专利名称：MAGE－10编码cDNA,肿瘤排斥抗原前体MAGE－10,对该分子具有特异性的抗体及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及肿瘤排斥抗原前体，编码它们的核酸分子，对所述物质具有特异性的抗体及其用途。
背景及现有技术通过宿主生物体对癌细胞的识别或者缺乏识别的研究已经在许多不同的方面着手进行着。对该领域的了解假定对基础免疫学和肿瘤学都有一些了解。
对小鼠肿瘤的早期研究表明当移植到同系基因的动物中时，这些物质表现为导致肿瘤细胞排斥的分子。这些分子被受体动物中的T-细胞“识别”，并且随着被移植的细胞的溶解激发了细胞溶解的T-细胞的应答。这一证据首先是通过化学致癌剂、比如甲基胆蒽在体外诱导的肿瘤得到的。人们发现由肿瘤表达的并且引起T-细胞应答的抗原对每个肿瘤而言都是不相同的。对于用化学致癌剂诱导肿瘤的一般性的教导以及在细胞表面抗原方面的差别而言，参见Prehn等人，《J.Natl.Canc.Inst.》18769-778(1957)；Klein等人，《癌症研究》201561-1572(1960)；Gross，《癌症研究》3326-333(1943)；Basombrio，《癌症研究》302458-2462(1970)。这类抗原已经逐渐被称作“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTAs”。当由化学致癌剂诱导时随着对上述抗原的呈递的观察，当在体外通过紫外辐射诱导肿瘤时得到了类似的结果。参见Kripke，《J.Natl.Canc.Inst.》53333-1336(1974)。
当对上述肿瘤的类型来说观察了T-细胞介导的免疫应答的同时，人们认为自发性肿瘤通常是非免疫原性的。因此，人们相信这些肿瘤并不提供激发对肿瘤携带受试者中的肿瘤应答的抗原。参见Hewitt等人，《英国癌症杂志》33241-259(1976)。
tum-抗原呈递细胞系的家族是由小鼠肿瘤细胞或细胞系的诱变得到的免疫原性变体，正如Boon等人，《J.Exp.Med.》1521184-1193(1980)所述，该公开的内容插入本文仅供参考。为了进行仔细的研究，通过突变在同系基因小鼠中不产生免疫应答并且将形成肿瘤的肿瘤细胞(即“tum+”细胞)来得到tum-抗原。当诱变处理这些tum+细胞时，它们被同系基因小鼠排斥，并且不能形成肿瘤(因此为“tum-”)。参见Boon等人，《美国科学院学报》74272(1977)，该公开的内容插入本文仅供参考。已经表明许多的肿瘤类型呈现出这一现象。例如参见Frost等人，《癌症研究》43125(1983)。
tum-变体似乎不能形成进行性(progressive)肿瘤，这是因为它们引发了免疫排斥过程。支持这一假说的证据包括肿瘤的“tun-”变体、即那些没有正常地形成肿瘤的变体在免疫系统受到亚致死照射抑制的小鼠中不形成肿瘤的能力，Van Pel等人，《美国科学院学报》765282-5285(1979)；并且观察到肥大细胞瘤P815的腹膜内注射的tum-细胞按指数规律增殖12—15天，然后在淋巴细胞和巨噬细胞流入当中仅在几天内tum-细胞就被清除了(Uyttenhove等人，《J.Exp.Med.》1521175-1183(1980))。进一步的证据包括即使当与随后的细胞的攻击一起供给免疫抑制剂量的辐射时，仍观察到小鼠获得了可以使它们抵抗随后对同一tum-变体的攻击的免疫记忆(Boon等人，《美国科学院学报》74272-275(1977)；Van Pel等人，如上所述；Uyttenhove等人，如上所述)。
随后的研究发现当使自发性肿瘤发生突变时，生产出了产生应答的免疫原性变体。的确，这些变体能够引起对原始肿瘤的免疫保护性应答。参见Van Pel等人，《J.Exp.Med.》1571992-2001(1983)。因此，已经表明可能会引起肿瘤中所谓的“肿瘤排斥抗原”的呈递，而该抗原为同系基因排斥应答的目标。当已把外源基因转染到自发性肿瘤中时，也已得到了类似的结果。关于这一点，参见Fearon等人，《癌症研究》482975-1980(1988)。
已经识别了一类抗原，它们呈递在肿瘤细胞的表面上并且被溶解细胞的T细胞所识别、从而导致溶解。在下文中，这类抗原将被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可以或者可以不引起抗体的应答。已对这些抗原研究的程度已经通过溶解细胞的T细胞的特征鉴定研究来实现，即在体外通过具体的溶解细胞的T细胞(下文为“CTL”)亚型来鉴定抗原的研究。当识别了呈递的肿瘤排斥抗原的时候，亚型便增殖，并且溶解呈递肿瘤排斥抗原的细胞。特征鉴定研究已经鉴定了特异性地溶解表达肿瘤排斥抗原的细胞的CTL克隆。在下列文献中可以发现这一工作的实例Levy等人，《癌症研究进展》241-59(1977)；Boon等人，《J.Exp.Med.》1521184-1193(1980)；Brunner等人，《免疫学杂志》1241627-1634(1980)；Maryanski等人，《欧洲免疫学杂志》1241627-1634(1980)；Maryanski等人，《欧洲免疫学杂志》12406-412(1982)；Palladino等人，《癌症研究》475074-5079(1987)。对于由CTLs识别的其它类型的抗原来说需要这种分析，其中包括次要组织相容性抗原，雄性特异性H—Y抗原，称作“tum-”抗原的一类抗原以及在本文中讨论的抗原。
上述主题的典型的肿瘤称作P815。参见DePlaen等人，《美国科学院细胞》852274-2278(1988)；Szikora等人，《EMBO J》91041-1050(1990)，以及Sibille等人，《J.Exp.Med.》17235-45(1990)，这些公开的内容插入本文仅供参考。P815肿瘤为一种用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱导的并且同时以体外的肿瘤和细胞系来培养的肥大细胞瘤。P815系在诱变后已经产生了许多的tum-变体，其中包括称作P91A(DePlaen，如上所述)、35B(Szikora，如上所述)和P198(Sibille，如上所述)的变体。与肿瘤排斥抗原相反—并且这是一个主要的区别—tum-抗原仅仅呈递于诱变处理肿瘤细胞之后。肿瘤排斥抗原呈递于没有诱变的某肿瘤的细胞上。因此，参考上述文献，细胞系可以是tum+、比如称作“P1”的系，并且可以被激发以生成tum-变体。由于tum-的表型不同于亲代细胞系的表型，因此人们预料到与其tum+亲代系相比在tum-细胞系的DNA中的差别，并且可以利用这一差别来确定在tum-细胞中感兴趣的基因的位置。结果，发现tum-变体(比如P91A、35B和P198)的基因与其正常的等位基因的不同之处在于在所述基因的编码区中的点突变。参见上述的Szikora和Sibille，以及Lurquin等人，《细胞》58293-303(1989)。这已经证明了不是本发明的TRAs具有的情况。这些论文也表明了由tum-抗原得到的肽是由用于通过CTLs识别的Ld分子呈递的。P91A由Ld呈递、P35由Dd呈递、而P198由Kd呈递。
于1992年5月22日提交的指定了同一代理人的作为主题申请的PCT申请PCT/US92/04354讲述了一个人肿瘤排斥抗原前体编码基因的家族、其称作MAGE家族。这些基因中的几种在van der Bruggen等人，《科学》2541643(1991)中也进行了讨论。目前清楚的是在肿瘤细胞中表达MAGE家族的多种基因，并且对这些肿瘤的诊断以及对在那些文献中讨论的其它目的而言所述的基因可以起到标记物的作用。另外参见Traversari等人，《免疫遗传学》35145(1992)；van der Bruggen等人，《科学》2541643(1991)和De Plaen等人，《免疫遗传学》40360(1994)。
上面所引用的并且插入本文仅供参考的美国专利5,342,774讲述了呈基因组DNA和cDNA形式的TRAPs的MAGE家族的多个成员。在上面引用的PCT申请PCT/US92/04354中，在SEQ ID NO22中讲述了为920个碱基对片段的MAGE-10的基因组DNA。DePlaen等人，《免疫遗传学》40360-369(1994)讨论了鉴定MAGE-10的485个核苷酸部分的PCR工作。另外参见Genbank登记号U10685，这些内容插入本文仅供参考。但是却没有讨论cDNA分子。
前面引用的PCT申请一般性地讨论了针对MAGE蛋白的抗体。Chen等人(Chen等人的美国专利5,541,104，这些内容插入本文仅供参考)讲述了特异性地结合到肿瘤排斥抗原前体MAGE-1上的单克隆抗体。这份专利插入本文仅供参考。为了制备出单克隆抗体，Chen等人在大肠杆菌中生产出了不是全长的MAGE-1 TRAP，这是因为全长分子的表达有一定的困难。
但是，现在已经发现可以生产出既与MAGE-1又与MAGE-10 TRAP结合的单克隆抗体。考虑到上述文献中的报道，这是令人吃惊的，因为用可以得到的有关MAGE-10的信息来生产上述抗体看起来是不可能的。根据SDS-PAGE发现由针对MAGE-10的cDNA编码的TRAP为分子量约为72千道尔顿的分子。也已发现可以生产出对MAGE-10具有特异性的多克隆抗体。在下面的公开内容中显示出这些以及本发明的其它方面。附图的简要描述
图1显示出Western印迹测定的结果，其中使用了电化学发光检测以便测试出单克隆抗体与多种细胞裂解物的反应性。
图2显示出测试的结果，其中把该测试设计为确定在MAGE-1 cDNA存在的条件下是否可以诱导细胞系NA8-MEL生产出72千道尔顿的蛋白。优诜实施方案的详细描述实施例1在大肠杆菌中以融合蛋白的形式制备出全长的重组MAGE-1蛋白。参见Schultz-Thater等人，《Int.J.Cancer》59435-439(1994)，该内容插入本文仅供参考。简单说来，即把全长的MAGE-1 cDNA克隆到众所周知的表达载体pET16b中。该载体可以使在N-末端含有10个组氨酸分子的融合蛋白表达。在Schultz-Thater操作后，培养大肠杆菌，在溶解所述细胞之后，在Ni2+柱上纯化重组融合蛋白。当通过SDS-PAGE测试时，纯化的物质显示出48千道尔顿的主要的条带。在接下来的实验中使用了这种48kD的物质。实施例2在生产出重组MAGE-1融合蛋白后，每次都用溶解在含有完全弗氏佐剂的组合物中的20ug的重组蛋白对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，并接种两次。接下来是两次附加的注射，每次都用含有不完全弗氏佐剂的20ug的重组MAGE-1。然后按照Carrel等人，《癌症研究》402523-2528(1980)所述的方法，使小鼠的脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合。培养得到的杂交瘤细胞，并且使用ELISA筛选来自培养物的上清液，以便测定出是否正在生成重组的MAGE-1特异性的单克隆抗体。ELISA涉及包被重组MAGE-1蛋白(250ng/50ul/孔)，接下来在4℃下培养过夜。加入上清液的样品，接下来加入生物素缀合的绵羊抗小鼠Ig和链霉抗生物素蛋白—碱性磷酸酶缀合物。
ELISA导致鉴定出289个生成了抗重组MAGE-1的抗体的杂交瘤。实施例3在接下来的一组实验中，测试抗体以便确定是否可以使用这些抗体来免疫染色对MAGE-1的mRNA而言呈阳性的细胞。
一开始筛选杂交瘤，以便设法除去任何具有交叉反应性的单克隆。为了做到这一点，测试具有已知的并且具有MAGE-TRAP不同表达模式的细胞系。已知MZ2-MEL 3.1表达所有的MAGE-1，2，3和4；MZ2-MEL2.2表达MAGE-2和3；并且测试了U251、即对所有四种MAGE而言均呈阴性的成胶质细胞瘤的细胞系。在16孔的塑料室中培养细胞，所述的室安装在冷丙酮中(0℃处理5分钟)，然后储存直至随时可以在-20℃下使用。然后用0.3％H2O2封闭内源过氧化物酶(10分钟)，随后在0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水溶液中预温育所述细胞30分钟。这就生成了由Carrel等人如上所述的三层生物素/亲和素/过氧化物酶系统的第一层。在固定了所述细胞之后，加入山羊抗小鼠IgG生物素缀合物(按照1∶50进行稀释)，以生成第二层。最后，在以1∶1000进行稀释后，加入亲和素—过氧化物酶缀合物。在第二层和第三层的情况下，培养30分钟、然后再培养15分钟。用氨基—乙基咔唑观察过氧化物酶，并使用Gill’s苏木精记录细胞染色的数目30秒。这组实验结果发现了两种mAbs、即6C1和6F2仅对MZ2-MEL 3.1细胞染色。然后将这两个克隆用于一系列与已对MAGE-1，2，3和4的mRNA进行了测试的细胞有关的实验中。针对MAGE-1 mRNA的表达，把细胞划分为呈阳性或呈阴性。这是按照下列方法来测定的Rimoldi等人，《Int.J.Cancer》54527-528(1993)；Brasseur等人，《Int.J.Cancer》63375-380(1995)。简单说来，使用众所周知的可以通过商业途径得到的方法和试剂从细胞样品中提取总RNA，然后使总RNA进行逆转录并且使用MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3和MAGE-4特异性引物使其进行聚合酶链式反应。参见上述的Brasseur等人。下面的表1给出了这一工作的结果。它表明不管MAGE-2、3或4的表达状态如何，两种mAbs对所有的MAGE-1阳性细胞都染色。
在优选的实施方案中，在第二步骤中通过使用至少为1/秒的伸长速率至少5秒，使结晶作用得到增强。
可以根据本发明方法进行结晶的化合物是天然来源的维生素E的琥珀酸酯，或称为d-α-琥珀酸生育酚酯(TS)。该化合物对应于以下结构式，其中键合到连接侧链的相同碳原子上的甲基从杂环存在于其中的平面被定位朝向观察者，而侧链则被定位远离观察者和杂环存在于其中的平面，侧链上两个甲基被定位远离观察者和侧链存在于其中的平面，而键合到侧链中相同碳原子上的对应氢原子从侧链存在于其中的平面定位朝向观察者。我们也将该化合物称为(2R，4’R，8’R)-α-琥珀酸生育酚酯。所述结构式为
在本发明中我们以其原意使用术语结晶以及类似含义的用语，并指结晶形成这个现象。
根据本发明，d-α-琥珀酸生育酚酯可在少量不妨碍本发明实施的其它物质的存在下进行结晶。因此，术语“d-α-琥珀酸生育酚酯”及缩写TS指的是上述化合物以及适用于本发明方法中的、含有基于d-α-琥珀酸生育酚酯重量计不超过10％(重量)的其它物质的d-α-琥珀酸生育酚酯混合物。这些物质通常是存在的，因它们包括在此前的加工步骤中或存在于维生素E油(生育酚)原料中，并且将这些物质完全从TS中除去在经济上是没有吸引力的。具体的物质将取决于用来制备TS的特定方法，但我们通常可以将其认为是痕量的残余结晶溶剂、清洗试剂或琥珀酸或琥珀酸酐、生育酚等。
在本发明中TS是从流态中结晶出来的。术语“流体”以其一般含义使用，指TS由于一种外力而均匀地改变其形状或方向。
表2—通过Western印迹用MAbs 6C1和6F12检测细胞系中的MAGE-1蛋白和72kDa的蛋白western印迹 MAGE-mRNA细胞系MAGE-1 蛋白
黑素瘤；(b)成胶质细胞瘤；(c)骨髓白血病；(d)乳腺癌；(e)成神经细胞瘤；(f)成纤维细胞实施例7已知在体外在一些MAGE-1mRNA阴性细胞系中，通过5—氮杂—2’—脱氧胞嘧啶、一种甲基化不足试剂(“DAC”)可以诱导MAGE-1的表达。与三种MAGE-1mRNA阴性细胞系(IGR39，NA8-MEL和U251)一起培养上述试剂72小时，在取出裂解物之后，与单克隆抗体6C1一起进行培养。这一处理诱导了46kDa和72kDa两种蛋白的生成。实施例8上面报道的令人感兴趣的结果表明进一步进行实验以测定72kDa蛋白的同一性。首先，使用可以通过商业途径得到的系统，由黑素瘤细胞系MZ2-MEL43制备出黑素瘤的表达文库。在制备之后，把噬菌体铺成平板(约为4×105pfus)，并转移到硝酸纤维素滤膜上。然后用5％奶粉的磷酸盐缓冲盐水的溶液封闭这些物质，随后与单克隆抗体6C1一起进行培养(在RPMI/10％胎牛血清中以1∶4稀释的杂交瘤上清液)。然后用PBS/0.5％Tween-20洗涤上述物质并与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗—小鼠IgG一起培养，其中是在PBS/5％奶粉的PBS溶液中以1∶3000进行稀释的。接下来用5％的Tween-20再洗涤一次。如上所述采用ECL检测信号。使所有的阳性噬菌斑进行第二次和第三次的筛选。然后挑选出阳性物质并将其转移到含有噬菌体裂解缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1％Tween20)的试管中，并使用上述物质的等分试样(5ul)来扩增噬菌体的插入片段。使用GTGGCGACGA CTCCTGGAG(SEQ ID NO1)和CAGACCAACT GGTAATGGTA GCG(SEQ ID NO2)它们均为λ引物、通过PCR扩增上述片段。循环参数为在94℃下处理1分钟、在61℃下处理1分钟、并在72℃下处理1分钟、共循环30次，接下来在72℃下最后延伸10分钟。
然后使用可以通过商业途径得到的测序试剂盒以及SEQ ID NO1得到了所述克隆的一部分5’序列。参见Casanova，《分子生物学方法》23191-197(1993)。对12个克隆进行了测序，并且发现有三个与MAGE-10的基因组序列的是相同的，其中所述的序列如DePlaen等人，《免疫遗传学》40360-369(1994)和Genbank登记号U10685所报道的。
然后使用SEQ ID NOS1和2以及可以通过商业途径得到的系统来扩增一个插入片段。对这次扩增来说，循环参数为在94℃下处理15秒钟、在61℃下处理30秒钟、在72℃下处理1分钟(循环10次)，在94℃下处理15秒钟、在61℃下处理30秒钟、在72℃下处理80秒钟外加20秒钟的循环延伸、共循环20次，接下来在72℃下处理10分钟以进行最后的延伸。用限制性内切核酸酶NotI和SalI切割扩增产物，然后将其亚克隆到Bluescript质粒中。随后使用T3和T7引物进行自动测序。经证实的为一部分的MAGE-10 cDNA序列(1400个碱基对)，该序列对应于位于5’一端第2770个位置上的起点，并且在上述DePlaen等人所报道的基因组序列的3’一端之外延伸了660个碱基对。实施例9使用从上述实验中得到的信息，进行其它的工作以得到MAGE-10的全长的cDNA克隆。
正如所表明的那样，上述部分的cDNA克隆长1.4kb。用限制性内切核酸酶使该片段进行消化，分离出对应于已知的gDNA序列的第2770-3510个核苷酸的HpaI片段，并且使用随机引发DNA标记试剂盒对其进行32P标记。然后使用标记的探针筛选来自黑素瘤细胞系(Lyse-4)的两个文库，它们位于载体pcDNAI/Amp和pCEP4中。在65℃下，使用5×SSC、5×Denhardt’s、0.5％SDS和100ug/ml变性鲑精DNA，在滤膜上进行杂交。然后在室温下用1×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜三次共10分钟，在65℃下用1×SSC、0.1％SDS洗涤一次共洗20分钟，并且在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤两次共洗20分钟。发现了10个阳性克隆，并使用用于pcDNAI/Amp载体的T7和SP6引物以及用于pCEP-4的pCEP-4正向引物自动进行测序。分离出几种MAGE-10克隆，并且根据3’一端的不同而归入两个类别(分别为2.5kb和1.5kb)。这一差别可能是由于在针对所述文库的cDNA合成期间由交替的(alternate)寡脱氧胸苷酸引发造成的。除了位于5’一端的开头的50-70个核苷酸之外，所有的克隆看起来都是相同的。与至少四个外显子的描述了其存在的已知的基因组序列相比，最后的两个与上述DePlaen等人预测的是相同的(第1740—1814位，以及1890—末端)。第二个外显子对应于第603—701位，而第一个外显子似乎与任何事先识别的MAGE-10序列都不对应。在最后的外显子中发现了开放读框。序列示于SEQ ID NO3中。在通过这些实验获得的收集的序列信息的基础上，开头的大约100个碱基表示共有序列。实施例10如上所述，从pcDNAI/Amp文库中分离出三个克隆，并使用它们在体外进行转录和翻译。这些插入片段大约长1.5千碱基，在大约第3156的位置上终止，其中使用了基因组序列计数。使用可以通过商业途径得到的系统翻译1ug的每种DNA，并把萤光素酶对照质粒用作对照。对翻译产物进行PAGE分析，并把非放射性标记的产物的复制凝胶转移到膜上，在该膜上使用mAb 6Cl或如下所述制备的多克隆抗体进行Western印迹。放射性标记的物质显示出来自经测试的所有三个克隆的72千道尔顿的蛋白，这表明mAb与MAGE-1和MAGE-10之间具有交叉反应性。实施例11抗MAGE-10的多克隆抗血清制备如下。制得了免疫原性的MAGE-10衍生的肽(H)QDRIATTDDTTAMASASSSATGSFSYPE(OH) (SEQ IDNO4)，即MAGE-10的一部分推导的氨基酸序列，这正好是这种肽与辅助肽P-30的杂交体。
如per Valmori等人，《免疫学杂志》149717-721(1992)所述，辅助肽P30是众所周知的。它是一种破伤风毒素T细胞表位，具有如下的氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO5)。把这些肽以400ug/ml溶解在100mM Tris-HCl，pH 7.5，0.9％NaCl中。在56天的时间内免疫接种兔子，其中在第0天用杂交的肽(0.5ml)接种、在第14天用MAGE-10肽(0.5ml)接种、在第28天第二次注射0.5ml的杂交肽、并且在第56天最后注射0.5ml的MAGE-10肽。
针对与MAGE-10的反应性，以不同的测定方法来测试根据这一方案生成的抗血清。具体地讲，沿着上述提出的路线，在Western印迹实验中测试对应于SEQ ID NO3的cDNA表达的体外翻译产物。发现所述的抗血清结合到通过体外表达生成的蛋白上。从黑素瘤的裂解物中还识别出了72kDa的条带。在ELISA中，发现多克隆抗体识别所述的MAGE-10肽。
前面的实验描述了特异性地结合到肿瘤排斥抗原前体TRAP上的单克隆抗体的生产。
因此，本发明涉及MAGE-10结合的单克隆抗体以及生产所述抗体的杂交瘤。发现mAbs在测定MAGE-10的表达中是有用的。可以加入mAbs(例如以标记的形式)，结合到固相上，或者用其它方法处理以提高MAGE-10检测的灵敏度。考虑到可以使用mAbs的方式，本发明包括任何一种标准类型的免疫测定，其中包括ELISAs、RIAs、竞争测定、凝集测定以及所有其它的测定。例如在诊断或监测癌症的存在或发展中，MAGE-10表达产物的检测是很有用的。
分离的MAGE-10蛋白也是本发明的一个特征。正如SDS-PAGE测得的，该分子的分子量约为72kDa，并且当为SEQ ID NO4的肽时它作为免疫原是很有用的，通过上述实施例所示它具有免疫原性。优选地，这些物质与合适的佐剂结合使用。
编码MAGE-10的分离的cDNA也是本发明的一个特征、比如SEQ IDNO3的cDNA。本发明的另一部分为cDNA分子，该分子具有在严格条件下(例如在65℃下0.2×SSC、0.1％SDS，或者更优选为0.1×SSC)与SEQ ID NO3杂交的互补序列。这些序列至少应当包括SEQ ID NO3的按照5’到3’顺序的第164—574个核苷酸。由SEQ ID NO3的第164—185以及553—574个核苷酸组成的核酸分子作为探针和/或引物是特别有用的，并且它们也是本发明的一部分。当可操作地连接到启动子上时，可以以表达载体的形式使用所述序列，然后用于转化或者转染细胞，以便生成多种重组的真核细胞系和原核细胞株。类似地，上述序列以及诸如SEQ ID NOS1和2这样的序列可以用于各种杂交测定中、比如基于PCR的测定。对本领域的普通技术人员来说，这些都是众所周知的并且在此不必重复。
把已经采用的术语和表达用作描述的术语、而并非是限制性的，并且不打算在上述术语和表达的使用中排除任何与所显示的和描述的特征或其部分等同的内容，应当认识到各种的改进都可能在本发明的范围内。(1)一般信息(i)申请人Rimoldi，Donata；Jongeneel，Victor；Coulie，Pierre；Cerrottini，Jean-Charles；Carrel，Stefan；Reed，Daryl(ii)发明名称MAGE-10编码cDNA，肿瘤排斥抗原前体MAGE-10，对该分子具有特异性的抗体及其用途(iii)序列数3(iv)通讯地址(A)地址Felfe&Lynch(B)街道805第三大道(C)城市纽约市(D)州纽约(E)美国(F)邮政编码10022(v)计算机可读形式(A)存储媒体类型软盘，3.5英寸，144kb存储量(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordpeffect(vi)目前申请资料(A)申请号(B)申请日(vii)在先申请资料(A)申请号US08/724,774(B)申请日1996年10月3日(C)分类号435(viii)律师/代理人信息
(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登记号30,946(C)证书号LUD5457-PCT(ix)电信信息(A)电话(212)688-9200(B)电传(212)838-3884(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度19个核苷酸(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGGCGACGA CTCCTGGAG19(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度23个核苷酸(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2CAGACCAACT GGTAATGATA GCG 23(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度2559个核苷酸(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCGGGGTCG CTCGAGCCGG CCGGGACTCG GGGATCASAA GTAACGGCGG 50YYMKYGTKCT GAGGGACAGG CTTGAGATCG GCTGAAGAGA GCGGGCCCAG 100GCTCTGTGAG GAGGCAAGGG AGGTGAGAAC CTTGCTCTCA GAGGGTGACT 150CAAGTCAACA CAGGGAACCC CTCTTTTCTA CAGACACAGT GGGTCGCAGG 200ATCTGACAAG AGTCCAGGTT CTCAGGGGAC AGGGAGAGCA AGAGGTCAAG 250AGCTGTGGGA CACCACAGAG CAGCACTGAA GGAGAAGACC TGCCTGTGGG 300TCCCCATCGC CCAAGTCCTG CCCACACTCC CACCTGCTAC CCTGATCAGA 350GTCATCATGC CTCGAGCTCC AAAGCGTCAG CGCTGCATGC CTGAAGAAGA 400TCTTCAATCC CAAAGTGAGA CACAGGGCCT CGAGGGTGCA CAGGCTCCCC 450TGGCTGTGGA GGAGGATGCT TCATCATCCA CTTCCACCAG CTCCTCTTTT 500CCATCCTCTT TTCCCTCCTC CTCCTCTTCC TCCTCCTCCT CCTGCTATCC 550TCTAATACCA AGCACCCCAG AGGAGGTTTC TGCTGATGAT GAGACACCAA 600ATCCTCCCCA GAGTGCTCAG ATAGCCTGCT CCTCCCCCTC GGTCGTTGCT 650TCCCTTCCAT TAGATCAATC TGATGAGGGC TCCAGCAGCC AAAAGGAGGA 700GAGTCCAAGC ACCCTACAGG TCCTGCCAGA CAGTGAGTCT TTACCCAGAA 750GTGAGATAGA TGAAAAGGTG ACTGATTTGG TGCAGTTTCT GCTCTTCAAG 800TATCAAATGA AGGAGCCGAT CACAAAGGCA GAAATACTGG AGAGTGTCAT 850AAAAAATTAT GAAGACCACT TCCCTTTGTT GTTTAGTGAA GCCTCCGAGT 900GCATGCTGCT GGTCTTTGGC ATTGATGTAA AGGAAGTGGA TCCCACTGGC 950CACTCCTTTG TCCTTGTCAC CTCCCTGGGC CTCACCTATG ATGGGATGCT 1000GAGTGATGTC CAGAGCATGC CCAAGACTGG CATTCTCATA CTTATCCTAA 1050GCATAATCTT CATAGAGGGC TACTGCACCC CTGAGGAGGT CATCTGGGAA 1100GCACTGAATA TGATGGGGCT GTATGATGGG ATGGAGCACC TCATTTATGG 1150GGAGCCCAGG AAGCTGCTCA CCCAAGATTG GGTGCAGGAA AACTACCTGG 1200AGTACCGGCA GGTGCCTGGC AGTGATCCTG CACGGTATGA GTTTCTGTGG 1250GGTCCAAGGG CTCATGCTGA AATTAGGAAG ATGAGTCTCC TGAAATTTTT 1300GGCCAAGGTA AATGGGAGTG ATCCAAGATC CTTCCCACTG TGGTATGAGG 1350AGGCTTTGAA AGATGAGGAA GAGAGAGCCC AGGACAGAAT TGCCACCACA 1400GATGATACTA CTGCCATGGC CAGTGCAAGT TCTAGCGCTA CAGGTAGCTT 1450CTCCTACCCT GAATAAAGTA AGACAGATTC TTCACTGTGT TTTAAAAGGC 1500AAGTCAAATA CCACATGATT TTACTCATAT GTGGAATCTA AAAAAAAAAA 1550AAAAAAAAGT TGGTATCATG GAAGTAGAGA GTAGAGCAGT AGTTACATTA 1600CAATTAAATA GGAGGAATAA GTTCTAGTGT TCTATTGCAC AGTAGGATGA 1650CTATAGTTAA CATTAAGATA TTGTATATTA CAAAACAGCT AGAAGGAAGG 1700CTTTTCAATA TTGTCACCAA AAAGAAATGA TAAATGCATG AGGTGATGGA 1750TACACTACCT GATGTGATCA TTATACTACA TATACATGAA TCAGAACATC 1800AAATTGTACC TCATAAATAT CTACAATTAC ATGTCAGTTT TTGTTTATGT 1850TTTTGTTTTT TTTTAATTTA TGAAAACAAA TGAGAATGGA AATCAATGAT 1900GTATGTGGTG GAGGGCCAGG CTGAGGCTGA GGAAAATACA GTGCATAACA 1950TCTTTGTCTT ACTGTTTTCT TTGGATAACC TGGGGACTTC TTTTCTTTTC 2000TTCTTGGTAT TTTATTTTCT TTTTCTTCTT CTTCTTTTTT TTTTTTAACA 2050AAGTCTCACT CTATTGCTCT GGCAGGAGTG CAGTGGTGCA GTCTCGGCTC 2100ACTGCAACTT CCGCCTCCTG GGTTCAAGCG ATTCTCCTGC CTCAGTCTCC 2150TGAGTAGCTG GGATTACAAG TGTGCACCAC CATACCCGGC TAATTTTGTA 2200TTTTTTAGTA GAGATGGGGT TTCACCATGT TGGCCAGGCT GGTCTCAAAC 2250TCCTGACCTC AGGTAATCTG CCCGCCTCAG CCTCCCAAAG TGCTGGGATA 2300ACAGGTGTGA GCCCACTGCA CCCCAGCCTC TTCTTGGTAT TTTAAAATGT 2350TGTTACTTTT ACTAGAATGT TTATGAGCTT CAGAATCTAA GGTCACACGT 2400TCGTTTCTGT TTATCCAGTT TAAGAAACAG TTTTGCTATT TTGTAAAACA 2450AATTGGGAAC CCTTCCATCA TATTTGTAAT CTTTAATAAA ATAACATGGA 2500ATTGGAATAG TAATTTTCTT GGAAATATGA AAAAATAGTA AAATAGAGAA 2550AATAATTTT 2559
权利要求
1. 编码MAGE-10肿瘤排斥抗原前体的分离的cDNA分子，其互补序列在严格条件下与SEQ ID NO3的第164-574个核苷酸杂交。
2. 权利要求1的分离的cDNA分子，它包括SEQ ID NO3的第67-2559个核苷酸。
3. 权利要求1的分离的cDNA分子，它包括SEQ ID NO3。
4. 包括权利要求1的分离的cDNA分子的表达载体，所述cDNA分子可操作地连接到启动子上。
5. 用权利要求3的表达载体转染或转化的真核细胞系或者原核细胞株。
6. 分离的MAGE-10肿瘤排斥抗原前体，它具有如SDS-PAGE测得的约为72千道尔顿的分子量。
7. 由权利要求1的分离的cDNA分子编码的分离的MAGE-10肿瘤排斥抗原前体。
8. 结合到权利要求6的分离的肿瘤排斥抗原前体上的单克隆抗体。
9. 由SEQ ID NO4的氨基酸序列组成的分离的肿瘤排斥抗原前体衍生的肽。
10. 包括权利要求6的分离的MAGE-10肿瘤排斥抗原前体和佐剂的免疫原性组合物。
11. 包括权利要求9的肽和佐剂的免疫原性组合物。
12. 多克隆抗血清，它是通过在有利于对其产生免疫应答的条件下用权利要求8的肽免疫接种非人的动物并由此分离出生成的抗血清来获得的。
13. 用于测定样品中MAGE-10肿瘤排斥抗原前体的存在的方法，该方法包括将所说的样品与权利要求8的单克隆抗体接触并且测定它们之间的结合。
14. 用于测定样品中MAGE-10肿瘤排斥抗原前体的存在的方法，该方法包括将所说的样品与权利要求12的多克隆抗血清接触并且测定它们之间的结合。
15. 杂交瘤细胞，在该细胞中生成了权利要求8的单克隆抗体。
16. 权利要求8的单克隆抗体，其中所说的抗体是人源化的。
全文摘要
编码肿瘤排斥抗原前体MAGE－10的分离的cDNA分子、其蛋白质、针对其的抗体以及这些物质的用途为本发明的一部分。
文档编号C07K14/00GK1239479SQ97180275
公开日1999年12月22日 申请日期1997年9月10日 优先权日1996年10月3日
发明者多娜塔·里莫尔迪, 维克托·扬尼尔, 皮埃尔·库利耶, 让－查尔斯·切罗蒂尼, 斯特凡·卡雷尔, 达里尔·雷德 申请人:路德维格癌症研究所