对hla分子结合亲和力提高的肽的利记博彩app

专利名称：：对hla分子结合亲和力提高的肽的利记博彩app
背景技术：
：本发明涉及预防、治疗或诊断许多病理状态的组合物和方法。特别提供能够结合选择的主要组织相容复合物(MHC)分子并诱导免疫反应的新肽。MHC分子可分成Ⅰ型或Ⅱ型。Ⅱ型MHC分子基本上表达于参与激发和维持免疫反应的细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等。Ⅱ型MHC分子被辅助T淋巴细胞识别，并诱导辅助T淋巴细胞的增殖，和对呈现的特定免疫原性肽的免疫反应的放大。Ⅰ型MHC分子表达于几乎所有的有核细胞上，并被细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别，这种T淋巴细胞然后破坏带有抗原的细胞。CTLs在肿瘤排斥和抵抗病毒、真菌和寄生虫的感染中是十分重要的。用两种不同的试验方法已经分析了Ⅰ型MHC分子的结合亲和力与分散的肽表位的免疫原性的关系(Sette等，免疫学杂志.，153:5586-5592(1994))。在第一种方法中，MHC分子结合亲和力在10000倍范围内变化的潜在表位的免疫原性在HLA-A※0201转基因小鼠中进行了分析。在第二种方法中，用急性乙型肝炎病人的PBL评价了大约100种乙型肝炎病毒来源的不同的潜在表位的抗原性，这些表位都带有A※0201结合基元。在这两种方法中，发现结合阈值约为500nM(优选500nM或更低)决定肽表位引起CTL反应的能力。这些结果与天然加工的肽或前面所述的T细胞表位的Ⅰ型结合亲和力的测定值十分相符。这些结果说明，在T细胞反应形成中决定基选择具有重要作用。通常，CTL反应并不直接针对所有可能的表位。而是限于少数几个免疫优势决定基(Zinkernagel等，免疫学进展27,51-59(1979)；Bennink等，实验医学杂志168,1935-1939(1988)；Rawle等，免疫学杂志146,3977-3984(1991))。早就认识到免疫优势(Benacerraf等，科学175,273-279(1972))可以解释为一个给定的表位选择性地结合一个特定的MHC分子的能力(决定基选择理论)(Vitiello等，免疫学杂志131:1635(1983)；Rosenthal等，自然267,156-158(1977))，或被存在的TCR特异性选择性地识别(全能理论)(Klein,J.,Immunology,theScienceofSelf-NonselfDiscrimination,JohnWiley&Sons,NewYork,pp270-310(1982))。已经证实，另外的因素，大多数与处理过程相关，也在诱发严格的免疫原性以外的反应中起关键作用，这些因素中的多数潜在的决定基将以免疫优势的形式存在(Sercarz等，免疫学年评11,729-766(1993))。调节一个特定的免疫原性肽与一个或多个HLA分子结合亲和力的能力，以及由此而调节由此肽引发的免疫反应的能力，将大大提高肽基疫苗和治疗制剂的用途。本发明提供这些和其它的优势。发明概述本发明提供用于疫苗和治疗学的肽和编码这些肽的核酸。本发明提供在病人身上诱导对预选的抗原产生细胞毒T细胞反应的方法。此方法包括将细胞毒T细胞与本发明的免疫原性肽接触。本发明的肽可能来源于许多抗原，包括病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原、真菌抗原等。本发明的方法可以在体外和体内进行。在优选实施方案中，向病人给予含有编码免疫原性肽序列的核苷酸分子，使肽与细胞毒T细胞接触。在一个实施方案中，肽有约9-15个残基，以小于约500nM的解离常数结合至少2个HLA-A3样分子，并诱导细胞毒T细胞反应。此免疫原性肽具有包含一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第一个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的的第二个初级锚定残基，选自R和K；和一个或多个次级锚定残基，选自位于第3位的Y、F或W，位于第6位的Y、F或W，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的P，以及这些的任意组合。本发明进一步提供结合HLA-A※0301基因产物的免疫原性肽。这些肽含有一个9残基的结合基元，从N末端到C末端如下位于第2位的第一个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二个初级锚定残基，选自R和K；和一个或多个次级锚定残基，选自位于第1位的R、H或K，位于第3位的Y、F或W，位于第4位的P、R、H、K、Y、F或W，位于第5位的A，位于第6位的Y、F或W，位于第8位的P，以及这些的任意组合。本发明也提供结合HLA-A※1101基因产物的免疫原性肽。这些肽含有一个9残基的结合基元，从N末端到C末端如下位于第2位的第一个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二个初级锚定残基，选自R和K；和一个次级锚定残基，选自位于第1位的A，位于第3位的Y、F或W，位于第4位的Y、F或W，位于第5位的A，位于第6位的Y、F或W，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的P，以及这些的任意组合。本发明也提供结合HLA-A※3101基因产物的免疫原性肽。这些肽含有一个9残基的基元，从N末端到C末端如下位于第2位的第一个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二个初级锚定残基，选自R和K；和一个次级锚定残基，选自位于第1位的R、H或K，位于第3位的Y、F或W，位于第4位的P，位于第6位的Y、F或W，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的A或P，以及这些的任意组合。本发明也提供结合HLA-A※3301基因产物的免疫原性肽。这些肽含有一个9残基的基元，从N末端到C末端如下位于第2位的第一个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二个初级锚定残基，选自R和K；和一个次级锚定残基，选自位于第3位的Y、F或W，位于第7位的A、Y、F或W，以及这些的任意组合。本发明也提供结合HLA-A※6801基因产物的免疫原性肽。这些肽含有一个9残基的基元，从N末端到C末端如下位于第2位的第一个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二个初级锚定残基，选自R和K；和一个次级锚定残基，选自位于第1位的Y、F、W、S、T或C，位于第5位的Y、F、W、L、I、V或M，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的P，以及这些的任意组合。本发明也提供鉴定以小于约500nM的解离常数结合HLA-A3样分子的免疫原性肽的方法。此方法包括筛选抗原蛋白中存在本发明结合基元的氨基酸序列，在抗原蛋白中选择有结合基元的一个或多个亚序列。制备和检测包含选定亚序列的约8个和11个残基的试验肽。然后鉴定解离常数小于500nM的肽。定义“肽”这个词与“寡肽”在本说明书中交换使用，以指示一系列残基，典型的是L氨基酸，一般是相邻氨基酸的α氨基与羧基之间通过肽键相互连接。本发明的寡肽长度小于15个残基，通常包含8个至11个残基，优选9或10个残基。一种“免疫原性肽”是一种含有等位基因特异的基元或超基元的肽，这样此肽能结合一个MHC分子，并诱导CTL反应。本发明的免疫原性肽能结合到合适的HLA-A3样分子上，并诱导对产生此免疫原性肽的抗原的细胞毒T细胞反应。“初级锚定残基”是在肽序列上一个特定位置的氨基酸，它可以在免疫原性肽和MHC分子之间提供一个接触点。一个限定长度的肽中1～3个，通常是2个初级锚定残基决定一个免疫原性肽的基元。这些残基通常与肽结合槽紧密接触，它们的侧链埋在槽本身的特定口袋中。典型的初级锚定残基位于9聚体肽的第2位和第9位。“次级锚定残基”是指一个氨基酸，它在肽中除初级锚定位置外的一个特定位置上，出现频率显著高于随机出现频率。另外次级锚定残基可以鉴定为高亲和力结合肽中出现频率较高的氨基酸或与高亲和力结合相关的氨基酸。在这些位置上特定残基的存在与否，可以用来精细地调节含有特定基元的肽的结合亲和力。这里使用的“负结合残基”是指如果在一定的位置(通常不是初级锚定位置)上存在，将会引起对靶HLA分子结合亲和力降低的氨基酸。“基元”是指限定长度的肽，通常是8到15个氨基酸，中残基的模式，它被特定的MHC分子识别。对于每种人的MHC等位基因，肽基元通常是不同的，并且在初级和次级锚定残基的模式上，肽基元也是不同的。“超基元”是指存在于免疫原性肽上时，使肽结合一个以上的HLA抗原的基元。超基元优选被至少一个HLA等位基因以高或中等亲和力(见下面的限定)识别，优选被至少2个等位基因识别，更优选被至少3个等位基因识别，最优选被3个以上等位基因识别。共有某些相似的肽结合基元的HLAⅠ型分子归类为HLA超型。这里所用的“HLA超型或家族”表示基于共同的肽结合特异性而归类的分子组，而不是基于共同的抗原决定基的血清超型。这里所用的“HLA-A3样”HLA分子(也称为一个等位基因)是指由HLA-A等位基因编码的一组HLA分子，它们与这里所公开的HLA-A3超基元共有交叉的肽结合基元。这些等位基因共有的9个残基的超基元包括以下初级锚定残基在第2位的A、L、I、V、M、S或T和第9位(9聚体的C末端)的正电荷残基，如R和K。用血清学或DNA分型鉴定的此家族的典型成员包括A3(A※0301)、A11(A※1101)、A31(A※3101)、A※3301和A※6801。此家族的其它成员包括A34、A66和A※7401。正如下面的详细解释，通过在次级锚定位置的置换，可以精细的调节与每一种等位基因的结合。“HLA-A2样”超型的特征是在肽配体的第2位和C末端偏爱小的或脂肪族氨基酸(L、I、V、M、A和T)。此家族包含至少8种HLA-A等位基因(A※0201、A※0202、A※0203、A※0204、A※0205、A※0206、A※6802和A※6901)。“HLA-B7样”超型包括至少一打HLA-B等位基因编码的产物(B7、B※3501、B51、B※5301、B※5401、B※5501、B※5502、B※5601、BB※6701和B※7801)(Sidney等，免疫学杂志154:247(1995)；Barber等，CurrBiol.5:179(1995)；Hill等，自然360:434(1992)；Rammensee等，免疫遗传学41:178(1995))，其特征是识别在第2位带脯氨酸并在C末端带疏水性或脂肪族氨基酸(L、I、V、M、A、F、W和Y)的肽。“分离的”和“生物纯的”这个词是指基本上没有在天然状态经常与之相伴的组分的物质。因此，本发明的肽不含有正常与原位环境相关的物质，如抗原呈递细胞上的MHCⅠ分子。一种蛋白即使分离到均一或优势带，仍然有天然蛋白的5-10％的痕量污染物与目的蛋白一起纯化。本发明的分离肽不含有这种共纯化的内源性蛋白。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物整合到寡肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。附图简述图1显示5个A3样等位基因的精确等位基因特异的基元A※0301、A※1101、A※3101、A※3301和A※6801。显示了与每一个非锚定位置相关的，以良好的或弱的结合能力结合到每个单独的等位基因上的单个残基，或化学性质相似的残基族。图2显示A3样超基元。圆括号内的数字指示优选的或有害的残基或残基族的分子数。图3概括了影响肽对a)B※0702、b)B※3501、c)B51、d)B※5301和e)B※5401结合能力的次级作用。这些图随后用来确定B7样超基元(f)。圆括号内的数值指示优选的或有害的残基或残基族的频率。图4显示由于在每一个非锚定位置上不同残基的作用，A※0101亚基元9聚体肽的相对平均结合能力。2-9残基(a)3-9残基(b)亚基元肽的数据组，象在材料与方法中介绍的那样分析和列表显示。2-9和3-9组分别含有101和85个不同的肽。也显示了影响带2-9(c)3-9(d)残基的A※0101亚基元的9聚体肽的结合能力的次级作用图。图5显示由于在每一个非锚定位置上不同残基的作用，A※0101亚基元10聚体肽的相对平均结合能力。分析和列表显示了2-10残基(a)或3-10残基(b)亚基元肽的数据组。2-10和3-10组分别含有91和89个不同的肽。也显示了影响带2-10(c)残基和(1)和或3-10残基(d)A1亚基元的10聚体肽的结合能力的次级作用图。优选实施方案的描述本发明涉及对人Ⅰ型MHC(称为HLA)等位基因，特别是HLA-A3样等位基因的等位基因特异的肽基元和超基元的确定。然后这些基元用来制备和修饰任何目的抗原的T细胞表位，这些抗原特别包括与人病毒病、寄生虫病、真菌病或癌症相关的抗原。正如上面所提到的，高HLA结合亲和力与更高的免疫原性相关。更高的免疫原性可以用数种不同的方法加以证明。例如，更高结合的肽会更经常地产生免疫。接近90％的高结合肽是免疫原性的，相比之下，以中等亲和力结合的肽只有50％是免疫原性的。更高结合的肽也导致更强烈的反应。结果，就需要更少的肽产生相似的生物学作用。因此在本发明的某些实施方案中，特别希望高结合的表位。在本发明的某些实施方案中，需要鉴定与优势表位相对的亚优势表位。这里采用的术语中(见Sercarz等，(1993)，同上)，一个“优势表位”诱导用完全天然抗原免疫产生的反应。这样一种反应在体外与肽表位交叉。一个“隐藏表位”激发由肽免疫引起的反应，但在体外不与完整蛋白用作抗原时交叉。最后，一个“亚优势表位”是这样一种表位，即用完整的抗原免疫几乎不引起任何免疫反应，但用肽免疫可以获得一种反应，而且这种反应(不象隐藏表位那样)在用完整蛋白在体外回忆这种反应时被检测。优势和亚优势的概念是与病毒病和癌症的治疗有关的。在慢性病毒病过程中，亚优势表位的参与对感染的成功清除是十分重要的，特别是在由于功能性耐受、抑制、病毒突变和其它机制引起优势CTL特异性失活时(Franco等，CurrentOptioninImmunology,7:524-531,(1995))。而且，在癌症和肿瘤抗原的情况下，识别至少某些最高结合的肽的CTL，似乎由于耐受和抑制而功能性失活，而较低结合亲和力的肽就被优先识别。特别是已经提到的，大量的来自已知的非病毒肿瘤相关抗原(TAA)的肽，以中等亲和力(IC50％在50-500mM之间)结合HLAⅠ型。已经发现15个已知的TAA肽中的8个，被肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或CTL识别，以50-500mM结合。这些结果与估计的组成对照，即90％的已知病毒抗原被识别为以50μM的IC50％或更小结合HLA的肽，而大约只有10％以50-500mM之间结合(Sette等，J.Immunol.,153:5586-5592(1994))。这种现象可能是由于在癌症状态下，因T细胞的耐受，而消除或功能性抑制识别数种最高结合的肽的CTL所致。本发明提供通过初级和次级锚定位置上所需残基的选择，而调节免疫原性肽的结合亲和力的方法。正如以下详细解释的那样，这里提供了增强结合到A3样等位基因的超基元。依靠对结合亲和力的理想作用，置换合适肽上的锚定残基。用本发明可以获得的修饰的例子包括增加特定等位基因的亲和力(如，通过对等位基因特异的次级锚定残基的置换)、提高不同等位基因之间的交叉反应性(如，通过一个以上的等位基因共有的次级锚定残基的置换)、和产生亚优势表位(如，通过能增加亲和力，但在免疫优势表位不存在的残基的置换)。许多潜在的靶蛋白上的表位可以用于本发明。合适抗原的例子包括前列腺特异抗原(PSA)、乙型肝炎核心和表面抗原(HBVc、HBVs)、丙型肝炎抗原、EB病毒抗原、黑色素瘤抗原(如MAGE-1)、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原和人乳头瘤病毒(HPV)抗原。真菌抗原的例子包括来自白色念珠菌、新型隐球菌、球孢菌属的种类、组织胞浆菌属的种类和烟曲霉的抗原。寄生虫抗原包括来自疟虫属的种类、锥虫属的种类、血吸虫属的种类、利氏曼虫等的抗原。本发明肽的制备和评价在PCT出版物W094/20127和WO94/03205中有描述。简言之就是合成含有来自特定抗原的表位的肽，并检测其结合到合适MHC分子上的能力，使用的检测方法包括用纯化的Ⅰ型分子和放射碘标记的肽和/或表达空载Ⅰ型分子的细胞，进行免疫荧光染色和流动显微荧光测定法；肽依赖的Ⅰ型装配测定法；和肽竞争性CTL识别抑制。进一步评价了那些结合到Ⅰ型分子上的肽作为CTLs靶子的能力，这些CTLs来自感染的或免疫过的个体；也评价它们诱导初级体外或体内CTL反应的能力，这些CTL反应可以产生能与疾病相关的选择性靶细胞反应的CTL群体。在整个这篇公开的内容中，用IC50’s这个词来表示结果。设定测定法进行的条件(即限制MHC和标记的肽的浓度)，这些值大约是KD值。应该指出的是，如果测定的条件改变了，IC50的值可以改变，而且常常依据所用的特定的试剂而变化很大(如MHC制剂)。例如MHC过浓会增加给定配体的表观的IC50检测值。正如这里所用的，“高亲和力”定义为以小于50nM的IC50(或KD)结合。“中等亲和力”是以50-500nM之间的IC50(或KD)结合。测定结合的检测法在PCT出版物WO94/20127和WO94/03205中有详细描述。另一个表示结合数据的方法，是以与一个参照肽的相对值来表示。这个参照肽在每一次检测中都用。随着特定检测法的敏感度的升降，被试肽的IC50’s也有一些变化。然而，与参照肽的相对的结合力是不会变的。例如在一定条件下进行检测，参照肽的IC500增加10倍，所有的IC50值也将升高约10倍。因此。为了避免意思不清楚，评价一个肽是一个好的、中等的、弱的或负的结合物，应该根据它与标准肽的IC50相对的IC50。用来描绘肽化合物的名称遵循常规的方法，即每个氨基酸残基的氨基在左边(N末端)，羧基在右边(C末端)。在代表本发明选择的特殊实施方案的表达式中，尽管没有特别指明，但氨基和羧基基团是处于生理pH值条件下的状态，除非有特别的说明。在氨基酸结构式中，每种残基通常以标准的3字母或单字母表示法表示。氨基酸残基的L型以一个大写的单字母符号或大写3字母符号中的第一个字母表示，而有D型的氨基酸残基的D型以小写的单字母符号或小写的3字母符号表示。甘氨酸没有不对称的碳原子，就简单地以“Gly”或G表示。免疫原性肽可以通过合成、DNA重组技术或从诸如全病毒或肿瘤等天然来源而制备。虽然这种肽优选基本上没有其它天然存在的宿主细胞蛋白及其碎片，但在某些实施方案中，此肽能够被合成连接到天然的片段或颗粒上。多肽或肽可以有不同的长度，不管是在中性(无电荷)状态，还是其盐，也不管是在没有被糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰状态，还是在有这些修饰状态，只要在这些修饰状态下，多肽的生物活性不被破坏。理想的条件是，肽尽可能小，而仍然保持大肽的全部生物活性。如果可能，将本发明的肽优化到8至20个氨基酸残基的长度比较理想，典型的是9到15个，优选9到10个，与结合到细胞表面MHCⅠ型分子上的、内源性处理的病毒肽或肿瘤细胞肽的大小相当。这里公开的优选的超基元适合于长度约9个残基的肽。其它长度的肽(如8、10和11个残基)的超基元、初级锚定和次级锚定的鉴定，可以用这里介绍的技术进行。有所需活性的肽可以按需要被修饰成含有某些所需的特征，如改进的药理学特性，而增加或至少基本上保留未修饰肽的全部生物活性，以结合理想的MHC分子并活化合适的T细胞。例如肽可以被不同地改变，如保守的或非保守的置换，这种改变为其使用提供了一定的优势，如改进的MHC结合。保守置换是指一个氨基酸残基被另一个生物学和/或化学性质相似的残基所置换，如一个疏水残基被另一个疏水残基置换，或一个极性残基被另一个极性残基置换。这些置换包括如下的组合Gly,Ala；Val,Ile,Leu.,Met；Asp,Glu；Asn,Gln；Ser,Thr；Lys,Arg；和Phe,Tyr。单个氨基酸置换的效果也可以用D-氨基酸检测。这种修饰可以用熟知的肽合成方法完成，正如在Merrifield，科学232:341-347(1986)，和StewartandYoung,SolidPhasePeptideSynthesis,(Rockford,I11.,Pierce),2dED.(1984)介绍的那样。肽也可以通过延伸或缩短此化合物的氨基酸序列而被修饰，如氨基酸的增加或删除。本发明的肽或类似物也可以通过改变某些残基的次序或组成而被修饰，但首先应该清楚某些氨基酸残基对生物活性是必需的，如那些在关键结合位点的或保守的残基，这些残基通常不被改变，从而对生物活性没有不利的作用。非关键的氨基酸不必限定于在蛋白中天然存在的那些，如L-α氨基酸或其D异构体，也可以包括非天然的氨基酸，如β-γ-δ氨基酸，和许多L-α氨基酸的衍生物。通常，单个氨基酸置换的一系列的肽被用来测定静电荷、疏水性对结合的影响。例如，沿着肽的长度制备一系列的正电荷(如Lys或Arg)或负电荷(如Glu)氨基酸置换物，揭示对各种MHC分子和T细胞受体敏感性的不同模式。另外，可以用小的、相对中性的残基如Ala、Gly、Pro、或类似的残基进行多个置换。置换物可以是同源寡聚体或异源寡聚体。被置换或添加的残基的数量和类型，取决于基本结合点之间的必需间距与所寻求的特定功能特征(如疏水性对亲水性)。与母本肽的亲和力相比，这种置换也可以获得对MHC分子或T细胞受体增加的结合亲和力。在任何情况下，这种置换所选用的氨基酸残基或其它分子片段，应该避免破坏结合的空间和电荷的干扰。典型的氨基酸置换是单个残基置换。置换、删除、插入或这些的任何组合可以合并以获得最终的肽。置换的变体是指那些在肽上至少一个残基被删除而在其位置上插入另一个不同的残基。这些置换通常按照以下的表1进行，此时希望精确调节肽的特征。表1原始残基示范置换AlaSerArgLys,HisAsnGlnAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisLys；ArgIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；HisMetLeu；IlePheTyr；TrpSerThrThrSerTrpTyr；PheTyrTrp；PheValIle；Leu通过选择比表1中的置换更不保守的置换得到功能上(如对MHC分子或T细胞受体的亲和力)的明显改变，即选择对维持以下特征有显著不同作用的残基，(a)在置换区域内肽主链的结构，如片层或螺旋构象，(b)在靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。通常预计对肽的性质产生最大改变的置换是(a)亲水残基，如丝氨酰基，置换(或被)疏水残基(置换)，如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)带正电荷侧链的残基，如赖氨酰基、精氨酰基、或组氨酰基，置换(或被)负电荷残基(置换)，如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(c)有庞大侧链的残基，如苯丙氨酸，置换(或被)没有侧链的残基(置换)，如甘氨酸。此肽也可以包含免疫原性肽中两个或更多个残基的等配物。这里所说的等配物是指由于第一段序列的空间构象符合第二段序列特异的结合位点，而能够置换第二段序列的两个或更多残基的一段序列。这个词特别包括本领域技术人员熟知的肽主链修饰。这些修饰包括酰胺氮的修饰、α碳的修饰、酰胺羧基的修饰、酰胺键的完全取代、延伸、删除或主链交联。一般参见Spatola,ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.Ⅶ(Weinsteined..1983)。用各种不同的氨基酸的模拟物或非天然的氨基酸进行肽修饰在提高肽在体内的稳定性是特别有用的。稳定性可以用许多方法检测。例如，肽酶和各种生物介质，如人血浆和血清，已被用于检测稳定性。见如Verhoef等，Eur.J.DrugMetab.Pharmcokin11:291-302(1986)。本发明的肽的半衰期用25％人血清(V/V)检测法方便地确定。方法大致如下收集的血清(AB型，非热灭活)在使用前离心去除脂肪。然后用RPMI组织培养基稀释到25％，用于检测肽的稳定性。在预定时间间隙，取出小量的反应液，加入6％的三氯乙酸或乙醇水溶液。絮状反应样品冷却(4℃)15分钟，然后旋转使沉淀的血清蛋白形成小球。然后用稳定特异的层析条件，通过反相HPLC确定肽的存在。本发明的肽或有CTL刺激活性的类似物，可以被修饰而提供所需的特性，而不是提高血清半衰期。例如肽诱导CTL活性的能力可以通过连接一段序列而加强，此序列含有至少一个能诱导T辅助细胞反应的表位。特别优选的免疫原性肽/T辅助肽结合物通过一个间隔分子连接。典型的间隔分子包括相对小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模拟物，它们在生理条件下基本不带电。间隔物一般选自Ala、Gly，或其它非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔物。应当知道，任选的现有的间隔物不必包含同一个残基，因此可以是异源或同源寡聚物。现有的间隔物通常是至少一个或两个残基，更常见的是3-6个残基。另外，CTL肽可以不用间隔物连接到T辅助肽上。免疫原性肽可以直接地，或借助一个间隔物在CTL肽的氨基末端或羧基末端，连接到T辅助肽上。免疫原性肽或T辅助肽的氨基末端可以被酰化。本发明所用的T辅助肽可以以CTL肽同样的方式修饰。例如，它们可以被修饰成含有D氨基酸或连接到诸如脂、蛋白质、糖等其它分子上。典型的T辅助肽包括破伤风类毒素830-843、流感307-319、疟疾环子孢子382-398和378-389。另外，T辅助肽是一种被大多数T辅助细胞识别的肽。这可以通过选择结合许多、大多数或全部的Ⅱ型MHC分子的氨基酸序列而实现。这些是被认为“MHC不严格限定的”或“杂乱的”T辅助序列。氨基酸序列杂乱的例子，包括来自抗原的序列，如破伤风毒素830-843位(QYIKANSKFIGITE),PlasmodiumfalciparumCS蛋白378-398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)和链球菌18KD蛋白1-16位(GAVDSILGGVATYGAA)。另外，用自然界未发现的氨基酸序列，以MHC不严格限定的方式，可以制备能刺激T辅助淋巴细胞的合成肽(见PCT出版物WO95/07707)。这些称为Pan-DR结合表位(PADRE)的合成化合物是根据其对大多数HLA-DR(人Ⅱ型MHC)分子的结合活性而设计的。例如，发现含有通式aKXVWANTLKAAa的肽，这里X=环己基丙氨酸、苯丙氨酸、或酪氨酸，a=D-丙氨酸或L丙氨酸，结合大多数HLA-DR等位基因，并刺激大多数个体的T辅助淋巴细胞的反应，不管个体的HLA类型。T辅助表位也可以被修饰而提高其生物学作用。例如，存在于T辅助表位的肽可以含有D-氨基酸而提高其对蛋白酶的抵抗力，因此延长其血清半衰期。T辅助表位也可以结合到其它分子上，如脂质、蛋白质或糖，或任何其它的合成化合物，而提高其生物活性。尤其是T辅助肽可以以氨基或羧基末端结合到一个或多个棕榈酸链上。在某些实施方案中，可能需要在本发明的药用组合物中包含至少一种引发CTL的组分。脂质已被鉴定为能引发体外抗病毒抗原CTL的试剂。例如，棕榈酸残基能结合到Lys残基的α和ε氨基基团上，然后借助一个或多个连接残基，如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等，连接到免疫原性肽上。然后这种脂化的肽能以分子团的形式、整合到脂质体中或与不完全弗氏佐剂等佐剂乳化直接注射。在优选实施方案中，特别有效的免疫原包括结合到Lys残基的α和ε氨基基团上的棕榈酸，这是借助Ser-Ser的连接结合到免疫原性肽的氨基端上。作为CTL反应的脂质引发的另一个例子，大肠杆菌脂蛋白，如三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)Ⅰ，当共价结合到一个适合的肽上，可以用来引发病毒特异的CTL。见Deres等，自然342:561-564(1989)，在此引用作为参考。本发明的肽可以偶联到P3CSS上，例如给一个个体给予脂肽以特异地引发对靶抗原的CTL反应。而且，由于中和抗体的诱导也可以用结合到呈现合适表位的肽上的P3CSS引发，所以这两种组合物可以合并使用，以更加有效地激发对抗感染的体液和细胞介导的应答。另外，额外的氨基酸可以加到肽的末端，而使一个肽容易连接到另一个肽上、使肽偶联到载体或大肽上、修饰肽或寡肽的理化性质等。氨基酸如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等可以被引入到肽或寡肽的C或N末端。在某些例子中，C末端的修饰会改变肽的结合特性。而且肽和寡肽的序列由于被末端-NH2酰化，如链烷基(alkaboyl)(C1-C20)、或巯基乙酰化，末端羧基酰胺化，如氨、甲胺等修饰，而与天然序列不同。在某些例子中，这些修饰能提供结合到一个支持物或其它分子的位点。本发明的肽能够以许多途径制备。由于较短，此肽可以按常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。有许多商品化的自动合成仪，可以按已知的程序使用。例如见StewartandYoung,SolidPhasePeptideSynthesis,2d.ed.,PierceChemicalCo.(1984)，同上。另外，可以用重组DNA技术，将编码一个感兴趣的免疫原性肽的核苷酸序列插入到一个表达载体中，转化或转染到一个合适的宿主细胞中，在适合表达的条件下培养。这些步骤在本领域是众所周知的，正如在Sambrook著的MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1982)所一般介绍的，在此引用作为参考。因此，包含一个或多个本发明的肽序列的融合蛋白可以用来呈递合适的T细胞表位。由于这里期望长度的肽的编码序列可以通过化学技术合成，例如Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)介绍的磷酸三酯法，可以通过简单地将编码天然肽序列的合适碱基置换而进行修饰。然后编码的序列可以提供合适的连接物，并连接到本领域常用的表达载体中，此载体用来转化合适的宿主产生所需要的融合蛋白。现在已有许多这样的载体和合适的宿主系统。对于融合蛋白的表达，编码序列带有可操作连接的起始密码子和终止密码子、启动子和终止子区以及通常的复制系统，以提供在所需的细胞系统中表达的表达载体。例如，与细菌宿主相容的启动子序列装在含有合适的限制位点以插入所需编码序列的质粒中。得到的表达载体转化到合适的细菌宿主中。当然，合适的载体和对照序列也可以使用酵母或哺乳动物细胞宿主。本发明的肽和本发明的药用和疫苗组合物，对给哺乳动物给药，特别是人给药，以治疗和/或预防病毒感染和癌症是有用的。用本发明的免疫原性肽可以治疗的疾病的例子包括前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、肾癌、颈癌、淋巴瘤、CMT和尖锐湿疣。另外，此肽可用于治疗任何感染性疾病，如病毒、真菌和寄生虫感染。例如在WO94/20127和WO94/03205中公开了合适的抗原。正如上面所提到的。本发明的肽与对肽上表位特异的CTL接触时，诱导CTL免疫反应。然而，肽与CTL接触的方式对本发明并不关键。例如肽可以在体内或体外与CTL接触。如果接触发生在体内，肽本身可直接对病人给药，或用以下介绍的其它的载体(如编码一种或多种肽的DNA载体、编码此肽的病毒载体、脂质体等)给药。对于药用组合物，免疫原性肽或编码它们的DNA给药给已经患有癌症或感染有目的病原体的病人。肽或编码它们的DNA可以单独给药，或以这里公开的一个或多个肽序列融合给药。处于潜伏期或急性感染期的病人可以用免疫原性肽单独治疗，或与其它合适的治疗方法联合。在治疗应用中，向病人给予足够量的组合物，以引发对病毒或癌症抗原有效的CTL反应，来治疗或至少部分控制症状和/或并发症。达到此目的的足够的量称为“治疗有效量”。对这种用途的有效量取决于诸如所给予的特定的组合物、给药的方式、疾病治疗时的阶段和严重程度、病人的体重和大概健康状态和处方医生的判断。但初次免疫(治疗或预防给药)的剂量范围大概是70kg的病人1.0μg～5000μg的肽。加强剂量为1.0μg-1000μg的肽，根据检测病人血液中特异的CTL的活性而确定的病人的反应和条件，决定加强期为数周或数月。必须牢记本发明的肽和组合物通常是用于严重的疾病状态，即威胁生命或潜在威胁生命的状态。在这种情况下，鉴于此肽的外源物质最少和相对无毒性，治疗医生可能和希望给予超量的肽组合物。对于治疗应用，应该在病毒感染的第一症状出现时，或肿瘤检出或手术切除时，或急性感染诊断后不久，开始给药。然后加强剂量直到至少症状基本消退并维持一段时间。在慢性感染中需要在加强剂量后补充剂量。用本发明的组合物治疗感染的病人可以促进急性感染病人感染的消除。对于那些易于(或倾向于)发展成慢性感染的病人，这些组合物对于预防从急性转变成慢性是特别有用的。例如一旦在感染前或在感染过程中，确定了易于转变的病人，正如这里介绍的，就向他们给予组合物，尽量减少给更大人群给药的必要。此肽和其它组合物也可以用来治疗慢性感染，和刺激免疫系统来清除携带者中病原体感染的细胞。重要的是，以一种制剂和方式提供的免疫增强肽的量，要足以有效地刺激T细胞反应。因此，为了治疗慢性感染，典型的剂量是，70kg病人每次约1.0μg～5000μg的范围，优选约5μg～1000μg。可能需要在确定的间隔期，如1到4周，给予免疫剂量继之以加强剂量，持续一个延长期至有效地免疫病人。在慢性感染的情况下，应该连续给药，直到临床症状或实验室检测显示病毒感染被清除或基本消退，并维持一段时间。用于治疗的药用组合物打算通过非肠道、表面、口服或局部给药。优选地，此药用组合物通过非肠道给药，如静脉、皮下、真皮内或肌肉内。因此本发明提供用于非肠道给药的组合物，此组合物包括免疫原性肽溶于或悬浮于一个可接受的载体，优选水性载体的溶液。可以使用各种水性载体，如水、缓冲水、0.8％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的、熟知的灭菌技术除菌，也可以通过过滤除菌。得到的液体溶液可以分装备用，或冻干。冻干的制剂在给药前与无菌溶液联合。这些组合物可以含有药用可接受的、因需要接近生理条件而加的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。本发明的CTL刺激肽在药用制剂中的浓度变化很大，即从重量小于0.1％，通常在或小于2％，到高至20％至50％或更高。浓度主要通过液体体积、粘性等选择，与所选择的特定的给药方式一致。本发明的肽也可以借助脂质体给药，脂质体把肽送到特定的组织，如淋巴组织、或选择性地送到感染的细胞，还可以延长肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、发泡剂、微胶粒、不溶性单分子层、液晶、磷脂分散体、片层等。在这些制剂中，释放的肽单独地、或与一个分子联合整合到脂质体中，这个分子结合到淋巴细胞中普遍存在的受体，如结合CD45抗原的单克隆抗体上，或与其它治疗的或免疫原性的组合物联合整合到脂质体中。因此填充有或包裹有本发明肽的脂质体，可以被直接送到淋巴细胞的部位，在这里脂质体然后释放选择的治疗性/免疫原性肽组合物。本发明所用的脂质体是由标准的发泡脂制备的，通常包含中性的和带负电荷的磷脂和甾醇，如胆甾醇。脂质的选择通常以以下的考虑为指导，如脂质体的大小、耐酸性和脂质体在血流中的稳定性。已有许多方法制备脂质体，如Szoka等，生物物理与生物工程年评9:467(1980),U.S.PatentNos.4235871,4501728,4837028，和5019369中介绍的。在此引入作为参考。为了运送到免疫细胞上，整合到脂质体中的配体可以包括，诸如对所需的免疫系统细胞的表面决定基特异的抗体或其片段。含有肽的脂质体悬液可以静脉给药，表面给药或局部给药，给药的剂量具体根据给药的方式、所给的肽的种类和所治疗疾病的阶段而变化很大。对于固体组合物可以使用常规的无毒的固相载体，例如包括药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，药用可接受的无毒组合物是通过混合任何正常使用的赋形剂，如前面列出的那些载体，和一般10-95％的活性成分，即一种或多种本发明的肽，更优选的浓度为25-75％而形成。对于气溶胶给药，免疫原性肽优选地与表面活性剂和推进剂一起以精细分散的形式提供。肽的典型的百分比是重量的0.01％-20％，优选1％-10％。表面活性剂必须是无毒的，而且最好在推进剂中是可溶的。这些试剂的代表是含6至22个碳原子的脂肪酸的酯或不完全酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸(olesteric)和油酸与脂肪族多元醇或其环状酐形成的酯。可以使用混合酯如混合或天然的甘油酯。表面活性剂可以占组合物重量的0.1％-20％，优选0.25-5％。组合物的平衡是用通常的推进剂。如果需要，也可包括载体，如鼻内给药的卵磷脂。本发明的另一方面涉及疫苗，疫苗含有一种活性组分，即免疫有效量的这里介绍的一种或多种免疫原性肽。这种肽可以通过连接到自身的载体或以活性肽单元的同源多聚物或异源多聚物的形式引入到包括人的宿主体内。这种多聚物具有提高免疫反应的优势，而且如果用不同的肽制备多聚物，就有另外的能力来诱导与病毒或肿瘤细胞不同的抗原决定基反应的抗体和/或CTLs的产生。有用的载体在本领域是熟知的，包括诸如甲状腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破伤风类毒素、多聚氨基酸如多聚(赖氨酸∶谷氨酸)、流感病毒、乙型肝炎核心蛋白、乙型肝炎重组疫苗等。疫苗也可以含有生理耐受的(可接受的)稀释剂，如水、磷酸缓冲盐水、或盐水，而且进一步一般包括一种佐剂。佐剂，如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、或明矾是本领域熟知的物质。而且，如上所述，CTL反应可以通过将本发明的肽结合到脂质，如P3CSS上而引发。用这里介绍的肽组合物，通过注射、气溶胶、口服、经皮或其它途径免疫，宿主的免疫系统通过产生大量的对目的抗原特异的CTLs而对疫苗反应，而且宿主对以后的感染至少部分免疫，或对发展成慢性感染有抵抗力。含有本发明肽的疫苗组合物给予易于患、或正处于病毒感染或癌症危险的病人，以激发对抗原的免疫反应，因此提高病人自身的免疫反应能力。这样一种量称为“免疫有效量”。在这种使用中，精确的剂量再次取决于病人的健康状况和体重、给药的方式和制剂的性质等。但通常的范围是70kg的病人约1.0μg至大约5000μg，更常用的是每70kg体重约10μg至大约500μg。在某些例子中，需要将本发明肽疫苗与能诱导对目的病毒，特别是对病毒被膜抗原，产生中和抗体反应的疫苗联合。为了治疗或免疫的目的，本发明的肽也可以用减毒的病毒宿主，如牛痘或禽痘病毒表达。这种方法涉及将牛痘病毒用作载体来表达编码本发明肽的核苷酸序列。如果将其引入急性或慢性感染的宿主或引入未感染的宿主，重组的牛痘病毒会表达免疫原性肽，因而激发宿主的CTL反应。牛痘载体和免疫程序有用的方法如U.SPatentNo.4722848的描述。在此引入作为参考。另一个载体是BCG(BcilleCalmetteGuerin)。BCG载体在Stover等，(Nature351:456-460(1991))中有描述，在此引入作为参考。对本发明肽的治疗给药或免疫有用的大量其它的载体，如伤寒沙门氏菌载体等，从这里的描述，本领域的技术人员是明了的。抗原肽也可用来引发离体CTL。产生的CTL能用来治疗对其它常规的治疗方法没有反应，或对肽疫苗的治疗方法没有反应的病人的慢性感染(病毒性或细菌性)或癌症。通过将病人的CTL前体细胞(CTLp)与一种来源的抗原呈递细胞(APC)以及合适的免疫原性肽在组织培养中共孵，可以诱发对特定病原体(感染因子或肿瘤抗原)的离体CTL反应。经过合适的孵育时间(通常1-4周)，CTLp被激活并成熟和发展成效应CTL。这些细胞重新输回给病人，这样它们将破坏特异的靶细胞(感染的细胞或肿瘤细胞)。编码一个或多个本发明肽的DNA也可以给病人给药。这种方法，例如在Wolff等，科学247:1465-1468(1990)和U.S.PatentNos.5580859和5589466中有描述。编码本发明肽的核苷酸给药的一个优选方法是使用编码多个本发明表位的小基因构建体。为了构建在人细胞中表达的编码选择的CTL表位的DNA序列(小基因)，反翻译此表位的氨基酸序列。使用人密码子使用表指导每一个氨基酸的密码的选择。这些编码表位的DNA序列直接毗连，构建一个连续的多肽序列。为了优化表达和/或免疫原性，将另外的元件整合到小基因的设计上。能够被反翻译并包括在小基因序列中的氨基酸序列的例子包括辅助T淋巴细胞表位、引导(信号)肽和内质网滞留信号。另外，CTL表位的MHC呈递，能够通过包含与CTL表位毗连的合成的(如多聚丙氨酸)或天然存在的旁侧序列而加强。小基因序列通过装配寡核苷酸而转到DNA中，这些寡核苷酸编码小基因的正链和负链。用熟知的技术，在合适的条件下合成、磷酸化、纯化和退火重叠的寡核苷酸(30-100个碱基长)。用T4DNA连接酶连接寡核苷酸的末端。这种合成的小基因，编码CTL表位多肽，能够克隆到所需的表达载体中。本
技术领域：
熟知的标准调节序列包含在载体中，以保证在靶细胞中表达。还需要几种载体元件一个带有下游克隆位点以便小基因的插入的启动子；一个为了有效转录终止的聚腺苷化信号；一个大肠杆菌复制起始区；和一个大肠杆菌的选择标记(如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。许多启动子可以用于此目的，如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其它合适的启动子序列，见U.S.PatentNos.5580859和5589466。可能需要另外的载体修饰来优化小基因表达和免疫原性。在某些情况下，有效的基因表达需要内含子，一个或多个合成的、或天然存在的内含子可以整合到小基因的转录区。也可以考虑包含mRNA稳定序列以提高小基因的表达。近来已经提出免疫刺激序列(ISSs或CpGs)对DNA疫苗的免疫原性起作用。如果发现可以提高免疫原性，这些序列可以包含在载体中，在小基因编码序列之外。在某些实施方案中，可以使用双顺反子，使产生小基因编码的表位和第二蛋白，后者用来加强或减弱免疫原性。蛋白或多肽如果协同表达，能够有助于加强免疫反应的例子包括细胞因子(如IL2、ILl2、GM-CSF)、细胞因子诱导分子(如LeIF)或协同刺激分子。辅助(HTL)表位可以结合到细胞内靶信号上，并与CTL表位分开表达。这就使HTL表位针对与CTL表位不同的细胞区。如果需要，还可以使HTL表位更有效地进入到Ⅱ型MHC途径，因此加强CTL诱导。与CTL诱导相比，通过免疫抑制分子(如TGF-β)的协同表达特异性地减弱免疫反应在某些疾病是有益的。一旦选择了一个表达载体，小基因就克隆到启动子下游的多克隆位点中。这个质粒转化到合适的大肠杆菌菌株中，用标准技术制备DNA。小基因的方向和DNA序列，以及包含在载体中的其它元件，用限制性酶切图谱和DNA序列分析来证实。装有正确质粒的细菌细胞可以以主细胞库和工作细胞库保存。治疗量的质粒DNA通过发酵大肠杆菌生产，接着纯化。用工作细胞库中的小量菌种，接种到发酵培养基中(如Terrific肉汤)，按熟知的技术在摇瓶或生物反应器中生长至饱和。用标准的生物分离技术，如Quiagen公司提供的固相阴离子交换树脂，纯化质粒DNA。如果需要，可以用凝胶电泳或其它方法从开环和线性DNA中分离超螺旋DNA。纯化的质粒DNA可以用许多制剂注射。最简单的是冻干的DNA在灭菌的磷酸缓冲盐水(PBS)中重配。这种方法称为“裸DNA”，近来正用于临床实验的肌肉内(IM)注射。为了使小基因DNA疫苗的免疫治疗效果达到最大，可能需要另一种方法配制纯化的DNA。已经介绍了许多方法，并且有新方法。阳离子脂质也可以用于这种制剂(如见DebsandZhu(1993)WO93/24640；ManninoandGould-Fogerite(1988)生物技术6(7):682-691；RoseU.S.PatNo.5279833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等，(1987)美国国家科学院院刊84:7413-7414中介绍的)。另外，糖脂、融合脂质体、肽和统称为保护性、相互作用、非浓缩(PINC)的化合物也可以与纯化的质粒DNA混合，以影响变量，如稳定性、肌肉内分散、或结合到特异的器官或细胞类型上。核酸也可以用弹道发送的方式给药，例如，象U.S.PatentNo.5204253介绍的那样。可以给予只包含DNA的颗粒。另外，DNA可以粘附到颗粒，如金粒上。靶细胞的致敏可用作一种功能性检测法，检测编码CTL表位的小基因的表达和Ⅰ型MHC的呈递。质粒DNA引入到哺乳动物细胞系中，此细胞系合适于作为标准CTL铬释放检测法的靶子。使用的转染法取决于最终的配方。对于“裸”DNA可以用电穿孔法，而阳离子脂质就可以在体外直接转染。表达绿荧光蛋白(GFP)的质粒可以共转染，而通过荧光活化细胞分类法(FACS)富集转染的细胞。然后这些细胞用铬-51标记，用作表位特异的CTL系的靶细胞。细胞裂解，通过51Cr的释放检测，指示编码CTL表位的小基因的MHC呈递的产生。体内免疫原性是第二种功能性检测小基因DNA制剂的方法。表达合适人MHC分子的转基因小鼠用DNA产物免疫。给药剂量和途径取决于制剂(如，IM适合溶于PBS的DNA,IP适合与脂质混合的DNA)。免疫后21天，收集脾细胞，在有编码每种被试表位的肽存在下再刺激1周。用标准的技术检测这些效应细胞(CTLs)对带有肽、铬-51标记的靶细胞的细胞裂解作用。由于MHC载有相应于小基因编码的表位的肽而致敏的靶细胞裂解，就证实了DNA疫苗体内诱导CTLs的功能。本发明的肽也发现用作诊断试剂。例如本发明的肽可以用来确定特定的个体对使用肽或相关肽的治疗方案的敏感性，因此对改进现有的治疗方案、或确定感染病人的预后是有帮助的。另外，此肽也可以用来预测哪些病人会有发展成慢性感染的危险。下面提供的例子是为了说明，并非为了限制。实例1A3样超型结合此实例提供每一种A3样等位基因A3、A11、A※3101、A※3301和A※6801的精细的基元，概要的次级锚定结合特异性。基元是通过计算此肽序列上每一个非锚定位置上肽的平均相对结合能力而得到的，这些肽带有20个常见氨基酸的每一个。按照每一个的化学相似性分组。材料与方法Ⅰ型纯化。以下的Epsstein-Barr病毒(EBV)转化的纯合细胞系用作Ⅰ型分子的来源GM3107(A3、B7；人遗传突变资源库)；BVR(A11、B35.3、Cw4；人遗传突变资源库)；SPACH(A31、B62、Cw1/3；ASHI资源库总汇)；和LWAGS(A※3301、B14、Cw8；ASHI资源库总汇)(Bodmer等，人类免疫学43:149(1995))。由Dr.WalterStorkus(匹兹堡大学)鉴定的C1R转染子用来分离A※6801。细胞系按以前的介绍维持(Sidney等，免疫学杂志154:247(1995)；Sette等，分子免疫学31:813(1994))。按以前的介绍(Sidney等，免疫学杂志154:247(1995)；Sette等，分子免疫学31:813(1994))制备细胞裂解物并纯化Ⅰ型分子。简言之，细胞在含1％NP-40(FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland)、150mMNaCl、5mMEDTA和2mMPMSF的50mMTris-HCl,pH8.5中以108细胞/ml的浓度裂解。裂解物过0.45μM的滤膜，10000g离心20分钟除去细胞核和碎片。然后用亲和层析纯化主要组织相容复合物(MHC)分子。非活化的SepharoseCL4B和蛋白ASepharose柱用作预柱。细胞裂解物反复通过连接有抗HLA(B、C)抗体B1.23.2(Rebai等，组织抗原22:107(1983))的蛋白ASepharose珠，而清除HLA-B和HLA-C分子。为了有效地清除，一般需要2至4次通过。接着，用抗HLA(A、B、C)抗体W6/32(Barnstable等，细胞14:9(1978))来结合HLA-A分子。蛋白的纯度、浓度、和清除步骤的效果由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结合检测和超基元确定。基于放射标记的标准探针肽结合到溶于去污剂的MHC分子的抑制，肽与可溶Ⅰ型分子结合的定量检测按以前介绍的进行(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994)；Kast等，免疫学杂志152:3904(1994)；Sidney等，免疫学杂志154:247(1995)；Sette等，分子免疫学31:813(1994)；Ruppert等，细胞74:929(1993))。简言之，1-10nM放射标记的探针肽，氯胺T法标记碘(Greenwood等，生物化学杂志89:114(1963))，在有1μM人β2微球蛋白(ScrippsLaboratories,SanDiego.CA,USA)和混合的蛋白酶抑制剂存在下，与不同量的MHC在室温下共孵。共孵2天后，MHC结合的放射活性的百分率用TSK2000柱上通过大小排除凝胶过滤层析确定。A3CON1肽(序列KVFPYALINK)(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994))用作检测A3、A11、A31和A※6801的放射标记探针。HBVc141-151(序列STLPETYVVRR)的T7→Y类似物(Missale等，实验医学杂志177:751(1993))用作检测A※3301的放射标记探针。在竞争检测法的情况中，计算产生放射标记探针肽结合抑制50％的肽浓度(IC50)。常常在一或两个高剂量检测肽，在随后的实验中确定产生阳性抑制的肽的IC50，在此实验中如果需要，进一步检测2-6个稀释度。使放射标记探针肽大约15％结合的MHC浓度用于所有的竞争抑制检测。因为在这些条件下(标记的)<(MHC)而且IC50>(MHC)，检测的IC50是真实KD值的合理的近似值。每一种竞争肽在2-4个完全独立的实验中检测。作为一个阳性对照，在每一次实验中都要检测与放射标记探针有关的未标记的肽，并测定其IC50。A3CON1检测A3、A11、A31和A※6801的平均IC50分别是11、6、18和8nM。ehHBVc141-151肽在A※3301检测法中的平均IC50是29nM。HLA-A特异的次级锚定基元的确定。使用Ruppert等(Ruppert等，细胞74:929(1993))介绍的方法的改良法来确定A※0201的次级锚定基元。简言之，等位基因特异的次级锚定基元，通过评价对20个常见氨基酸在9聚体序列的每一个非锚定位置上的HLA结合的作用而确定。通过计算每一位置氨基酸组合(如1位丙氨酸；2位丙氨酸等)的平均相对结合值而进行评估。为克服某些氨基酸的出现频率低的问题，如以前介绍的(Ruppert等，细胞74:929(1993))那样，将一些氨基酸与其它性质类似的归成一组。在特定位置上以平均结合能力4倍高于(或低于)全部200肽组合的总的平均结合能力结合的残基类型，就被认为以好(或弱)结合能力结合。肽合成。按以前介绍的方法(Ruppert等，细胞74:929(1993))合成肽，或从ChironMimotopes(ChironCorp.,Australia)以原料购买。合成的肽通过反相高压液相层析(HPLC)纯化到＞95％的均一性。这些合成肽的纯度在分析反相柱上检测，其组成用氨基酸分析、测序和/或质谱分析确定。在不同的人种背景和设计的人群覆盖度中HLA超型的表型频率的计算。用双向分布公式gf=1-(SQRT(1-af))(Tiwari等，TheHLAComplex，见HLAandDiseaseAssociates,NY,Springer-Verlag(1985))从抗原或等位基因的频率计算每一种HLA等位基因的基因频率(Imanishi等，第11届国际组织相容性专题讨论会论文汇编，Vol,1,Tokyo,OxfordUniversityPress(1992)；Fernandez-Vina等，人类免疫学33:163(1992))。为获得总的表型频率，计算累积基因频率，用逆公式(af=1-(1-Cgf)2)推算累积抗原频率。如下所讨论的，如果在DNA分型水平没有频率数据，就假定对应的血清学鉴定的抗原频率。为了获得总的潜在的人群覆盖度，假定没有连锁不平衡并且只包括经鉴定属于每一种超型的等位基因(最少估计值)。由基因座相互组合取得的总的潜在覆盖度的估计值，是通过把非A覆盖人群的比例加到A的覆盖度，非A覆盖人群的比例可以认为是B等位基因所覆盖的部分(如，总数=A+B※(1-A))。A3系超型的确定成员是A3、A11、A31、A※3301和A※6801。虽然A3样超型可能潜在地包括A32、A66和A※7401，但这些等位基因并不包括在总的频率计算值中。同样地，A2样超型家族的确定成员包括A※0201、A※0202、A※0203、A※0204、A※0205、A※0206、A※6802和A※6901(可能也包括A※3001)。最后，B7样超型的确定等位基因是B7、B※3501-03、B51、B※5301、B※5401、B※5501-2、B※5601、B※6701和B※7801(可能也包括B※1401、B※3504-06、B※4201和B※5602)。结果不同的HLA等位基因的肽结合口袋的结构分析。如上所述，以前的研究显示，HLA分子A3、A11和A※6801与第二位带有小的或疏水的残基、并在C末端带正电荷的配体的特异性有关(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994)；Guo等，自然360:364(1994)；Falk等，免疫遗传学40:238(1994)；Dibrino等免疫学杂志151:5930(1993)；Dibrino等，美国国家科学院院刊90:1508(1993)；Zhang等，美国国家科学院院刊90:2217(1993)；Sette等，分子免疫学31:813(1994))。我们决定更详细地评价在配体特异性上这些明显的相似性的结构基础。为这个目的，由于已知抗原肽在第二位和C末端的残基侧链与形成HLAⅠ型分子的B和F口袋的残基接触(Madden等，细胞75:693(1993)；Saper等，JMolBiol219:277(1991))，因此列表显示对于各种HLAⅠ型分子形成这些多形袋口的残基。发现已知识别第二位上小的或疏水的残基的HLA型(如，A※0101、A※0201、A※0301、A※1101、A※6801、和A※6802)，和识别配基肽的C末端带正电荷残基的HLA型(如，A※0301、A※1101、A※6801、和A※2705)共有某些关键的结构特征。尤其是，结合第二位小的和疏水残基的HLA分子分别在第45位和67位带有脂肪族残基(M或V)，在66位和70位分别带有潜在的氢键形成残基如N和K，或H和Q。所有的分子在99位都带有Y残基。相比之下，表现出不同结合特异性的Ⅰ型分子在一个或多个位置不同。同样，只有优选的C末端带正电荷的Ⅰ型分子在77、80、81和116位分别带有D、T、L和D。总而言之，这种分析显示一类HLAⅠ型分子(A3、A11和A※6801)在其B和F口袋共有某些关键的结构特征，以及一个常见的肽配体基元，其特征在于第二位的小的或疏水的残基和C末端带正电荷的残基。在这一点上，我们暂时把这些HLAⅠ型分子称为A3样超型的一部分，相应的基元称为A3样超基元。对其它基元不清楚的Ⅰ型分子的分析显示，A※3101、A※3301、A※3401、A※6601和A※7401在B和F口袋也共有这些同样的共有序列。因此预测这些分子是A3样超型的一部分。最近的结果(Falk等，免疫遗传学40:238(1994))独立地证实A31和A33的确有A3样肽基元的特征。表现重叠初级锚定特异性和肽结合全部特性的A3样分子。为了比较被某些最常见的A3样分子(A3、A11、A31、A※3301和A※6801)识别的基元的范围，对这些分子的主要锚定(第二位和C末端)结合特异性进行了更详细的分子分析。以前已经介绍了测定非标记合成肽对放射标记探针肽结合到亲和纯化的HLAⅠ型分子的抑制能力的A3和A11特异的肽结合检测法(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994)；Kast等，免疫学杂志152:3904(1994)；Sette等，分子免疫学31:813(1994))。用类似的方法建立了对A31、A※3301和A※6801特异的结合检测法(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994)；Kast等，免疫学杂志152:3904(1994)；delGuercio等，.免疫学杂志154:685(1995)；Sidney等，免疫学杂志154:247(1995)；Sette等，分子免疫学31:813(1994)；Ruppert等，细胞74:929(1993))。然后，通过检测一个原型多聚A肽AXAAAAAAX的第2位或第9位被置换的一组肽对A3、A11、A31、A※3301和A※6801的抑制能力，考察A3样分子的初级锚定特异性。每一个分子显示偏爱各自特定的残基，但在大多数所考虑的例子中，第2位被A、I、L、M、S、T或V占据和C末端被R或K占据时，获得显著的结合。这些结果与由我们(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994))和其它人(Falk等，免疫遗传学40:238(1994)；Dibrino等免疫学杂志151:5930(1993)；Dibrino等，美国国家科学院院刊90:1508(1993))得出的集中测序结果完全相符，并且在A31、A※3301和A※6801的初级锚定基元的确定中也相符。总而言之，这些结果显示，A3样初级锚定基元可定义为第2位的A、I、L、M、S、T或V和C末端的R或K。A3样分子共有重叠的肽结合全部特征。下一步检查A3样超型初级锚定基元使A3样超型分子之间的结合减弱的程度。收集了一组200个，第2位带有A、I、L、M、S、T或V和C末端带有R或K的，天然存在的9聚体肽序列。与限制每一种可能的锚定组合以单个氨基酸的天然频率的比例出现不同，含有此组合的肽是从病毒和肿瘤抗原序列中随机选择。当检测每种肽结合纯化的A3、A11、A31、A※3301和A※6801分子的能力时，显然，独特的结合模式与每一种等位基因型相关(结果未列出)。例如，有些肽更选择性地只结合一种Ⅰ型分子，而另一些肽则更广泛的交叉结合4种或5种被试分子。我们发现，一般大约10％(5％-16％)的肽-HLA组合与良好结合(IC50≤50nM)到任何给定的等位基因相关，大约17％(11％-24％)与中等结合(IC5050-500nM)到任何给定的等位基因相关。高结合和中等结合的频率与以前提到的含A※0201集中测序基元的肽的频率相当(Ruppert等，细胞74:929(1993))。然而，最值得注意的是观察到相对高的交叉反应性。在能够结合最少一种A3样分子的127种肽中，有43种(34％)结合3种或更多个A3样超型分子。4种肽结合所有5个被测试的A3样分子。比较起来，在被测试的结合5个无关的Ⅰ型分子(A※0101、A3、A24和B7)的39种肽中，只有3种(8％)结合两个分子，没有一种结合3个或更多的分子。5种测试的A3样分子中的至少4种被鉴定为高或中等结合物的肽，见表2。在此表中，好或中等结合能力是指IC50≤500nM，并用阴影加以突出。综合在一起，这些结果证实，在A3样超型分子的结合全部特征上有显著的重叠，而且证实了A3样超型的初级锚定基元。A3样超型确定对潜在的肽配体提供简并性的次级锚定残基。如上所述，虽然A3样超型分子的结合全部特征上的重叠是显著的，但也远不是完全的；每一种A3样分子保留相当程度的特异性。为了了解所观察到的交叉反应性的基础，我们试图限定一个A3样超基元，此基元能描绘与A3样超型简并性有关的肽配体的特征，并在预测A3样简并的结合物时是有用的。首先，这里分析的概括了次级锚定结合特异性的每一种A3样等位基因的精确的基元(A3、A11、A31、A※3301和A※6801)，象在材料与方法中介绍的那样得到。方法与以前用于确定一个精确的A※0201基元的方法(Ruppert等，细胞74:929(1993))类似。通过计算带有20种常见氨基酸的每一种的肽序列上每一个非锚定位置的平均相对结合能力而得到这些基元，按照单个的化学相似性分组。用这种方法产生的结果的代表、A3的计算值见表3A。接着，正如一个例子，检测在其序列的第3位带有一个芳香族残基(F、W、Y)的21种不同的肽。这些肽对A3的平均相对结合能力，是200个肽的总的平均值的31.7倍。与以前在A※0201介绍的相类似，优选的和有害的残基是指平均结合能力比总的平均值分别高4倍或低4倍的残基。因此，在第3位的芳香族残基被认为是对A3结合“优选的”残基。表2．A3样超基元交叉反应性肽表3由相对结合值确定的等位基因特异性次级锚定优先位点对每一种等位基因(A3、A11、A31、A※3301)进行类似的分析，并用来得出每一位置上等位基因特异的次级锚定所需图(表3B-E)。检测的A3样超型的每种等位基因所获得的修饰的基元总结于图1。每种分子表现出各自独特的次级锚定需要。例如，在第4位带正电荷残基(R、H、K)的被A3优选，而不被任何其它A3样分子优选。同样，在第8位，甘氨酸(G)与A11的低结合能力有关，而负电荷残基(D、E)只对A31有害。除了这些类型的独特的等位基因特异的特性外，某些残基与大多数的A3超型分子的低结合力或高结合力有关。例如，第1位的脯氨酸(P)对所有被检测的5种A3样分子都是有害的。第7位的芳香族残基(F、W、Y)和第8位的脯氨酸被5种被检测分子中的4种优选(图1)。基于这些不同的单个精确的基元，构建了A3样超基元。对所考虑的5种等位基因的至少3种是有害的残基，确定为在超基元上有害的残基。相反，被所考虑的5种等位基因的至少3种优选，但对任何等位基因无害的残基，确定为优选残基。按这种方法得到的A3样超基元见图2。预测高交叉反应性肽的A3超基元功效的实验。为了检测以上确定的A3样超基元的正确性，检测了以前未用于分析超基元的另外一组108个肽对A3、A11、A31、A※3301和A※6801的结合。这组肽包括至少有一个优选的超基元残基而没有有害的残基(超基元阳性)的30个肽，至少有一个有害残基的43个肽(超基元阴性)，和既没有优选的也没有有害的残基的35个肽(超基元中性)。在30个超基元阳性的肽中，27个(90％)结合到2个或更多的A3样分子上，16个(53％)结合到3个或更多的分子上。相比之下，35个超基元中性的肽中的18个(51％)结合2个或更多A3型，8个(23％)结合3个或更多的分子。最后，超基元阴性的肽结合多个等位基因的能力低很多，6个肽(14％)结合2个A3样分子，没有肽结合3个或更多的分子。这些结果与原来那组用来确定超基元的肽用同一类型的分析得到的结果性质相似，而与以前提到的对照肽结合无关的HLA等位基因所观察到的交叉反应性水平形成鲜明的对照。在以前的实验中，只有少数几个肽(8％)结合到一个等位基因上，而不是原始的限制元件上。从用于证实A3样超基元的那组肽中，证实了10个另外的肽以高或中等亲和力结合5个被试A3样分子中的至少4个(表2B)。在所有主要人种群中保守的HLA超型的高表型频率。为了评价HLA超型大体上的潜在关联，特别是A3样超型的潜在关联，检测了各种HLAⅠ型等位基因或抗原的发生率。到目前为止，现有的大多数HLA-A和B的数据是根据血清学分型得到的。这些数据在DNA序列确定的等位基因水平没有分辨率，因此不能区分亚型。然而，通过肽结合的研究(delGuercio等，免疫学杂志154:685(1995)；Tanigaki等，人类免疫学39:155(1994))，或集中测序分析(Fleischer等，组织抗原44:311(1994)；Rotzschke等，Eur免疫学杂志22:2453(1992))，或基于一级序列的口袋结构的分析，比较亚型的肽结合特异性显示，大多数例子的亚型有非常相似的，即使不完全一致的，肽的主要锚定特异性。因此在以下的分析中，如果没有DNA亚型水平的群体数据，但结合的数据、发表的基元或序列分析认为亚型有重叠的肽结合特异性，就可以假定在亚型等位基因和血清学确定的抗原之间有一对一的相关。检测不同的人种背景中各种A3样等位基因的发生率时，很明显每一种单个的等位基因或抗原的频率在人种群之间变化很大(Imanishi等，第11届国际组织相容性专题讨论会论文汇编，Vol.1,Tokyo,OxfordUniversityPress(1992)),5种A3样等位基因的累积频率是非常恒定的(在37％至53％之间)。例如，A3在高加索人、北美黑人和西班牙人中常见，但在日本人中几乎没有。相反，A31在日本人中常见而在高加索人和北美黑人中很少见。相比之下，在5种被检测的人群中的每一种中，A3样超型在至少37％、高的达53％的个体中存在。在本文中也有兴趣指出A3样超型的存在不是一个孤立的事情，因为最近我们已经报道了A2样(delGuercio等，免疫学杂志154:685(1995))和B7样(Sidney等，免疫学杂志154:247(1995))超型的存在。每种这些另外的超型也是非常突出的，在不同人种背景中以十分恒定的累积频率(在40％至60％之间)存在。事实上，能够容易地在基因水平计算出，现存的HLA-A或B基因总拷贝的至少一半，似乎属于这3种HLA超型中的一种或另一种。讨论这里发表的结果证实来自至少5种不同的HLA等位基因(A3、A11、A31、A※3301和A※6801)，和依据口袋结果分析预示的可能的至少3种其它的等位基因(A※3401、A※6601和A※7401)产物，可以归类为一个功能性A3样超型。这个确定是基于许多观察作出的。作为一个组，这些分子(a)在它们的肽结合区内共有一定的关键结构特征，(b)它们偏爱类似的初级锚定，(c)共有大部分重叠的结合性能。通过检查这些等位基因分子优选的、大量的带锚定残基的肽的结合活性，也确定了A3样超基元。这种超基元，是基于每一种A3样超型分子的次级锚定需要的详细图得到的，可以有效地预测A3样简并的结合肽。最后，A3样超型，和通用的超型，在所有主要人种群中以非常高的表型频率出现。照此，基于肽结合特异性的HLAⅠ型超型，代表了解HLAⅠ型分子之间相互关系的血清学和系谱分类的一种功能性的替代。除了用于A3样超基元的产生外，本研究公开的单个次级锚定图本身对了解肽结合到Ⅰ型分子上有显著作用。由于这些图是用大小均一的肽得到的，因此在每个次级位置上的优选决定基可能比天然加工肽的集中测序得到的更加准确。这里确定的基元也可以确定对肽结合起有害作用的残基。Barber和他的同事(Barber等，当代生物学5:179(1995))已经证实，肽可以被我们归于HLA-B7样超型中的两个分子识别，两个其它的肽被一个以上的A3样等位基因识别(Missale等，实验医学杂志177:751(1993)；Koenig等，免疫学杂志145:127(1990)；Culmann等，免疫学杂志146:1560(1991))(见表4)。使用一种体内诱导初级CTLs的方法(Wentworth等，分子免疫学32:603(1995))，我们观察到能够被A3和A11识别的肽的几个例子。我们检测了A3样超型限制性表位对A3样超型分子的结合能力，并注意到相对高水平的简并性。在表4所列的7个表位中，只有一个是九碱基顺序，能够分析在图2A中提出的超基元(将来的研究目标是把超基元扩展到长于9个残基的肽)。这个肽是超基元阳性的，并结合5个A3样分子中的3个。然而，每种表位与A3样超型的初级锚定特异性相符是重要的。比较我们基于肽结合而提出的超型的分类与基于DNA序列(和血清学反应性)的HLA-A等位基因的分类的关系(Ishikawa等，人类免疫学39:220(1994)；Firgaira.等，免疫遗传学40:445(1994)；Karo等，免疫学杂志143:3371(1989))揭示了相似和差异。例如，HLA-A3和A11似乎关系密切，而且来自一个共同的祖先基因(48-50)。然而，A31和A33来自含有A2/A10/A19组的古老谱系，这个谱系与A3和A11的谱系不同。最后，HLA-A※6901属于A28HLA进化组(Fernandez-Vina等，人类免疫学33:163(1992)；Ishikawa等，人类免疫学39:220(1994)；Lawlor等，免疫学年评8:23(1190))，也含有HLA-A※6802和-A※6901等位基因。然而，基于它们的肽结合特异性，HLAA※6801是A3样超型的一员，而A※6802和A※6901已证实属于A2样超型(delGuercio等，免疫学杂志154:685(1995))。因此，基于现有的HLA等位基因的表型树(Ishikawa等，人类免疫学39:220(1994)；Firgaira.等，免疫遗传学40:445(1994)；Karo等，免疫学杂志143:3371(1989))，在两种古代HLA谱系中发现A3样等位基因:含有A3和A11的A1/A9，和含有A31、A33和A※6801的A2/A10/A19。如果HLA-A3样超型的存在是共同祖先的反映，那么A3样基元事实上代表原始人HLAⅠ型肽结合特异性，其它的特异性代表对变化的致病环境的适应。表4A3样限制肽的结合b良好结合能力是指＜500nM，以阴影突出。然而，这些观察也激起引起兴趣的可能性，即可能在群体水平，存在一个维持各种HLAⅠ型超型等位基因的高频率的选择优势，这种选择优势由共同的祖先或趋同进化产生。这种优势可能与群体水平有效肽结合特性的产生相关。这种观察明显来自这个事实，即来自同一个系统发育家族的不同分子可能属于不同的结合超型家族。也有可能这些现象部分地与人转运相关抗原加工分子(TAP)的肽特异性的最佳利用有关(Androlewicz等，美国国家科学院院刊90:9130(1993)；Androlewicz等，免疫1:7(1994)；vanEndert等，免疫1:491(1994)；Heemels等，免疫1:775(1994)；Momburg等，当代免疫学视点6:32(1994)；Neefjes等，科学261:769(1993))，这些TAP分子优先转运带有一定序列特征的肽，如疏水的、芳香族的、或C端带正电荷的。最近由vanEndert和他的同事与我们合作进行的研究，评价了大量肽的TAP相对亲和力，并且介绍了扩展的TAP结合基元。令人惊奇的是，这个基元含有许多与A3样超基元相关的结构特征，如在9聚体肽的第3位和第7位优选芳香族残基，而且在第1位和第3位没有负电荷残基，在第1位没有P。基于这里提供的实验证据，似乎除了基于血清学或系统发育关系的分类外，HLAⅠ型等位基因也可以根据它们配体的特异性归类到超型。最近已鉴定了3个超型A2样、A3样和B7样，其它的，如B44样超型已在文献中提出(Fleischer等，组织抗原44:311(1994)；Harris等，免疫学杂志151:5966(1993)；Thorpe等，免疫遗传学40:303(1994)；Falk等，免疫遗传学41:162(1994)；Falk等，免疫遗传学41:165(1994))。虽然尚不知道还有多少超型将被鉴定，也不知道它们包括哪些种类，但现有的结果证实肽结合特异性简并的现象，以前认为是限制于Ⅱ型HLA(Panina-Bordignon等，Eur免疫学杂志19:2237(1989)；O’Sullivan等，免疫学杂志145:1799(1990)；Busch等，国际免疫学2:443(1990))，也是肽结合到Ⅰ型HLA的特征。不管Ⅰ型超型出现的原因是什么，都应该强调它们潜在的实际的关联。定量结合检测法的可行性和详细的超基元可以鉴定高交叉反应的肽。接着这个可以用几种混合的CTL表位广泛地覆盖，也可能对潜在地使用以肽为基础的方法发展疫苗有重大的意义(Vitiello等，JClinInvest95:341(1995))。实例2B7样超型结合以前的工作(Sidney等，免疫学杂志.，154,247-159(1995)；Hill等，自然360:434-439(1992)；Falk等，免疫遗传学38:161-162(1993b)；Barber等，当代生物学5:179(1995)；Schonbach等，免疫学杂志.，154:5951-5958(1995))显示，统称为B7样超型的HLAB特异性的较大家族，以常见的肽结合基元为特征(第2位的P、C末端的疏水残基或芳香族残基)。在这个例子中，用以上介绍的分子结合检测法详细检测5种最常见的B7样等位基因(B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401)初级锚定(第2位和C末端)的特异性。为完成这个，我们合成并检测了一系列FHVnef84-92肽(序列FPVRPQVPL)的单个置换类似物的结合。HIVnef84-92以高(IC50≤50nM)或中等(IC5050-500nM)亲和力结合B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401。发现B7样超型分子有共同的而更严格的第2位特异性。对于所有的5个等位基因，脯氨酸都是优选的残基。除了一个例外(在B※3501中的A)，所有被检测的第2位置换物比在C末端带脯氨酸锚定的亲本肽的结合亲和力降低10倍以上。相比之下，当分析结合特异性时，每一种HLA-B型在C末端表现出完全不同的特异性模式。例如，B※0702优选M、F和L，而B※5101优选L、I和V。除了这些差异以外，所有的C末端特异性模式呈现很大程度的重叠。脂肪族残基I和V至少被5种分子中的4种优选，A、L、M、F和W在大多数例子中优选或耐受。其它残基，如Y或T，只被个别的例子耐受，有些(如K或D)根本不被耐受。这些关于初级锚定特异性的结果与Sidney等，免疫学杂志，154,247-259(1995)公开的结果完全相符。能够简并B7样超型结合的肽，在第2位带有脯氨酸，在C末端带有疏水或芳香族残基(V、I、L、M、F、W、A)。在正式确定B7样超型初级锚定基元时，我们也保守地包括Y，尽管它相对缺乏简并性，因为Y在集中测序分析时构成B※3501的优势信号(Hill等，自然360,434-439(1992)；Falk等，免疫遗传学38.161-162(1993b)；Schonbach等，免疫学杂志154:5951-5958(1995))。总而言之，B7样超型的初级锚定基元确定为第2位的P，和C末端的A、I、L、M、V、F、W和Y。B7样超型配体的优选大小Ⅰ型分子通常优选长度为8至10个残基的肽(Falk等，自然351，290-296(1991))，虽然更长的肽也表现结合(Massale等，实验医学杂志177:751(1993)；Chen等，免疫学杂志.152:2874(1994)；Collins等，自然371-626(1994))。为了确定对B7样超型最佳的肽长度，合成了几组8-、9-、10-和11-残基的肽，它们代表了天然存在的病毒、肿瘤或细菌序列，并且每种都带有上述的B7样超型初级锚定特异性，对它们的B7样每个类型6种结合能力进行了分析。结论是9残基代表所有被检测的B7样分子的最佳肽长度。这个评估在任何分子结合每种大小的肽的百分率方面，和在观察到的交叉反应程度方面都是真实的(结果未列出)。B7样等位基因的次级锚定基元和B7样超基元其它的残基可以作为次级锚定，因此对肽提供补充的结合能量(Ruppert等，细胞74:929-937(1993)；Madden等，细胞75,693-708(1993)；Saito等，生物与化学杂志268,21309(1993)；Sidney等，人类免疫学45,79-93(1996)；Kondo等，免疫学杂志155:4307-4312(1995)；Parker等，免疫学杂志152,163-175(1994))。也已经证实，一些残基可能对肽结合到Ⅰ型分子有负作用(Ruppert等，细胞74:929-937(1993)；Sidney等，人类免疫学45,79-93(1996)；Kondo等，免疫学杂志155:4307-4312(1995)；Boehncke等，免疫学杂志150，331-341(1993))。为了建立能有效地选择有简并B7样结合能力的肽的B7样超基元，我们用这里介绍的方法，试图确定参与肽结合到B7样分子的次级锚定和次级作用。确定了5种最常见的B7样分子，B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401的结合能力，这5种分子包含199个9聚体肽，代表含有B7样超型初级锚定(第2位的脯氨酸、C末端的A、V、I、L、M、F和W)的天然存在的病毒序列；并分析了结果。计算了带有20种氨基酸中每一种的肽的每一位置的平均相对结合能力(ARBC)，并与完整的肽的ARBC进行比较。因为一些氨基酸很少出现，因此，按照以前介绍的(Ruppert等，细胞74:929-937(1993))按单个化学相似性对残基分组。这个分析对B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401分别进行。发现优选的和排斥的模式，对于次级锚定而言，每个分子表现的相当不一致。例如，在实验组中，18个肽在第1位有正电荷残基(R、H或K)。这些肽作为一组，是很好的B※0702结合物，ARBC为21。然而，对于B51，同样的肽是相对弱的结合物，ARBC为0.25。然而也可以注意到优选的很大的相似性。例如，在第1位带有芳香族残基(F、W和Y)的肽作为一组，是B7样超型分子组的良好结合物，对B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401，ARBC分别为4.2、17、16、20和70。以上讨论的数值，接着用来获得每个位置等位基因特异的次级锚定所需条件的图谱。为完成这个，优选的和有害的残基定义为ARBCs比总的平均值分别高3倍或低3倍的残基。这些优选的和有害的作用总结于图3。次级锚定图更清楚的揭示，尽管每个分子表现自己独特的次级锚定需要，但一些特征在B7样分子之间高度保守。例如，如上所示，在第1位的芳香族残基(F、W和Y)被所有5种B7样分子优选。相反，第8位的酸性残基(D、E)与所有5种分子的弱结合能力相关。被所考虑的5种等位基因中3种或更多优选，但对任何分子无害的次级效应，或另一方面，对5种分子中的3种或更多种有害的次级效应称为共有的效应。然后这些共有的特征，整合到扩展的B7样超基元限定的，与大多数B7样超型分子弱或好结合相关的残基中。按照这个逻辑，预计带有优选的次级残基超基元的肽，将比不带优选残基或带有害残基的肽表现出更大程度的B7样超型简并性。通过确定一组独立的带有B7样初级锚定特异性的肽的结合交叉反应性而检测这种假设。正如预计的，超基元阳性的肽(即，至少一个超基元带优选的次级残基，并没有有害残基的肽)，比超基元阴性的肽(一个或更多的超基元有有害的残基)在B7样超型内表现出明显更大程度的交叉反应性(结果未列出)。提高结合能力的超基元的完成正如这里证实的，HLA超基元在预测高度简并的肽可能是有价值的。然而，最有趣的是，HLA超基元的确定，应该也能够通过鉴定肽序列内哪些残基可能被归类或“固定”，而设计高度交叉反应的表位，并在一个超型内使肽有更大的简并性。为评估这种可能性，选择了在B7样超型内显示高度简并性的6个肽(表5)。每一种肽以高(IC50＜50rtM)或中等(IC5050-500nM)亲和力结合5种最常见的B7样分子中的至少3种。这些肽在以上介绍的B7样超基元和等位基因特异的次级锚定基元的范围内进行了分析，以确定在其序列内的特定的残基是否能被“固定”，而进一步加强它们结合到B7样超型分子上。这个评估发现所考虑的特定的肽中，没有一个含有超基元阴性残基。3种肽(HCV核心168、MAGE2170和MAGE3196)每种带有一个对单个B7样分子有害的残基(表5)。下一步，合成一组单个置换的类似物。某些含有次级锚定置换的类似物根据这里公开的数值选择，这些置换为超基元阳性，或在特定的等位基因是阳性，对任何其它置换无害。因为C末端初级锚定的优选对每种等位是独特的，因此也考虑在这个位置的置换。因此，例如为了检测是否能够增加简并性，用超基元阳性F置换第1位的天然残基制备许多类似物。其它的置换，如HBVpol541C末端的L置换Y，用以说明亲本肽对B※0702和B※5401的弱结合。当检测这组肽与B7样超型分子的结合能力时，产生表5所示的结果。在每种情况下，第1位被F置换时，表现出比亲本序列增强的结合和/或简并性。例如，MAGE2170以高的亲和力结合到B※0702上，以中等亲和力结合到B※3501、B51和B※5301上，但以弱亲和力结合到B※5401上。此肽的F1类似物以高亲和力结合所有5种分子。针对特异分子的置换的成功很难加以概括。例如，HBVpol541C末端L置换天然的Y在结合到B※0702上是成功的，同时增加结合到其它分子上的亲和力(在B51和B※5401最显著)。在另一些例子中，观察的效果不象预期的那样，正如在HBVenv313证实的那样。此肽以高亲和力结合到B※0702、B※3501、B51和B※5301上，但只很弱地结合到B※5401上。基于这个观察，即第5位的脂肪族残基(L、I、V和M)对B※5401是阳性的，而对其它分子是相对中性的，因此制备第5位是M的类似物以提高B※5401的结合。然而，正如表5所示，用M5类似物获得的显著提高的B※5401的结合能力是以降低对B※0702、B51和B※5301的结合为代价的。虽然单个类似物的成功是可变的，但值得注意的是，对于每一种情况，至少一种类似物能够提高结合亲和力，或扩展亲本肽的简并性。因此，已经简并的肽能够被独立地“固定”以提高其结合能力并扩展其简并性。表5独立的置换提高肽配体的B7样超型结合能力和简并性总之，根据这里显示的结果，很明显更高亲和力的结合肽可以通过用中性或优选的残基置换序列中的“阴性”或中性的残基而产生。这些肽也可能具有独特的免疫学特性，即尽管与野生型序列仍然有交叉反应，但不会发生耐受、删除或抑制机制，不会灭活对野生型序列有反应的CTL，并由于癌症的慢性感染而呈递。同样的技能可以用来产生有更高程度交叉反应性，因此更有利群体覆盖的肽。实例3A2样超型结合我们也进一步获得了关于A2.1结合的结构要求的信息。为完成这个，我们试图确定第2位和第9位锚定的可行程度。为了这个目的，合成了一组在第2位或第9位带单个置换的多聚(A)9聚体模型肽的类似物，此模型肽含有以前报道的(Ruppert等，细胞74:929-937(1993))在第2位是L、第9位是V的A2.1基元，并测定了结合能力。合成了第2位和第9位锚定的一共13个不同的类似物。与以前报道的A2.1基元十分相符，在第2位带有L或甲硫氨酸(M)的肽是最好的结合物。即使用相对保守的置换，如异亮氨酸(Ⅰ)、V、丙氨酸(A)和苏氨酸(T)也引起结合能力的显著降低(10至100倍)。更加根本的改变(即D、K、F、C、P、G、N和S残基)会完全消除结合能力。在第9位得到相似的结果，在此位置上只有保守的置换，如L和I，在10倍以内结合未置换的模型多聚AA2.1肽结合物。带有A或M置换的类似物也结合，但强度较低(降低10-至100-倍)。最后，所有其它被测置换(T、C、N、F、S、G、P和R)与A2.1结合能力的完全丧失相关。因此，基于这些结果并与以前的研究(19-20)十分相符，“典型的”A2.1基元可以被鉴定为在第2位是L或M，第9位是L、V或I。从这些结果我们推测，任何在第2位或第9位(或第10位)带有“非典型的”(但仍能接受的)残基的肽(例如第2位是I、V、A或T，第9或10位是A、M或T)的A2结合能力，可以通过用更“典型的”锚定取代而提高。下面举出一些例子说明实际上这是怎样完成的。例如，序列为LWVTVYYGV的FHVEnv2181肽以12500nM的IC50％结合A2.1，而第2位的锚定被置换的类似物LMVTVYYGV以3.3nM的IC50％结合。天然存在序列FLPSDFFPSI的HBVc以22nM的IC50％结合A2.1，但其C末端锚定被置换的V10变型以2.5nM的Kd结合A2.1。最后，HBVpol538肽(YMDDVVLGA)以200nM的IC50％结合A2.1，而V9变型以5.1nM的IC50％结合。其它固定的锚定肽的例子见表6。检测了某些固定肽诱导CTL反应的能力。例如，用初级CTL检测法(21)检测了HIVEnv2181肽和HBVpol721肽，发现是阳性。阳性CTL识别结果也见于HBVc18-27和HBVpol538肽。进一步的实验揭示了非锚定残基在确定结合能力方面的突出作用。这些分析的结果也在Ruppert等(同上)中有介绍。按照我们的分析，一个给定的氨基酸组别在A2.1结合物上的频率被非结合物的频率相除得到频率比率。这个比率说明一个给定的残基组别是否优先存在于结合物(比率＞1)或非结合物(比率＜1)的给定的位置上。为了便于分析，设定了比率的临界水平，使在结合物上的频率比非结合物上高4倍以上的残基视为是有利的或优选的残基，而在结合物的频率比非结合物上低4倍以上的残基视为是不利的或有害的残基。按照这个方法，鉴定了与A2.1结合能力或结合缺失有显著关系的残基组别。通常，最不利的作用见于带电氨基酸。在第1位，P和酸性残基(E和D)在A2.1结合肽上不常见。在第6位非结合肽是碱性(R、H或K)残基，而酸性和碱性残基在好的结合物的第3位和第7位不常见。相反，第1、3和5位的芳香族残基与高亲和力结合相关。而且带有侧链的OH-或SH-残基，如S、T或C偏爱第4位，而A偏爱第7位，P偏爱第8位。总之，不同氨基酸组别的频率分析使我们能够更准确地确定A2.1基元，这个基元考虑了第2和第9锚定位置之外的其它位置对A2.1结合亲和力的影响。10聚体A2.1配体的分析以上介绍的用于9聚体肽的同样的方法也用于分析由一组10聚体肽获得的结果。在10聚体肽的N-和C-末端，观察到的模式与9聚体肽观察到的十分相似。例如，象在9聚体肽中的一样，在10聚体肽组中，第1位的特征是，在结合物组中芳香族残基的频率升高，而负电荷残基和P同样与弱结合相关。在第3位，也是负电荷与弱结合相关。有趣的是在这个位置上，脂肪族(不是芳香族)残基与高亲和力结合相关。在此肽的C末端也观察到一定的相似性。在10聚体肽中，倒数第二位即第9位(与9聚体肽的第8位对应)是相当随意的，只有碱性残基在非结合物上出现频率较高。与9聚体肽的第7位的情况相似，10聚体的倒数第3位，即第8位既不容忍正电荷残基也不容忍负电荷残基。同样，在10聚体的第7位不喜欢正电荷残基，这与以前观察的9聚体的第6位一样。与第3位观察到的相比，与高结合相关的残基是不同的。芳香族和疏水性残基在高亲和力结合物的第8位常见(这与9聚体上第7位只有A常见不同)。最后，在肽的中间观察到一个明显有特色的模式。在第4位，G被高结合物偏爱，而A和正电荷残基非常常见于非结合物。在A2.1结合物的第5位完全没有P。值得注意的是在10聚体肽的第4和5位观察到的趋势，没有一个与9聚体肽的第4或5位相对应。概括地说，按照以上在9聚体肽中介绍的相似的策略，可以产生A2.110聚体肽的详细的基元。比较9聚体肽和10聚体肽的非锚定位置，可以发现重要的差别和显著的相似性。总之，根据这里显示的结果，很明显更高亲和力的结合肽可以通过用中性或优选的残基置换序列中的“阴性”或中性的残基而产生。这些肽也可能具有独特的免疫学特性，即尽管与野生型序列仍然有交叉反应，但不会发生耐受、删除或抑制机制，不会灭活对野生型序列有反应的CTL，并且由于癌症的慢性感染而呈递。肽抗原结合到多个HLA等位基因上以确定A2样超型。已经建立了用放射标记的肽和表达HLAⅠ型的哺乳动物细胞，如EBV转化的B细胞系和PHA活化的母细胞的直接MHC结合检测法。如果靶细胞在有β2微球蛋白存在时26℃预孵过夜，可以获得放射标记探针的显著结合。在这些条件下，每个细胞类型表达的HLA分子的小部分都可以被标记的肽结合。用这些检测法可以检测A※0201限制的乙型肝炎病毒核心18-27肽与其它A2亚型的交叉反应程度。已经确定此肽表位也结合A※0202、A※0205和A※0206但不结合A※0207亚型。用数组合成的肽类似物进行的抑制实验强调了HLA-A※0201、A※0202和A※0205等位基因的类似配体特异性。有助于形成不同HLA等位基因的B和F口袋的多形残基的分析可以预测乙型肝炎病毒核心18-27表位与2个其它的HLA等位基因的结合(HLA-A※6802和A※6901)。因此，统称为A2超型的至少6个不同的HLA-A分子组成的一个家族，似乎共有重叠的配体特异性(在第2位和C末端的脂肪族残基)。这些结果显示广泛交叉反应的肽表位可以被鉴定，并可以极大地提高肽基接种方法的预期可行性。而且，这些结果显示置换的类似物的另外的用途。特别是同时提高A2超型的数个成员的结合亲和力。用HPV16EF.86-93肽、TLGIVCPI及其类似物TLGIVXPI(这里X代表α氨基丁酸)为例，说明了这是怎样完成的。然后检测了这两种肽对A2样等位基因的结合模式。显然X置换极大地提高了对所有A2样等位基因的结合亲和力，而得到一个更有用的肽。其特征是比其原来的亲本序列有更高的结合能力和更广泛的交叉反应性。用A2/Kb转基因小鼠随后进行的实验证实，X置换肽诱导的CTL与野生型序列完全交叉反应，而且X肽，由于它的更高的结合亲和力，是一个更有效的免疫原。实例4A24和A1结合次级作用和A24结合我们使用一个多聚(A)9聚体模型肽，此肽含有在第2位是Y、第9位是F的A24特异的基元。发现第2位不仅接受Y也接受F、M，可能还接受W。在9或10残基配体的C末端，F和W是最优选的，但L和Ⅰ也能接受。预计M在这个位置也能接受(Kubo等，免疫学杂志152:3913(1994))。从这些结果，我们得出结论，在第2位或第9位(或第10位)带有一个非典型的，但仍能被接受的残基(例如在第2位是F、M、W或第9(或10)位是L、I、M)的任何肽的A24结合力，可以通过用一个更典型的锚定取代这些残基而提高。Kondo等，免疫学杂志155:4307-4312(1995)介绍了非锚定残基在决定A24结合能力的突出作用的进一步实验的结果。收集了所有A24结合的数据库，并且计算了带有特定残基的肽的每个位置的相对平均结合亲和力。在9聚体肽的情况下发现，例如在第1位带G或负电荷残基(D、E)的肽倾向弱结合，平均亲和力比所分析的总共141个9聚体肽的平均亲和力低10倍。相比之下，在第1位带芳香族残基(F、Y、W)的肽结合良好，平均亲和力比总的平均亲和力高11.8倍。在第1位带正电荷残基(R、K、M)的肽也倾向良好结合，平均亲和力比总的平均亲和力高4.6倍。也检测了数个其它位置对A24结合能力的消极的次级作用第3和6位的D或E，第4和7位的G，第6位的正电荷残基(K、R、H)，第8位的A，第5位的P，和第5和8位的酰胺(Q和N)。相反，发现第7或8位的芳香族残基(Y、F、W)对A24结合有利，第4位的小的氢键残基如(S、T、C)有积极的作用。显然，9聚体序列上的每个单个的位置都可能影响A24的结合。还有趣的是疏水残基(F、W、Y、L、I、V和M)从不与弱结合相关。用10聚体肽获得的结果也进行了类似的分析。与上一节的结果相似，在10聚体肽中也发现数个次级作用。象9聚体肽的情况那样，第3和第6位的负电荷残基(D、E)与弱结合相关。然而，一般来说，10聚体的次级作用图与9聚体的完全不同。例如，在9聚体肽中，P在任何位置都与显著提高结合不相关，但在第5位时，与降低结合相关。对于10聚体，P在10聚体肽配体第4、5或7位与提高结合能力相关。在10聚体中，第5位似乎对次级作用最重要，因为Y、F和W(除了已经提到的P)与好的A24结合相关，而R、H和K与弱的结合能力相关。第7和9位存在A和第4和8位存在酰胺(Q、N)也与弱结合能力相关。次级作用和A1结合与以上介绍的对A24类似的分析也应用于HLA-A※0101分子。简言之，以上的研究已经确定了两个对HLA-A※0101特异的不同的肽结合基元。获得了对A※0101亚基元的9聚体和10聚体次级相互作用图。为得到这个次级相互作用图，收集了与这两个基元的每个相对应的肽组有关的A※0101结合数据。对于每个位置，计算了带每个特定残基的肽的相对平均结合亲和力。为了补偿某些特定残基的低出现率，并获得更有意义的抽样，按Ruppert等(同上)的介绍，组合带有类似化学侧链的氨基酸。对9聚体肽进行这种分析获得的，2-9和3-9亚基元的结果分别见图4a和4b。由这种分析检测的次级作用的说明图见图4c和4d(分别代表2-9和3-9亚基元)。正如上面所介绍的，平均亲和力提高或降低4倍以上被断定为显著的。一般说来，特定残基类型的存在会消极地或积极地影响大多数位置的结合能力。例如，在2-9亚基元的情况下，发现在第1位带有D或E的肽很弱地结合到A※0101分子上，平均相对结合能力(ARBC)为0.20。相反，在同一位置(第1位)带有芳香族残基(Y、F或W)的肽，平均亲和力比整个肽组的总平均结合能力高4倍(ARBC4-0)。检查这个图发现肽结合A※0101的肽的一些有趣的特征。首先，如上面所提到的，在第2和3位上的两个锚定相互之间起协同作用。在第2位带有M、S或T锚定的肽的亲和力，被第3位存在的D或E显著提高(第3位是A时提高程度弱一些)。反之，在第3位带有D或E锚定的肽的亲和力，被S、T和M的存在显著提高(但也可以是其它的疏水或短链分子如L、V、I、C和A)。通过检测其它位置揭示了带两个亚基元的肽与同A※0101分子相互作用的差异程度。比较图4a和4b的数值，清楚地显示有许多例子在一个基元上起中性作用的残基，在另一个基元上起积极的或消极的作用。例如，在2-9基元的第1位，G和芳香族残基(Y、F和W)是优选的(ARBC＞4.0)，A和带正电荷的残基(R、H和K)是相对中性的(ARBCs在4.0和0.25之间)，而带负电荷的残基(D和E)是有害的(ARBC＜0.25)。在带3-9亚基元的肽中注意到有一个不同的模式，除了G仍然是优选的外，其它的优选被打乱了。在第1位带正电荷的残基对肽结合有显著的正影响(ARBC为8.3)，带负电荷的残基和芳香族残基是中性的(ARBCs分别为1.3和0.61)，A是有害的(ARBC为0.15)。在基元内的每个位置都观察到类似的修饰类型。总的说来，次级锚定优选残基在亚基元之间不同，在图3的总结图中可以清楚地看到。在这一节里可以看到，除了第1位的G是共有的优选残基这个唯一的例外，和第2和3位的协同锚定外，两个A※01019聚体亚基元的次级基元事实上是完全不同的。因此，定量而言，两个9聚体基元的27个次级作用中只有一个是共有(3.7％)。与见于A24、A※0201扩展的基元和A3样分子(20)之间的多种相似性相比，这些A※0101基元差异的程度是显著的，在那些基元之间，任何两个扩展的基元之间可见共有3到5(13-26％)个次级作用。10聚体配体次级锚定残基的确定。与上一节关于9聚体配体的介绍相类似，也确定了2-10和3-10亚基元的次级锚定残基和次级作用。这些分析的结果见图5a-d。第2和3位的锚定再一次表现出相互协同作用。在2-10亚基元中，第3位的D、E(A、Q和N的程度低很多)，在3-10亚基元中，第2位的疏水(L、I、V、M)或短链(S、T、C)残基与显著提高平均结合能力相关。在第2、3位和C末端以外的位置比较两个10聚体基元显示，与9聚体中的情况一样，次级锚定特异性的修饰取决于主要锚定残基。例如，在第7位，A和S,T和C在2-10基元上优选，而在3-10基元上是中性的。相反，G在3-10基元上优选，而在2-10基元上是中性的。但与9聚体亚基元对比，在10聚体中观察到的这些差异明显没有那么显著。事实上，两个10聚体亚基元共有许多优选残基。第1和5位的Y、F和W，第4位的A，第7位的P，和第8位的G对两种亚基元都有积极的作用。同样，第8位的R、H和K对两种10聚体亚基元都是有害的(图5c和5d)。总的说来，两种10聚体基元共有25个次级作用中的6个(24％)。提供以上的例子用来说明本发明，而非限制其范围。本发明的其它改变对本领域的技术人员是显而易见的，并包括在所附权利要求中。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均引作参考文献。权利要求1．一种诱导病人对预选的抗原发生细胞毒T细胞反应的方法，此方法包括将细胞毒T细胞与约9至15个残基的免疫原性肽接触，这些肽以小于约500nM的解离常数结合至少两种HLA-A3样分子，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有含有一个结合基元的9残基序列，从N末端至C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；和一个或多个次级锚定残基，选自第3位的Y、F或W，第6位的Y、F或W，第7位Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。2．权利要求1的方法，其中肽由9至10个残基组成。3．权利要求1的方法，其中肽来自病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原，或真菌抗原。4．权利要求1的方法，其中接触步骤在体外进行。5．权利要求1的方法，其中接触步骤通过向病人给予包含编码此免疫原性肽的序列的核酸分子而进行。6．一种诱导病人对预选的抗原发生细胞毒T细胞反应的方法，此方法包括将细胞毒T细胞与约9至15个残基的免疫原性肽接触，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A*0301基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有含有一个结合基元的9残基序列，从N末端至C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；和一个或多个次级锚定残基，选自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P、R、H、K、Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。7．权利要求6的方法，其中肽由9至10个残基组成。8．权利要求6的方法，其中肽来自病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原，或真菌抗原。9．权利要求6的方法，其中接触步骤在体外进行。10．权利要求6的方法，其中接触步骤通过向病人给予包含编码此免疫原性肽的序列的核酸分子而进行。11．一种诱导病人对预选的抗原发生细胞毒T细胞反应的方法，此方法包括将细胞毒T细胞与约9至15个残基的免疫原性肽接触，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A*1101基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有含有一个结合基元的9残基序列，从N末端至C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第1位的A，第3位的Y、F或W，第4位的Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。12．权利要求11的方法，其中肽由9至10个残基组成。13．权利要求11的方法，其中肽来自病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原，或真菌抗原。14．权利要求11的方法，其中接触步骤在体外进行。15．权利要求11的方法，其中接触步骤通过向病人给予包含编码此免疫原性肽的序列的核酸分子而进行。16．一种诱导病人对预选的抗原发生细胞毒T细胞反应的方法，此方法包括将细胞毒T细胞与约9至15个残基的免疫原性肽接触，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A*3101基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽含有9到约15个残基，具有含有一个结合基元的9残基序列，从N末端至C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，或第8位的A或P，和任何这些的组合。17．权利要求16的方法，其中肽由9至10个残基组成。18．权利要求16的方法，其中肽来自病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原，或真菌抗原。19．权利要求16的方法，其中接触步骤在体外进行。20．权利要求16的方法，其中接触步骤通过向病人给予包含编码此免疫原性肽的序列的核酸分子而进行。21．一种诱导病人对预选的抗原发生细胞毒T细胞反应的方法，此方法包括将细胞毒T细胞与约9至15个残基的免疫原性肽接触，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A*3301基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽包括含有一个结合基元的9残基序列，从N末端至C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第3位的Y、F或W，第7位的A、Y、F或W，和任何这些的组合。22．权利要求21的方法，其中肽由9至10个残基组成。23．权利要求21的方法，其中肽来自病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原，或真菌抗原。24．权利要求21的方法，其中接触步骤在体外进行。25．权利要求21的方法，其中接触步骤通过向病人给予包含编码此免疫原性肽的序列的核酸分子而进行。26．一种诱导病人对预选的抗原发生细胞毒T细胞反应的方法，此方法包括将细胞毒T细胞与约9至15个残基的免疫原性肽接触，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A*6801基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽包括含有一个结合基元的9残基序列，从N末端至C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第1位的Y、F、W、S、T或C，第5位的Y、F、W、L、I、V或M，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。27．权利要求26的方法，其中肽由9至10个残基组成。28．权利要求26的方法，其中肽来自病毒抗原、肿瘤相关抗原、寄生虫抗原，或真菌抗原。29．权利要求26的方法，其中接触步骤在体外进行。30．权利要求26的方法，其中接触步骤通过向病人给予包含编码此免疫原性肽的序列的核酸分子而进行。31．一种包含约9至15个残基的免疫原性肽的组合物，这些肽以小于约500nM的解离常数结合至少两个HLA-A3样分子，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有包含一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个或多个次级锚定残基，选自第3位的Y、F或W，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。32．一种包含约9至15个残基的免疫原性肽的组合物，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A※0301基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有包含一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个或多个次级锚定残基，选自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P、R、H、K、Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。33．一种包含约9至15个残基的免疫原性肽的组合物，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A※1101基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有包含一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第1位的A，第3位的Y、F或W，第4位的Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。34．一种包含约9至15个残基的免疫原性肽的组合物，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A※3101基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽含有9到约15个残基，具有包含一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的A或P，和任何这些的组合。35．一种包含约9至15个残基的免疫原性肽的组合物，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A※3301基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽具有包含一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第3位的Y、F或W，第7位的A、Y、F或W和任何这些的组合。36．一种包含约9至15个残基的免疫原性肽的组合物，这些肽以小于约500nM的解离常数结合HLA-A※6801基因产物，并诱导细胞毒T细胞反应，免疫原性肽包括含有一个结合基元的9残基序列，从N末端到C末端如下位于第2位的第1个初级锚定残基，选自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2个初级锚定残基，选自R和K；一个次级锚定残基，选自第1位的Y、F、W、S、T或C，第5位的Y、F、W、L、I、V或M，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何这些的组合。37．一种鉴定以小于约500nM的解离常数结合HLA-A3样分子的免疫原性肽的方法，此方法包括以下步骤筛选抗原蛋白中存在权利要求31、32、33、34、45和36的结合基元的氨基酸序列；在抗原蛋白中选择有结合基元的一个或多个亚序列；制备包含选定亚序列的约8个和约11个残基的试验肽；确定试验肽结合基因产物的能力；鉴定解离常数小于500nM的肽。全文摘要本发明提供包含HLA－A3超基元的免疫原性肽。此肽可用于治疗、诊断或检测许多病理状态。文档编号C07K14/47GK1225590SQ97194430公开日1999年8月11日申请日期1997年3月10日优先权日1996年3月11日发明者A·瑟特,R·W·彻斯特鲁特,J·悉尼申请人:埃皮曼尼公司