通过表达高水平的抗生物素蛋白诱导植物雄性不育性的利记博彩app

专利名称：通过表达高水平的抗生物素蛋白诱导植物雄性不育性的利记博彩app
背景技术：
本发明涉及使用编码抗生物素蛋白的DNA分子控制植物育性的方法。特别是，本发明涉及生产表达抗生物素蛋白的转基因雄性不育植物的方法。此外，本发明涉及在雄性不育植物子代中恢复雄性育性的方法。
花粉育性的控制在杂种作物生产中是重要的，参见例如J.M.Poehlman，BREEDING FIELD CROP，3rd ed.(Van Nostrand andReinhold，New York，NY，1987)，该书通过引用结合到本文中。例如在杂种玉米生产中，通常在花粉散发之前，物理除去雄性花序或雄穗，达到花粉育性的控制。人工去雄穗的工作量很大。虽然机械去雄穗比人工去雄穗的工作量小，但它的可靠性较小，需要随后检查作物，并且可能需要进行补救性人工去雄穗。两种去雄穗方法都引起母本产量的损失。
然而，大多数重要的主要作物在同一个花内具有雄性和雌性两个功能器官；因此，去雄不是一个简单的操作。尽管在花粉散发前可以手工除去花粉形成器官，但该方式杂种生产的工作量极大，并且极其昂贵。
也可以通过应用具有杀雄配子性质的叶喷雾剂控制花粉育性。Cross等人，Sex Plant Reprod.4235(1991)。例如将乙烯利撒到花药上，导致小麦花粉额外的有丝分裂，导致大麦绒毡层细胞退化，导致画眉属花粉畸形或花粉败育。Bennet等人，Nature 240566(1972)，Colhoun等人，Plant Cell Environ.621(1983)；Berthe等人，Crop Sci.1835(1978)。然而，化学方法的工作量大，并且存在将化学药品毒性导入环境的潜在问题。
此外，使用杀配子剂的杂种种子的工业生产受费用和化学药品可用性的限制，也受施药可靠性和作用时间的限制。杀配子剂的一个严重的限制是它们具有毒害植物的作用，其严重性取决于基因型。其它限制包括这些化学药品可能对花期较长的作物无效，因为产生的新花可能不受影响。因此，需要重复使用化学药品。
目前大田作物的许多工业杂种种子生产系统依赖于传粉控制的遗传方法。用作母本的植物或者不能散粉、产生生化上不能进行自花受精的花粉，或者不能制造花粉。不能自花受精的植物称为“自交不亲和”。与使用自交不亲和性系统有关的困难包括自交不亲和母系的可用性及其繁殖，以及自交不亲和性的稳定性。在某些情况下，可用化学方法克服自交不亲和性，或在阻断花粉的生化机制被激活前对未成熟芽进行人工授粉。可失效的自交不亲和性系统通常非常易受恶劣气候条件的伤害，后者破坏或减小生化阻断自花传粉的效力。
工业种子生产较广泛感兴趣的是造成雄性不育的基于遗传花粉控制的系统。这些系统有两个一般类型(1)核雄性不育性，这是因为一个或多个核基因发生突变，不能形成花粉，或(2)细胞质遗传的雄性不育性，通常称为“细胞质雄性不育性”(CMS)，其中因为细胞质细胞器(通常为线粒体)的改变，花粉形成被阻断或花粉败育。
核不育性可以或者是显性，或者是隐性。如果可以进行母系的营养繁殖或无性繁殖，那么显性不育性只能用于杂种种子的形成。如果不育性植物或可育性植物易于区别，那么可以使用隐性不育性。然而，显性不育性系统和隐性不育性系统的工业实用性分别受无性繁殖的费用和自花能稔植物母系选株的限制。
尽管有涉及使用CMS的杂交方案，但是其工业价值有限制。一个CMS系统的实例是位于细胞质的线粒体中的一个特异性突变，在适当的核背景下导致不能形成成熟花粉。在某些情况下，核背景可以补偿细胞质突变，形成正常花粉。特异性核“恢复基因”使得具有CMS线粒体的植物形成花粉。一般来说，使用CMS进行工业种子生产涉及使用三个育种系一个雄性不育系(母本)；一个保持系，与雄性不育系同源，但含有完整功能的线粒体；和一个父本系。父本系可以携带或可以不携带细胞质特异性恢复基因。
对于诸如蔬菜之类杂种的种子回收不重要的作物而言，可以使用CMS系统，而不用恢复。对于杂种的果实或种子为工业产品的作物而言，必须用父本的特异性恢复基因恢复杂种种子的育性，或必须对雄性不育杂种授粉。可以通过用小比例的雄性可育植物进行授粉而完成。在大多数物种中，由于所有的细胞质细胞器都只由卵细胞遗传，因此CMS特征是母体遗传的。
CMS系统具有一些限制，可以妨碍它们作为生产雄性不育植物的唯一方法。例如，玉米的一种特殊CMS类型(T细胞质)赋予对特定真菌感染产生的毒素的敏感性。虽然许多作物仍使用CMS系统，但它在某些环境条件下可能发生故障。
因此，显然非常需要除人工、机械、化学和常规遗传方法外的控制花粉生产的方法。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供产生雄性不育植物的方法，即通过异源表达抗生物素蛋白使植物不育。
本发明的另一目的是提供一个嵌合基因，该基因包含编码抗生物素蛋白的DNA序列，操作性地与植物启动子序列连接。
本发明的另一目的是提出逆转因表达抗生物素蛋白引起的雄性不育性的方法。
按照本发明的一个实施方案，通过提供包含操作性地与植物启动子连接的编码抗生物素蛋白核苷酸序列的分离DNA分子，达到这些目的和其它目的。在一个推荐实施方案中，该分离的DNA序列包含于一个表达载体中。在另一推荐实施方案中，该植物启动子序列为组成型启动子，在另一推荐实施方案中，组成型启动子为遍在蛋白质启动子。
按照本发明的另一实施方案，提供一转基因植物，其中该植物包含异源核苷酸序列，后者包含抗生物素蛋白基因，并且该异源核苷酸序列提高植物组织中抗生物素蛋白的浓度，引起雄性不育性。在一个推荐实施方案中，转基因植物为玉米植株、大豆植株或向日葵植株。在另一推荐实施方案中，该异源DNA分子还包含一个组成型启动子序列，后者在一个推荐实施方案中为遍在蛋白质启动子序列。
按照本发明的再一个方面，提供产生转基因雄性不育植物的方法，包括将包含一个启动子和一个抗生物素蛋白基因的表达载体导入植物细胞中，其中启动子控制抗生物素蛋白基因的表达，而抗生物素蛋白基因的表达引起雄性不育性。在一个推荐实施方案中，由该植物细胞再生转基因植物。在另一推荐实施方案中，该启动子包括遍在蛋白质启动子或可诱导启动子。
按照本发明的再一个方面，提供使用抗生物素蛋白基因产生雄性不育杂种植物的方法，包括产生包含上述DNA分子的第一亲本雄性不育植株，其中抗生物素蛋白的表达引起雄性不育性；产生表达第二外源基因的第二转基因亲本植株；以及第一亲本与第二亲本异花受精，产生表达第二外源基因的杂种植株，其中第二外源基因的产物减少杂种植株中抗生物素蛋白的表达，由此产生雄性可育杂种植物。
在本发明该方面的一个推荐实施方案中，第二外源基因选自反义基因、核酶基因和外导序列(extemal guide sequence)基因。在另一推荐实施方案中，反义基因包含抗生物素蛋白mRNA序列，在再一推荐实施方案中该mRNA序列在可诱导启动子的控制下。在另一推荐实施方案中，核酶基因包含抗生物素蛋白mRNA序列。在再一推荐实施方案中，外导序列基因包含抗生物素蛋白mRNA序列。在再一推荐实施方案中，第一亲本植株的DNA分子还包含操作性地与所述启动子连接的LexA操纵子，其中第二外源基因为LexA阻遏物基因。在另一推荐实施方案中，启动子序列为包含一个花药框的花药特异性启动子序列，花药框选自SEQ ID NO1的核苷酸序列、SEQ ID NO2的核苷酸序列、SEQ ID NO3的核苷酸序列和它们的一个功能片断。
在本发明该方面的再一推荐实施方案中，花药框具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列，而花药特异性启动子还包含一个核心启动子，该核心启动子选自CaMV 35S核心启动子、SEQ ID NO4的核苷酸序列、SEQ ID NO5的核苷酸序列、SEQ ID NO6的核苷酸序列和它们的一个功能片断。
按照本发明的再一个方面，提供使因表达抗生物素蛋白而雄性不育的植物恢复育性的方法，包括向植物喷洒生物素溶液。
附图简述

图1表示抗生物素蛋白编码质粒PHI5168。
图2表示编码bar基因的质粒PHI610。
推荐实施方案的详细说明1.定义在以下说明中，大量使用多个术语。为了便于理解本发明，提供以下定义。
结构基因为转录为信使RNA(mRNA)、然后翻译为特定多肽的氨基酸序列特征的DNA序列。
外源基因在本说明书中是指操作性地与至少一个异源调控成分连接的DNA序列。例如，如果由5126基因的花药特异性调控成分控制，那么除玉米5126结构基因外的任何基因都被认为是外源基因。
启动子为指导基因(诸如结构基因、反义基因、核酶基因或外导序列基因等)转录的DNA序列。启动子通常位于基因5’区，接近转录起始位点。如果启动子为可诱导启动子，那么相应于诱导物增加转录速率。相反，如果启动子为组成型启动子，那么转录速率不受诱导物的调控。植物启动子为植物组织中指导基因转录的启动子序列。
核心启动子含有启动子功能的基本核苷酸序列，包括TATA框和转录起点。根据该定义，核心启动子在缺乏增强活性或赋予组织特异性活性的特定序列的情况下，可能具有或不具有可检测的活性。例如，SGB6核心启动子由SGB6基因转录起始位点5’方向(5’-ward)的大约38个核苷酸组成，而花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S核心启动子由35S基因组的转录起始位点5’方向的大约33个核苷酸组成。
组织特异性启动子为这样一种DNA序列，当它操作性地与一个基因连接时，它指导的该基因的转录水平在生物体特定组织中比该生物体中的一些或所有其它组织高。例如，花药特异性启动子为指导植物花药组织中相关基因较高水平转录的DNA序列。例如，SGB6花药特异性启动子可以指导外源基因在花药组织中表达，而不在根组织或胚芽鞘组织中表达。
这里所用的“花药特异性启动子”包括两个功能成分一个“花药框”和一个核心启动子。特定的花药框可能具有标准增强子的功能特征。花药框和核心启动子的组合可以比单独的核心启动子更大程度地刺激基因表达。甚至在含有得自不同基因的花药框和核心启动子的嵌合花药特异性启动子的情况下也是如此。下面描述这类嵌合花药特异性调控成分。
操纵子是位于基因5’方向的DNA分子，它含有由阻遏蛋白识别并结合的核苷酸序列。阻遏蛋白与其识别的操纵子的结合导致基因转录的抑制。例如，LexA基因编码与LexA操纵子结合的阻遏蛋白。
分离的DNA分子为由生物体DNA分离的DNA片断。例如，编码抗生物素蛋白基因的克隆DNA分子为一个分离的DNA分子。分离的DNA分子的另一实例为化学合成的DNA分子或酶法制备的cDNA，它不整合入生物体的基因组DNA。
增强子为可以增加转录效率的DNA调控成分。
互补DNA(cDNA)为用酶(反转录酶)由mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，与mRNA的部分互补的引物用于反转录的起始。本领域技术人员也使用术语“cDNA”，是指由这种单链DNA分子与其互补DNA链组成的双链DNA分子。
术语表达是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达涉及将结构基因转录为mRNA，然后将mRNA翻译为一种或多种多肽。
克隆载体是一种诸如质粒、粘粒或噬菌体之类的DNA分子，它能够在宿主细胞中自主复制。克隆载体通常含有一个或少数限制性内切酶识别位点，这些位点上可以以确定的方式插入外源DNA序列，而不损失载体的基本生物学功能；还含有标记基因，后者适用于用克隆载体转化的细胞的识别和筛选。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的一种DNA分子。基因表达通常在某些调控成分(包括组成型启动子或可诱导启动子、组织特异性调控成分和增强子)的控制下。我们说这一基因与调控成分“操作性地连接”。
重组宿主可以为任何或者含有一个克隆载体或者含有一个表达载体的原核细胞或真核细胞。该术语也包括已经进行遗传工程、在宿主细胞的染色体或基因组中含有一个或多个克隆基因的那些原核细胞或真核细胞。
转基因植物为具有一个或多个含有外源基因的植物细胞的植物。
在真核生物中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录，产生mRNA。可以设计一个DNA分子，使其含有RNA聚合酶II的模板，其中RNA转录物的序列与一定特定的mRNA互补。该RNA转录物称为反义RNA，而编码反义RNA的DNA序列称为反义基因。反义RNA分子能够与mRNA分子结合，导致mRNA翻译的抑制。
核酶为含有一个催化中心的一种RNA分子。该术语包括RNA酶、自身拼接RNA和自身切割RNA。编码核酶的DNA序列称为核酶基因。
外导序列为一种RNA分子，它将一个内源核酶(RNA酶P)导向特定种类的胞内mRNA，导致该mRNA被RNA酶P切割。编码外导序列的DNA序列称为外导序列基因。2.概述本发明通过制备表达抗生物素蛋白的转基因植物，提供产生雄性不育植物的方法。抗生物素蛋白可以以非组织特异性方式以组成型表达，或可以以花药特异性方式表达。也提供恢复雄性育性的方法。
分离抗生物素蛋白基因，将其插入适于导入植物组织的表达载体中。表达载体还包含一个启动子，后者可以为组成型启动子、非组织特异性启动子(诸如遍在蛋白质启动子等)、组织特异性启动子(诸如花药特异性启动子等)或可诱导启动子。通过标准方法将表达载体导入植物组织中，筛选并繁殖转基因植物。表达抗生物素蛋白的转基因植物为雄性不育的。通过在转基因植物中共表达抑制抗生物素蛋白基因转录或抑制抗生物素蛋白mRNA翻译的第二基因，可以恢复雄性育性。或者，可以通过用生物素溶液喷洒发育的植物，恢复雄性育性。3.编码抗生物素蛋白的DNA分子的分离可以用已知方法分离编码抗生物素蛋白的核苷酸序列。例如，可以用Gope等人，Nucleic Acids Res.153595(1987)所述方法(该论文通过引用结合到本文中)，从鸡输卵管cDNA文库中分离编码鸡卵清抗生物素蛋白的cDNA。
或者，可以由已知产生抗生物素蛋白的生物体的基因组DNA中获得抗生物素蛋白基因的基因组克隆。例如，可以用Keinanen等人，Eur.J.Biochem.220615(1994)所述方法，由鸡基因组DNA中克隆鸡抗生物素蛋白基因。
也可以采用聚合酶链反应(PCR)，用标准方法分离抗生物素蛋白基因。参见Erlich，PCR TECHNOLOGYPRINCIPLES ANDAPPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION(Stockton Press，NY，1989)和Innis等人，PCR PROTOCOLSA GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS(Academic Press，San Diego，1990)。诸如ELONGASETM系统(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)之类的长核苷酸序列的PCR扩增方法，也可以用来获得较长的核苷酸序列，诸如编码抗生物素蛋白的基因组克隆。与已知的抗生物素蛋白基因序列的5’末端和3’末端互补的PCR引物可以用市售的寡核苷酸合成仪、诸如Applied Biosystems(Foster City，CA)供应的那些合成仪来合成。在一个推荐实施方案中，该引物包括含有限制性核酸内切酶切割位点的其它核苷酸序列。这类位点的存在使得在用适当的限制性内切酶处理后，将PCR产物定向克隆到适当的克隆载体中。参见在CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel等人Eds(JohnWiley & Sons，New York，1987)第15.7.1页中Finny的“MolecularClonig of PCR Products”。
PCR的模板DNA可以或者是cDNA或者是基因组DNA，可以用本领域众所周知的方法由适当的生物体制备。Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，SecondEdition，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY1989)。可以用诸如TriazolTM(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)之类的市售试剂，直接由鸟类、爬行动物或两栖动物组织制备基因组DNA。或者，可以用市售的药盒(Pharmacia，Piscataway，NJ)，用由鸡输卵管组织提取的mRNA制备编码抗生物素蛋白的cDNA。用标准技术，使用poly(dT)或随机六聚物引物，将该mRNA制剂用作cDNA合成的模板。参见Sambrook等人，supra。然后，用市售药盒(Pharmacia)进行cDNA合成，使用Saiki等人，Science 239487(1988)的方法，将cDNA直接用于PCR。
用上述方法分离的基因组DNA或cDNA片断可以按照常规技术(诸如使用限制性内切酶降解产生适当末端，使用碱性磷酸酶处理以避免DNA分子不合适的连接，以及用适当的连接酶连接等)，插入诸如噬菌体或粘粒载体之类的载体中。Ausubel等人(eds.)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3.0.5-3.17.5页(1990)[“Ausubel”]公开了这类载体的操作技术。
或者，采用相互引发长寡核苷酸，合成编码抗生物素蛋白的DNA分子，可以获得编码抗生物素蛋白的核苷酸序列。参见例如Ausubel等人第8.2.8-8.2.13页。也参见Wosnick等人，Gene 60115(1987)。目前采用聚合酶链反应的技术提供合成最大为1.8千碱基对长度的基因的能力。Adang等人，Plant Molec.Biol.211131(1993)；Bambot等人，PCR Methods and Applications 2266(1993)。合成的抗生物素蛋白基因的核苷酸序列可以基于任何已知的编码抗生物素蛋白的DNA分子。参见例如Gope等人，supra。
可以用诸如限制性内切酶分析、Southem分析、引物延伸分析和DNA序列分析之类的多种标准技术分析这些克隆。例如引物延伸分析或S1核酸酶保护分析可以用来将克隆基因转录的假定起始位点定位。Ausubel第4.8.1-4.8.5页；Walmsley等人，在METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，VOL.7GENE TRANSFER ANDEXPRESSION PROTOCOLS，Murray(ed.)，第271-281页(HumanaPress Inc.1991)中的“Quantitative and Qualitative Analysis of ExogenousGene Expression by the S1 Nuclease Protection Assay”。4.将抗生物素蛋白基因克隆到达载体中和制备转基因植物一旦分离出抗生物素蛋白基因，则用标准方法将其放入表达载体中。参见Sambrook等，supra。适当表达载体的选择取决于将表达载体导入宿主细胞的方法。表达载体通常含有(1)编码细菌复制原点和抗生素抗性基因的原核DNA成分，用于细菌宿主中表达载体的生长和筛选；(2)用于插入外源DNA序列(例如抗生物素蛋白基因)的克隆位点；(3)控制外源基因转录起始的真核DNA成分，诸如启动子等；(4)控制转录物加工的DNA成分，诸如一个转录终止/加poly(A)的序列等；以及(5)编码标记蛋白(例如报道基因)的基因，其中该基因操作性地与控制转录起始的DNA成分连接。在METHODS IN PLANTMILECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，Glick等人(eds)第89-119页(CRC Press，1993)中Gruber等人的“Vector for PlantTransformation，”中有植物表达载体和报道基因的一般描述。
在本发明的一个推荐实施方案中，使用植物遍在蛋白质启动子系统。植物遍在蛋白质启动子是本领域众所周知的。参见例如欧洲专利申请0 342 926，该专利申请通过引用结合到本文中。遍在蛋白质启动子为组成型启动子。
在本发明的另一推荐实施方案中，使用可诱导启动子对抗生物素蛋白表达进行诱导调控。这一可诱导启动子的实例为玉米的谷胱甘肽S转移酶系统。参见Weigand等人，Plant Mol.Biol.7235(1986)。该方法也用于可逆诱导雄性不育性。因此，抗生物素蛋白的表达和伴随的雄性不育性可以根据需要，通过激活启动子来控制。当不激活启动子时，抗生物素蛋白不表达，植物为雄性可育。
可以将含有抗生物素蛋白基因的表达载体导入原生质体中，或导入完整的组织(诸如未成熟胚和分生组织)中，或导入愈伤组织培养物中，或导入分离的细胞中。表达载体最好导入完整的组织中。例如在METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY，Glick等人(eds)第67-88页(CRC Press，1993)中Miki等人的“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，”和在CORN AND CORN IMPROVEMENT，3rd Edition，Sprague等人(eds)，第345-387页(American Society of Agronomy，Inc.et al.1988)中Phillips等人的“Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation”中提供了培养植物组织的一般方法。
将表达载体导入植物组织的方法包括根癌农杆菌直接感染植物组织或将植物组织与根癌农杆菌共培养。Horsch等人，Science 2271229(1985)。最好用解除武装的Ti质粒作为外源DNA序列的载体。可以采用例如欧洲专利申请116 718(1984)和270 822(1988)中所述步骤进行转化。推荐的Ti质粒在边界序列之间或至少在右边界序列的上游含有外源DNA序列。
采用诸如直接基因转移(参见例如PCT申请WO 85/01856和欧洲申请275 069)、体外原生质体转化(例如美国专利4,684,611)、植物病毒介导的转化(例如欧洲申请067 553和美国专利4,407,956)和脂质体介导的转化(例如美国专利4,536,475)之类的步骤，可以用其它类型的载体转化植物细胞。Fromm等人，Bio/Technology 8833(1990)和Gordon-Kamm等人，The Plant Cell 2603(1990)提供了适当的玉米转化方法。Christou等人，Trends in Biotechnology10239(1992)和Lee等人，Proc.Nat’l Acad Sci.USA 886389(1991)描述了水稻的标准转化方法。可以采用与转化玉米或水稻的相似技术转化小麦。此外Casas等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9011212(1993)描述了转化高粱的方法，而Wan等人，Plant Physiol.10437(1994)描述了转化大麦的方法。
一般来说，直接基因转移法优选用于单子叶植物的转化，特别是诸如水稻、玉米、高粱、大麦或小麦之类的谷类。适当的直接转移法包括微弹(microprojectile)介导的传送、DNA注射、电穿孔等。参见例如Gruber等人，supra、Miki等人，supra和Klein等人，Bio/Technology10268(1992)。更优选用生物弹道(biolistic)装置，通过微弹介导的传送将表达载体导入单子叶植物组织中。5.雄性育性的调控A.雄性不育植物的产生为了诱导根据本发明的雄性不育性，构建一个表达载体，其中编码抗生物素蛋白的DNA序列操作性地与调控植物组织中基因转录的DNA序列连接。以上描述了表达载体的一般要求。为了通过表达抗生物素蛋白得到雄性不育性，抗生物素蛋白最好不是仅仅以瞬时方式表达，而是将表达载体以这样的方式导入植物胚胎组织，使得抗生物素蛋白在成熟植株的发育晚期表达。例如采用提供表染色体复制的植物病毒载体，可以达到有丝分裂的稳定性。
提供获得有丝分裂稳定性的推荐方法是将表达载体序列整合到宿主染色体中。将表达载体通过微弹传送到植物组织中，或采用上述其它标准方法，可以提供这种有丝分裂稳定性。参见例如Fromm等人，Bio/Technology 8833(1990)、Gordon-Kamm等人，The Plant Cell 2603(1990)和Walters等人，Plant Molec.Biol.18189(1992)。
抗生物素蛋白基因导入植物组织后的转录最好由非特异性刺激基因在植物组织中表达的组成型启动子控制。适用于此目的的组成型启动子的一个实例为supra所述的遍在蛋白质启动子。
抗生物素蛋白基因的转录也可以由以组织特异性方式刺激基因表达的启动子控制。特别推荐的花药特异性启动子为由玉米B73自交系分离的5126启动子。5126启动子刺激从四分孢子期至早单核小孢子期的花药表达外源基因。
另一适宜的花药特异性启动子为SGB6启动子，它也由B73系分离。SGB6启动子可以在小孢子发育的四分孢子期至中单核期的花药绒毡层细胞中诱导外源基因的表达。
或者，采用花药框和核心启动子的组合，可以提供花药特异性的基因表达。特别推荐的花药框为5126花药框，包含以下核苷酸序列5′GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCCCGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGGTTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT 3′[SEQ ID NO1].
AAAGGATAAT GGTACGTGTC TAGA
另一适宜的花药框位于94个碱基对的DNA片断中，该片断由SGB6转录起始位点上游的第583-490位核苷酸定义。该94个碱基对的SGB6花药框的核苷酸序列为(-5 83) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCTTGTCAAGTGA TCTATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGAGGATTGTGCG GTTTCTTTTG GCACAAATGG CATGAACAGACCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCTGTAATCCGGG ACGC(-490)[SEQ ID NO2].
CATTAGGCCC TGCG或者，由玉米G9启动子获得适宜的花药框，它在发育的减数分裂期至四分孢子期刺激基因表达。G9花药框包含以下核苷酸序列5′GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGACGCCGGCGCC TAGGACCGAC CTACTTTGGC TACGCTCTCTAGAAAAAAAA ATTGTTGCAT GTAGTTGGCG CCTGTCACCCTCTTTTTTTT TAACAACGTA CATCAACCGC GGACAGTGGGAACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGATTGGTTTGGT CATCAACTCC GTGCGGGACA AACGAGTGCTTCACGAACeT AGATCT 3′[SEQ ID NO3].
AGTGCTTGCA TCTAGA可以按照上述方法通过合成寡核苷酸获得5126、SGB6和G9花药框。本领域技术人员会理解，可以进行缺失分析，将公开的花药框中的一个或多个其它花药特异性调控序列定位。这类花药框的“功能片断”也可以用来调控花药特异性方式的抗生物素蛋白的基因表达。
推荐的核心启动子得自5126核心启动子、SGB6核心启动子、G9核心启动子和花椰菜花叶病毒35S核心启动子。
特别推荐的核心启动子为5126核心启动子，它包含以下核苷酸序列
5′AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAATTCTCTAGATTCA TTCCATATAT ACACGTATCA GAGGATTAAGTTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTACAAGTAGAAGT TGGAGATCGA CTAACTAGAG ACCATAAATGCACTCTTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCACGTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTGAAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG 3′[SEQ ID NO4].
TTTAGTTTCA ACGAAACGGT ACSGB6核心启动子由SGB6基因转录起始位点上游的大约38个核苷酸组成。适宜的SGB6核心启动子具有以下核苷酸序列5′ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGACGAGTAGAGTGGGA TAATTATGGT ACGACTGCTCCCAATAGC 3′[SEQ ID NO5].
GGTTATCG一个适宜的得自G9基因的核心启动子包含核苷酸序列5′AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTTTCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCTT TCGCTCTAAACACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCATGTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCG ACGTGACGTAACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG 3′[SEQ ID NO6].
TGTAGCTCGA TTGATAGACG TCGGTAC5126、SGB6和G9的核心启动子的功能片断也提供适宜的核心启动子。上面描述了获得这类功能片断的方法。
可以采用嵌合调控成分(包含一个基因的花药框和第二基因的花药特异性启动子)，延伸抗生物素蛋白基因表达的发育窗口。例如，SGB6调控序列在发育的四分孢子期至中单核期刺激基因表达，而G9调控序列在减数分裂期间和至发育的四分孢子期刺激基因表达。SGB6花药框和G9启动子的组合在减数分裂期间和至发育的中单核期刺激外源基因的转录。因此，花药框和花药特异性启动子的各种组合对本发明特别有用。
也可以使用病毒核心启动子。适宜的病毒核心启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)核心启动子、玄参花叶病毒核心启动子等。Gruber等人，supra。病毒核心启动子最好为CaMV 35S核心启动子或其变异体。
为了筛选转化细胞，表达载体含有一个诸如除草剂抗性基因等的选择性标记基因。例如，这类基因可以赋予对甲膦基高丙氨酸(phosphinothricine)、草甘膦、磺酰脲类、莠去津或咪唑啉酮的抗性。选择性标记基因最好是bar基因或编码甲膦基高丙氨酸乙酰转移酶的pat基因。在Leemans等人，欧洲专利申请0-242-246(1987)和White等人，Nucleic Acids Res.181062(1990)中可以发现bar基因的核苷酸序列。Wohlleben等人，Gene 7025(1988)公开了pat基因的核苷酸序列。bar基因或pat基因的表达赋予对诸如glufosinate(在其它除草剂中以Basta和Ignite出售)和bialaphos(以Herbi-ace和Liberty出售)之类的除草剂的抗性。
表达载体可以含有在组成型启动子或花药特异性启动子控制下编码抗生物素蛋白的DNA序列以及在组成型启动子控制下的选择性标记基因。或者，选择性标记基因可以在单独的选择性表达载体中，通过胚胎组织的“共转化”传递到宿主细胞中。
B.F1杂种中雄性育性的恢复上述方法可以用来产生转基因雄性不育植物，以在自交系之间大规模定向杂交中生产-F1杂种。如果转基因雄性不育植物的所有卵细胞都不含有重组抗生物素蛋白基因，那么一部分F1杂种将具有雄性可育的表现型。另一方面，如果重组抗生物素蛋白基因存在于转基因雄性不育植物的所有卵细胞中，因为由乙烯诱导的不育性为显性，那么F1杂种将具有雄性不育的表现型。因此，可能需要采用雄性育性恢复系统，以生产雄性可育F1杂种。当收获的产品为种子时，这一育性恢复系统在自花受精物种中具有特殊的价值。
通常提出的在一个转基因植物系中恢复育性的方法需要产生第二“恢复”系转基因植物。例如，将因靶酶的表达而雄性不育的转基因植物与表达靶酶抑制剂的雄性可育植物按上述方法杂交。Mariani等人，Nature 357384(1992)。
在本情况下，类似的方法需要生产转基因的恢复系植物，它表达靶为抗生物素蛋白mRNA的核酶，或表达反义抗生物素蛋白。例如，可以将核酶设计为表达指向mRNA分子中某一靶序列的核酸内切酶活性。例如，Steinecke等人，EMBO J.111525(1992)通过烟草原生质体中的核酶，达到最多100％抑制新霉素磷酸转移酶的基因表达。最近，Perriman等人，Antisense Res.&Devel.3253(1993)采用表达修饰的锤头核酶的载体，在烟草原生质体中抑制氯霉素乙酰转移酶活性。在本发明正文中，抗生物素蛋白mRNA为核酶提供适当的靶RNA分子。
使用含有编码反义RNA的核苷酸序列的表达载体，可以以相似的方法恢复育性。反义RNA分子与靶mRNA分子的结合导致翻译的杂交停止。Paterson等人，Pro Natl.Acad.Sci.USA 744370(1987)。在本发明正文中，适宜的反义RNA分子具有与抗生物素蛋白mRNA互补的序列。在本发明一个推荐实施方案中，反义RNA在可诱导启动子的控制下。因此，激活该启动子使得雄性育性恢复。
在另一方法中，可以构建表达载体，其中表达载体编码的RNA转录物能够启动RNA酶P介导的抗生物素蛋白mRNA分子的切割。按照该方法，可以构建外导序列，将内源核酶(RNA酶P)导向抗生物素蛋白mRNA，随后由该细胞核酶切割该mRNA。Altman等人的美国专利5,168,053、Yuan等人，Science 2631269(1994)。外导序列最好包含一个与抗生物素蛋白mRNA互补的10-15个核苷酸的序列和3’-NCCA核苷酸序列，其中N最好为嘌呤。Id。外导序列转录物与靶类mRNA通过在mRNA和互补外导序列之间形成碱基对进行结合，由此启动RNA酶P在位于碱基对区域5’端的核苷酸切割mRNA。Id。
在恢复雄性育性的另一方法中，转基因雄性不育植物含有一个表达载体，后者除含有操作性地与抗生物素蛋白基因连接的启动子序列外，也含有一个原核调控成分。产生转基因雄性不育植物，它在该启动子控制下表达一个原核多肽。在F1杂种中，该原核多肽与原核调控序列结合，阻遏抗生物素蛋白的表达。
例如，LexA基因/LexA操纵子系统用来调控按照本发明的基因表达。参见美国专利4,833,080(080专利)和Wang等人，Mol.CellBiol.131805(1993)。更具体地讲，雄性不育植物的表达载体可以含有LexA操纵子序列，而雄性可育植物的表达载体含有LexA阻遏物的编码序列。在F1杂种中，LexA阻遏物与LexA操纵子序列结合，抑制抗生物素蛋白基因的转录。
例如通过合成含有众所周知的LexA操纵子序列的DNA片断，可以获得LexA操纵子DNA分子。参见例如’080专利和Garriga等人，Mol.Gen.Genet.236125(1992)。合成编码LexA阻遏物的DNA分子，可以获得LexA基因。上面讨论了基因合成技术，例如Garriga等人，supra描述了LexA基因序列。或者编码LexA阻遏物的DNA分子可以由质粒pBR500获得。美国典型培养物保藏登记号为67758。
恢复育性的再一个方法利用抗生物素蛋白对生物素的高亲和性，用生物素溶液喷洒发育的植物。生物素溶液也包含最小量的有机助溶剂(诸如DMSO)以确保生物素的完全溶解。在花粉发育的减数分裂期进行喷洒，以定期的间隔进行重复，直至观察到花粉散发。喷洒之间的间隔为1-7天不等。在本发明的一个推荐实施方案中，每3-5天重复喷洒一次。
本领域技术人员可以采用原核调控系统(诸如Lac阻遏物/lac操纵子系统或trp阻遏物/trp操纵子系统等)，容易地设计其它雄性育性恢复策略。
因此，通过参考以下实施例，会更容易理解一般描述的本发明，通过说明提供实施例，这些实施例不是为了限制本发明。实施例1通过抗生物素蛋白的高度组成型表达制备雄性不育转基因玉米欧洲专利申请0 442 174A1(通过引用结合到本文中)中已经描述了形成转基因玉米植株的方法。其方法简述如下。
PHI5168，一个携带遍在蛋白质启动子控制下的抗生物素蛋白基因和含有一个PINII终止子序列的载体，用它形成转基因玉米植株。图1显示了PHI5168的结构。PHI610是一个携带双35S启动子控制下的bar基因和携带一个PINII终止子序列的表达载体，将其与抗生物素蛋白构成物(construct)一起共转化，通过用bialophos处理转化混合物，进行转基因植物的筛选。图2显示了PHI610的结构。按照Green等人，Molecular Genetics of Plants and Animals，editors Downey等人，Academic Press，NY，20，147(1983)的方法，将两个表达载体转化到胚胎发生悬浮培养物(得自第II型胚胎发生培养物)中。在Murashige等人，Physio.Plant；Vol 15，第453-497页(1962)中所述的Murashige和Skoog(“MS”)培养基(添加2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和30g/L的蔗糖)中维持培养物。在实验前7天，悬浮培养物通过710微米筛，将滤液保持在MS培养基中。
通过在布氏漏斗(Whatman No.614)上进行真空过滤，由悬浮培养物收获细胞，将100ml(鲜重)细胞置于3.3cm陪替氏平板中。将细胞分散于0.5ml新鲜的培养基中，形成细胞薄层。将未覆盖的陪替氏平板置于粒子枪装置(由Biolistics Inc.，Geneva NY制造)的样品室中。用真空泵将样品室内压力减小至0.1大气压，以减少由于空气摩擦引起的微粒子的减速。用钨粒子(平均直径为大约1.2微米)(GTE SylvaniaPrecision Materials Group，Towanda，Pennsylvania)轰击细胞。通过将5μlDNA的TE缓冲液(pH7.7)溶液(1μg DNA/100λ)加入1.5ml Eppendorf管中的25μl 50mg钨粒子/ml蒸馏水的悬浮液中，将PHI5168和PHI610的等量混合物装载到微粒子上。粒子凝聚并在管中沉淀。
将含有外源基因的转化植物细胞的培养物在560R(培养基)(具有1mg/ml bialaphos的N6基培养基)中培养4-8周。该培养基筛选表达Bar基因的细胞。
然后在胚胎发生培养物中诱导胚胎形成，将细胞萌发为植株。用两个培养基顺序萌发在愈伤组织维持培养基中观察到的体细胞胚。首先将愈伤组织转移到含有5.0mg/L吲哚乙酸(IAA)的培养基(成熟培养基)10-14天，以继续增殖愈伤组织。转移的愈伤组织为50mg/平板，以优化每单位组织块的收率。
然后，将愈伤组织由“成熟”培养基转移至第二培养基(与第一培养基相比，含有较低浓度的IAA(1mg/L))上。这时，将培养物置于光下。萌发的体细胞胚的特征为连接根入口的伸长绿苗。然后将体细胞胚转移至培养管(150×25mm)中的培养基中，再培养10-14天。这时，植物大约高7-10cm，具有足够的大小和活力在温室条件下健化。
为了健化再生植株，将拟转移至生长室中的植株从无菌容器中取出，冲去根部的固化琼脂培养基。将小植株置于生长室的市售盆栽混合土中，该生产室配有雾化装置维持接近100％的相对湿度而又不过度润湿植物根部。在保湿室中3-4周后，植物茁壮得足以移植到大田条件下。
通过观察雄性不育性，分析大田中的植株。然后，用标准方法，通过PCR和Southern印迹法，进一步分析筛选植株抗生物素蛋白基因的存在，通过ELISA，分析筛选植株抗生物素蛋白的表达。
通过PCR分析了94个植株，其中53个发现为可育的，41个为不育的。每个植株的育性与PCR检测抗生物素蛋白基因的存在相比时，发现基因存在和植物不育性之间有98％相关性。通过Southern印迹法，详细分析了5个植株抗生物素蛋白基因的存在。通过Southern分析，3个植株表现出含有抗生物素蛋白基因。所有3个植株都有不育性问题。没有抗生物素蛋白基因的2个植株完全可育。因此，抗生物素蛋白基因的存在和不育性问题之间100％相关。实施例2使用含有双载体(包括编码抗生物素蛋白的DNA序列)的农杆菌菌株，产生雄性不育转基因大豆植株形成转基因大豆植株的方法为美国专利申请07/920,409(通过引用结合到本文中)中描述的方法。大豆(Glycine max)Pioneer变种9341的种子通过暴露于玻璃钟罩中放出的次氯酸钠进行表面消毒。将3.5ml盐酸(34-37％w/v)加入100ml氯化钠(5.25％w/v)中产生气体。在大约1立方英尺体积的容器中暴露16-20小时。表面消毒的种子于室温下，贮藏在陪替氏培养皿中。将按照不含植物生长调节剂的Gambourg的1/10强度的琼脂固化培养基(含有最小量有机物的B5基础培养基，Sigma Chemical Catalog No.G5893、0.32gm/L蔗糖、0.2％w/v 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)(0.3mM))铺平板，并于28℃、日照长度为16小时、冷白日光灯照度大约为20μEm-2S-1下培养，萌发种子。3或4天后，制备用于共培养的种子。除去种皮，除去子叶下3-4mm的伸长根。
含有修饰的双质粒(含有抗生物素蛋白基因)的根癌农杆菌菌株LBA4404的过夜培养物，在基本A培养基(含有1μg/ml四环素)中生长至对数期，将其合并，在550nm下测定光密度。将足够体积的培养物置于15ml/锥形离心管中，使得沉淀时，每管收集109细胞/ml的1-2×1010细胞。以6,000×g离心10分钟进行沉淀。离心后，弃上清液，离心管于室温下保持至需要接种物为止，但不超过1小时。
分批进行接种，使得每个种子平板用刚刚再悬浮农杆菌沉淀处理。细胞沉淀分别再悬浮于20ml接种培养基中，后者含有3.2g/LB5盐(G5893)、2.0％w/v蔗糖、45μM 6-苄氨基嘌呤(BAP)、0.5μM吲哚丁酸(IBA)、100μM乙酰丁香酮(AS)，并用10mM MES缓冲至pH5.5。通过涡旋达到再悬浮。然后将接种物倒入含有制备的种子的陪替氏培养皿中，用手术刀分开子叶节。通过苗端纵向切开将种子分成两半，保持两个完整的子叶，来完成分开。然后用手术刀将苗端的两半橇离相应子叶。然后，通过沿对称轴重复刻划，用手术刀分开子叶节。小心不要完全通过外植体切至轴端。在大致5分钟内制备外植体，然后与细菌于室温下温育30分钟，不进行搅拌。30分钟后，将外植体转移至用0.2％w/v Gelrite(Merck & Company Inc.)固化的相同培养基平板中。包埋外植体，使其近轴端向上并与培养基表面齐平，在大约20μEm-2S-1的冷白日光灯光下于22℃培养3天。
3天后，将外植体转移至液体反选择培养基中，后者含有3.2g/l B5盐(G5893)、2％w/v蔗糖、5μM BAP、0.5μM IBA、200μg/ml万古霉素、500μg/ml头孢噻肟，用3mM MES缓冲至pH5.7。外植体于室温下在每个陪替氏培养皿中用恒定的缓慢旋转搅拌洗涤4天。更换4次反选择培养基。
然后，将外植体挑到琼脂固化的选择培养基中，后者含有3.2g/lB5盐(G5893)、2％w/v蔗糖、5.0μM BAP、0.5μM IBA、50μg/ml硫酸卡那霉素、100μg/ml万古霉素、30μg/ml头孢噻肟、30μg/ml羧噻吩青霉素-棒酸复合剂(timentin)，用3mM MES缓冲至pH5.7。选择培养基用0.3％w/v Seakem琼脂糖固化。将外植体近轴端向下包埋在培养基中，于28℃下培养，在冷白日光灯照度为60-80μEm-2S-1下的日照长度为16小时。
2周后，外植体在旋转摇床上再用液体培养基洗涤。洗涤在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的反选择培养基中过夜进行。第二天，将外植体挑到琼脂糖固化选择培养基上。将它们近轴端向下包埋在培养基中，再培养2周。
在选择培养基上1个月后，与黄化非健康组织相对照，可见到转化组织为绿色扇形体的再生组织。丢弃没有绿色扇形体的外植体，将具有绿色扇形体的外植体转移至伸长培养基中，后者含有3.2g/l B5盐(G5893)、2％w/v蔗糖、3.3μM IBA、1.7μM赤霉酸、100μg/ml万古霉素、30μg/ml头孢噻肟、30μg/ml羧噻吩青霉素-棒酸复合剂，用3mM MES缓冲至pH5.7。伸长培养基用0.2％w/v Gelrite固化。包埋绿色扇形体，使其近轴端向上，按照前述方法培养。在该培养基上继续培养，每2周转移至新鲜平板上。当苗长度为0.5cm时，将它们从基部切下，置于13×100ml试管中的生根培养基中。生根培养基含有3.2g/l B5盐(G5893)、15g/l蔗糖、20μM烟酸、900mg/L焦谷氨酸(PGA)和10μM IBA。生根培养基用3mM MES缓冲至pH 5.7，并用0.2％w/v Gelrite固化。10天后，将苗转移至不含IBA或PGA的相同培养基上。这些苗生根，将其在上述相同的环境条件下保持在试管中。
当根系很好地建立时，将小植株转移至无菌土壤中。温度、光照期和光强度保持与上述条件相同。
用ELISA证实并定量测定转基因大豆植株中的抗生物素蛋白的表达，通过PCR和Southern印迹法证实该基因的存在。可以用这些相同的方法，在连续世代中评价表达稳定性。发现不育性问题与大豆中的抗生物素蛋白的表达相关。实施例3通过表达抗生物素蛋白制备雄性不育向日葵植株编码抗生物素蛋白的表达盒用来产生转基因向日葵植株和种子。将编码抗生物素蛋白的DNA序列插入遍在蛋白质启动子控制下的表达盒中。
然后，用EcoRI位点，在诸如PHI 5765之类的双载体中亚克隆该表达盒。然后，将该双载体转移到根癌农杆菌辅助菌株中。
向日葵植株在按照Bidney等人，Plant Mol.Bio.Vol.18第301页，1992所述方法进行微粒子轰击后，用农杆菌菌株LBA4404转化。简单地讲，将先锋向日葵SMF-3系的种子除壳并进行表面消毒。种子在黑暗中，于26℃在用水润湿的滤纸上吸涨18小时。除去子叶和根基，将分生组织外植体培养在374BGA培养基(MS盐、Shephard维生素、40.mg/L硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.8％植物琼脂(phytagar)pH 5.6加0.5mg/L BAP、0.25mg/L IAA和0.1mg/LGA)中。24小时后，除去第一片叶，暴露顶端分生组织，将该外植体圆顶面向上置于含有水琼脂的60mm×20mm陪替氏平板中心的2cm圆圈中。外植体用悬浮于TE缓冲液中的钨粒子、或用与附有含抗生物素蛋白基因的表达质粒的粒子轰击2次。分生组织外植体在光下，于26℃在374BGA培养基中再共培养72小时。
在72小时共培养后，将农杆菌处理的分生组织转移至374培养基(具有1％蔗糖的374BGA，不含BAP、IAA或GA3)，添加250μg/ml头孢噻肟。让小植株在16小时日照长度和26℃的培养条件下，发育2周，发育为绿色或黄化。将小植株转移至含有卡那霉素的培养基中，让其生长。按实施例2所述方法证实并定量测定植株中抗生物素蛋白的存在。发现雄性不育性的存在与植株表达抗生物素蛋白相关。
虽然上述说明涉及具体的推荐实施方案，但应理解本发明并非如此有限。本领域技术人员会想到可以对公开的实施方案进行各种修改，这类修改将包括在以下权利要求书定义的本发明范围内。本说明书中提到的所有的发表文章和专利申请表现出本发明所属领域技术人员的水平。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL，INC.
(B)街道700 CAPITAL SQUARE，400 LOCUST STREET(C)城市DESMOINES(D)州IOWA(E)国家美国(F)邮政编码50309(ii)发明题目通过表达高水平的抗生物素蛋白诱导植物雄性不育性(iii)序列数6(iv)相应的地址(A)收信人Foley&Lardner(B)街道3000 K Street，N.W.，Suite 500(C)城市Washington(D)州D.C.
(E)国家美国(F)邮政编码20007-5109(v)计算机可读形式(A)媒介类型软磁盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申请数据(A)申请号尚颁发(B)申请日期(vii)先前申请数据(A)申请号US 08/475,582(B)申请日期1995年6月7日(viii)代理律师/代理人资料
(A)姓名Bent，Stephen A.
(B)注册号29,768(C)参考/代理机构编号33229/403/PIHI(ix)远程通信资料(A)电话(202)672-5300(B)传真机(202)672-5399(C)电传904136(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特性(A)长度64个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC TTTCCTATTA CCATGCACAG60ATCT 64(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特性(A)长度94个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO2ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT GGATTGTGCG GTTTCTTTTG60GCACAAATGG CATGAACAGA GTAATCCGGG ACGC94(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特性(A)长度136个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO3GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT60GTAGTTGGCG CCTGTCACCC AACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGA120TCACGAACGT AGATCT136(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特性(A)长度142个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO4AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTCATAGT CTCCTAATTC TTCATCTTCA ACCTCTAGCT60GATTGATCTC TGGTATTTAC CACTCTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCAC120AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG142(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特性(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO5ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGCGAG CCAATAGC38(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特性(A)长度107个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO6AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTT CACAGCTGAA AGCAGCCAAA60ACGCAGAAGC TGCACTGCAT ACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG 10权利要求
1.一个分离的DNA分子，包含可操作地与植物启动子序列连接的编码抗生物素蛋白的一个核苷酸序列。
2.一个表达载体，包含权利要求1的分离的DNA分子。
3.按照权利要求2的表达，其中所述植物启动子序列为组成型启动子。
4.按照权利要求3的分离的DNA分子，其中所述组成型启动子序列为遍在蛋白质启动子序列。
5.转基因植物，其中所述植物包含一个异源核苷酸序列，后者包含一个抗生物素蛋白基因，其中所述异源核苷酸序列增加该植物组织中抗生物素蛋白的浓度，并且由此所述较高的抗生物素蛋白浓度使得所述植物雄性不育。
6.按照权利要求5的转基因植物，其中所述植物为玉米植株。
7.按照权利要求5的转基因植物，其中所述植物为大豆植株。
8.按照权利要求5的转基因植物，其中所述植物为向日葵植株。
9.按照权利要求5的转基因植物，其中所述异源核苷酸序列还包含一个组成型启动子序列。
10按照权利要求9的转基因植物，其中所述组成型启动子序列为遍在蛋白质启动子序列。
11.产生转基因雄性不育植物的方法，包括将包含一个启动子和一个抗生物素蛋白基因的一个表达载体导入植物细胞中，其中所述启动子控制所述抗生物素蛋白基因的表达，由此所述抗生物素蛋白基因的表达引起雄性不育性。
12.按照权利要求11的方法，还包括由所述植物细胞再生转基因植株。
13.按照权利要求11的方法，其中所述启动子包括遍在蛋白质启动子。
14.用抗生物素蛋白基因产生雄性可育杂种植物的方法，包括以下步骤(a)产生包含按照按照权利要求1的DNA分子的第一亲本雄性不育植株，其中抗生物素蛋白的表达引起雄性不育性；(b)产生表达第二外源基因的第二转基因亲本植株；(c)所述第一亲本与所述第二亲本异花受精，产生杂种植株。其中所述杂种植株表达所述第二外源基因，而所述第二外源基因的产物降低所述杂种植株中抗生物素蛋白的表达，由此产生雄性可育杂种植株。
15.按照权利要求14的方法，其中所述第二外源基因选自反义基因、核酶基因和外导序列基因。
16.权利要求15的方法，其中所述反义基因包括抗生物素蛋白的mRNA序列。
17.权利要求16的方法，其中所述核酶基因包括抗生物素蛋白的mRNA序列。
18.权利要求16的方法，其中所述外导序列基因包括抗生物素蛋白的mRNA序列。
19.权利要求14的方法，其中所述第一亲本植物的所述DNA分子还包含可操作地与所述启动子连接的LexA操纵子，而所述第二外源基因为LexA阻遏物基因。
20.权利要求2的表达载体，其中所述启动子序列为包含选自以下花药框的花药特异性启动子序列(a)具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA分子；(b)具有SEQ ID NO2核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO3核苷酸序列的DNA分子；(d)(a)、(b)或(c)的一个功能片断。
21.权利要求20的表达载体，其中所述花药框具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，而所述花药特异性启动子还包含选自以下的一个核心启动子(a)CaMV 35S核心启动子；(b)具有SEQ ID NO4核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO5核苷酸序列的DNA分子；(d)具有SEQ ID NO6核苷酸序列的DNA分子；(e)(b)、(c)或(d)的一个功能片断。
22.权利要求20的表达载体，其中所述花药框具有SEQ ID NO2的核苷酸序列，而所述花药特异性启动子还包含选自以下的一个核心启动子(a)CaMV 35S核心启动子；(b)具有SEQ ID NO4核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO5核苷酸序列的DNA分子；(d)具有SEQ ID NO6核苷酸序列的DNA分子；(e)(b)、(c)或(d)的一个功能片断。
23.权利要求20的表达载体，其中所述花药框具有SEQ ID NO6的核苷酸序列，而所述花药特异性启动子还包含选自以下的一个核心启动子(a)CaMV 35S核心启动子；(b)具有SEQ ID NO4核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO5核苷酸序列的DNA分子；(d)具有SEQ ID NO6核苷酸序列的DNA分子；(e)(b)、(c)或(d)的一个功能片断。
24.由抗生物素蛋白的表达赋予雄性不育的植物中恢复育性的方法，包括用生物素溶液喷洒所述植物。
25.权利要求11的方法，其中所述启动子包括诱导启动子。
26.权利要求15的方法，其中所述反义基因可操作地与诱导启动子连接。
全文摘要
通过增加植物组织中内源抗生物素蛋白的浓度,可以产生雄性不育植物。通过产生含有一个表达载体的转基因植物,可以得到该效果,在该载体中一个启动子操作性地与一个编码抗生物素蛋白的DNA序列连接。也公开了恢复雄性育性的方法。
文档编号C07K14/465GK1192784SQ96196046
公开日1998年9月9日 申请日期1996年6月6日 优先权日1995年6月7日
发明者J·A·霍华德, M·C·阿尔伯森 申请人:先锋高级育种国际公司