专利名称：具有提高的免疫原性的修饰多肽的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及显示出提高的免疫原性的重组体多肽，特别是涉及通过脂结构修饰的多肽。具体来说本发明涉及通过脂结构修饰的寄生虫多肽，更具体地说涉及通过这样的脂结构修饰的Plasmodium falciparum的环子孢子蛋白质。本发明还涉及诱导针对所述修饰的多肽的免疫反应的方法、用于产生所说的多肽的方法、载体和宿主以及包含所说的多肽的疫苗。
免疫的系统是复合物，对其了解还不充分。外源免疫原被宿主免疫系统识别的方式仅有部分阐明。接触外源蛋白质的哺乳动物的免疫反应可在很大程度上变化。制备具有增加的免疫原性的多肽的任何方法都很有意义，它能克服其它微弱的致免疫表位位点的缺陷。
一种改善采用重组蛋白质的免疫接种的方法是从来源于一种或多种传染性病原体的一种以上蛋白质产生多个表位位点。该方法使得可以获得不昂贵的多价而更有效的疫苗，从而可导致更简单的和更安全的免疫用药制度。然而，这样的方法意味着每种多肽都可足量生产，而每种用于免疫的多肽需要特异性的纯化方案以确保最理想的数量。发现如下的方法是一种挑战其中可诱导强烈的抗特异性表位的免疫反应，但是免疫原数量低或存在于其它多肽混合物中，如同其在某些体内状态下观察的一样。
Plasmodium falciparum是最常见的疟疾病原体，在昆虫和人宿主中以不同的形式发现。在哺乳动物中使用灭活的寄生虫形式作为疫苗显示出很有前途的结果。然而，主要的限制是这样的事实其子孢子不能培养，而且必须从蚊唾液腺中分离，这妨碍了用此获得保护的灭活的寄生虫的使用。
为了解决这个问题，在异源重组系统中表达编码不同的疟原虫属形式的特异性蛋白质的基因并在一定程度上成功地用作潜在的宿主抗原。另外，使与限定肽抗原对应的区域用于保护研究，这显示出了这样的免疫的局限性。环子孢子蛋白质(CSP)是存在于在昆虫咬伤传染之后在组织中发现的Plasmodium falciparum子孢子表面的抗原之一。该蛋白质作为多肽前体被合成，其由氨基端信号序列(加工时除去)、在称为区域I和区域II(它们包含在不同的疟原虫属物种之间的保守序列)侧面的大的中央重复结构域以及疏水末端羧基结构域组成。由氨基酸族天冬酰胺-丙氨酸-天冬酰胺-脯氨酸(ASN-ALA-ASN-PRO)的衔接重复区域组成的重复结构域NANP显示出是Plasmodium falciparumCSP的有效B-细胞表位。包含这样的重复区域的合成肽在一定程度上成功地用作保护研究中的亚单位疫苗。对CSP蛋白质的T-细胞反应元件定位在重复片断的外部。在迄今为止的所有实验中，进行了用大量纯化抗原的免疫实验。
本发明的一个目的是提供修饰的蛋白质，如Plasmodium falciparum蛋白质，即使寄生虫抗原没有纯化，这种蛋白质也可引发强烈的免疫反应。该方法对于进一步开发不太昂贵但更有效的免疫用药制度的全细胞疫苗是有利的。
按照本发明，现发现了把葡基磷脂酰肌醇(GPI)锚添加至抗原中可引发比无锚的相应抗原更高的免疫反应。
因而本发明提供了显示出提高的免疫原性的重组多肽，该多肽包含引发与无锚的相应多肽相比增加的免疫反应的葡基-磷脂酰肌醇结构。所述多肽可以是抗原，优选地是寄生虫抗原，如Plasmodium falciparum环子孢子蛋白质(CSP)或其修饰蛋白质之类的Plasmodium falciparum抗原。
在本说明书和权利要求书中，使用短语“或其修饰蛋白质”是指掺入显示出诱导免疫反应的足够的免疫原性之环子孢子蛋白质的任何衍生物。因此，本发明不仅包括完全蛋白质，而且包括其片段或突变蛋白质。
在本文中通过参考Plasmodium falciparumCSP蛋白质说明本发明。然而，本发明不限于这种特定的抗原。对于熟练技术人员，通常可以以其它合乎需要的抗原替代CSP而不进行过多的实验来获得本发明的优点。本发明基于发现添加GPI-锚至任何多肽可提高其免疫原性。
已在异源重组系统(大肠杆菌、酵母、牛痘病毒、杆状病毒、沙门氏菌、盘基网柄菌)中获得了CSP的表达。现已发现粘液霉菌网柄菌属(Dictyostelium)的物种可用作产生重组蛋白质的有效真核表达系统。而且，与其它表达系统相比，完全稳定的CSP多肽可以在网柄菌属中产生(Fasel，N.，Begdadi-Rais，C.，Bernard，M.，Bron，c.，cORRADIN，g.和Reymoud，C.D.，(1992)，基因，111，157-163)。这样，该系统可用来获得强烈而持久的免疫保护，因为全CSP携带B-和T-细胞表位。
而且，网柄菌属具有生物技术潜力。它是自由生活的有机体，易于生长及保持。菌株可在细菌培养基上生长，加倍时间大约为3小时，在细菌悬液中可生长至高密度(达到每升1010个细胞)或在包含葡萄糖、胨和酵母抽提物的半合成培养基中生长，加倍时间是大约12小时。
网柄菌属的生活史由生长和发育期组成。发育期通过饥饿启动，其特征在于先前的单个细胞聚合以形成多细胞机体，然后该多细胞机体分化产生孢子。在细菌或丰富的半生熟孢子存在下发芽导致更新生长。在发育周期过程中，产生可传播的因素，结合到其受体上的至少其中之一诱导一组特异性的基因转录(参见Loomis，盘基网柄菌的发育，Acad.出版社，1982)。盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)的生长性质和转化容量提供了表达外源蛋白质的可能性，因为对细菌来说细胞可以以低成本生长，特异性蛋白质的表达可通过在简单培养基中的饥饿控制。最后，盘基网柄菌的安全、无毒、无致病性的自由生活有机体，它是全细胞疫苗开发的候选者(如果不能为人类的，至少可以为兽医的)。
这样，盘基网柄菌可通过用合适的载体转化细胞、在允许多肽表达的环境下培养细胞以及可有可无地分离多肽用于产生本发明的修饰多肽。合适的载体包含编码多肽的DNA序列，该DNA序列和定位于其下游的糖脂锚添加序列可操作地连接，合适的转录起始和终止序列也可操作地与其连接。DNA序列优选地编码寄生虫抗原，如Plasmodium falciparum环子孢子蛋白质(CSP)或其修饰蛋白质之类的Plasmodium falciparum抗原。
许多在各种有机体中的细胞表面蛋白质通过葡基磷脂酰肌醇(GPI)结构锚定在膜双分子脂膜中。该复合结构作为前体糖脂合成并转移到在内质网中的糖蛋白上。实施的GPI锚转移到特异性的多肽上仅当适当的信号序列(本文作为“糖脂锚添加序列)包含在靶蛋白质的C-末端区域中才是可能的。该信号序列显示出由一组在疏水C-末端序列的上游的10-12个残基组成。在网柄菌属中，特异性蛋白质显示出被GPI锚定。把C-末端序列抗原决定簇限定为这些蛋白质之一，即接触位点A(Noegel，A.，Gerisch，G.，Stadler，J.和Westphal，M.，(1986)，EMBO杂志，5，1473-1476)。转移进多肽的GPI锚可通过特异性磷脂酶(GPI-磷脂酶C或D)裂解，导致如通过特定的去垢剂TX-114的不同分隔检测的蛋白质疏水性质的修饰。
因此，按照本发明，所述重组DNA载体包含衍生自盘基网柄菌接触位点A的糖脂锚添加序列。
本发明还提供了产生针对多肽的一种或多种表位的抗体的方法，该方法包括用本发明的多肽免疫合适的宿主(例如哺乳动物)并在随后可有可无地分离由此产生的多肽。作为替代物可以使用全血清。优选地，免疫的多肽采取表达多肽的宿主细胞的全细胞裂胞产物形式。
在本发明中的一个例子是，通过注射表达葡基磷脂酰肌醇锚定的CSP网柄菌属的全细胞溶胞产物引发小鼠中的免疫反应。而且，特异性的免疫反应只有当CSP表位和GPI连接时获得，显示出免疫反应的加强。
本发明还涉及免疫哺乳动物宿主的疫苗。该疫苗包括以免疫保护量存在的本发明的修饰多肽以及合适的赋形剂。免疫保护量包括，例如，大约1-5×107，特别是2×107个用编码所说的多肽和糖脂锚添加序列之载体转化的宿主细胞的多肽含量。
下列实施例用来说明本发明，但是不应被认为是对其范围的限制。
实施例1.引言下列实施例教导了通过把糖脂锚添加进盘基网柄菌并用于免疫用药制度的修饰的Plasmodium falciparumCSP的产生方法。详细地说，通过在粘液霉菌盘基网柄菌中融合前导肽与衍生自网柄菌属接触位点A的葡基-磷脂酰肌醇(GPI)添加信号序列表达CSP多肽。
用表达这种GPI修饰多肽的网柄菌属全细胞溶胞产物免疫小鼠。产生的抗体识别多肽的两个不同的区。这样，GPI修饰多肽可在网柄菌属细胞中表达。分离形式的多肽和包含多肽的细胞可用于具有免疫、诊断性试验或基础研究潜力的免疫方案。
2.材料和方法下列实验中使用的方法由许多熟知的并对分子生物学、蛋白质化学和免疫学领域的技术人员来说易于操作的技术组成。并非总是详尽描述这样的方法。
酶从商业来源获得并按照供给者的方案使用。
细菌培养基和当前的克隆技术在Sambrook等(分子克隆实验室手册，CSH出版社，1989)中有描述。
单克隆抗体和NANP从F，Sinaglia(Beffman La Roche有限公司，巴塞尔)获得。
3.包含质粒的CS的构建3.1.pEDII-CS 49表达载体pEDI-CS由包含对在原核宿主中繁殖和保持重要的元件(复制起点和氨苄青霉素抗性基因)的pVEII载体(Maniak和Nellen，(1990)，核酸研究，18，5375)和编码赋予真核细胞遗传霉素(G418)抗性的Tn903编码的新霉素抗性基因(在网柄菌属肌动蛋白15转录单位的控制之下)组成。Discoidin1启动子的存在使得可以进行下游序列以及肌动蛋白8序列表达的发育控制，确保RNA的正确终止。
为了pEDI-CS表达载体的构建，首先把CS NF54基因的HaeIII+RsaI的1161bp限制片段(Caspers，P.，Gentz，R.，Matile，H.，Pink，J.R.和Sinigaglia，F.，(1989)，Mol.Biochem.Parisitol.，35，185-189)在通过Klenow DNA聚合酶填补之后插入到pVEII的Asp718+BamHI位点中。随后在Applied Biosystem Model，380B DNA合成仪上合成编码接触位点A(CsA)前导肽加上3种氨基酸的序列的DNA链。合成的前导肽的核苷酸序列如下5-ATGTCTAGATTTTTAGTATTGATAATATTATATAATTTTAAATAGTGCACATTCAGCTCCAACCCAGGATCCATG-3并通过把平末端片段在SmaI位点导入M13mp18复制形式中、然后进行DNA测序确认。
然后分离包含GsA前导肽的XbaI/BamHI限制片段并插入存在于所说载体中的XbaI/BamHI位点上，以产生表达载体pEDII-CS。在pEDII-CS表达载体中，用UAA终止密码子替代CSP的天然UAG终止密码子。通过使用如下的寡核苷酸通过DNA片段扩增替代大多数CSP编码区完成这一步骤5扩增引物(置于CsA前导肽序列下游并包含BamHI位点)
5-ACCCAGGATACCCTTATTCCAG-33-扩增引物(与CSP基因的最后密码子相对应但包含UAA终止密码子和SacI位点)5-AAAGCCGAGCTCTTAATTAAGGAACAAGAAGGATAAT-3这些寡核苷酸携带特异性限制位点BamHI和SacI，它们也存在于pEDII-CS中并用于替代pEDII-CS的CSP基因片断。使用这种策略，我们获得了表达载体pEDII-CS49，其产生具有其最初的C-末端多肽的CSP蛋白质。
3.2.pERIV-CS为了表达CSP的GPI修饰形式，构建质粒pERIV-CS。该质粒源自自身衍生自pERII的pERIV，pERII是网柄菌属ras ras启动子片段、CsA信号肽、肌动蛋白6终止序列和neoR盒在pGEM3载体中的组合。所说neoR盒包含网柄菌属肌动蛋白15启动子、细菌Tn903抗性基因、网柄菌属肌动蛋白15终止序列，采用EcoRV将其从pDneo2(Witke，W.和Nellen，A.(1987)，EMBO杂志，4143-4148)分离并插入到PGEM3(Promega公司)中。然后把得自pERI-CS的网柄菌属ras启动子-CsA信号肽片段(Fasel等，同上)插入EcoRI和BamHI位点之间。首先把提取自pDneo2的肌动蛋白6终止序列克隆进pGEM4(Promega公司)的HindIII位点中以提供第二个BamHI位点，然后再分离并将其插入到定位于CsA信号肽后的BamHI位点中。包含正确的方向的肌动蛋白6终止序列的构建体称为PERII。通过EcoRV+XhoI消化该质粒，使用适当的位点插入通过编码葡基磷脂酰肌醇锚添加序列之区域的扩增获得的DNA片段。用于扩增的两种寡核苷酸具有下列序列5扩增引物(包含EcoRV位点)5-CCCGGTACCAGGCCTGATATCTCCAACTCCAACTGAAAC-33扩增引物(包含XhoI位点)5′-CGGCTCGAGTTAAATTAATAAAACAAAAGAAATG-3′用Asp718+EcoRV消化pERIV质粒并插入CSP NF54等位基因。通过使用下列扩增引物扩增获得CSP DNA(包含CSP基因但不包含N-末端信号肽和C-末端疏水CSP编码片断)5扩增引物(包含Asp718位点)
5′-CCCGGTACCATTATTCCAGGAATACCAGTGC-3′3′扩增引物(包含可与EcoRV位点融合的HaeIII位点)5′-ATAGGCCACATTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3在以Asp718和HaeIII消化之后，在pERIV的Asp718和EcoRV位点之间插入扩增的DNA。获得的质粒定名为pERIV-CS。
4.网柄菌属细胞的培养、转化与表达网柄菌属在HL-5培养基上于振荡悬浮液中培养至5×106细胞/ml并在PDF(衬垫稀释液体)中饥械(Sussman，M.，(1987)，细胞生物学方法(Spudich，J.A.，ed.)，pp9-29，学术出版公司，Orlando，FL)。通过电穿孔导入各种载体，如在(Nellen，W.和Firtel，R.A.(1985)，基因，39，155；Howard，P.K.，Ahern，K.G.和Firtel，A.(1988)，核酸研究，16，2613-1623)中所述选择表达细胞。
对于Discoidin I启动子依赖性表达，除非特别指出，将盘基网柄菌细胞以5×106细胞/ml的密度于PDF中在振荡悬浮液(160rpm)中饥饿4小时(Fasel等，同上)。
对于ras启动子构建体，除非特别指出，将细胞在PDF中以大约5×106/ml饥饿6小时，通过添加200μM和10nM的DIF(分化诱导因子)(Morris，H.R.，Taylor，G.W.，Massento，M.S，Jermyn，K.A.，Kay，R.R.(1987)，自然，328，811)一小时诱导转录(Louvion，J.F.，Scholder，J.C.，Pinaud，S.，和Reymond，C.D.，(1991)，核酸研究，19，6133-6138)。
5.蛋白质分析通过10％SDS-PAGE分离(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，NY)在1×Laemmli缓冲液中煮沸5分钟的得自2×106个细胞(每4mm宽的槽)的蛋白质。将蛋白质电转移到硝化纤维膜上(Immunoblots)。把50μg/ml的抗NANP单克隆抗体(Sp3E9)(Boulanger，N.，Matile，H.和Betschart，B.(1988)，Acta.Tropica，45，55-65)添加到滤膜上并在室温下温育过夜。使用碱性磷酸酶缀合的蛋白质和化学发光反应(Amersham)来揭示抗NANP结合。
6.GPI-磷酸脂酶D测定通过在20mM Tris/HCl pH 7.5、0.1M CaCl2、0.008％TX-100中由四个周期的冻结和解冻裂解细胞试验用GPI修饰的CSP的GPI-PLD敏感性。添加1或5个单位的GPI-PLD酶(Boehringer Mannheim)并在37℃下温育提取物1小时。然后把在包含1mM EDTA的1×TBS中的TX-114添加至1％的最终浓度，分离水相和去垢剂相。把样品溶解在10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶中并如上所述使用Sp3E9单克隆抗体通过免疫印迹进行分析。
7.ELISA通过ELISA测定产生抗N-末端(氨基酸22-125)、NANP重复肽或C-末端(氨基酸289-390)片断肽的血清和单克隆抗体。简言之，乙烯平板以不同的肽涂覆、以在PBS中的1％BSA洗涤并封闭。用包含0.05％的Tween 20的1％BSA/PBS系列稀释单克隆或血清抗体。把稀释血清添加到抗原涂覆的孔中并在室温下温育1小时。以包含0.05％Tween 20的PBS洗涤平板，添加过氧物酶-缀合的物种特异性的抗IgG的适当的稀释液并在室温下温育1小时。把100ml的过氧物酶底物溶液添加到每个孔中，并测定A410。设计小鼠血清的ELISA滴度以便血清稀释液产生比对照小鼠的平均值大2D的吸光度值。
8.动物的免疫和抗血清分析把两倍25μl或一倍50μl 1∶1的不完全弗洛因德佐剂和2×107个细胞的声处理的混合物分别皮下或腹膜注射进Balb/C小鼠中。4周之后，用等同的物质进行加强免疫，再10天后收集血清并通过ELISA分析。
9.结果对于活疫苗或诊断性试验的开发，表达经GPI修饰的CSP。这样，用包含GPI锚定结构域的接触位点A(CsA)的最后49个氨基酸替代CSP-末端疏水片段(最后23个氨基酸)(Noegel等，同上)(
图1A和B)。在ras启动子的控制下插入CSP/GsA融合基因(Louvion等，同上，Fasel等，同上)。把构建体导入盘基网柄菌细胞(pERIV-CS)。使用抗CSP抗体的免疫荧光用来在pERIV-CS细胞表面确定CSP的存在(数据未显示)。由于ras启动子的使用，仅诱导细胞的20％至40％显示出表达，这是那些分化成预茎细胞(prestalk)的细胞(Reymond，C.D.，Gomer，R.H.，Mehdy，C.和Firtel，R.A，(1984)39，141-148)。
在盘基网柄菌中产生的CSP/CsA融合蛋白具有预期为GPI修饰蛋白质的两亲特征(Bordier，C.(1981)生物化学杂志，256，1604-1607，Conzelmann，A.，Spiazzi，A.，Hyman，R.和Bron，C.(1986)，EMBO杂志，5，3291-3296)，因为它在TX-114去垢剂相中分配(图2)。为了确定在CSP/CsA融合蛋白质上GPI锚的存在，通过在0.008％TX-100中冻结和解冻的3个周期溶解，用1或5单位的GPI-PLD处理细胞溶胞产物1小时。CSP/CsA的脂部分用5单位的GPI-PLD除去改变了它的疏水特征并使其分配进水相(图2)，但是与1单位的GPI-PLD温育的效果有限。这些结果表明了在网柄菌属细胞中表达的CSP上存在GPI结构，这表明盘基网柄菌可通过添加GPI锚产生、加工和修饰异源的寄生虫蛋白质。
为了评价GPI修饰的CSP引起免疫反应的能力，用和不完全弗洛因德佐剂混合的2×107个全细胞皮下或腹膜免疫8只Balb/C小鼠。在第二次注射之后十天，通过抗得自CSP的不同区域的合成肽的ELISA分析体液免疫反应(表1)。检测抗体的抗优势免疫的NANP重复区、抗C-末端非重复区(氨基酸289-390)、但不抗N-末端22-125合成肽。有趣的是，特异性抗体的存在和抗体滴度不受注射路线的影响(表1)。对照实验小鼠用表达通过pEDII-CS49合成的CSP的网柄菌属细胞注射。在这种情况下，CSP具有其最初的肽C末端片段，而且不受GPI锚修饰。在ELISA中检测了不针对抗CSP不同片断的抗体(表2)。
10.图例图1环子孢子蛋白质(CSP)表达载体A.在正文中给出了这两种载体产生的详尽描述。简言之，把缺乏其最初18个氨基酸的CSP符合读框地融合到CsA前导肽中，形成pEDII-CS，最初的Plasmodium falciparumUAG替代UAA导致构建体pEDII-CS 49的形成。pERIV-CS得自pERII(参见正文)，在这种pERII中在肌动蛋白15启动子和终止序列之间包含Tn5 neoR基因。CsA蛋白质的GPI锚定结构域在CSP的C-末端在读框中被替代(参见图B)。符号“Discoidin I”和“ras”是在网柄菌属中促进转录的序列。箭头表明转录起始位点。I、II和III表明了高度保守的CSP区域。
B.在pERIV-CS中，用CsA蛋白质的最后49个氨基酸替代CSP疏水结构域。在CSP(划线的)和CsA序列之间的克隆期间添加另外的脯氨酸(P)。
图2.在盘基网柄菌细胞中表达的CSP的磷脂修饰用1单位(道1)或5单位(道2)的GPI-PLD处理从大约2×106个细胞中提取的蛋白质一小时，进行TX-114相分离(Bordier，同上)，并通过免疫印迹分析。简言之，水解稳定转化的细胞并通过SDS PAGE分离，把蛋白质转移到硝化纤维膜上。通过使用(NANP)50单克隆抗体Sp3E9的免疫检测显示CSP。使用分子量标准估计CSP的表观分子量(62kDa)。分子量标准如下磷酸化酶b(97kDa)，牛血清蛋白(66kDa)，卵清蛋白(42.7kDa)。Aq水相，TxTX-114去垢剂相。0不用GPI-PLD处理的样品。
11.表表1以(NANP)50、M1(189-390)肽免疫的小鼠的pERIV-CS血清a的ELISA。
a血清在在用2×107个细胞免疫的Balb/C小鼠单次加强之后7天获得b小鼠皮下(sc)或腹膜(ip)免疫c对照动物仅以不完全弗洛因德佐剂注射表2以(NANP)50、M1(289-390)和M2(22-125)肽免疫的小鼠的pEDII-CS 49血清a的ELISA
a血清在用2×107个细胞免疫的Balb/C小鼠单次加强之后7天获得b小鼠皮下(sc)或腹膜(ip)免疫c对照动物仅以不完全弗洛因德佐剂注射
权利要求
1.显示出提高的免疫原性的重组多肽，该重组多肽包含葡基-磷脂酰肌醇结构。
2.如权利要求1所要求的多肽，其中所说的多肽是一种抗原。
3.如权利要求2所要求的多肽，其中所说的抗原是一种寄生虫多肽。
4.如权利要求3所要求的多肽，其中所说的寄生虫抗原是Plasmodiumfalciparum多肽。
5.如权利要求4所要求的多肽，其中所说的Plasmodium falciparum抗原是环子孢子蛋白质(CSP)或其修饰蛋白质。
6.表达如权利要求1-5之任一所要求的多肽的重组DNA载体，该载体包含编码所述多肽的DNA序列，该DNA序列可操作地和定位在其下游的糖脂锚添加序列连接，合适的转录起始和终止序列以及可有可无的前导肽序列都可操作地与其连接。
7.如权利要求6所要求的重组DNA载体，其中所说的DNA序列编码寄生虫抗原。
8.如权利要求7所要求的重组DNA载体，其中所说的寄生虫抗原是Plasmodium falciparum抗原。
9.如权利要求8所要求的重组DNA载体，其中所说的Plasmodiumfalciparum抗原是环子孢子蛋白质(CSP)或其修饰蛋白质。
10.如权利要求6-9之任一所要求的重组DNA载体，其中所说的糖脂锚添加序列源自盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)接触位点A。
11.包含如权利要求6-10之任一所要求的重组DNA载体的重组宿主细胞。
12.如权利要求11所要求的重组宿主细胞，其中所说的宿主是网柱菌亚纲宿主。
13.如权利要求12所要求的重组宿主细胞，其中所说的网柱菌亚纲宿主是网柄菌属(Dictyostelium)物种，具体来说是盘基网柄菌。
14.诱导针对多肽的一种或多种表位的免疫反应的方法，该方法包括用如权利要求1-5之任一所要求的多肽免疫哺乳动物宿主，尔后分离由此产生的抗体。
15.如权利要求14所要求的方法，其中所说的用于免疫的多肽采用表达所述多肽的宿主细胞的全细胞裂解物形式。
16.用于产生如权利要求1-5所要求的修饰多肽的方法，该方法通过用如权利要求6-10所要求的合适载体转化合适的宿主细胞，在使得所说的多肽可以表达的环境之下培养细胞并可有可无地分离所说的多肽。
17.一种疫苗，该疫苗包含免疫保护量的如权利要求1-5之任一所要求的多肽和合适的赋形剂。
18.如权利要求17所要求的疫苗，其中所说的免疫保护量包括大约1-5×107，特别是2×107个如权利要求11-13中所要求的宿主细胞的多肽含量。
全文摘要
本发明涉及显示出提高的免疫原性的重组体多肽,该重组多肽包含葡基胺—磷脂酰肌醇结构。所述多肽是例如抗原,如寄生虫多肽,特别是Plasmodium falciparum多肽,如环子孢子蛋白质(CSP)。本发明还涉及用于表达多肽的重组DNA载体、诱导针对所述多肽的一种或多种表位的免疫反应的方法以及用于产生包含所说多肽的修饰多肽疫苗的方法。
文档编号C07K14/435GK1187851SQ96193455
公开日1998年7月15日 申请日期1996年4月25日 优先权日1996年4月25日
发明者N·J·法塞尔, C·D·雷蒙德 申请人:Rmf迪克塔吉恩有限公司