质粒pHκRY2-10和pHκRF2-52用从质粒pHκKY2-58 DNA和质粒pHκKF2-19 DNA得到的DNA作为模板，构建另外两个表达载体。a)第一步PCR图9所示为第一步PCR的主要步骤VLR5’制备出编码分泌信号序列，FRL1区，CDRL1区，和FRL2区(第45位的赖氨酸残基被精氨酸残基所替代)的DNA片断。下文中将该片断称作“VLR5’DNA片断”。PCR的反应条件如下反应液的组成质粒pHκKY2-58 DNA，1μg；寡核苷酸引物VL5P，80 pmol；寡核苷酸引物VLRN，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VLR3’Y制备出编码FRL2区(其中第45位的赖氨酸残基被精氨酸残基所替代)，CDRL2区，FRL2区(第87位为酪氨酸残基)，FRL3区和Ck区的DNA片断。下文将该片断称作“VLR3’YDNA片断”。PCR的反应条件如下质粒pHκKY2-58 DNA，1μg；寡核苷酸引物VLRP，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VLR3’F制备出编码FRL2区(其中第45位的赖氨酸残基被精氨酸残基所替代)，CDRL2区，FRL3区(第87位为苯丙氨酸残基)，CDRL3区，FRL4和Ck区的DNA片断。下文将该片断称作“VLR3’F DNA片断”。PCR的反应条件如下质粒pHκKF2-19DNA，1μg；寡核苷酸引物VLRP，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的VLR5’，VLR3’Y，VLR3’F片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。用5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶对该DNA(约20-30μg)进行电泳分析。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割下来并用装有Centricon10[Amicon]的Centruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。通过离心(7，500 xg)1小时浓缩洗脱下的DNA，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。b)第二步PCR图10所示为第二步PCR的主要步骤。VL-RY用PCR制备上述VLR5’DNA片断和VL3’YDNA片断的融合片断。(该片断在下文中称作“VL-RY DNA片断”)。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的VLR5’DNA溶液，10μl第一步PCR制备的VLR3’DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL5P，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VL-RF用PCR制备上述VLR5’DNA片断和VLR3’F DNA片断的融合片断。该片断在下文中称作“VL-RF DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的VLR5’DNA溶液，10μl第一步PCR制备的VLR3’DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VL5P，80pmol；寡核苷酸引物VLTERM，80pmol；25mM dNTP混合物，20μl；
10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的VL-RY和VL-RF片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。用5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶对该DNA(约20-30μg)进行电泳分析。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过1小时离心(7，500xg)，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。
图11所示为构建携带VL-RY和VL-RF DNA片断的草图。
进一步用石炭酸抽提然后用乙醇沉淀以纯化VL-RF DNA片断。然后用限制酶Xhol和Xbal消化该DNA(1μg)。
一部分(1μg)的质粒pME18S DNA[Hara，T．和Miyajima，A．见上文]也被限制酶Xho1和Xba1所消化。用CIP处理所得DNA。将一部分(100ng)脱磷酸化的pME18S质粒DNA连接到0．5μg用Xba1和Xho1所消化的每一个VL-RY和VL-RF DNA片断上。用连接试剂盒[Takara Syuzo]进行连接反应，并将连接反应产物转化到E．coli菌株DH5α中。
如上所述，对转化子菌落中的质粒DNA进行限制性分析以鉴定含有目的DNA插入片断的质粒。证实了质粒pHκKY2-10含有VL-RY DNA片断而质粒pHκKF2-52含有VL-RF DNA片断。两种情况下，片断均以正确取向插入到了pME18S启动子SRα的下以表达免疫球蛋白产物。4)核酸序列的鉴定质粒pHκKY2-58，pHκKF2-19，pHκKY2-10和pHκRF2-52的DNA插入片断已被测序。在该测序步骤中所用的引物为上述SHKF-4，SHKF-5，SHKF-6，SHKF-12，SHKR-13，SHKF-11，SHKF-2和SHKR-3。另外，合成了三个新引物；PMEF2；(SEQ ID No．153)；SHKF-14(SEQ ID No．154)；以及PMER2；(SEQ ID No．155)。
用双脱氧链终止法[Sanger，F．S．等(1977)美国科学院学报美国745463]对DNA进行测序。在测序前，用碱-SDS裂解法[Sambrook，J．等，见上文]从宿主细胞中分离出质粒DNA模板并用氯化铯离心[Sambrook，J．等，出处同上]纯化该DNA。
具体地说，将一部分纯化的质粒DNA(1μg)溶解于16μl重蒸馏水中。把该溶液同2μl 2mM EDTA和2μl 2N氢氧化钠(NaOH)相混合，然后在室温下培养5分钟。然后加入一部分(4μl)10mM的醋酸铵溶液和100μl100％乙醇，并将该混合物置于干冰中10分钟。以15，000rpm的转速离心5分钟回收溶液中DNA。用80％(v／v)的乙醇洗涤所得沉淀并减压干燥。将干燥的DNA溶解在7μl的重蒸馏水中并作为测序中使用的模板。
用7-Deaza-Sequenase试剂盒，2．0型，dCTP试剂盒[Amersham]实施核酸测序反应。将全部的质粒溶液(7μl)加入到1pmol的引物和1μl的反应缓冲液中(试剂盒所提供的)。将该混合物在65℃下培养2分钟。通过逐步将混合物冷却到室温使质粒DNA同引物退火。按照试剂盒中的说明，用[α32P]dCTP[Amersham]实施DNA标记反应。用含有5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶，8M尿素的TEB缓冲液[100mM Tris，100mM硼酸，1 mM EDTA，pH8．3]对反应产物进行电泳分析。将凝胶干燥，用放射性自显影技术鉴定DNA序列。
质粒pHκKY2-58的DNA插入片断的序列如SEQ ID No．77所示。该核酸序列含有一个编码含有SEQ ID No．78所限定多肽链的开放阅读框架。
质粒pHκKF2-19的DNA插入片断的序列如SEQ ID No．79所示。该核酸序列含有一个编码含有SEQ ID No．80所限定多肽链的开放阅读框架。
质粒pHκRY2-10的DNA插入片断的序列如SEQ ID No．81所示。该核酸序列含有一个编码含有SEQ ID No．82所限定多肽链的开放阅读框架。
质粒pHκRF2-52的DNA插入片断的序列如SEQ ID No．83所示。该核酸序列含有一个编码含有SEQ ID No．84所限定多肽链的开放阅读框架。
实施例6构建CH11H链人源化形式的表达载体a)引物的制备下列DNA片断是用PCR合成的编码HμH链(一条人源化抗人Fas抗体CH11H链)多肽链(SEQ ID No．86)的DNA(SEQ ID No．85)；以及编码HμM链(一条人源化抗人Fas抗体CH11H链)多肽链(SEQ ID No．88)的DNA(SEQ ID No．87)；为PCR反应合成了如下22个引物(VH1P；(SEQ ID No．156)；(VHSP；(SEQ ID No．157)；VHSN；(SEQ ID No．158)；VH2P；(SEQ ID No．159)；VH2N；(SEQ ID No．160)；VH3P；(SEQ ID No．161)；VH3N；(SEQ ID No．162)；VH4P；(SEQ ID No．163)；VH4N；(SEQ ID No．164)；VHAPAPX；(SEQ ID No．165)；VHAPAN；(SEQ ID No．166)；VHTERM；(SEQ ID No．167)；HUMFR2P；(SEQ ID No．168)；MOUFR2N；(SEQ ID No．169)；MOUFR2P；(SEQ ID No．170)；MOUFR2；(SEQ ID No．171)；GTOSP；(SEQ ID No．172)；GTOSN；(SEQ ID No．173)；TCVVAP；(SEQ ID No．174)；TCVVN1；(SEQ ID No．175)；ME18P；(SEQ ID No．176)；和VH06；(SEQ ID No．178)；2)构建质粒pMEC22在一多步骤方法中构建了人源化CH11链的表达载体。首先，构建了含有人IgMH链恒定区羧基末端(下文称作“C-末端”)的质粒。MEC制备了编码人IgMH链C-末端氨基酸序列的DNA片断。该片断在下文中称作“MEC DNA片断”。图12显示了构建过程的草图。该PCR反应条件如下反应液的组成质粒pHH1-5 DNA，1μg；寡核苷酸引物VHAPAPX，80pmol；寡核苷酸引物VHTERM，80pmol；dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的MEC DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。
图13显示了构建携带MEC DNA片断的质粒的草图。
用石炭酸抽提然后用乙醇沉淀以进一步纯化MEC DNA片断。然后用限制酶Xhol和Xbal消化该DNA(1μg)。
也用限制酶Xhol和Xbal消化了一部分(1μg)质粒pME18S DNA[Hara，T．和Miyajima，A．，见上文]。用CIP处理所得到的DNA。把一部分(100ng)去磷酸化的pME18S质粒DNA连接到0．5μg被Xbal和Xhol所消化的MEC片断。用连接反应试剂盒[Takara Shuzo]实施连接反应，并将连接产物转化到E．coli JM109菌株[Takara Shuzo]中。
对转化子菌落中的质粒DNA进行限制性分析以鉴定出含有目的DNA插入片断的质粒。得到质粒pMEC22，MEC DNA以正确的取向插入到pME18S SRα启动子的下游以表达免疫球蛋白产物。3)构建质粒pMEHC20a)第1步PCR图14显示了第一步PCR的草图HSEC制备出编码一个分泌信号序列和FRH1区N-末端的DNA片断。下文中将该片断称作“HSEC DNA片断”。所用PCR反应条件如下反应混合物的组成为质粒pCR3-H123 DNA，1μg；寡核苷酸引物VHSN，80pmol；寡核苷酸引物VH1P，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VH1制备出编码FRH1区和CDRH1区N-末端的DNA片断。下文中将该片断称作“VH1 DNA片断”。所用PCR反应条件如下反应混合物的组成为质粒pHH1-5DNA，1μg；寡核苷酸引物VHSP，80pmol；寡核苷酸引物VH2N，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VH2制备出编码CDRH1区，FRH2区C-末端和CDRH2区N-末端的DNA片断。下文中将该片断称作“VH2 DNA片断”。所用PCR反应条件如下反应混合物的组成为质粒pCR3-H123 DNA，1μg；寡核苷酸引物VH2P，80pmol；寡核苷酸引物VH3N，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VH3制备出编码FRH1区和CDRH2区N-末端，FRH3区和CDRH3区的DNA片断。下文中将该片断称作“VH3 DNA片断”。所用PCR反应条件如下反应混合物的组成为质粒pHH1-5 DNA，1μg；寡核苷酸引物VH3P，80pmol；寡核苷酸引物VH4N，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VH4
制备出编码CDR3区，FR-4区和H链恒定区N-末端的DNA片断。下文中将该片断称作“VH4DNA片断”。所用PCR反应条件如下反应液的组成为质粒pHH1-5 DNA，1μg；寡核苷酸引物VH4P，80pmol；寡核苷酸引物VHAPAN，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取PCR扩增的HSEC，VH1，VH2，VH3和VH4 DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。b)第2步PCR图15所示为第2部PCR的草图。VHS12用PCR制备上述HSEC，VH1和VH2的融合DNA片断。该片断在下文中称作“VHS12 DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的HSECDNA溶液，10μl第一步PCR制备的VH1 DNA溶液，10μl第一步PCR制备的VH2 DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VH1P，80pmol；寡核苷酸引物VH3N，80pmol；
25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。VH34用PCR制备上述VH3 DNA和VH4 DNA的融合片断。该片断在下文中称作“VHS34DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的VH3DNA溶液，10μl第一步PCR制备的VH4DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VH3P，80pmol；寡核苷酸引物VHAPAN，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取VHS12和VH34 DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。c)第3步PCR图16显示了第3步PCR的草图。VHS1234
用PCR制备上述VH12 DNA片断和VH34 DNA片断的融合片断。该片断在下文中称作“VHS1234 DNA片断”。使用下述PCR反应条件反应液的组成第二步PCR制备的VH12 DNA溶液，10μl第二步PCR制备的VH34 DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VH1P，80pmol；寡核苷酸引物VHAPAN，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取VHS1234 DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。
图17所示为构建带有VHS1234 DNA的质粒的草图。
用石炭酸抽提然后用乙醇沉淀从而进一步纯化所得VHS1234 DNA片断。然后用限制酶Xho1和Apa1消化该DNA。
也用限制酶Xho1和Apa1消化了一部分(1μg)pMEC22质粒DNA。然后用CIP脱磷酸化。把一部分(100ng)脱磷酸化的pMEC22质粒DNA连接到0．5μg被Xho1和Apa1所消化的VHS1234 DNA片断上。用连接反应试剂盒[Takara Shuzo]实施连接反应，并将连接产物转化到E．coli JM109菌株[TakaraShuzo]中。
对转化子菌落中的质粒DNA进行限制性分析以鉴定出含有目的DNA插入片断的质粒。得到含有VHS1234 DNA片断的质粒pMEHC20。将该片断以正确的取向插入到pMHC22 SRα启动子的下游以表达免疫球蛋白产物。4)构建质粒pHFR3和质粒pHFR4a)第一步PCR图18为第一步PCR的示意图。HUMFR5’制备出编码分泌信号序列，FRH1区，CDRH1，以及FRH2区(其中第38到第44位氨基酸残基被精氨酸，谷氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸和甘氨酸残基所取代)的DNA片断。下文将该片断称作“HUMFR5’DNA片断”。其PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEHC20 DNA，1μg；寡核苷酸引物VH1P，80pmol；寡核苷酸引物HUMFR2N，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。HUMFR3’制备出编码FRH2区(其中第38到第44位氨基酸残基被精氨酸，谷氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸和甘氨酸残基所取代)的DNA片断。下文将该片断称作“HUMFR3’DNA片断”。其PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEHC20 DNA，1μg；寡核苷酸引物VH06，80pmol；寡核苷酸引物HUMFR2P，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；PfuDNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。MOUFR5’制备出编码分泌信号序列，FRH1区，CDRH1，以及FRH2区(其中第38到第44位氨基酸残基被赖氨酸，谷氨酸，丙氨酸，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸和丝氨酸所替代)的DNA片断。下文将该片断称作“MOUFR5’DNA片断”。其PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEHC20 DNA，1μg；寡核苷酸引物VH1P，80pmol；寡核苷酸引物MOUFR2N，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；PfuDNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。MOUFR3’制备出编码FRH2区(其中第38到第44位氨基酸残基被赖氨酸，谷氨酸，丙氨酸，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸和丝氨酸所替代)，CDRH2区，FRH3区，CDRH3区，FRH4区，以及H链恒定区N-末端的DNA片断。下文将该片断称作“MOUFR3’DNA片断”。其PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEHC20DNA，1μg；寡核苷酸引物VH06，80pmol；寡核苷酸引物MOUFR2P，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取HUMFR5’，HUMFR3’，MOUFR5’以及MOUFR3’DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。b)第二步PCR图19是第二步PCR的示意图。HUMFR2用PCR制备上述HUMFR5’和HUMFR3’DNA的融合片断。该片断在下文中称作“HUMFR2DNA片断”)。使用下述PCR反应条件反应液的组成第一步PCR制备的HUMFR5’DNA溶液，10μl第一步PCR制备的HUMFR3’DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VH1P，80pmol；寡核苷酸引物VH06，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。MOUFR2用PCR制备上述MOUFR5’和MOUFR3’DNA的融合片断。该片断在下文中称作“MOUFR2DNA片断”)。使用下述PCR反应条件反应液的组成
第一步PCR制备的MOUFR5’DNA溶液，10μl第一步PCR制备的MOUFR3’DNA溶液，10μl寡核苷酸引物VH1P，80pmol；寡核苷酸引物VH06，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取HUMFR2和MOUFR2DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。
用石炭酸抽提随后用乙醇沉淀以进一步纯化这样得到的HUMFR2和MOUFR2 DNA片断。然后用限制酶Xho1和Bg1Ⅱ消化该DNA。
图12为构建携带HUMFR2 DNA片断及MOUFR2 DNA片断的质粒的示意图也用限制酶Xho1和Bg1Ⅱ消化了一部分(1μg)pMHC20质粒DNA。然后用CIP脱磷酸化。把一部分(100ng)脱磷酸化的pMHC20质粒DNA连接到0．5μg被Xho1和Bg1Ⅱ所消化的HUMFR2或MOUFR2 DNA片断。用连接反应试剂盒[Takara Syuzo]实施连接反应，并将连接产物转化到E．coli JM109菌株[Takara Shuzo]中。
对转化子菌落含有的质粒DNA进行限制性分析以鉴定出含有目的DNA插入片断的质粒。于是得到了含有HUMFR2 DNA片断的质粒pHFR3，含有MOUFR2 DNA片断的质粒pHFR4。5)构建质粒pMECW5
用PCR以质粒pMEC22DNA为PCR反应的模板构建质粒pMECW5。
图21为该PCR反应的示意图。a)第一步PCRHHC1制备出代表质粒pMEC22 DNA插入片断5’-端的DNA片断。下文中将该片断称作“HHC1 DNA片断”。该PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEC22 DNA，1μg；寡核苷酸引物ME18P，80pmol；寡核苷酸引物GTOSN，80pmol；25mM dNFPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。HHC2制备出相应于质粒pMEC22 DNA插入片断中间区的DNA片断。下文中将该片断称作“HHC2 DNA片断”。该PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEC22 DNA，1μg；寡核苷酸引物GTOSP，80pmol；寡核苷酸引物TCVVN1，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。HHC3
制备出代表质粒pMEC22DNA插入片断3’-端的DNA片断。下文中将该片断称作“HHC3 DNA片断”。该PCR反应条件如下反应溶液的组成质粒pMEC22 DNA，1μg；寡核苷酸引物TCVVAP，80pmol；寡核苷酸引物VHTERM，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20ul；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取HHC1，HHC2和HHC3 DNA片断。然后用100％乙醇沉淀DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。b)第二步PCR图22所示为第二步PCR的草图。HHC1-2通过PCR法制备了HHC1 DNA片断和HHC2 DNA片断的融合片断。下文中将该DNA片断称作“HHC1-2DNA片断”。其PCR反应条件如下反应溶液的组成第一步PCR中制备的HHC1 DNA溶液，10μl；第一步PCR中制备的HHC2 DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物ME18P，80pmol；寡核苷酸引物TCVVN，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；
10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取所得到的HHC1-2片断。然后用乙醇沉淀该DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。c)第三步PCR图23所示为第三步PCR的示意图。HHC123用PCR法制备出上述HHC1-2和HHC3 DNA的融合DNA片断。下文中将该片断称作“HHC123 DNA片断”。该PCR反应条件如下反应溶液的组成第一步PCR中制备的HHC3 DNA溶液，10μl；第二步PCR中制备的HHC1-2 DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物ME18P，80pmol；寡核苷酸引物VHTERM，80pmol；25mM dNTPs混合物，20μl；10x Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶[Stratagene]，10个单位。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取所得到的HHC1-2片断。然后用乙醇沉淀该DNA。将该DNA(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时的离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在50μl的蒸馏水中。
图24为构建带有HHC123 DNA的质粒的示意图。
通过石炭酸抽提及随后的乙醇沉淀以进一步纯化这样得到的HHC123DNA。用限制酶Xho1和Xba1消化该DNA。
也用限制酶Xhol和Xbal消化了一部分(1μg)质粒pME18S DNA[Hara，T．和Miyajima，A．，见上文]。然后用CIP脱磷酸化。把一部分(100ng)脱磷酸化的pME18S质粒DNA连接到0．5μg被Xhol和Xbal所消化的HHC123 DNA片断上。用连接反应试剂盒[Takara Shuzo]实施连接反应，并将连接产物转化到E．coli JM109菌株[Takara Shuzo]中。
对转化子菌落含有的质粒DNA进行限制性分析以鉴定出含有目的DNA插入片断的质粒。鉴定出质粒pMECW含有HHC123 DNA片断。6)构建人源化形式的编码CH11 H链的表达质粒pHμH5-1和表达质粒pHμM1-1将质粒pHFR3 DNA，质粒pHFR4 DNA和质粒pMECW5 DNA的DNA连接起来以构建最终的表达质粒pHμHM5-1和pHμM1-1。
如下制备出HFR3 DNA片断。同时用限制酶Apa1和Xho1消化一部分(30μg)质粒pHFR3 DNA。用5％(w／v)的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离消化产物。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测到的大小为950bp的目的DNA片断从凝胶中切割下来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱出来。
如下制备出HFR4 DNA片断。同时用限制酶Apa1和Xho1消化一部分(30μg)质粒pHFR3 DNA。用5％(w／v)的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离消化产物。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测到的大小为950bp的目的DNA片断从凝胶中切割下来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱出来。
用限制酶Xho1和Apa1消化了一部分(1μg)质粒pMECW5DNA。然后用CIP脱磷酸化。把一部分(100ng)脱磷酸化的pMECW5质粒DNA连接到，每个上面制备的0．5μg HFR3 DNA或HFR4 DNA片断上。用连接反应试剂盒[Takara Syuzo]实施连接反应，并将连接产物转化到E．coli DH5α菌株[TakaraShuzo]中。
对转化子菌落中的质粒DNA进行限制性分析以鉴定含有目的DNA插入片断的质粒。证实质粒pHμH5-1含有HFR3 DNA片断。质粒pHμM1-1含有HFR4 DNA片断。7)核酸序列的鉴定质粒pHμH5-1和pHμM1-1的DNA插入片断已经被测序。测序过程中所用的引物为上面描述的ME18P(SEQ ID No．176)和VH06(SEQ ID No．178)，还有8个新合成的引物。它们是ME18RV；(SEQ ID No．177)；VH05；(SEQ ID No．179)；VH07；(SEQ ID No．180)；VH08；(SEQ ID No．181)；VH01；(SEQ ID No．182)；VH02；(SEQ ID No．183)；VH03；(SEQ ID No．184)；以及VH04；(SEQ ID No．185)．用双脱氧链终止法[Sanger，F．S．等，见上文]对DNA进行测序。在测序前，用碱-SDS裂解法[Sambrook，J．等，见上文]将质粒DNA模板从宿主细胞中分离出来并用氯化铯[Sambrook，J．等，出处同上]纯化该DNA。
经测序分析证实了pHμH5-1的DNA插入片断序列编码SEQ ID No．86所定义的多肽。pHμM1-1的DNA插入片断序列编码SEQ ID No．88所定义的多肽。
实施例7COS-7细胞中编码人源化形式的CH11亚基的DNA的表达上面构建的人源化H链DNA和人源化L链DNA在COS-7细胞系中进行了表达，该细胞系是从猴肾中得到的。用基因转染仪ECM600M(BTX)，通过电穿孔法使人源化H链和人源化L链的表达质粒被转染到COS-7细胞系中。
将COS-7细胞[美国典型培养物保藏号No．CRL-1651]培养在225cm2培养瓶中[Sumitomo Bakelite]。这些细胞在含有10％肽牛血清[CSL]的Dulbecco改进的Eagle培养基(下文简写为“DMEM”；Nissui Seiyaku)生长成为半融合状。去掉培养基并用3ml的胰蛋白酶-EDTA溶液[Sigma Chemicals公司]在37℃下处理COS-7细胞3分钟。在800rpm的转速下离心2分钟以回收这些细胞，然后用磷酸缓冲液
洗涤细胞两次。用PBS(-)缓冲液将洗涤过的COS-7细胞浓度调整到4×106个细胞／毫升以得到COS-7悬浮液。
平行地，用质粒Maxiprep试剂盒[MaxiPrep DNA Purification试剂盒；Promega]由H链表达质粒和L链表达质粒制备质粒DNA。将每一条重链表达质粒和轻链表达质粒的一部分DNA(40μg)混合在一个试管中，然后用100％的乙醇沉淀。下面限定了轻链和重链DNA混合物的组合。用40μl的PBS(-)缓冲液重悬浮该DNA。将得到的重链混合物(40μl)同500μl上面制备的COS-7细胞悬浮液(2×106)相混合。
将该混合物转入一有4mm(BioRad)电极间隔的电穿孔样品池中，然后放入电穿孔仪中。然后用电穿孔法将目的质粒DNA导入COS-7细胞中，用150V，900μF的脉冲。电穿孔后，将细胞-DNA混合物重悬浮于20ml含有10％胎牛血清的DMEM中，然后转入75cm2的培养瓶中[SumitomoBakelite]。将这些细胞在37℃下于7．5％的二氧化碳中培养24小时。去除培养物上清液并用无血清DMEM培养液洗涤这些细胞。加入一部分(20ml)无血清培养液并将这些细胞在37℃下于7．5％的二氧化碳中培养24小时。
按上述方法，用下面的质粒或质粒联合转染COS-7细胞。在每种情况下都回收上清液。
(A)pME18S(B)pHμM1-1和pHκKY2-58(C)pHμM1-1和pHκKF2-19
(D)pHμM1-1和pHκRY2-10(E)pHμM1-1和pHκRF2-52(F)pHμM5-1和pHκKY2-58(G)pHμM5-1和pHκKY2-19(H)pHμM5-1和pHκRY2-10(I)pHμM5-1和pHκKY2-52检测实施例1人源化抗-人Fas抗体的检测可用Western印迹来鉴定通过本发明生产的人源化抗-人Fas抗体。该方法涉及用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文称作“SDS-PAGE”)分离蛋白质，接着将蛋白转到硝酸纤维素膜上。通过与抗体的交叉反应可鉴定出转移的蛋白质。1)用SDS-PAGE进行分离用排阻限为12，000-14，000道尔顿的透析管，在5升水中透析实施例7中得到的一部分(1ml)培养物的上清液。在4℃下透析15小时。用离心-浓缩器[CC-101；Tomy Seiko]在真空下干燥所得到的溶液。把混合液在100℃下加热5分钟后，加入一部分(10μl)样品缓冲液[2％(w／v)SDS(电泳级；BioRad)，5％(v／v)β-巯基乙醇(Sigma Chemicals有限公司)，10％(v／v)甘油，0．1％(w／v)溴酚蓝]以产生电泳样品。将得到的电泳样品放入SDS-PAGE(4％到20％梯度凝胶；Iwaki Glass)，并于室温下在20mA的恒定电流下电泳1小时。2)蛋白质的转移和固定一旦进行了电泳，就要用半干印迹法[Towbin，H．，等，(1979)，美国科学院学报美国，76，4530]将蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜[转移印迹转移膜；BioRad]中。所用的特定设备和条件如下转移缓冲液20mM Tris，150mM甘氨酸，10％(v／v)的甲醇；印迹设备由Iwaki Glass(TF03-05)所生产；走电泳的条件4℃，0．2A(恒定电流)，1小时。
在相同条件下进行SDS-PAGE和Western印迹，得到两个相同的硝酸纤维素膜。分析一个膜以检测L链并分析另一个膜以检测H链。3)抗体的鉴定经Western转移后，将硝酸纤维素膜浸渍在含有3％(w／v)明胶[NipponBioRad]的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7．5)以及500mM氯化钠[NaCl](下文中称作“TBS”)水溶液中。在室温下将该膜摇动1小时(下文将这一步骤称作“封闭”)。
用过氧化氢酶标记的抗-人IgM链抗体对人源化抗体H链[过氧化氢酶结合的亲和纯化山羊抗-人IgM，Fc5μ特异性片断，Jackson免疫学研究实验室]进行了鉴定。封闭后，从封闭液中取出硝酸纤维素膜并在10ml含有5μl标记的抗-人IgM H链抗体的缓冲液(含有1％(w／v)明胶的TBS溶液)中摇动1小时。然后取出硝酸纤维素膜并浸渍在20ml含有2％(v／v)吐温20[Biorad]的TBS溶液中，并在室温下轻轻摇动洗涤20分钟。重复该洗涤过程。然后用纸巾把洗涤过的硝酸纤维素膜印迹干燥。
通过过氧化氢酶同抗体结合的能力来鉴定膜上的蛋白质同抗体间的交叉反应性。
用ECL Western印迹系统[Amersham]对膜上残留的过氧化氢酶活性进行检测。更具体地说，该系统中的底物在过氧化氢酶的催化作用下进行化学反应时能够发光。可用ECL微型照相机[Amersham]和快照胶卷[667型；宝丽莱]检测所发出的光。残留在凝胶中的蛋白质被感光[Oakley等，(1980)，分析生物化学，105，361及后页]。所拍摄的照片同感光的凝胶相比较以鉴定特异地结合到抗体上的蛋白质带。
用过氧化氢酶标记的抗-人IgM链抗体对人源化抗体L链[过氧化氢酶标记的人κ轻链HP6156单克隆抗体；Kilkeguard和Perry实验室]进行了鉴定。封闭后，从封闭液中取出硝酸纤维素膜并在10ml含有5μl标记的抗-人IgM L链抗体的缓冲液(含有1％(w／v)明胶的TBS溶液)中于室温下摇动4小时。然后取出硝酸纤维素膜并浸渍在20ml含有2％(v／v)吐温20的TBS溶液中，并在室温下轻轻摇动洗涤20分钟。重复该洗涤过程。然后用纸巾把洗涤过的硝酸纤维素膜印迹干燥。
同检测人源化H链一样，可用ECL Western印迹系统[Amersham]对同抗体反应的任何蛋白质进行检测。交叉反应后会导致发光，可用摄影胶卷进行检测。所拍摄的照片同感光的凝胶相比较以鉴定特异地结合到抗体上的蛋白质带。
用对人H链特异性的抗体，从而在实施例7中的样品(B)，(C)，(D)，(E)，(F)，(G)，(H)和(I)中检测出分子量约为78，000道尔顿的蛋白质带。这些样品均取自被pHμM1-1或pHμH5-1转染的COS-细胞。
用对人L链特异性的抗体，从而在实施例7中的样品(B)，(C)，(D)，(E)，(F)，(G)，(H)和(I)中检测出分子量约为25，000道尔顿的蛋白质带。这些样品均取自被质粒pHκKY2-58，质粒pHκKF2-19，质粒pHκRY2-10或质粒pHκRF2-52所转染的COS-细胞。检测实施例2抗-Fas抗体同Fas抗原的结合活性的鉴定用ELISA技术对本发明中的人源化抗-Fas抗体同Fas抗原将的结合能力进行鉴定。该方法涉及制备可溶性人源化Fas融合蛋白，以及对抗体同可溶性蛋白相结合的鉴定。1)可溶性人Fas抗原融合蛋白的表达为了生产可溶性人Fas抗原，构建了由人Fas抗原胞外区和小鼠白细胞介素-3受体胞外区所组成的融合蛋白表达载体。下文中将该蛋白称作“人Fas融合蛋白”。
用PCR法制备编码人Fas融合蛋白DNA，如下；a)模板DNA在本PCR反应中需用两个质粒的质粒DNA以生产人Fas融合蛋白。第一个质粒是编码小鼠Fas抗原胞外区[Watanabe-Fukunaga，R．，等(1992)，免疫学杂志，148，1274及后页]和小鼠白细胞介素-3受体胞外区受体[Gorman，D．，等，(1990)，美国科学院学报美国87，5459及后页，Hara，T．和Miyajima，A．，(1992)，胚胎学杂志，11，1875][Nishimura，Y．等，(1995)，免疫学杂志，154，4539]融合蛋白的质粒pME18S-mFas-AIC[Nishimura，Y．等，(1995)，免疫学杂志，154，4395]。另一个质粒是携带有编码人Fas抗原cDNA的pCEV4[Itoh，N．，等，(1991)，细胞，66，233]。b)引物的制备为PCR反应制备了四个核苷酸引物。所制备引物的序列为N1；(Seq．ID No．186)；C3N；(Seq．ID No．187)；N3N；(Seq．ID No．188)以及CTN2；(Seq．ID No．189)；c)第一步PCR图26为第一步PCR的示意图。HFAS制备出编码人Fas抗原胞外区的DNA片断。下文中将该片断称作“HFASDNA片断”。在下述条件下，用LA PCR试剂盒[Takara Syuzo]实施PCR反应。反应溶液的组成质粒pCEV4 DNA，20ng寡核苷酸引物N1，0．5μg；寡核苷酸引物C3N，0．5μg；dNTP混合物，25μl；10x LA PCR缓冲液，25μl；LA Taq聚合酶[Takara Syuzo]，12．5 units．用重蒸馏水将最终的溶液体积调整到250μl。试剂盒中提供有dNTP混合物，10x LA PCR缓冲液和LA Taq聚合酶。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。MAIC制备出编码小鼠白细胞介素-3受体胞外区的DNA片断。下文中将该片断称作“MAIC DNA片断”。在下述条件下，用LA PCR试剂盒[Takara Syuzo]实施PCR反应。反应溶液的组成质粒pME18S-mFas-AIC DNA，20ng寡核苷酸引物N3N，0．5μg；寡核苷酸引物CTN2，0．5μg；dNTP混合物，25μl；10xLA PCR缓冲液，25μl；
LATaq聚合酶[Takara Syuzo]，12．5 units．用重蒸馏水将最终的溶液体积调整到250μl。试剂盒中提供有dNTP混合物，10xLA PCR缓冲液和LA Taq聚合酶。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取由PCR所扩增的HFAS DNA片断和MAIC片断。然后用100％的乙醇沉淀该DNA。将DNA片断(约20-30μg)在5％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时的离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在20μl的蒸馏水中。d)第二步PCR图27为第二步PCR的示意图。FASAIC制备出编码人Fas融合蛋白的DNA片断。下文中将该片断称作“FASAICDNA片断”。在下述条件下，用LA PCR试剂盒[Takara Syuzo]实施PCR反应。反应溶液的组成第一步PCR中制备的HFAS DNA溶液，20μl；第一步PCR中制备的MAIC DNA溶液，20μl；寡核苷酸引物N1，0．5μg；寡核苷酸引物CTN2，0．5μg；dNTP混合物，25μl；10xLA PCR缓冲液，25ul；LA Taq聚合酶[Takara Syuzo]，12．5units．用重蒸馏水将最终的溶液体积调整到250μl。试剂盒中提供有dNTP混合物，10xLA PCR缓冲液和LA Taq聚合酶。
具体地说，首先将反应液在94℃下加热2分钟。然后用下面的热循环对该样品加热94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下2分钟。该循环重复30次。然后，将反应液在72℃下温育10分钟。
用石炭酸提取由PCR所扩增的FASAIC DNA片断。然后用100％的乙醇沉淀该DNA。将DNA片断(约20-30μg)在1％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将这样检测出的DNA片断切割出来并用装有Centricon10[Amicon]的Centriruter[Amicon]从聚丙烯酰胺凝胶中将DNA片断电洗脱下来。经过约1小时的离心(7，500xg)步骤，使洗脱下的DNA浓缩，接着用乙醇沉淀。将每种情况下最终的DNA产物溶解在20μl蒸馏水中。
图28为构建携带FASAIC DNA片断的质粒的示意图。
用石炭酸抽提然后用乙醇沉淀对通过这种方法得到的FASAIC DNA做进一步的纯化。然后用限制酶EcoR1和Xba1消化该DNA。
用限制酶EcoR1和Xba1消化一部分(2μg)质粒pME18S-mFas-AICDNA。用0．8％(w／v)的琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。用1μg／ml的溴化乙锭对凝胶染色，这样在紫外光下可观测到DNA片断。用剃刀将3，000bp的DNA带从凝胶中切割下以回收该DNA。
把一部分上面得到的消化的pME18S-mFas-AIC DNA连接到一部分用EcoR1和Xba1消化的FASAIC DNA上。用连接反应试剂盒实施这一连接反应，并将连接产物转化到E．coli DH5α菌株中。
对转化子菌落中含有的质粒DNA进行限制性分析以鉴定出含有目的DNA插入片断的质粒。证实出质粒phFas-AIC2含有以正确取向插入到SRα启动子下游的FASAIC DNA片断(编码人Fas融合蛋白)中以表达免疫球蛋白多肽。e)在COS-7细胞中的表达用基因转染仪ECM600M(BTX)，通过电穿孔法将上面得到的人Fas融合蛋白的表达质粒转染到COS-7细胞系中。
将COS-7细胞[美国典型培养物保藏号No．CRL-1651]培养在225cm2培养瓶中[Sumitomo Bakelite]。这些细胞在含有10％肽牛血清[CSL]的DMEM培养基中生长成为半融合状。去掉培养基并用3ml的胰蛋白酶-EDTA溶液[Sigma Chemicals公司]在37℃下处理COS-7细胞3分钟。在800rpm的转速下离心2分钟以回收这些分离出的细胞然后用PBS(-)缓冲液[Nissui Seiyaku]洗涤细胞两次。用PBS(-)缓冲液将洗涤过的COS-7细胞浓度调整到4x106个细胞／毫升以得到COS-7悬浮液。
平行地，用质粒Maxiprep试剂盒[MaxiPrep DNA Purification试剂盒；Promega]制备出100μg phFas-AIC2质粒DNA。用100％的乙醇沉淀该DNA，然后将DNA悬浮在100μl的PB(-)缓冲液中。将该质粒溶液(100μl)同500μl上面制备的COS-7细胞悬浮液(相当于2×106个细胞)相混合。将该混合物转入一有4mm[BioRad]电极间隔的电穿孔样品池中，然后放入电穿孔仪。接着用电穿孔法将目的质粒DNA转入COS-7细胞中，所用脉冲为150V-900μF。
电穿孔后，将细胞-DNA混合物重悬浮于20ml含有10％胎牛血清的DMEM中，然后转入75cm2的培养瓶[Sumitomo Bakelite]。将这些细胞在37℃下于7．5％的二氧化碳中培养24小时。去除培养物上清液并用无血清DMEM培养液洗涤这些细胞。加入一部分(20ml)无血清培养液并将这些细胞在37℃下于7．5％的二氧化碳中培养24小时。然后回收上清液。2)用ELISA法鉴定其与Fas抗原的结合能力下文是用ELISA法鉴定人源化抗体同Fas抗原的结合能力。
将COS-细胞培养物的上清液(如上面第一部分所制备的)同50mM的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9．5)以1∶5的比例相混合。向96-孔平板(3690，底面积0．16cm2；Coster)的每一个孔中加入一部分混合物(50μl)并在4℃下培养过夜，使人Fas融合蛋白吸附到孔的表面。吸附作用完成后，用含有0．05％吐温20的PBS(-)缓冲液(酶免疫测定级；BioRad，下文中称作“PBS-T”)对每个孔进行洗涤。
在PBS中制备SuperBlock封闭缓冲液[Pierce公司]，并向每个孔中加入该缓冲液50μl。将该平板在室温下培养2小时从而能够有效地封闭。再用PBS-T洗涤各孔。
向每个孔中加入50μl实施例7中制备的稀释的培养物上清液样品，并在37℃下培养2小时。再用PBS-T洗涤各孔。将一部分(50μl)在PBS中以1∶10，000的比例稀释的过氧化氢酶标记的山羊抗-人IgM单克隆抗体[Jackson免疫学研究实验室]分别加入到每个孔中并将平板在37℃下培养2小时。用PBS-T洗涤后，向每孔中分别加入50μl底物溶液[过氧化氢酶底物套-ABTS；BioRad]并开始进行比色分析。
通过每个孔在405nm和492nm处的吸光度在微量培养板读出器[3550UV型；BioRad]上的读数来计算培养物上清液中的人源化抗体同人Fas抗原融合蛋白的结合能力。405nm处的吸光度和492nm处的吸光度的比值使IgM同固相的结合能够进行计算。
分析的结果表明实施例7中的样品(B)，(C)，(D)，(E)，(F)，(G)，(H)和(I)能够同人Fas抗原融合蛋白相结合(图29和30)。
检测实施例3诱导细胞程序死亡活性的鉴定将上面实施例7中制备的培养物上清液样品同人淋巴细胞系‘HPB-ALL’一起培养以鉴定上清液中人源化抗体的细胞毒素活性。
在5％的CO2中，37℃的条件下，HPB-ALL细胞生长在含有20mMHEPES，50μlβ-巯基乙醇，0．33％碳酸氢钠[Sigma]以及10％肽牛血清[CSL]的RPMI 1640培养基[Nissui Seiyaku]中，(下文中称作‘RPMI’培养基)。在对数生长期，以800 RPM的转速离心3分钟以回收HBP-细胞。将所得细胞沉淀以6×105个细胞／毫升的细胞浓度重悬浮于RPMI培养基中从而得到HBP-ALL细胞悬浮液。
把实施例7中制备的每种培养物上清液同小鼠抗-人Fas抗体CH11一起稀释到下列浓度250，100，25，10，2．5，1，0．25以及0．1ng／ml。将每种稀释液的一部分(50μl)同96-孔平板的每个孔中的50μl HBP-ALL细胞悬浮液(3×104个细胞／微升)相混合。该平板在5％的CO2中，37℃下培养2小时。用3550UV型微量培养板读出器[Bio-Rad公司]测量450nm和750nm处的吸光度。通过测试实施例1中的Western印迹光密度测定分析法测出每种样品的浓度。
可用下面的公式计算出HBP-ALL细胞的存活百分率存活率(％)=(A-C)／(B-C)×100其中A=同HBP-ALL细胞共同培养后所剩余的CH11或人源化抗体的细胞数。B=单独培养HBP-ALL细胞(没有CH11或人源化抗体)后所剩余的细胞数。C=仅用RPMI培养基，没有HBP-ALL细胞(同上面的A和B一样，培养20个小时)。
结果表示在图31中。在每种情况下均计算出了作为细胞毒素活性指数的ED50值。ED50值表示有50％的细胞存活时IgM的浓度。
结果如下样品 ED50(ng／ml)B1．1C1．0D1．7E1．5G2．4I3．4CH1110．7结果表明，同有J链的CH11相比较，没有J链的重组抗-Fas IgM分子的细胞毒素活性要高3到10倍。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型内部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1Asp Tyr Asn Met His15(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型内部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys15 10 15Ser(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型内部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr1 5(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型内部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His1 5 10 15(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型内部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1 5(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型内部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1773个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅵ)原始来源(A)生物体小鼠(G)细胞类型杂交瘤(H)细胞系CH11(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．1770(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置58．．1770(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．57(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19 -15 -10 -5GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA 96Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC144Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT GAC TAC AAC ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT192Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu30 35 40 45GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn50 55 60CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAT TCC TCC AGC 288Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCA AGA AGT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GAG AGT CAG TCC TTC CCA AAT GTC TTC432Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe110 115 120 125CCC CTC GTC TCC TGC GAG AGC CCC CTG TCT GAT AAG AAT CTG GTG GCC480Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala130 135 140ATG GGC TGC CTA GCC CGG GAC TTC CTG CCC AGC ACC ATT TCC TTC ACC528Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr145 150 155TGG AAC TAC CAG AAC AAC ACT GAA GTC ATC CAG GGT ATC AGA ACC TTC576Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe160 165 170CCA ACA CTG AGG ACA GGG GGC AAG TAC CTA GCC ACC TCG CAG GTG TTG624Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu175 180 185CTG TCT CCC AAG AGC ATC CTT GAA GGT TCA GAT GAA TAC CTG GTA TGC672Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys190 195 200 205AAA ATC CAC TAC GGA GGC AAA AAC AGA GAT CTG CAT GTG CCC ATT CCA720Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro210 215 220GCT GTC GCA GAG ATG AAC CCC AAT GTA AAT GTG TTC GTC CCA CCA CGG768Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg225 230 235GAT GGC TTC TCT GGC CCT GCA CCA CGC AAG TCT AAA CTC ATC TGC GAG816Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu240 245 250GCC ACG AAC TTC ACT CCA AAA CCG ATC ACA GTA TCC TGG CTA AAG GAT864Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp255 260 265GGG AAG CTC GTG GAA TCT GGC TTC ACC ACA GAT CCG GTG ACC ATC GAG912Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu270 275 280 285AAC AAA GGA TCC ACA CCC CAA ACC TAC AAG GTC ATA AGC ACA CTT ACC960Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr290 295 300ATC TCT GAA ATC GAC TGG CTG AAC CTG AAT GTG TAC ACC TGC CGT GTG 1008Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val305 310 315GAT CAC AGG GGT CTC ACC TTC TTG AAG AAC GTG TCC TCC ACA TGT GCT 1056Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala320 325 330GCC AGT CCC TCC ACA GAC ATC CTA ACC TTC ACC ATC CCC CCC TCC TTT 1104Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe335 340 345GCC GAC ATC TTC CTC AGC AAG TCC GCT AAC CTG ACC TGT CTG GTC TCA 1152Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser350 355 360 365AAC CTG GCA ACC TAT GAA ACC CTG AAT ATC TCC TGG GCT TCT CAA AGT 1200Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser370 375 380GGT GAA CCA CTG GAA ACC AAA ATT AAA ATC ATG GAA AGC CAT CCC AAT 1248Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn385 390 395GGC ACC TTC AGT GCT AAG GGT GTG GCT AGT GTT TGT GTG GAA GAC TGG 1296Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp400 405 410AAT AAC AGG AAG GAA TTT GTG TGT ACT GTG ACT CAC AGG GAT CTG CCT 1344Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro415 420 425TCA CCA CAG AAG AAA TTC ATC TCA AAA CCC AAT GAG GTG CAC AAA CAT 1392Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His430 435 440 445CCA CCT GCT GTG TAC CTG CTG CCA CCA GCT CGT GAG CAA CTG AAC CTG 1440Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu450 455 460AGG GAG TCA GCC ACA GTC ACC TGC TTG GTG AAG GGC TTC TCT CCT GCA 1488Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala465 470 475GAC ATC AGT GTG CAG TGG CTT CAG AGA GGG CAA CTC TTG CCC CAA GAG 1536Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu480 485 490AAG TAT GTG ACC AGT GCC CCG ATG CCA GAG CCT GGG GCC CCA GGC TTC 1584Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe495 500 505TAC TTT ACC CAC AGC ATC CTG ACT GTG ACA GAG GAG GAA TGG AAC TCC 1632Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser510 515 520 525GGA GAG ACC TAT ACC TGT GTT GTA GGC CAC GAG GCC CTG CCA CAC CTG 1680Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu530 535 540GTG ACC GAG AGG ACC GTG GAC AAG TCC ACT GGT AAA CCC ACA CTG TAC 1728Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr545 550 555AAT GTC TCC CTG ATC ATG TCT GAC ACA GGC GGC ACC TGC TAT 1770Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr560 565 570TGA 1773(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度590个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19 -15 -10 -5Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys1 5 10Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu30 35 40 45Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn50 55 60Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser65 70 75Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe110 115 120 125Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala130 135 140Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr145 150 155Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe160 165 170Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu175 180 185Leu Ser Pro Lys Sar Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys190 195 200 205Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro210 215 220Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg225 230 235Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu240 245 250Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp255 260 265Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu270 275 280 285Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr290 295 300Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val305 310 315Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala320 325 330Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe335 340 345Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser350 355 360 365Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser370 375 380Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn385 390 395Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp400 405 410Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro415 420 425Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His430 435 440 445Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu450 455 460Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala465 470 475Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu480 485 490Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe495 500 505Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser510 515 520 525Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu530 535 540Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr545 550 555Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr560 565 570(2)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度717个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅵ)原始来源(A)生物体小鼠(G)细胞类型杂交瘤(H)细胞系CH11(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．714(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置58．．714(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．57(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG ATG TTC TGG ATT CCT GCT 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala-19 -15 -10 -5TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 96Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val1 5 10AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT AAG AGC CTT 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu15 20 25GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA 192Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30 35 40 45GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser50 55 60GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr65 70 75CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC 336Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys80 85 90TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG 384Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu95 100 105GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA 432Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro110 115 120 125TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG 480Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu130 135 140AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC 528Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly145 150 155AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC 576Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser160 165 170AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC 624Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 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(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度238个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala-19 -15 -10 -5Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val1 5 10Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu15 20 25Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30 35 40 45Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser50 55 60Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr65 70 75Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys80 85 90Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu95 100 105Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro110 115 120 125Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu130 135 140Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly145 150 155Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser160 165 170Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp175 180 185Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr190 195 200 205Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys210 215(2)SEQ ID NO11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度480个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅵ)原始来源(A)生物体小鼠(G)细胞类型杂交瘤(H)细胞系CH11(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．477(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置67．．477
(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．66(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11ATG AAG ACC CAC CTG CTT CTC TGG GGA GTC CTC GCC ATT TTT GTT AAG48Met Lys Thr His Leu Leu Leu Trp Gly Val Leu Ala Ile Phe Val Lys-22 -20 -15 -10GCT GTC CTT GTA ACA GGT GAC GAC GAA GCG ACC ATT CTT GCT GAC AAC96Ala Val Leu Val Thr Gly Asp Asp Glu Ala Thr Ile Leu Ala Asp Asn-5 1 5 10AAA TGC ATG TGT ACC CGA GTT ACC TCT AGG ATC ATC CCT TCC ACC GAG 144Lys Cys Met Cys Thr Arg Val Thr Ser Arg Ile Ile Pro Ser Thr Glu15 20 25GAT CCT AAT GAG GAC ATT GTG GAG AGA AAT ATC CGA ATT GTT GTC CCT 192Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Val Val Pro30 35 40TTG AAC AAC AGG GAG AAT ATC TCT GAT CCC ACC TCC CCA CTG AGA AGG 240Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Arg45 50 55AAC TTT GTA TAC CAT TTG TCA GAC GTC TGT AAG AAA TGC GAT CCT GTG 288Asn Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Val Cys Lys Lys Cys Asp Pro Val60 65 70GAA GTG GAG CTG GAA GAT CAG GTT GTT ACT GCC ACC CAG AGC AAC ATC 336Glu Val Glu Leu Glu Asp Gln Val Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile75 80 85 90TGC AAT GAG GAC GAT GGT GTT CCT GAG ACC TGC TAC ATG TAT GAC AGA 384Cys Asn Glu Asp Asp Gly Val Pro Glu Thr Cys Tyr Met Tyr Asp Arg95 100 105AAC AAG TGC TAT ACC ACT ATG GTC CCA CTT AGG TAT CAT GGT GAG ACC 432Asn Lys Cys Tyr Thr Thr Met Val Pro Leu Arg Tyr His Gly Glu Thr110 115 120AAA ATG GTG CAA GCA GCC TTG ACC CCC GAT TCT TGC TAC CCT GAC 477Lys Met Val Gln Ala Ala Leu Thr Pro Asp Ser Cys Tyr Pro Asp125 130 135TAG 480
(2)SEQ ID NO12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12Met Lys Thr His Leu Leu Leu Trp Gly Val Leu Ala Ile Phe Val Lys-22 -20 -15 -10Ala Val Leu Val Thr Gly Asp Asp Glu Ala Thr Ile Leu Ala Asp Asn-5 15 10Lys Cys Met Cys Thr Arg Val Thr Ser Arg Ile Ile Pro Ser Thr Glu15 20 25Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Val Val Pro30 35 40Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Arg45 50 55Asn Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Val Cys Lys Lys Cys Asp Pro Val60 65 70Glu Val Glu Leu Glu Asp Gln Val Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile75 80 85 90Cys Asn Glu Asp Asp Gly Val Pro Glu Thr Cys Tyr Met Tyr Asp Arg95 100 105Asn Lys Cys Tyr Thr Thr Met Val Pro Leu Arg Tyr His Gly Glu Thr110 115 120Lys Met Val Gln Ala Ala Leu Thr Pro Asp Ser Cys Tyr Pro Asp125 130 135(2)SEQ ID NO13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅴ)片断类型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser1 5 10 15 20Ile(2)SEQ ID NO15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度391个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅵ)原始来源(A)生物体小鼠(G)细胞类型杂交瘤(H)细胞系CH11(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置2．．391(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置32．．391(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置2．．31(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG46Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln-10 -5 1 5CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC94Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser10 15 20TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAC AAC ATG CAC TGG GTG 142Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val25 30 35AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT 190Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro40 45 50TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA 238Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr55 60 65TTG ACT GTT GAC AAT TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC 286Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser70 75 80 85CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA AGT TAC TAT334Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr90 95 100GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GAG382Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu105 110 115AGT CAG TCC391Ser Gln Ser120(2)SEQ ID NO16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度388个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅵ)原始来源(A)生物体小鼠(G)细胞类型杂交瘤(H)细胞系CH11(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置2．．388(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置29．．388(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置2．．28(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16G ATG TTC TGG ATT CCT GCT TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA 46Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln-9 -5 1 5AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT 94Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser10 15 20TGC AGA TCT AGT AAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA142Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu25 30 35CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC190His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr40 45 50AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT238Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser55 60 65 70GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG286Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu75 80 85GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG334Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala90 95 100TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA382Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro105 110 115ACT GTA388Thr Val120(2)SEQ ID NO17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17CTAAGGGAATTCCGCCTCTCCTCAGACACTGAA(2)SEQ ID NO18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18TTTTACTCTAGAGACCCAAGGCCTGCCTGGTTGA(2)SEQ ID NO19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19AAATAGGAATTCCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCC(2)SEQ ID NO20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20ATGATCTCTAGAGTGGTGGCATCTCAGGACCT(2)SEQ ID NO21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21TTGCGGAATTCCTCACCTGTCCTGGGGTTATT(2)SEQ ID NO22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅲ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22ATTGCCTCTAGAGCCTCTAAGGACAACGAGCT(2)SEQ ID NO23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23TGGGGCCTCAGTGAAGATAT(2)SEQ ID NO24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24CAATGGTGGTACTGGCTACA(2)SEQ ID NO25的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅲ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25TGACATCTGAGGACTCTGCA(2)SEQ ID NO26的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26TCCTCAGAGAGTCAGTCCTT(2)SEQ ID NO27的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27TCCTTCACCTGGAACTACCA(2)SEQ ID NO28的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28TCCCAAGAGCATCCTTGAAG(2)SEQ ID NO29的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29AGATCTGCATGTGCCCATTC(2)SEQ ID NO30的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30TCTAAACTCATCTGCGAGGC(2)SEQ ID NO31的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO31GGTGACCATCGAGAACAAAG(2)SEQ ID NO32的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32AGGGGTCTCACCTTCTTGAA(2)SEQ ID NO33的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33TCCTTTGCCGACATCTTCCT(2)SEQ ID NO34的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34GTGTGTACTGTGACTCACAG(2)SEQ ID NO35的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35AACTGAACCTGAGGGAGTCA(2)SEQ ID NO36的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36AACTCTTGCCCCAAGAGAAG(2)SEQ ID NO37的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅲ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37ATCCTGACTGTGACAGAGGA(2)SEQ ID NO38的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38ACAAGTCCACTGGTAAACCC(2)SEQ ID NO39的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO39AGGATATCTTCACTGAGGCC(2)SEQ ID NO40的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO40ATCCACTCAAGGCTCTTTCC(2)SEQ ID NO41的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO41ACTGCAGAGTCCTCAGATGT(2)SEQ ID NO42的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO42AGACGGTGACTGAGGTTCTT(2)SEQ ID NO43的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅲ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO43CAGGTGAAGGAAATGGTGCT(2)SEQ ID NO44的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO44ATGCTCTTGGGAGACAGCAA(2)SEQ ID NO45的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO45CTCTGTTTTGCCTCCGTAG(2)SEQ ID NO46的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO46TGGCCTCGCAGATGAGTTTA(2)SEQ ID NO47的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO47CCTTTGTTCTCGATGGTCAC(2)SEQ ID NO48的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO48TGTGGAGGACACGTTCTTCA(2)SEQ ID NO49的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO49ACTTTGAGAAGCCCAGGAGA(2)SEQ ID NO50的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO50AGATCCCTGTGAGTCACAGT(2)SEQ ID NO51的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO51AGCAGGTGGATGTTTGTGCA(2)SEQ ID NO52的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO52TGAAGCCACTGCACACTGAT(2)SEQ ID NO53的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO53AGTTCCATTCCTCCTCTGTC(2)SEQ ID NO54的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO54TGTGTCAGACATGATCAGGG(2)SEQ ID NO55的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO55TGAAGTTGCCTGTTAGGCTG(2)SEQ ID NO56的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO56CTTGGAGATCAAGCCTCCAT(2)SEQ ID NO57的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO57GCTGAGGATCTGGGAGTTTA(2)SEQ ID NO58的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO58GATGCTGCACCAACTGTATC(2)SEQ ID NO59的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO59CGACAAAATGGCGTCCTGAA(2)SEQ ID NO60的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO60ACGTTGACCAAGGACGAGTA(2)SEQ ID NO61的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO61ATCTGCAAGAGATGGAGGCT(2)SEQ ID NO62的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO62ACCCCAGAAAATCGGTTGGA(2)SEQ ID NO63的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO63CCGGAGGAACATGTGTACTT(2)SEQ ID NO64的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO64TCGTTCATACTCGTCCTTGG(2)SEQ ID NO65的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO65CATCTCAGGACCTTTGTCTC(2)SEQ ID NO66的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO66CACCTGTCCTGGGGTTATTT(2)SEQ ID NO67的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO67AGACAAGATGAAGACCCACC(2)SEQ ID NO68的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO68AAGCGACCATTCTTGCTGAC(2)SEQ ID NO69的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO69ATATCTCTGATCCCACCTCC(2)SEQ ID NO70的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO70GAAATGCGATCCTGTGGAAG(2)SEQ ID NO71的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO71CTATACCACTATGGTCCCAC(2)SEQ ID NO72的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO72AGAAGCAGGTGGGTCTTCAT(2)SEQ ID NO73的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO73TAGAGGTAACTCGGGTACAC(2)SEQ ID NO74的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO74AAGTTCCTTCTCAGTGGGGA(2)SEQ ID NO75的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO75GGTGGCAGTAACAACCTGAT(2)SEQ ID NO76的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO76CATGATACCTAAGTGGGACC(2)SEQ ID NO77的信息(ⅰ)序列特征(A)长度720个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置61．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO77ATG AGG CrC CCT GCT CAG CTC CTG GGG CTG CTA ATG CTC TGG GTC CCA 48Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5GGA TCC AGT GGG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC 96Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10GTC ACC CTT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT AAG AGC 144Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG 192Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT 240Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60TCT GGG GTC CCA GAC AGA TTC AGC GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC 288Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TAC336Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr80 85 90TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGC CAA GGG ACC AAG384Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105GTG GAA ATC AAA CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG432Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG480Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT528Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC576Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA624Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG672Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT717Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215TAG720
(2)SEQ ID NO78的信息(ⅰ)序列特征(A)长度239个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO77Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr80 85 90Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140Leu Asn Ash Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215(2)SEQ ID NO79的信息(ⅰ)序列特征(A)长度720个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置61．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO79ATG AGG CTC CCT GCT CAG CTC CTG GGG CTG CTA ATG CTC TGG GTC CCA 48Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5GGA TCC AGT GGG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC 96Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10GTC ACC CTT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT AAG AGC 144Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG 192Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT 240Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60TCT GGG GTC CCA GAC AGA TTC AGC GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC 288Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TTC 336Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe80 85 90TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGC CAA GGG ACC AAG 384Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105GTG GAA ATC AAA CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG 432Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG 480Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT 528Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC 576Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA 624Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG 672Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 717Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215TAG 720
(2)SEQ ID NO80的信息(ⅰ)序列特征(A)长度239个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO80Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe80 85 90Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215(2)SEQ ID NO81的信息(ⅰ)序列特征(A)长度720个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置61．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．60(ⅸ)序列描述SEQ ID NO81ATG AGG CTC CCT GCT CAG CTC CTG GGG CTG CTA ATG CTC TGG GTC CCA 48Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5GGA TCC AGT GGG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC 96Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10GTC ACC CTT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT AAG AGC 144Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG 192Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Mis Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40CCA GGC CAG TCT CCA AGG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT 240Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60TCT GGG GTC CCA GAC AGA TTC AGC GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC 288Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TAC 336Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr80 85 90TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGC CAA GGG ACC AAG 384Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105GTG GAA ATC AAA CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG 432Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG 480Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT 528Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC 576Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA 624Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG 672Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 717Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215TAG 720
(2)SEQ ID NO82的信息(ⅰ)序列特征(A)长度239个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO82Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr80 85 90Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Sar Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 l80 185Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200Gly Lau Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215(2)SEQ ID NO83的信息(ⅰ)序列特征(A)长度720个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置61．．717(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO83ATG AGG CTC CCT GCT CAG CTC CTG GGG CTG CTA ATG CTC TGG GTC CCA 48Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5GGA TCC AGT GGG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC 96Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10GTC ACC CTT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT AAG AGC 144Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG 192Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40CCA GGC CAG TCT CCA AGG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT 240Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60TCT GGG GTC CCA GAC AGA TTC AGC GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC 288Ser Gly Val pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TTC 336Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe80 85 90TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGC CAA GGG ACC AAG 384Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105GTG GAA ATC AAA CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG 432Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro110 115 120CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG 480Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT 528Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC 576Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA 624Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG 672Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 717Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215TAG 720
(2)SEQ ID NO84的信息(ⅰ)序列特征(A)长度239个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO84Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser15 20 25Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe80 85 90Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Proll0 115 120Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu125 130 135 140Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp145 150 155Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp160 165 170Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys175 180 185Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln190 195 200Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215(2)SEQ ID NO85的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1786个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．．1764(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置58．．1764(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．57(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO85ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19 -15 -10 -5GTC CAC TCT GAG GTG CAG CTT GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT GAC TAT AAT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA GGA CTC 192Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAA TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn50 55 60CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAT TCC GCG AGC 288Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ala Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCT GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA AGT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAG GGA 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGG AGT GCA TCC GCC CCA ACC CTT TTC 432Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe110 115 120 125CCC CTC GTC TCC TGT GAG AAT TCC CCG TCG GAT ACG AGC AGC GTG GCC 480Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala130 135 140GTT GGC TGC CTC GCA CAG GAC TTC CTT CCC GAC TCC ATC ACT TTC TCC 528Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser145 150 155TGG AAA TAC AAG AAC AAC TCT GAC ATC AGC AGT ACC CGG GGC TTC CCA576Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro160 165 170TCA GTC CTG AGA GGG GGC AAG TAC GCA GCC ACC TCA CAG GTG CTG CTG624Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu175 180 185CCT TCC AAG GAC GTC ATG CAG GGC ACA GAC GAA CAC GTG GTG TGC AAA672Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys190 195 200 205GTC CAG CAC CCC AAC GGC AAC AAA GAA AAG AAC GTG CCT CTT CCA GTG720Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val210 215 220ATT GCC GAG CTG CCT CCC AAA GTG AGC GTC TTC GTC CCA CCC CGC GAC768Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp225 230 235GGC TTC TTC GGC AAC CCC CGC AAG TCC AAG CTC ATC TGC CAG GCC ACG816Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr240 245 250GGT TTC AGT CCC CGG CAG ATT CAG GTG TCC TGG CTG CGC GAG GGG AAG864Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys255 260 265CAG GTG GGG TCT GGC GTC ACC ACG GAC CAG GTG CAG GCT GAG GCC AAA912Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys270 275 280 285GAG TCT GGG CCC ACG ACC TAC AAG GTG ACC AGC ACA CTG ACC ATC AAA960Glu 5er Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys290 295 300GAG AGC GAC TGG CTC AGC CAG AGC ATG TTC ACC TGC CGC GTG GAT CAC 1008Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His305 310 315AGG GGC CTG ACC TTC CAG CAG AAT GCG TCC TCC ATG TGT GTC CCC GAT 1056Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp320 325 330CAA GAC ACA GCC ATC CGG GTC TTC GCC ATC CCC CCA TCC TTT GCC AGC 1104Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser335 340 345ATC TTC CTC ACC AAG TCC ACC AAG TTG ACC TGC CTG GTC ACA GAC CTG 1152Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu350 355 360 365ACC ACC TAT GAC AGC GTG ACC ATC TCC TGG ACC CGC CAG AAT GGC GAA1200Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Ash Gly Glu370 375 380GCT GTG AAA ACC CAC ACC AAC ATC TCC GAG AGC CAC CCC AAT GCC ACT1248Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr385 390 395TTC AGC GCC GTG GGT GAG GCC AGC ATC TGC GAG GAT GAC TGG AAT TCC1296Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser400 405 410GGG GAG AGG TTC ACG TGC ACC GTG ACC CAC ACA GAC CTG CCC TCG CCA1344Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro415 420 425CTG AAG CAG ACC ATC TCC CGG CCC AAG GGG GTG GCC CTG CAC AGG CCC1392Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro430 435 440 445GAT GTC TAC TTG CTG CCA CCA GCC CGG GAG CAG CTG AAC CTG CGG GAG1440Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu450 455 460TCG GCC ACC ATC ACG TGC CTG GTG ACG GGC TTC TCT CCC GCG GAC GTC1488Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val465 470 475TTC GTG CAG TGG ATG CAG AGG GGG CAG CCC TTG TCC CCG GAG AAG TAT1536Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr480 485 490GTG ACC AGC GCC CCA ATG CCT GAG CCC CAG GCC CCA GGC CGG TAC TTC1584Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe495 500 505GCC CAC AGC ATC CTG ACC GTG TCC GAA GAG GAA TGG AAC ACG GGG GAG1632Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu510 515 520 525ACC TAC ATC TGC GTG GTG GCC CAT GAG GCC CTG CCC AAC AGG GTC ACC1680Thr Tyr Ile Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr530 535 540GAG AGG ACC GTG GAC AAG TCC ACC GGT AAA CCC ACC CTG TAC AAC GTG1728Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val545 550 555TCC CTG GTC ATG TCC GAC ACA GCT GGC ACC TGC TAC TGA1767Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr560 565
(2)SEQ ID NO86的信息(ⅰ)序列特征(A)长度588个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO86Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19 -15 -10 -5Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys1 5 10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn50 55 60Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ala Ser65 70 75Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe110 115 120 125Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala130 135 140Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser145 150 155Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro160 165 170Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu175 180 185Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys190 195 200 205Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val210 215 220Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp225 230 235Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr240 245 250Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys255 260 265Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys270 275 280 285Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys290 295 300Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His305 310 315Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp320 325 330Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser335 340 345Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu350 355 360 365Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu370 375 380Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr385 390 395Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser400 405 410Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro415 420 425Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro430 435 440 445Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu450 455 460Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val465 470 475Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr480 485 490Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe495 500 505Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu510 515 520 525Thr Tyr Ile Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr530 535 540Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val545 550 555Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr560 565(2)SEQ ID NO87的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1768个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅸ)特征(A)名称／关键词CDS(B)位置1．1764(ⅸ)特征(A)名称／关键词成熟多肽(B)位置58．．1764(ⅸ)特征(A)名称／关键词信号肽(B)位置1．．57(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO87ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19 -15 -10 -5GTC CAC TCT GAG GTG CAG CTT GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT GAC TAT AAT ATG CAT TGG GTG AAG CAG GCC CAT GGA AAG AGC CTC 192Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ala His Gly Lys Ser Leu30 35 40 45GAA TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn50 55 60CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAT TCC GCG AGC 288Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ala Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCT GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA AGT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAG GGA 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGG AGT GCA TCC GCC CCA ACC CTT TTC 432Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe110 115 120 125CCC CTC GTC TCC TGT GAG AAT TCC CCG TCG GAT ACG AGC AGC GTG GCC 480Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala130 135 140GTT GGC TGC CTC GCA CAG GAC TTC CTT CCC GAC TCC ATC ACT TTC TCC 528Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser145 150 155TGG AAA TAC AAG AAC AAC TCT GAC ATC AGC AGT ACC CGG GGC TTC CCA 576Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro160 165 170TCA GTC CTG AGA GGG GGC AAG TAC GCA GCC ACC TCA CAG GTG CTG CTG 624Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu175 180 185CCT TCC AAG GAC GTC ATG CAG GGC ACA GAC GAA CAC GTG GTG TGC AAA 672Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys190 195 200 205GTC CAG CAC CCC AAC GGC AAC AAA GAA AAG AAC GTG CCT CTT CCA GTG 720Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val210 215 220ATT GCC GAG CTG CCT CCC AAA GTG AGC GTC TTC GTC CCA CCC CGC GAC 768Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp225 230 235GGC TTC TTC GGC AAC CCC CGC AAG TCC AAG CTC ATC TGC CAG GCC ACG 816Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr240 245 250GGT TTC AGT CCC CGG CAG ATT CAG GTG TCC TGG CTG CGC GAG GGG AAG 864Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys255 260 265CAG GTG GGG TCT GGC GTC ACC ACG GAC CAG GTG CAG GCT GAG GCC AAA 912Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys270 275 280 285GAG TCT GGG CCC ACG ACC TAC AAG GTG ACC AGC ACA CTG ACC ATC AAA 960Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys290 295 300GAG AGC GAC TGG CTC AGC CAG AGC ATG TTC ACC TGC CGC GTG GAT CAC1008Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His305 310 315AGG GGC CTG ACC TTC CAG CAG AAT GCG 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(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO90GGGAATTCATGGACTGGACCTGGAGGWTCCTYTT(2)SEQ ID NO9l的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO91CCTCTAGAGGTTAGTTGCATGCACACACAGA(2)SEQ ID NO92的信息(ⅰ)序列特征(A)长度112个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO92Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO93的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO93GCGAATTCTGCCTTGACTGATCAGAGTTTCCTCA(2)SEQ ID 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GGACCCGCCA GAATGGCGAA GCTGTGAAAA CCCACACCAA CATCTCCGAG 1260AGCCACCCCA ATGCCACTTT CAGCGCCGTG GGTGAGGCCA GCATCTGCGA GGATGACTGG1320AATTCCGGGG AGAGGTTCAC GTGCACCGTG ACCCACACAG ACCTGCCCTC GCCACTGAAG1380CAGACCATCT CCCGGCCCAA GGGGGTGGCC CTGCACAGGC CCGATGTCTA CTTGCTGCCA1440CCAGCCCGGG AGCAGCTGAA CCTGCGGGAG TCGGCCACCA TCACGTGCCT GGTGACGGGC1500TTCTCTCCCG CGGACGTCTT CGTGCAGTGG ATGCAGAGGG GGCAGCCCTT GTCCCCGGAG1560AAGTATGTGA CCAGCGCCCC AATGCCTGAG CCCCAGGCCC CAGGCCGGTA CTTCGCCCAC1620AGCATCCTGA CCGTGTCCGA AGAGGAATGG AACACGGGGG AGACCTACAT CTGCGTGGTG1680GCCCATGAGG CCCTGCCCAA CAGGGTCACC GAGAGGACCG TGGACAAGTC CACCGGTAAA1740CCCACCCTGT ACAACGTGTC CCTGGTCATG TCCGACACAG CTGGCACCTG CTACTGACCC1800TGCTGGCCTG CCCACAGGCT CGGGGCGGCT GGCCGCTCTG TGTGTGCATG CAAACTAACC1860CGTGTCAAC1869(2)SEQ ID NO138的信息(ⅰ)序列特征(A)长度891个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅳ)原始来源(A)生物体人(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO138TGCCTTGACT GATCAGGACT CCTCAGTTCA CCTTCTCACA ATGAGGCTCC CTGCTCAGCT 60CCTGGGGCTG CTAATGCTCT GGGTCCCAGG ATCCAGTGGG GATGTTGTGA TGACTCAGTC 120TCCACTCTCC CTGCCCGTCA TCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GCTCTAGTCA 180AGGCCTCGTA TTCAGTGATG GAAACACCTA CGTGAATTGG TTTCATCAGA GGCCAGGCCA 240ACCTCCAAGG CGCCTAATTT ATGAGGTTTC TCACCGGGAC TCTGGGGTCC CAGACAGATT 300CAGCGGCAGT GGGTCAGGCA CTGATTTCAC ACTGAAAATC AGCAGGGTGG AGGCTGAGGA 360TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGGTAC ACAGTGGCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC 420GAAGGTGGAA ACCAAACGAA CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA 480TGAGCAGTTG AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 540AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AAGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT CCCAGGAGAG 600TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC AGCAGCACCC TGACGCTGAG 660CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAACTCTA CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG 720CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT TCAACAGGGG AGAGTGTTAG AGGGAGAAGT GCCCCCACCT 780GCTCCTCAGT TCCAGCCTGA CCCCCTCCCA TCCTTTGGCC TCTGACCCTT TTTCCACAGG 840GGACCTACCC CTATTGCGGT CCTCCAGCTC ATCTTTCACC TCATCTAGAG C 891(2)SEQ ID NO139的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO139AGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTAAGAGCCTTGT(2)SEQ ID NO140的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO140ACAAGGCTCTTACTAGATCTGCAGGAGATGGAGGCCGGCT(2)SEQ ID NO141的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO141AAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAG(2)SEQ ID NO142的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO142CTGAATCTGT CTGGGACCCC AGAAAATCGG TTGGAAACTT(2)SEQIDNO143的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO143GGCTGAGGAT GTTGGGGTTT ATTACTGCTC TCAAAGTACACATGTTCCTC(2)SEQDNO144的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无
(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO144GAGGAACATG TGTACTTTGA GAGCAGTAAT AAACCCCAACATCCTCAGCC(2)SEQ ID NO145的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO145GGCTGAGGAT GTTGGGGTTT ATTTCTGCTC TCAAAGTACACATGTTCCTC(2)SEQ ID NO146的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO146GAGGAACATG TGTACTTTGA GAGCAGAAAT AAACCCCAACATCCTCAGCC
(2)SEQ ID NO147的信息(ⅰ)序列特征(A)长度52个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO147CTCAAAGTAC ACATGTTCCT CCGGCGTTCG GCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT(2)SEQ ID NO148的信息(ⅰ)序列特征(A)长度52个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO148ATTTCCACCT TGGTCCCTTG GCCGAACGCC GGAGGAACATGTGTACTTTG AG(2)SEQ ID NO149的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO149GGGCTCGAGT GCCTTGACTG ATCAGGACTC CTCAGTTCAC(2)SEQ ID NO150的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO150GGCCAGTCTC CAAGGCTCCT GATCTACAAAG(2)SEQ ID NO151的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO151CTTTGTAGAT CAGGAGCCTT GGAGACTGGCC(2)SEQ ID NO152的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO152CCCTCTAGAC TAACACTCTC CCCTGTTGAAG(2)SEQ ID NO153的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO153CTGCTCTAAA AGCTGCGGAA(2)SEQ ID NO154的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO154TAGATCTGCA GGAGARGGAG(2)SEQ ID NO155的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO155TATGTTTCAG GTTCAGGGGG(2)SEQ ID NO156的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO156GGGCTCGAGC TAAGGGAATT CCGCCTCTCC TCAGACACTG(2)SEQ ID NO157的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO157GAACTGCAGG CGTCCACTCT GAGGTGCAGC TTGTGCAGTC(2)SEQ ID NO158的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO158GACTGCACAA GCTGCACCTC AGAGTGGACG CCTGCAGTTC(2)SEQ ID NO159的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO159AATATGCATA AATTCGAATG GATGGGATAT ATTTATCCTTACCAATGGTGG(2)SEQ ID NO160的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO160CATCCATTCG AATTTATGCA TATTATAGTC AGTGAAGGTGTATCCAGAAG(2)SEQ ID NO161的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO161CCACATTGAC TGTTGACAAT TCCGCGAGCA CAGCCTACAT(2)SEQ ID NO161的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO161CCACATTGAC TGTTGACAAT TCCGCGAGCA CAGCCTACAT(2)SEQ ID NO162的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO162ATGTAGGCTG TGCTCGCGGA ATTGTCAACA GTCAATGTGG(2)SEQ ID NO163的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO163GAAGTTACTA TGCTATGGAC TACTGGGGCC AGGGAACCCT(2)SEQ ID NO164的信息(ⅰ)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO164TAGTCCATAG CATAGTAACT TCTCGCACAG TAATACACAG(2)SEQ ID NO165的信息(ⅰ)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO165GGGCTCGAGG CCAAAGAGTC TGGGCCCACG ACCTACAAG(2)SEQ ID NO166的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO166CTTGTAGGTC GTGGGCCCAG ACTCTTTGGC(2)SEQIDNO167的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO167GGGTCTAGAT CAGTAGCAGG TGCCAGCTGTG(2)SEQ ID NO168的信息(ⅰ)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO168TATGCATTGG GTGCGCCAGG CCCCCGGACA AGGACTCGAATGGATGGGAT ATATTTATCC(2)SEQ ID NO169的信息(ⅰ)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO169CGAGTCCTTG TCCGGGGGCC TGGCGCACCC AATGCATATTATAGTCAGTG AAGGTGTATC(2)SEQ ID NO170的信息(ⅰ)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO170TATGCATTGG GTGAAGCAGG CCCATGGAAA GAGCCTCGAATGGATGGGAT ATATTTATCC(2)SEQ ID NO171的信息(ⅰ)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO171CGAGGCTCTT TCCATGGGCC TGCTTCACCC AATGCATATTATAGTCAGTG AAGGTGTATC(2)SEQ ID NO172的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO172GAGCGACTGG CTCAGCCAGA GCATGTTCAC(2)SEQ ID NO173的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO173GTGAACATGC TCTGGCTGAG CCAGTCGCTC(2)SEQ ID NO174的信息(ⅰ)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO174ACCTACATCT GCGTGGTGGC CCATGAGGCC CTGCCC(2)SEQ ID NO175的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO175GGCCTCATGG GCCACCACGC AGATGTAGGT CTCCCCCGTGTTCCATTCCT(2)SEQ ID NO176的信息(ⅰ)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO176GCTTTATTTG TAACCATTAT AAGCTG(2)SEQ ID NO177的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无
(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO177CTAGATCAGT AGCAGGTGCC AGCTGTGTCG(2)SEQ ID NO178的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO178CATAGTAACT TCTCGCACAGTAAF(2)SEQ ID NO179的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO179GATACACCTT CACTGACTAT AAT(2)SEQ ID NO180的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO180@”z-nCGTCGGATAC GAGCAGCGTG(2)SEQ ID NO181的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO181CACCCCGCGA CGGCTTCTT(2)SEQ ID NO182的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO182GGATCACAGG GGCCTGACCT(2)SEQ ID NO183的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO183CTGTGAAAACCCACACCAAC(2)SEQ ID NO184的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO184GCTGAACCTG CGGGAGTCGG(2)SEQ ID NO185的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO185GTGGCCCATG AGGCCCTGCC(2)SEQ ID NO186的信息(ⅰ)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO186GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGAA GCTCTTT(2)SEQ ID NO187的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”
(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO187GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA(2)SEQ ID NO188的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅲ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO188TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC(2)SEQ ID NO189的信息(ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核苷酸(A)描述／desc=“合成的DNA”(ⅱ)假设的无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO189CCCTCTAGAC GGGTCACGTG GGCATCAC
权利要求
1.一种生产至少包括一条重链和一条轻链的人源化抗体及其衍生物的方法，该方法包括的步骤为a 选择含有至少一个CDR的非人抗体；b 选择一人抗体重链；c 选择一人抗体轻链；d 至少将非人抗体重链中的一个CDR或其片断引入人抗体重链中以形成重组重链；和e 至少将非人抗体轻链中的一个CDR或其片断引入人抗体轻链中以形成重组轻链；其中所述对每一条人抗体轻链和重链的选择完全由它们分别同非人抗体重链和轻链的序列同源性所决定。
2.权利要求1的方法中，其中所述的CDR区在从非人抗体链向人抗体链中引入至少一个CDR或其片断之前已被从人抗体链中去除。
3.权利要求1的方法中，所述序列同源性是氨基酸序列的同源性。
4.权利要求1的方法中，对所述序列同源性的确定基本上仅同构架区有关。
5.权利要求1的方法中，对所述每一条人抗体链的选择的确定的依据是同非人抗体链在构架区至少有70％的氨基酸一致性。
6.权利要求1的方法中，所述每一条非人抗体链的CDR都被引入到相应的人抗体链中。
7.权利要求1的方法中，所述选择的非人抗体是小鼠CH11抗体。
8.权利要求1的方法中，所述选择的人轻链来自于人抗体RPMI6410’CL。
9.权利要求1的方法中，所述人重链来自于人抗体21·28’CL。
10.权利要求1的方法中，所述的从人抗体中得到的氨基酸区至少包括每个抗体构架区的大部分。
11.权利要求10的方法中，所述的从人抗体中得到的氨基酸区进一步包括恒定区，或恒定区的一部分。
12.权利要求1的方法中，将所述至少一个非人CDR区引入到人抗体时同时引入至少一个非人CDR构架区的至少一个有意义氨基酸残基。
13.一种生产至少包括一条轻链和一条重链的人源化抗体及其衍生物的方法，该方法包括的步骤为a 选择一种至少包括一个CDR的非人抗体；b 选择人抗体重链；c 选择人抗体轻链；d 至少将非人抗体重链的一个CDR或其片断引入人抗体重链以形成重组重链；和e 至少将非人抗体轻链的一个CDR或其片断引入人抗体轻链以形成重组轻链；其中所述对每一条人抗体重链和轻链的选择完全由它们分别同非人抗体重链和轻链的氨基酸序列同源性所确定；其中将所述至少一个非人CDR区同至少一个非人CDR构架区的至少一个有意义氨基酸残基一起引入到人抗体，将非人构架区的至少一个有意义氨基酸残基和CDR一起引入，条件是该残基至少满足下列准则之一a) 受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置上，而供体中的相应氨基酸被普遍发现于受体的那个位置；b) 根据准则ⅰ)、ⅱ)和ⅲ)之一，推断在免疫球蛋白三维模型中，氨基酸有一个侧链原子同一抗原或一人源化抗体的CDR形成一个键；ⅰ) 侧链原子与第二原子的距离小于它们的范德华半径之和加0．5埃；ⅱ) 侧链原子是极性的且与第二个极性原子间的距离小于3．4埃；和ⅲ) 侧链原子是带电荷的且与带相反电荷原子的距离小于3．35埃；c) 发现该氨基酸所处位置涉及到确定CDR规范分类的结构；和d) 氨基酸位于重链和轻链的某一推定接触表面上。
14.权利要求13的方法，其中所述准则(b)和(d)中氨基酸的位置是由制作分子模型确定的。
15.权利要求14的方法，其中所述对氨基酸的位置鉴定还要通过与其它抗体的X-射线晶体衍射数据相比较。
16.权利要求13的方法，其中构架区的氨基酸被引入的条件是通过制作分子模型推断构架区的氨基酸同CDR相连接并且通过X-射线晶体衍射实验也常常发现该构架区的氨基酸同CDR相连接。
17.权利要求13的方法，其中所述序列的同源性的评定基本上仅与构架区有关。
18.权利要求13的方法，其中所述对每一条人抗体的选择的确定标准是抗体构架区的氨基酸至少有70％同非人抗体链的相同。
19.权利要求13的方法，其中每一条非人抗体链的全部CDR都被引入到相应的人抗体链中。
20.权利要求13的方法，其中所述选择的非人抗体是小鼠CH11抗体。
21.权利要求13的方法，其中所述人轻链来自人抗体RPMI6410’CL。
22.权利要求13的方法，其中所述人重链来自人抗体21·28’CL。
23.权利要求13的方法，其中所述来自人抗体的氨基酸区至少包括各抗体构架区的大部分。
24.权利要求23的方法，其中所述来自人抗体的氨基酸区还包括恒定区，或恒定区的一部分。
25.一种至少包括一条轻链和一条重链的人源化抗体或其衍生物，其生产方法包括如下步骤a 选择一至少含有一个CDR的非人抗体；b 选择一条人抗体重链；c 选择一条人抗体轻链；d 至少从非人抗体重链向人抗体重链中引入一个CDR或其片断，以形成重组重链；和e 至少从非人抗体轻链向人抗体轻链中引入一个CDR或其片断，以形成重组轻链；其中所述对每一条人抗体重链和轻链的选择完全由它们分别同非人抗体重链和轻链的氨基酸序列同源性所确定；其中将所述至少一个非人CDR区同至少一个非人CDR构架区的至少一个有意义氨基酸残基一起引入到人抗体，将非人构架区的至少一个有意义氨基酸残基和CDR一起引入，条件是该残基至少满足下列准则之一a) 受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置上，而供体中的相应氨基酸被普遍发现于受体的那个位置；b) 根据准则ⅰ)、ⅱ)和ⅲ)之一，推断在免疫球蛋白三维模型中，氨基酸有一个侧链同人源化抗体的CDR或抗原形成一个键；ⅰ) 侧链原子与第二原子的距离小于它们的范德华半径之和加0．5埃；ⅱ) 侧链原子是极性的且与第二个极性原子间的距离小于3．4埃；并且ⅱ)侧链原子是带电荷的且与带相反电荷原子的距离小于3．35埃；c) 发现该氨基酸所处位置涉及到确定CDR规范分类的结构；和d) 氨基酸位于重链和轻链的某一推定接触表面上。
26.权利要求25所述的抗体，该抗体具有抗-Fas活性。
27.权利要求25所述的抗体，其中所述分子是有抗-Fas活性的IgM分子。
28.权利要求27所述的抗体，该抗体没有J链。
29.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．78限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．86限定的氨基酸序列。
30.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．78限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．88限定的氨基酸序列。
31.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．80限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．86限定的氨基酸序列。
32.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．80限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．88限定的氨基酸序列。
33.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．82限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．86限定的氨基酸序列。
34.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．82限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．88限定的氨基酸序列。
35.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．84限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．86限定的氨基酸序列。
36.一种包含一条重链和一条轻链的人源化抗体，其中所述轻链包含由SEQ ID No．84限定的氨基酸序列而重链包含由SEQ ID No．88限定的氨基酸序列。
37.编码权利要求25中所述抗体的RNA。
38.编码权利要求25到36中任何所述抗体的DNA。
39.在60-70℃，6x的标准柠檬酸盐缓冲液的条件下，可同编码权利要求25中抗体的DNA杂交的DNA。
40.一种含有权利要求39所述DNA的可复制载体。
41.权利要求40的载体，该载体是一种表达载体。
42.一种选自重组DNA载体pHκKY2-58，pHκKF2-19，pHκRY2-10，pHκRF2-52，pHμH5-1和pHμM1-1的载体。
43.用权利要求41所述表达载体转化了的宿主细胞。
44.大肠杆菌pHκKY2-58(FERM BP-5861)。
45.大肠杆菌pHκKF2-19(FERM BP-5860)。
46.大肠杆菌pHκRY2-10(FERM BP-5859)。
47.大肠杆菌pHκRF2-52(FERM BP-5862)。
48.大肠杆菌pHμH5-1(FERM BP-5863)。
49.大肠杆菌pHμM1-1(FERM BP-5864)。
50.一种生产免疫球蛋白的方法，包括在能够使载体中编码免疫球蛋白H链或L链亚基的DNA进行表达的条件下培养权利要求43的宿主细胞，以及从培养物中回收免疫球蛋白。
51.一种治疗自身免疫性疾病的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用无毒性剂量的权利要求25所述抗体。
52.权利要求51的方法中，所述的自身免疫性疾病是风湿症。
53.权利要求51的方法中，所述的哺乳动物是人。
全文摘要
本发明提供了一种能够诱导表达Fas的细胞的细胞程序死亡的人源化抗－人Fas抗体且该抗体可用于治疗自身免疫性疾病和类风湿性关节炎。另外,本发明提供了编码这种抗体H链和L链可变区的DNA以及使抗体人源化的方法。
文档编号C07K16/18GK1203922SQ9810947
公开日1999年1月6日 申请日期1998年3月21日 优先权日1998年3月21日
发明者芹泽伸记, 春山英幸, 中原馨, 高桥亘, 米原伸 申请人:三共株式会社