专利名称：：具酶活性的重组羧肽酶b的生产的利记博彩app这是于1995年1月25日提交的美国申请系列08/378,233号的部分继续，其内容在此引入作为参考。
背景技术：
：本项说明中各种发表文章均以括号内的阿拉伯数字引入作为参考，这些参考文献完全的引用可于本说明书末尾，权利要求之前找到。这些发表的公开内容整体作为参考文献引入本项说明，以便更完全地描述本发明相关的技术状况。天然存在的羧肽酶B[肽酰-L-赖氨酸(-L-精氨酸)水解酶EC3.4.17.2]是一种含锌的胰外肽酶，它可特异地从肽链中去除C端的精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸(1，2)。天然存在的大鼠羧肽酶B是从一种前体蛋白，羧肽酶原B(PreprocarboxypeptidaseB)产生的。此蛋白含有一个108个氨基酸长的N-末端片段，包括一段信号序列(13个氨基酸)和一段活性肽部位(95个氨基酸)。羧肽酶原B是没有酶活性的。在羧肽酶原B转运到内质网的过程中，信号肽被切掉。得到的不具酶活性的羧肽酶原B前体由细胞分泌出来，然后通过胰蛋白酶将活性肽切离形成具酶活性羧肽酶B(7)。成熟的大鼠羧肽酶B包含307个氨基酸(5)，分子量为35kD。它含有7个半胱氨酸残基，其中6个配对形成二硫键。羧肽酶B在商业和研究上均有广泛用途，比如生产胰岛素和其他生物活性多肽，以及蛋白质序列分析。商业上从猪的胰腺纯化而得的羧肽酶B非常昂贵，而且并不完全去除其他蛋白酶。猪羧肽酶原B(ProcarboxypeptidaseB)前体的部分氨基酸序列和牛羧肽酶B的全部氨基酸序列已经发表(3，4中分别可见)。而且，大鼠基因和人类基因cDNA的全长核苷酸序列亦已经发表(5，6分别可见)。Yamamoto等(6)曾报导缺失活性肽部位的起始11个氨基酸，不具酶活性的人羧肽酶原B的重组体表达。他们亦报道了不具酶活性的β-半乳糖苷酶-羧肽酶原B融合蛋白的重组体表达，其中羧肽酶原B缺失活性肽的起始11个氨基酸。欧洲公开588118号A2公开了一种骨相关的羧肽酶样蛋白，名为OSF-5。据推测OSF-5作为一种粘附分子或生长因子起作用，并可用作治疗骨代谢疾病的药物。然而，没有任何OSF-5实际功能或活性的报道，亦没有任何天然存在或重组的具生物活性的蛋白的生产得到证实。本发明公开了重组的、高度纯化的、具酶活性而且并不昂贵的羧肽酶B的生产。具酶活性的羧肽酶B的生产以前从未见报道，因而此处公开的内容是全新的。发明概述本发明提供了一种生产具酶活性的羧肽酶B的方法，包括将一种含有编码羧肽酶原B的DNA的重组体细胞处理，使得此DNA指导羧肽酶原B的表达，再从这些细胞中回收羧肽酶原B，然后在羧肽酶原B可折叠的条件下处理回收的羧肽酶原B，再将折叠的羧肽酶原B酶切以产生具酶活性羧肽酶，并且纯化此具酶活性的羧肽酶B。本发明进而提供了具酶活性羧肽酶B。附图简述图2和图3所示的质粒限制性酶切图谱并不代表位于质粒上的所有限制性酶切位点。然而，对于完全理解本发明所需的限制性酶切位点全部表示出来了。图1大鼠胰腺羧肽酶原B的氨基酸和相应的cDNA核苷酸序列显示了大鼠胰腺羧肽酶原B的cDNA核苷酸序列和相应的氨基酸序列，以及成熟的羧肽酶B的核苷酸序列和活性肽的核苷酸序列。该DNA序列与Clauser等(5)发表的DNA序列有4个核苷酸不同；其中两个导致了氨基酸的改变Lys14→Asn和Arg142→Asp。亦显示了克隆中(实施例1)使用的三种引物的DNA核苷酸序列(较大的字体)羧肽酶原B5′末端引物，成熟羧肽酶B5′末端引物和3′端引物。根据与来源于牛胰(10，12)的羧肽酶A同源性对氨基酸进行编号，其中成熟的大鼠羧肽酶B的第一个氨基酸(Ala)计为4号。星号(*)指示与羧肽酶A比较，大鼠羧肽酶B带有的额外的氨基酸(Leu)。图2质粒pCPB和质粒pCPB-C的构建质粒pABN用内切酶BamHI和NcoI消化，其2500bp的片段被分离并与BamHI-NcoI消化的羧肽酶BcDNA的940bp长度的片段(如实施例1中所述获得)连接。新产生的质粒命名为pCPB，用来转化大肠杆菌4300。质粒pCPB用BamHI和NdeI消化以分离大片段，质粒pCPB亦被AseI和ScaI消化以分离大片段。这两个大片段与5′端磷酸化的寡核苷酸混合形成异源的链体，其中该寡核苷酸是用聚合酶-连接酶缓冲液(5×缓冲液32.5mMTris-HClpH7.5，40mMMgCl2，5mM2-巯基乙醇，0.5MNaCl)通过定点突变制备的(实施例1)。将混合物煮沸变性DNA链，然后缓慢冷却变性DNA。反应产物用电穿孔法来转化大肠杆菌1645。转化子通过在含氨苄的LB琼脂培养生长，并通过用制备突变的5′端磷酸化的寡核苷酸片段进行原位的克隆差异杂交来筛选。从阳性克隆中提取质粒DNA，经过限制性酶切分析和DNA核苷酸序列分析后，选出一种含有突变的SpeI位点克隆。新获得的质粒命名为pCPB-C，它编码在290位氨基酸发生了半胱氨酸变为丝氨酸的突变的羧肽酶B。质粒pCPB-C用来转化大肠杆菌4300。图3质粒pProCPB-C和质粒pλProCPB的构建如实施例1中所述获得的羧肽酶原B的cDNA，用NdeI和ClaI酶切以分离760bp片段，它编码活性肽部分和部分羧肽酶B。质粒pPCB-C用BamHI和ClaI酶切以分离760bp片段，它编码羧肽酶B的剩余部分，包括Cys290→Ser突变。质粒pAB用NdeI和BamHI酶切以分离2500bp片段，该片段编码所有在细菌中表达必需的元件。(见实施例1)。以上三种片段被连接，新获得的质粒命名pProCPB-C。质粒pProCPB-C和pPCB用StuI和XhoI酶切，一个3700bp的片段以质粒ProCPB-C中分离，此片段编码所有在细菌中表达所需元件(实施例1)，整个活性肽和部分羧肽酶B。一个440bp的片段从质粒pCPB中分离，此片段编码羧肽酶其余部分。这两个片段被连接，新形成的质粒命名为pλProCPB。图4重组体羧肽酶B和天然羧肽酶B的活性比较商业上可得的猪羧肽酶B(Sigma)和如实施例5中所述制备的重组体羧肽酶B的活性根据Folk的方法(11)，以马尿酰-L-精氨酸为底物来测定。催化反应的Vo利用浓度为0.025-1.0mM的底物测得。发明详述质粒pλProCPB贮存在大肠杆菌中，按照并满足布达佩斯条约关于国际认可的用于专利程序的微生物的保藏的要求，1994年8月4日以保藏号69673在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，ATCC位于马里兰州20852，Rockville，ParklawnDrive12301。此处所用的“CPB”表示通过重组体DNA方法或其他方法制备的一种多肽，它具有相同或基本上相同的任何天然存在的哺乳动物羧肽酶B的氨基酸序列。因而，术语CPB包括与天然羧肽酶B有一个或多个氨基酸，优选不超过大约10个氨基酸的差异的多肽。此处所用的“ProCPB”表示通过重组体DNA方法或其他方法制备的一种多肽，其带有相同或基本上相同的任何天然存在的哺乳动物羧肽酶原B的氨基酸序列。因而，术语ProCPB包括与天然的羧肽酶原Bs有一个或多个氨基酸，优选不超过大约10个氨基酸的差异。本领域技术人员可轻易决定利用已建立的大众所知的方法，哪些氨基酸残基可被加入，缺失或替换(包括用哪些氨基酸替换)。这些方法包括，比如常规用于设计和制造编码多肽的细菌表达的DNA；用定点突变技术对cDNA的修饰和基因组序列的修饰；重组体蛋白和表达载体的构建；细菌的多肽表达；以及用常规的生化分析法测定多肽的生化活性。此处所用的一种“具酶活性”CPB指具有天然存在的哺乳动物羧肽酶B的生物活性的CPB。为了此定义的目的，天然存在的羧肽酶B的生物活性即其特异性地去除肽C末端精氨酸、赖氨酸、或鸟氨酸的能力。基本上同样的氨基酸序列在此处定义为与同源的或同等的序列相比，其带有氨基酸序列上的替换和/或缺失和/或增加，并可包含此类氨基酸高达10个残基。此同源或同等的序列多处可见描述，比如Lehniger，《生物化学》第二版，WorthPub.，N.Y(1975)，第4章；Creighton，《蛋白质结构，一种实用的方法》IRLPressatOxfordUniv.Press，Oxford，England(1989)；Dayhoff，《蛋白质序列和结构图片集》5卷，国家生物医学研究基金会，Maryland(1972)，第九章。此类氨基酸替换是本领域技术人员所熟知的。在一个优选的实施方案中，编码ProCPB或CPB的DNA可从人、大鼠、牛或猪获得。此DNA可通过逆转录，聚合酶链式反应(PCR)，合成或半合成法，或通过一种以上此类方法，或通过其他本领域技术人员知道的方法得到。编码ProCPB或CPB多肽的DNA可通过本领域技术人员熟知的方法致突变，比如，Bauer等(1985)，《基因》3773-81。突变的序列可被插入到此处所述合适的载体中，将此载体转入细胞中，通过处理使得突变的DNA指导多肽的表达。本领域的技术人员都知道与本申请相关的保藏的质粒可轻易地用已知技术(例如用定点突变或接头插入法)改变，以编码一种多肽表达。此类技术已有描述，例如SambrookJ.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)《分子克隆，实验指南》第二版，冷泉港实验室出版社。可用于表达编码CPB或ProCPB的核酸的载体为病毒，如细菌病毒，例如细菌噬菌体(如λ噬菌体)；粘粒；质粒和其他载体。编码ProCPB或CPB的cDNA用本领域熟知的方法插入到合适的载体中，例如，利用限制性内切酶位点，插入体和载体DNA均通过酶切产生互补末端，其碱基互相配对，然后用一种DNA连接酶连在一起。另外，带有与载体DNA限制性位点互补的碱基序列的合成的接头可被连接到插入段DNA上，然后再用切割此位点的限制性内切酶消化。其他方法亦是可行的。本发明的载体包含的一段编码ProCPB或CPB的序列可在原核和真核宿主细胞的范围内表达，例如，细菌、酵母、真菌、细菌细胞或哺乳动物细胞如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、鸡胚细胞、成纤维细胞、肾细胞或其他已知细胞系。这些载体进一步还包括在宿主细胞内表达克隆的基因所必需的调节元件，定位在编码ProCPB或CPB的核酸附近，以便影响其表达。表达必需的调节元件包括启动子和操纵子序列以及一个核糖体结合位点。例如，一种细菌表达载体可能包括诸如λPLOL或deo启动子之类的启动子操纵子序列。为了启动翻译，可能需要利用核糖体结合位点λCII或deo。此类载体可通过商业途径获得，亦可通过本领域所周知的方法由已知序列组装而成，例如1989年5月16日授予并共同受让(co-assigned)的美国专利4,831,120号和1992年9月1日授予并共同受让的美国专利5,143,836号，均公开了有关λPL启动子的方法；而1989年2月22日公布，并共同受让的欧洲专利申请公开号303,972亦公开了有关deo启动子的方法。其他适宜的元件比如阻遏物(repressor)和增强子亦可能存在。本领域的技术人员都知道怎样针对不同的表达系统，使用合适的调节元件。本发明的表达质粒包括适宜的调节元件，它们定位在质粒上与编码ProCPB或CPB多肽的DNA邻近的部位，以便在适宜的宿主细胞内影响ProCPB或CPB多肽的表达。此类调节元件为启动子和操纵子，例如deoP1P2和λPL；以及核糖体结合位点，如deo和CII；同时还包括阻遏物和增强子。在本发明的优选实施方案中，调节元件定位在编码ProCPB或CPB的DNA上游邻近部位。本发明的质粒还包含ATG启动子。编码ProCPB或CPB的DNA与ATG启动子同相。本发明的质粒亦包含一段DNA序列，此序列含有一个来源于一种可在宿主细胞内自主复制的细菌质粒的复制起点。适宜的复制起点可从许多来源得到，比如质粒pBR322(ATCC保藏号37017)。本发明的质粒亦含一段具有与选择或鉴定表型特征有关的基因的DNA序列。当质粒存在于宿主细胞内时这种特征即呈现出现，如一种抗药基因，像抗氨苄青霉素，氯霉素或四环素。优选的细菌寄主细胞为大肠杆菌细胞，一种合适的大肠杆菌的例子是菌株4300，但其他大肠杆菌菌株和其他细菌亦可用作质粒的宿主。用作宿主的细菌可是任何菌株包括营养缺陷型(如A1645)，原养菌(如A4255)，和溶解菌株；F+和F-菌株；带有λ原噬菌体的cI857阻遏物序列的菌株(如A1645和A4255)以及缺少deo阻遏物和/或deo基因的菌株(见欧洲专利申请公布号0303972，1989年2月22日公布)。大肠杆菌菌株4300已保藏在ATCC保藏号69363。所有上述的大肠杆菌宿主菌株均可通过本领域熟知的方法“去除”它们所携带的质粒，例如R.P.Novick所描述的溴化乙锭法，《细菌学综述》33，210(1969)。本发明提供了一个生产具酶活性CPB的方法，它包括处理一种带编码ProCPBDNA的重组体细胞，使得此DNA指导ProCPB的表达，从细胞中回收表达的ProCPB，在ProCPB可折叠的条件下处理回收的ProCPB，然后把回收的ProCPB用酶切分裂以产生具酶活性的CPB，并纯化此具酶活性的CPB。在一个优选方案中，从重组体细胞中回收ProCPB包括破坏重组体细胞的细胞壁或其片段以产生细胞裂解产物，离心分离细胞裂解产物中的胞内沉淀物质，然后在合适的缓冲液中溶解胞内沉淀物质。在另一个实施方案中，处理回收的ProCPB，包括在室温，pH9-9.5左右孵育ProCPB约20-40小时。在又一个实施方案中，处理回收的ProCPB包括在室温、pH9-9.5左右、有ZnCl2、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽存在的条件下，孵育ProCPB约20-24小时。设计的将折叠的ProCPB酶切分裂包括调整pH至8.5左右，并用胰蛋白酶在37℃，作用60分钟来切割ProCPB。进一步设计的纯化具酶活性的CPB包括离子交换层析法。本领域技术人员应该清楚的是任何离子交换层析法均可利用。一种弱的阴离子交换柱如DEAE-琼脂糖列为优选。弱的阴离子交换柱经常含有一个叔胺的功能基团(二乙基铵乙基)，但是亦可使用季铵乙基或季铵。柱的基质可基于无机化合物、合成树脂、多糖或有机聚合物；可能的基质有琼脂糖，纤维素，三丙烯酰基(trisacryl)，葡聚糖，玻璃珠，环氧乙烷丙烯酸珠，丙烯酰胺，琼脂糖/聚丙烯酰胺共聚物或亲水性乙烯基聚合物。同样设计的纯化具酶活性的CPB包括离子交换层析和疏水性层析。将为本领域技术人员欣赏的是任何疏水性柱均可使用，苯基琼脂糖为优选。功能基团可为苯基、苯甲基、辛基或丁基。基质可为上述的任一种。在另一个优选实施方案中，纯化具酶活性的CPB包括离子交换层析，疏水层析和透滤法。在一个特别的优选实施方案中，ProCPB由保藏于ATCC保藏号69673的质粒pλProCPB表达。本发明进一步提供具酶活性的CPB，没有其他哺乳动物来源的物质。实施例下面的实施例是为了帮助理解本发明而不在于，亦不应被认为是限制其范畴。这些实施例中没有对一些常规方法的详细描述，如载体构建，将编码多肽的基因插入到此类载体或将所得载体导入宿主细胞。这些实施例中亦没有对常规的用于分析此类宿主载体系统产生的多肽的方法的详尽描述。此类方法对本领域一般的技术人员来说均为熟知而且在许多出版物中都有描述，它们的内容在此以参考文献的方式引入此说明，包括以下例的方式Sambrook，J.，Fritsch，E.T.和Maniatis，T(1989)《分子克隆实验指南》第2版，冷泉港实验室出版社。实施例1用PCR方法克隆大鼠羧肽酶B的cDNAI.DNA扩增总RNA由Sprague-Dawley大鼠胰脏中提取，以总RNA中分离40μgpolyA+mRNA(通过寡聚dT-纤维素柱)获得的polyA+mRNA的等份试剂(10μg)用作逆转录反应的模板，此逆转录反应中含有一个合成的羧肽酶B3′-末端引物(5)(图1)。形成3单链互补DNA后(ss-cDNA)，用乙醇沉淀mRNA，分出等份试剂ss-cDNA用来进行PCR扩增。为了扩增编码CPB的DNA(940bp)，一个合成的与羧肽酶B3′末端相应的引物和一个合成的与成熟的羧肽酶B的5′末端相应的引物同时使用(图1)。为了扩增编码ProCPB的DNA(1230bp)，一个合成的与羧肽酶B3′末端相应的引物和一个合成的与羧肽酶原B5′末端相应的引物同时使用(图1)。PCR扩增条件如下1.3′端引物2μg2.5′端引物2μg3.ss-cDNA5μl4.缓冲液dNTP′s0.2mMTris-HCl50mMKCl20mMMgCl28mM5.Taq聚合酶I2.5单位总体积100μl6.矿物油(防止蒸发)50μl7.1个循环×[92℃1分钟；40℃2分钟和72℃4分钟]8.35个循环×[92℃1分钟；53℃2分钟和72℃3分钟]9.1个循环×[92℃1分钟；53℃2分钟和72℃15分钟]PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳分析，亦包括扩增对照和分子大小标准。观察到940bp和1230bp两个不同的带。940bp的带代表CPB核苷酸序列而1230bp带代表包含活性肽核苷酸序列的ProCPB核苷酸序列。PCR扩增后，DNA通过氯仿和酚抽提，乙酸铵和异丙醇沉淀，从反应混合物中纯化出来。II.质粒pCPB质粒pCPB(图2)的构建是通过用BamHI和NcoI消化CPBcDNA，接着凝胶电泳纯化，然后将此片段亚克隆到BamHI和NcoI消化，在2500bp的质粒pABN片段上，此质粒编码以下在细菌中表达所必需的原件(i)λPL启动子通过诱导使得基因从大肠杆菌细胞中表达，也就是将温度由30℃变为42℃，使得温度敏感的阻遏物cI857失活；(ii)deo核糖体结合位点(rbs)；(iii)色氨酸转录终止子(8)；(iv)来源于pBR322的氨苄青霉素抗性基因；和(v)pBR322复制起点。III.质粒pCPB-C天然存在的羧肽酶B氨基酸序列包括7个半胱氨酸残基，其中6个以二硫键配对相连，一个(Cys290)为游离半胱氨酸残基(1)。我们相信此游离半胱氨酸残基在重组体CPB再折叠过程中会形成不必要的分子间或分子内的二硫键。Cys290既不位于催化位点亦不位于羧肽酶底物结合位点，因而显然不是酶的活性所需(1，2)。所以我们决定生产一种此半胱氨酸为丝氨酸取代的CPB，此CPB命名为CPB-C。合成一个含有2个核苷酸替换的5′末端磷酸化的寡聚核苷酸ThrCys......ACCTGT......羧肽酶B中原始序列ThrSer5′ATCCGCCAGACTAGTGAGGAGACAATG3′突变序列SpeI此寡聚核苷酸是为了通过图2中所描述的定点突变的方法，将质粒pCPB中编码Cys290的核苷酸以编码丝氨酸的核苷酸替换(9)，新得到的质粒命名为pCPB-C。IV.质粒pProCPB-C具有ProCPB-C核苷酸序列命名pProCPB-C的质粒(含有Cys290→Ser突变)被构建好，并用来转化大肠杆菌4300。V.质粒pλProCPB具有ProCPB核苷酸序列名为pλProCPB的质粒被构建好(图3)，并被用来转化大肠杆菌4300。此质粒保藏于ATCC，在ATCC保藏号69673下，1994年8月4日。质粒DNA由质粒pCPB，pCPB-C，pλProCPB，pProCPB-C制备，通过限制性酶切分析和核苷酸测序来鉴定正确序列的存在。实施例2发酵，生长条件和ProCPB与CPB的纯化I贮藏培养物带有pλProCPB质粒的大肠杆菌4300的贮藏培养物在含氨苄(100μg/ml)的LB培养基上生长。II接种物接种物在100ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液中于30℃扩增至细胞浓度为O.D.660＝2.0。生产培养液(LB培养液+氨苄(100μg/ml))接种后，30℃，孵育，通风，摇动并用NH3保持其pH为7.2。在生长过程中加入20克葡萄糖。一旦细胞浓度达到O.D.660为12，升温至42℃使ProCPB表达，2小时后，细胞浓度达到O.D.660为22-29，收获细菌。III.纯化质粒pλProCPB表达的ProCPB积聚在胞内沉淀物中，通过以下步骤分离40克(湿重)细菌团悬浮于450ml含1mMPMSF(Sigma)，50mMTris-HCl，pH8，10mMEDTA的缓冲液中，并用终浓度为50μg/ml的溶菌酶(Sigma)于37℃处理2小时。混合物用超声处理并加入TritonX-100(Merck)至终浓度为2％，于室温搅动2小时。粗胞内沉淀物通过离心沉淀(14000rpm，30min，4℃，并用水洗。含ProCPB的胞内沉淀物溶于含25mMNaCl，8M尿素，10mMDTT，20mMBis-TrispH7的缓冲液B中。溶液于缓冲液B平衡的DEAE-琼脂糖快速柱中层析，蛋白质用100mMNaCl的缓冲液B洗脱，ProCPB在0℃，用40％饱和的(NH4)2SO4沉淀。后来出现具酶活性的CPB只有通过生产其前体蛋白来生产。然而，开始时，多肽CPB和CPB-C均以类似于上述生产ProCPB的方式生产，ProCPB-C亦是按同样方法生产的。使用的质粒分别为pCPB，pCPB-C和pProCPB-C(如实施例1中所述)，带有这些质粒的大肠杆菌的生长条件和多肽的纯化方法基本上与上述ProCPB的方法一致，只是用于溶解含重组CPB或CPB-C的胞内沉淀物的缓冲液含有pH9，20mM乙醇胺，10mMDTT和8M尿素。值得注意的是在每一个方案中，如上述所生产和纯化的多肽均无酶活性。为了产生具酶活性的蛋白，多肽的折叠在实施例3中叙述。实施例3ProCPB-C的折叠和活化多肽CPB和CPB-C按实施例2生产，但发现没有酶活性，使用已知的折叠方法(如下所述)亦得不到具酶活性蛋白质。为了解决得不到具酶活性蛋白这个问题，发展了另一个方法，包括前体蛋白的表达和折叠，然后处理以释放(remove)折叠的前体蛋白的活性肽部份。这样产生了如下的步骤。按实施例2所生产的ProCPB-C，以10mg/ml浓度溶于8M尿素、5mMHCl并用100mM甘氨基、0.2mMZnCl2pH为9，10和11稀释至1mg/ml。这就是折叠溶液。室温孵育以上折叠溶液17小时来完成折叠，此时产生的ProCPB-C没有酶活性(见表I)。然后用HCl将含折叠的ProCPB-C的溶液的pH值调至8.5左右，并用胰蛋白酶(1∶200w/w)于37℃处理30分钟，释放活性肽。为了终止反应，加入PMSF至终浓度为0.1mM。如此获得的折叠的CPB-C的酶活性根据Folk(1970)(11)的方法测定一个活力单位定义为25℃时每分钟催化水解1μmol马尿酰-L-精氨酸底物，导致254nm处1厘米路径长的光吸收增加0.12的酶量。商业可得的猪的羧肽酶(Sigma)的特定的活性为230u/mg。表I不同条件下ProCPB-C(和来源于其的CPB-C)的特定活性</tables>表I指出了具酶活性的CPB-C的获得ProCPB-C折叠后，用上述的医疗条件，以胰蛋白酶处理折叠的ProCPB-C。表I进一步指出当折叠混合物的pH为9时CPB-C的特定活性比pH为10或11时要高。实施例4改进的折叠条件下列实验是为了建立最优化的折叠和活化条件。我们假定通过胰蛋白酶切的折叠的ProCPB-C所获得的CPB-C的特定活性越高，那么此ProCPB-C的折叠条件越优。除以下实验外，“仅含底物”和“商业的猪羧肽酶”用来作为对照。开始，当使用0.05-0.1mg/ml的ProCPB-C在pH9.5进行折叠，结果得到了改进(如实施例3中所述)。I.温度对于ProCPB-C折叠的影响ProCPB-C的折叠如此进行在温度为10-37℃，100mM甘氨酸缓冲液，pH9.5的条件下将0.05mg/ml多肽孵育90个小时。折叠的ProCPB-C的样品用胰蛋白酶(1∶200w/w)处理，如此获得的CPB-C的特定活性用实施例3中所述方法测定。当ProCPB-C在20℃-30℃之间折叠时，获得最高的特定活性。II.氧化和还原的谷胱甘肽对ProCPB-C折叠的影响ProCPB-C的折叠如此进行在25℃，氧化和/或还原的谷胱甘肽(GSSG/GSH)或抗坏血酸(表II)存在条件下，于pH9.5、0.01mMZnCl2，100mM甘氨酸缓冲液中孵育0.05mg/ml多肽。然后，孵育过的溶液于37℃用胰蛋白酶(1∶200w/w)处理1小时，如此获得的CPB-C的特定活性在18和45小时之后测定(如实施例3所述方法)。表II在折叠溶液中存在氧化剂/还原剂时CPB-C的特定活性<>*抗坏血酸以每摩尔SH基团加2.5mol的浓度加入。表II指出共同加入GSSG和GSH急剧增加了CPB-C的特定活性，因而推测其亦增加了ProCPB-C的折叠效率。单独加入GSSG或抗坏血酸亦增加ProCPB-C的折叠，只是幅度较小。在另一系列实验中发现，在折叠溶液中加入0.1mMGSSG和0.5mMGSH时获得最理想的ProCPB-C的折叠。III.胰蛋白酶对折叠的ProCPB-C的活化建立了获得最佳活性CPB-C的方法，即将孵育的折叠溶液用胰蛋白酶1∶50w/w于37℃处理1小时切割ProCPB-C释放活性肽。IV.pH对ProCPB-C折叠的影响pH对ProCPB-C折叠的影响通过一系列在前面优化的条件下的实验来确定。ProCPB-C的折叠如此进行以0.1mg/ml浓度在100mM甘氨酸、0.02mMZnCl2、0.5mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，在不同pH值(8.75-10.00之间)下，于25℃孵育24小时。折叠的ProCPB-C样品以胰蛋白酶(1∶50w/w；溶于1mMHCl，10mMCaCl2)处理，如此获得的CPB-C的特定活性用实施例3中描述的方法测定。当ProCPB-C折叠在pH9.25进行时，获得最高的CPB-C特定活性。V.ZnCl2对于ProCPB-C折叠的影响折叠溶液中ZnCl2的浓度对于ProCPB-C折叠的影响通过一系列在前述优化条件下的实验来确定。当ZnCl2浓度比估计的CPB-C的浓度(mol/mol)高2-20倍时，产生的CPB-C的特定活性最高。当没有ZnCl2，而在折叠混合物中加入EDTA螯合掉残余二价离子时进行折叠，CPB-C的特定活性降低到零。VI.蛋白质浓度对ProCPB-C折叠的影响ProCPB-C的折叠在表III中指示的蛋白浓度下于优化的条件(如上述确定的)中进行24小时。胰蛋白酶消化后，CPB-C的活性按实施例3中所述方法测定。表III折叠溶液中蛋白质浓度作用下CPB-C的特定活性</tables>表III指出产生的CPB-C的特定活性在蛋白质浓度为0.05mg/ml时最高。VIII.折叠时间对于CPB-C特定活性的作用ProCPB-C最佳的折叠时间通过一系列在前述优化的条件下的反应来确定。ProCPB-C的折叠以0.1mg/ml浓度在100mM甘氨酸，pH9.25，0.1mMGSSG，0.5mMGSH和0.01mMZnCl2中进行。折叠的ProCPB-C样品以胰蛋白酶(1∶50w/w)处理，获得的CPB-C的特定活性按实施例所述方法，在折叠开始后的不同时间点测定(0-40小时之间)。反应开始20小时后，用胰蛋白酶切割折叠的ProCPB-C，获得最高的CPB-C活性。折叠超过20小时并不改变CPB-C的特定活性。实施例5不同CPB蛋白的折叠和活化如实施例2所述的生产和纯化的CPB、CPB-C、ProCPB和ProCPB-C分别以0.1mg/ml在100mM甘氨酸缓冲液、pH9.5、0.01mMZnCl2、0.5mMGSH、0.1mMGSSG中于室温折叠24小时，即使用的折叠条件基本上为实施例4中所建立的优化条件。每种含折叠的CPB、CPB-C、ProCPB或ProCPB-C的溶液的pH值用HCl调为8.5，然后含ProCPB和ProCPB-C的溶液用胰蛋白酶(1∶50w/w)于37℃处理1小时，释放活性肽。加入PMSF至终浓度为0.1mM来终止反应。CPB、CPB-C、ProCPB和ProCPB-C的特定活性按实施例3所述方法测定。表IV在优化的条件下折叠和活化后CPB、CPB-C、ProCPB和ProCPB-C的特定活性<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="846">折叠特定活性(u/mg)对照1-不经胰蛋白酶处理0.00-不加蛋白0.00折叠-CPB0.00-CPB-C0.08-ProCPB42.90-ProCPB-C20.90</table></tables>1对照中“无胰蛋白酶”只是针对ProCPB-C而做。表IV指出具酶活性的CPB仅仅可从表达含有活性肽前体的细胞中产生，因而，活性肽对于CPB的正确折叠是必不可少的。表IV亦指出具最佳活性的CPB通过含游离Cys290残基的ProCPB(由质粒pλProCPB表达)折叠和活化产生，而不能由含Cys290→Ser突变的ProCPB折叠和活化产生。因而，Cys290显然为最佳的折叠和/或CPB的最高活性所必需。实施例6改进的ProCPB的折叠I.来源于粗胞内沉淀物的ProCPB的折叠ProCPB最佳的折叠条件发现基本上与实施例4中确定的ProCPB-C的最佳折叠条件一致。一个简单的用于折叠和活化ProCPB的方法如此进行使用粗胞内沉淀物，省略实施例2的第III部份所述的起始纯化步骤。发现含ProCPB的粗胞内沉淀物(如实施例2中产生的)可以高蛋白浓度溶解于100mM甘氨酸，pH9.5和8M尿素溶液中(表V)。折叠在优化的条件下室温作用24小时。pH值升高到最适pH9.5(前已确定)。折叠的ProCPB用胰蛋白酶(1∶50w/w)切割，CPB的特定活性按实施例3中所述方法测定。表V含粗胞内沉淀物的折叠溶液中的蛋白浓度作用下CPB的特定活性</tables>表V指出具酶活性CPB可从来源于粗胞内沉淀物的ProCPB折叠然后胰蛋白酶消化而得。而且，此CPB在所有测定的蛋白浓度下其酸活性水平相似。这个出乎意料的结果，因为折叠前用DEAE-琼脂糖纯化的CPB(实施例2)在折叠混合物中蛋白浓度增加时，其特定活性下降。显然，胞内沉淀物含有帮助ProCPB折叠的因子。II.通过折叠来源于粗胞内沉淀物的ProCPB来扩大CPB(i)生产以42升带有质粒pλProCPB并表达ProCPB的大肠杆菌4300中纯化CPB至近乎均一。发酵和生长条件基本上与实施例2中所述一样。粗胞内沉淀物用水洗，并以20mg/ml溶解于pH9.5，100mM甘氨酸，8M尿素溶液中，用pH9.5100mM甘氨酸稀释至1mg/ml，加入0.1mMZnCl2，0.5mMGSH和0.1mMGSSG，生成的折叠溶液于25℃孵育24小时。然后用HCl调其pH值为8.5，折叠的ProCPB用胰蛋白酶(20μg/ml)于37℃消化1小时。用0.1mMPMSF灭活胰蛋白酶。(ii)纯化具酶活性的CPB以20mg每ml树脂的浓度加入到以20mMTris-HClpH8.0平衡的DEAE-琼脂糖快速柱中(Pharmacia)。CPB以pH880mMNaCl，20mMTris-HCl洗脱。硫酸铵(0.8M)加入到DEAE洗脱液中，它可在20mMTris-HClpH8，0.8M硫酸铵平衡的苯基琼脂糖快速柱(Pharmacia)中进一步层析分离。CPB被0.4M硫酸铵洗脱下来，浓缩，并对100mMNaCl，20mMTris-HCl，pH8透滤，然后贮于-20℃。在以上纯化步骤中，42升带质粒pλProCPB，O.D.660＝36的大肠杆菌4300按以上步骤处理，获得1.25升特定活性为637u/mg的具酶活性CPB。所有步骤产量为60％左右。商业上猪羧肽酶B的特定活性在同样的条件下测定为298u/mg。实施例7具酶活性CPB的特征如实施例5和6所述生产的CPB具有与猪羧肽酶B相仿的生化和酶学特征。依据其氨基酸组成所计算的重组CPB的消光系数为ε1％280＝19.7，商业的猪羧肽酶B的消光系数为ε1％280＝21.4(1)。重组CPB特定活性为637u/ml(马尿酰-L-精氨酸底物)并且根据原子吸收光谱测定，每摩尔酶含1摩尔锌原子。N-末端氨基酸序列分析揭示其为Ala-Ser-Gly-His-Ser，正如根据成熟的大鼠羧肽酶B的氨基酸序列分析(5)预计的一样。重组CPB活性的最佳pH值用25mM如下缓冲液来确定NaOAc，pH4-6；Bis-Tris，pH6-7.5；Tris-HClpH7.5-9；和甘氨酸，pH9-12。CPB特定活性依实施例3所述方法测定。pH为8时获得最好的CPB酶活性。CPB在55℃孵育导致50％的活力丢失而65℃则完全失活。用马尿酰-L-精氨酸作底物来进行重组CPB的动力学分析。底物浓度高出0.5mM时便抑制CPB活力。进一步研究揭示重组体CPB被其催化产物精氨酸抑制，精氨酸是羧肽酶B的竞争性抑制剂。相应的Lineweaver-Burk曲线显示Km值为0.38mM。重组CPB亦可被一种强二价离子螯合剂1，10-菲咯啉，因而证明Zn离子对CPB酶活性的重要性。在1mM1，10-菲咯啉存在时，可观察到1mg/ml重组CPB50％的活力丢失。实施例8CPB将胰岛素原转变为胰岛素如EP347781B1中所述的微胰岛素原(Mini-Proinsulin)可用胰蛋白酶和实施例5和6中生产的重组CPB处理，使之转变为胰岛素。胰蛋白酶特异性地在其精氨酸残基和A链之间切割。然后CPB特异地将精氨酸残基从其B链的C-端水解下来。商业的人胰岛素(Boehringer-Mannheim)可用作标准，同时胰蛋白酶和商业猪羧肽酶B切割的微胰岛素原以及胰蛋白酶单独切割的微胰岛素原亦可用作标准。参考文献1.Barrett和McDonald(1985)，《哺乳动物蛋白酶，词汇和书目》第2卷，学院出版社，Orlando，Florida。2.Coll等(1991)，欧洲分子生物学联合会杂志，101-9。3.Burgos等(1991)，生物化学304082-4089。4.Titani等(1975)，美国国家科学院院报721666-1670。5.Clauser等(1988)，生物化学杂志263(33)17837-17845。6.Yamamoto等(1992)，生物化学杂志2672575-2581。7.Aviles等(1985)，生物化学和生物物理研究通讯13097-103。8.Yanofsky等(1981)，核酸研究96647-66689.Morinaga等(1984)，生物技术，7月636-639。10.Bradshaw等(1969)，美国国家科学院院报631389-1394。11.Folk(1970)，酶学方法19504-508。12.Gardell等(1988)，生物化学杂志263(33)17828-17836。序列表(1)一般信息(i)申请人Bio-TechnologyGeneralCorp.(ii)发明题目具酶活性的羧肽酶B的生产(iii)序列数8(iv)通信地址(A)收信人Cooper&DunhamLLP(B)街道1185AvenueoftheAmericas(C)城市纽约(D)州纽约(E)国家美国(F)区号10036(v)机读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)当前申请数据资料(A)申请号未知(B)提交日期1996年1月25日(C)类别(viii)委托/代理人信息(A)姓名White，JohnP.(B)登记号28,678(C)参考/档案号0336/43847-A-PCT(ix)通讯信息(A)电话(212)278-0400(B)传真(212)391-0525(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型cDNA(iii)前提无(iv)反义无(xi)序列描述SEQIDNO1GCGCATATGCATGCTTCCGAGGAGCACTTTGATGGC36(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度285个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型cDNA(iii)前提无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置1.285(xi)序列描述SEQIDNO2CATGCTTCCGAGGAGCACTTTGATGGCAACCGGGTGTACCGTGTCAGT48HisAlaSerGluGluHisPheAspGlyAsnArgValTyrArgValSer151015GTACATGGTGAAGATCACGTCAACTTAATTCAGGAGCTAGCCAACACC96ValHisGlyGluAspHisValAsnLeuIleGlnGluLeuAlaAsnThr202530AAAGAGATTGATTTCTGGAAACCAGATTCTGCTACACAAGTGAAGCCT144LysGluIleAspPheTrpLysProAspSerAlaThrGlnValLysPro354045CTCACTACAGTTGACTTTCATGTTAAAGCAGAAGATGTTGCTGATGTG192LeuThrThrValAspPheHisValLysAlaGluAspValAlaAspVal505560GAGAACTTTCTGGAGGAGAATGAAGTTCACTATGAGGTACTGATAAGC240GluAsnPheLeuGluGluAsnGluValHisTyrGluValLeuIleSer65707580AACGTGAGAAATGCTCTGGAATCCCAGTTTGATAGCCACACCCGT285AsnValArgAsnAlaLeuGluSerGlnPheAspSerHisThrArg859095(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度95个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQIDNO3HisAlaSerGluGluHisPheAspGlyAsnArgValTyrArgValSer151015ValHisGlyGluAspHisValAsnLeuIleGlnGluLeuAlaAsnThr202530LysGluIleAspPheTrpLysProAspSerAlaThrGlnValLysPro354045LeuThrThrValAspPheHisValLysAlaGluAspValAlaAspVal505560GluAsnPheLeuGluGluAsnGluValHisTyrGluValLeuIleSer65707580AsnValArgAsnAlaLeuGluSerGlnPheAspSerHisThrArg859095(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型cDNA(iii)前提无(iv)反义无(xi)序列描述SEQIDNO4GCGCCATGGCAAGTGGACACAGCTACACCAAGTACAAC38(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)长度927个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型cDNA(iii)前提无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置1..927(xi)序列描述SEQIDNO5GCAAGTGGACACAGCTACACCAAGTACAACAACTGGGAAACGATTGAG48AlaSerGlyHisSerTyrThrLysTyrAsnAsnTrpGluThrIleGlu100105110GCGTGGATTCAACAAGTTGCCACTGATAATCCAGACCTTGTCACTCAG96AlaTrpIleGlnGlnValAlaThrAspAsnProAspLeuValThrGln115120125AGCGTCATTGGAACCACATTTGAAGGACGTAACATGTATGTCCTCAAG144SerValIleGlyThrThrPheGluGlyArgAsnMetTyrValLeuLys130135140ATTGGTAAAACTAGACCGAATAAGCCTGCCATCTTCATCGATTGTGGT192IleGlyLysThrArgProAsnLysProAlaIlePheIleAspCysGly145150155TTCCATGCAAGAGAGTGGATTTCTCCTGCATTCTGTCAGTGGTTTGTG240PheHisAlaArgGluTrpIleSerProAlaPheCysGlnTrpPheVal160165170175AGAGAGGCTGTCCGTACCTATAATCAAGAGATCCACATGAAACAGCTT288ArgGluAlaValArgThrTyrAsnGlnGluIleHisMetLysGlnLeu180185190CTAGATGAACTGGATTTCTATGTTCTGCCTGTGGTCAACATTGATGGC336LeuAspGluLeuAspPheTyrValLeuProValValAsnIleAspGly195200205TATGTCTACACCTGGACTAAGGACAGAATGTGGAGAAAAACCCGCTCT384TyrValTyrThrTrpThrLysAspArgMetTrpArgLysThrArgSer210215220ACTATGGCTGGAAGTTCCTGCTTGGGTGTAGACCCCAACAGGAATTTT432ThrMetAlaGlySerSerCysLeuGlyValAspProAsnArgAsnPhe225230235AATGCTGGCTGGTGTGAAGTGGGAGCTTCTCGGAGTCCCTGCTCTGAA480AsnAlaGlyTrpCysGluValGlyAlaSerArgSerProCysSerGlu240245250255ACTTACTGTGGACCAGCCCCAGAGTCTGAAAAAGAGACAAAGGCCCTG528ThrTyrCysGlyProAlaProGluSerGluLysGluThrLysAlaLeu260265270GCAGATTTCATCCGCAACAACCTCTCCACCATCAAGGCCTACCTGACC576AlaAspPheIleArgAsnAsnLeuSerThrIleLysAlaTyrLeuThr275280285ATCCACTCATACTCACAGATGATGCTCTACCCTTACTCCTATGACTAC624IleHisSerTyrSerGlnMetMetLeuTyrProTyrSerTyrAspTyr290295300AAACTGCCTGAGAACTATGAGGAATTGAATGCCCTGGTGAAAGGTGCG672LysLeuProGluAsnTyrGluGluLeuAsnAlaLeuValLysGlyAla305310315GCAAAGGAGCTTGCCACTCTGCATGGCACCAAGTACACATATGGCCCA720AlaLysGluLeuAlaThrLeuHisGlyThrLysTyrThrTyrGlyPro320325330335GGAGCTACAACAATCTATCCTGCTGCTGGGGGATCTGACGACTGGTCT768GlyAlaThrThrIleTyrProAlaAlaGlyGlySerAspAspTrpSer340345350TATGATCAGGGAATCAAATATTCCTTTACCTTTGAACTCCGGGATACA816TyrAspGlnGlyIleLysTyrSerPheThrPheGluLeuArgAspThr355360365GGCTTCTTTGGCTTTCTCCTTCCTGAGTCTCAGATCCGCCAGACCTGT864GlyPhePheGlyPheLeuLeuProGluSerGlnIleArgGlnThrCys370375380GAGGAGACAATGCTTGCAGTCAAGTACATTGCCAATTATGTCCGAGAA912GluGluThrMetLeuAlaValLysTyrIleAlaAsnTyrValArgGlu385390395CATCTATATTAGTGA927HisLeuTyr**400(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)长度309个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQIDNO6AlaSerGlyHisSerTyrThrLysTyrAsnAsnTrpGluThrIleGlu151015AlaTrpIleGlnGlnValAlaThrAspAsnProAspLeuValThrGln202530SerValIleGlyThrThrPheGluGlyArgAsnMetTyrValLeuLys354045IleGlyLysThrArgProAsnLysProAlaIlePheIleAspCysGly505560PheHisAlaArgGluTrpIleSerProAlaPheCysGlnTrpPheVal65707580ArgGluAlaValArgThrTyrAsnGlnGluIleHisMetLysGlnLeu859095LeuAspGluLeuAspPheTyrValLeuProValValAsnIleAspGly100105110TyrValTyrThrTrpThrLysAspArgMetTrpArgLysThrArgSer115120125ThrMetAlaGlySerSerCysLeuGlyValAspProAsnArgAsnPhe130135140AsnAlaGlyTrpCysGluValGlyAlaSerArgSerProCysSerGlu145150155160ThrTyrCysGlyProAlaProGluSerGluLysGluThrLysAlaLeu165170175AlaAspPheIleArgAsnAsnLeuSerThrIleLysAlaTyrLeuThr180185190IleHisSerTyrSerGlnMetMetLeuTyrProTyrSerTyrAspTyr195200205LysLeuProGluAsnTyrGluGluLeuAsnAlaLeuValLysGlyAla210215220AlaLysGluLeuAlaThrLeuHisGlyThrLysTyrThrTyrGlyPro225230235240GlyAlaThrThrIleTyrProAlaAlaGlyGlySetAspAspTrpSer245250255TyrAspGlnGlyIleLysTyrSerPheThrPheGluLeuArgAspThr260265270GlyPhePheGlyPheLeuLeuProGluSerGlnIleArgGlnThrCys275280285GluGluThrMetLeuAlaValLysTyrIleAlaAsnTyrValArgGlu290295300HisLeuTyr**305(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型cDNA(iii)前提无(xi)序列描述SEQIDNO7CGCGGATCCTCACTAATATAGATGTTCTCGGACATAATT39(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学特征线性(ii)分子类型cDNA(iii)前提无(xi)序列描述SEQIDNO8ATCCGCCAGACTAGTGAGGAGACAATG2权利要求1.一种生产具酶活性CPB的方法，包括(a)处理一种含编码ProCPB的DNA的重组体细胞，使得此DNA指导ProCPB的表达；(b)从细胞中回收表达的ProCPB；(c)在允许ProCPB折叠的条件下处理回收的ProCPB；(d)将折叠的ProCPB酶切处理，产生具酶活性的CPB；(e)纯化具酶活性的CPB。2.根据权利要求1的方法，其中回收步骤(b)包括(i)破坏重组体细胞的细胞壁或其片段，产生细胞裂解液；(ii)通过离心从裂解液中分离胞内沉淀物；(iii)将沉淀溶于5.根据权利要求1的方法，其中酶切步骤(d)包括(i)调节pH至约8.5；和(ii)用胰蛋白酶于37℃作用约60分钟切割ProCPB。6.根据权利要求1的方法，其中纯化步骤(e)包括离子交换层析。7.根据权利要求1的方法，其中纯化步骤(e)包括离子交换层析和疏水层析。8.根据权利要求1的方法，其中纯化步骤(e)包括离子交换层析、疏水层析和透滤。9.根据权利要求1的方法，其中ProCPB由保藏于ATCC保藏号69673的质粒pλProCPB表达。10.具酶活性CPB，不含其他来源于哺乳动物的物质。全文摘要本发明提供了一种生产具酶活性的CPB的方法,它包括将一种含有编码ProCPB的DNA的重组体细胞处理,使得此DNA指导ProCPB的表达,再从这些细胞中回收所表达的ProCPB,然后在ProCPB可折叠的条件下处理回收的ProCPB,将折叠的ProCPB酶切处理产生具酶活性的CPB,并纯化此具酶活性的CPB。文档编号C07K14/62GK1177377SQ96192367公开日1998年3月25日申请日期1996年1月25日优先权日1995年1月25日发明者J·哈尔曼,N·胡尔加,S·门德罗维赫,M·高雷基申请人:生物技术通用公司