专利名称：一种检测分枝杆菌属细菌存在的方法以及及其所用的试剂盒和抗体的利记博彩app
背景技术：
本发明涉及到一种基于免疫学技术的，及其所用分枝杆菌属细菌存在的方法，以及用于试剂盒和抗体。
已经知道，多种已知的分枝杆菌属细菌能引起人和动物的多种传染性疾病。有一种分枝杆菌属细菌，结核分枝杆菌，能引起人结构病。
结核病被认为是在全世界大部地区的主要可传染性疾病。尽管医学科学取得了巨大的进展，有时产生了这种疾病已经被征服的印象，以及尽管有国际间有组织的共同努力，但是，结核病仍然是占压倒多数的世界性健康问题。仅1990年，全世界报告的新病例有8百多万，死亡3百多万(Snider，1994)。世界卫生组织预测，到2000年，每年新病例数将上升到1020万，死亡数上升到350万，亚洲和亚-撒哈拉非洲是受影响的最主要地区(Dolim，Raviglione and Koch，1994)。当前十年间，结核病例估计数和同期死亡估计数的全球分布情况，分别在
图1和图2中显示(Dolin，Raviglione and Koch，1994)。 图1估计1990-1999年累计结核病例的全球分布 图2估计1990-1999年累计结核病 致死人数的全球分布资料证明，结核病和爱滋病之间有密切的关系，这二种疾病常常相伴同时存在的情况，使形势更加严峻(Torres et al，1990；De Cook 1994；Cantwell and Binkin，1994；Murray，1994)。在结核分枝杆菌的不同株和其它非典型分枝杆菌中，多重药物抗性的出现，更增加了对付这个巨大问题的艰巨性(Blumberg，Miller and Koornhof，1994；Morse，1994)。
为制订对抗这些疾病的更有成效的全球战略计划，迫切需要准确和及时地检测结核病和与分枝杆菌有关的疾病。
传统的实验室检测法的主要缺点是，或者不能区分活菌和死菌(快速简例的Ziehl-Neelsen染色法)，或者假如方法能证实存在活菌(直接培养法)，但是完成实验室检测需要几个星期。这本身就延误了治疗，并且有可能导致疾病进一步扩散。
较新近的技术是基于通过如血清学试验，淋巴细胞对分枝杆菌抗原的增殖反应试验，或通过测定腺苷脱氨酶含量的方法，来测定病人对感染的反应，或者是基于用免疫测定法如ELISAs(酶联免疫吸附试验法)，用气相和液相色谱法质量光谱法测定分枝杆菌的抗原和组分。更现代的分子技术包括聚合酶链反应(PCR)，DNA探针或DNA指纹法(Musial et al，1988，Godfrey-Faussett，1994)。
但是，上述列举的方法都不能满足能鉴别死、活分枝杆菌细胞的快速、简便和可靠测定的所有要求。发明概述本发明提供了一种通过用免疫学方法检测样品中的至少一种分枝杆菌细胞内种抗原，来检测和鉴定动物生物样品中的分枝杆菌属细菌的诊断测定法。
“细胞内分枝杆菌抗原”在此定义为分枝杆菌属细菌的一种非表面抗原或一种代谢产物。
细胞内分枝杆菌抗原的优选检测法是，将生物样品暴露于分枝杆菌细胞内抗原特异性的一种或多种抗体。
优选的本检测法包括溶菌步骤，在样品与抗体接触之前，使存在于样品中的至少一些分枝杆菌细胞，释放出存在于它们细胞壁中的至少一些抗原。
优选的本检测法还包括，在使分枝杆菌细菌溶菌之前，对生物样品的处理步骤，使分枝杆菌细胞从可能包裹它们的任何器官碎片中释放出来，并使生物样品去污染，清除其中存在的不希望有的微生物。
优选的细胞内分枝杆菌抗原，是存在于分枝杆菌细菌细胞壁中的分枝菌酸混合物，每种分枝菌酸都具有如下的一般结构 优选的生物样品是痰，血，脑-脊液，粪便，尿，胃洗出液，唾液，组织，咽喉拭子或皮肤伤口渗出液。
优选的本检测法还包括，在与标记抗体接触之前，用固相化抗体亲和性处理技术，对样品中分枝菌酸的浓缩步骤。优选的浓缩步骤是用免疫亲和性柱进行的。
本发明的另一方面，一种从提取的分枝杆菌分枝菌酸和污染成分的混合物中，对具有上述一般结构的分枝杆菌分枝菌酸进行组份分离和进一步纯化的方法包括如下步骤将分枝菌酸和污染成分的混合物溶解于双相溶剂中，然后将对此混合物进行液-液相分离。优选的情况是，纯化的分枝菌酸以后不受化学衍生化处理。优选的双相溶剂系统含有氯仿，甲醇和水。
优选的情况是，双相溶剂系统包含有上相和下相。
优选的方法也包括使上、下相混合和平衡的步骤。
优选的情况是，上相的组成是12-18％氯仿，45-55％甲醇和20-40％水。更优选的情况是，上相的组成是15％氯仿，52％甲醇和3％水。
优选的情况是，下相的组成是50-80％氯仿，15-40％甲醇和2-8％水。更优选的情况是，下相液的组成是68％氯仿，27％甲醇和5％水。
优选的纯化过程是在反流仪或其它任何液-液萃取装置上进行。
本发明的另一方面，提供了一种具有如下一般结构的，经过组份分离和纯化的纯化分枝菌酸 本发明的另一方面，提供了一个针对细胞内分枝杆菌抗原的抗体。
该抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选地是动物来源的抗体。
优选的抗体是一个，针对一通过上述方法纯化的分枝菌酸产生的分离多克隆抗体。
本发明的另一方面，提供了一种细胞内分枝杆菌抗原和载体的结合物。
优选的细胞内抗原是一种分枝菌酸，并且优选的是吸附在载体上。
该载体可以是一种蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)，明胶或钥孔帽贝血兰蛋白(KLH)。
根据本发明的另一方面，一种用于检测生物样品中分枝杆菌属细菌存在的试剂盒包括一个针对通过上述方法纯化的分枝菌酸而产生的抗体，并对此抗体作了可测定性标记。
该试剂盒还可能包括适量的分枝杆菌分枝菌酸和载体的结合物，以及任选地还包括一个固相化抗体。发明详述本发明的目的是建立一种诊断检测方法，用于证实在来源于人或动物的生物样品中存在分枝杆菌，生物样品可以是如下种类痰，脑脊液，血，尿，粪便或组织样品，胃洗出液，唾液，咽喉拭子或伤口渗出液。
该检测法是基于用免疫学方法检测来源于分枝杆菌的一种或多种细胞抗原和分枝菌酸。该检测法还可能基于使用标记抗体，标记物可以是酶，荧光染料，乳胶颗粒或其它任何适合的标记物。
分枝菌酸是高分子量的α-羟基脂肪酸，在α-位置具有中等长度的α链。
因为已经知道，分枝杆菌属的每种细菌可以通过独特类型的分枝菌酸来鉴别(Butler，Jost and Kilburn，1991，Butler and Kilburn，1988)，因此用本测定法提供的特异性抗体来区分本属细菌中的各个成员应该是可能的。实施例1构成本发明基础的试验研究，包括如下步骤并据此提供了一种用于检测和鉴定生物样品中分枝杆菌属细菌的方法第1步 获得分枝杆菌属菌株。培养物购自American Type CultureCollection(ATCC)。
第2步 从分枝杆菌属菌培养物中分离出分枝菌酸，借助高效液相色谱(HPLC)分析法对分枝菌酸进行鉴定和纯化。
第3步 用BSA，KLH和明胶作载体分子，制备分枝菌酸结合物。
第4步 免疫实验动物，产生对分枝菌酸的特异性抗体。并对抗体作质量鉴定。
第5步 计划建立一种诊断检测法(使抗原-抗体反应能够测定)。
第6步 接着对诊断检测法进行评价证实该检测法的特异性、灵敏度和测定范围，并与现有的检测法相比较。
本试验研究的材料(包括实验动物)，方法和结果叙述如下。实验材料培养物用于本实验的菌株是，结核杆菌H37Rv ATCC 27294-有毒菌株，来源于一个感染病人的肺。
该培养物是以冷冻干燥的形式购自Americam Type CultureCollection(ATCC)，Maryland，USA。培养基如下培养基被用于培养结核杆菌液体培养基Dubos肉汤固体培养基Lowenstein-Jensen(LJ)培养基Middlebrook 7H-10培养基配制这些培养基必需成分的详细组成以及建议的灭菌条件，见(结核病研究方法实验指南)Laboratory Manual of Tuberculosis Methods，Tuberculosis Research Institute of the SA Medical ResearchCouncil(1980，Chapter 6，pp 83-105；Second Edition，revised byEE Nel，HH Kleeberg and EMS Gatner)。此培养基是由Pretori大学病理研究所，医学微生物研究室配制的。试剂下列试剂用于对分枝菌酸的皂化，萃取，衍生化和高效液相色谱(HPLC)分析试剂A62.5g KOH(分析纯)，溶于125ml水中，加入125ml甲醇(BDH，HPLC级)。试剂B浓盐酸(BDH，分析纯)，用水1∶1稀释。试剂C溶于甲醇-水(1∶1)中的2％碳酸氢钾称取10g碳酸氢钾(BDH，分析纯)，溶于250ml水中，加入250ml甲醇。试剂D将溶于冠醚(Pierce Chemicel Co，Cat，No 48891)中的对-溴代苯酰基溴，按每份500μl的量，分装于玻璃小瓶内，此瓶具有Teflon涂膜并带有琥珀色螺旋帽。拧紧小瓶螺旋帽，并用Parefilm封口，试剂D存于4℃。试剂E试剂E是将试剂B与甲醇1∶1混合配制而成。HPLC标准品高分子量内标物(C-100)来自Ribi ImmunoChem ResearchCompany，Cat No R-50。将1mg此标准品混悬于2.0ml二氯甲烷(BDH HPLC级)中，按350μl等分量分装于具有Teflon涂膜的开鞘螺旋帽小瓶中，小瓶用Parafilm封口，4℃贮存。
为阻止二氯甲烷挥发，使用时将分装的HPLC标准品放置在冰浴内。
氯仿(Associated Chemical Enterpriser，化学纯)二氯甲烷(BDH，HPLC-级)试剂A，B，C和E，均在实验前新鲜配，制并准备所有必要的安全预防措施。
这些试剂均用双蒸馏去离子水配制。
下列试剂用于纯化提取的分枝菌酸氯仿(Saarchem，分析纯)甲醇(Merck，化学纯)下列试剂用于免疫实验动物牛血清白蛋白(BSA)，Sigma批号11H1040分枝菌酸-BSA结合物钥孔帽贝血兰蛋白(KLH)，Sigma免疫化学药品分枝菌酸-KLH结合物福氏不完全佐剂(FIA)AdjuPrime免疫调控因子(Pierce Chemical Company，Cat No77138)灭菌盐水-0.85％(m/v)NaCl溶液，用双蒸水配制。
下列试剂用于进行ELISA试验，检测分枝菌酸特异性抗体牛血清白蛋白(BSA)-Sigma批号11H1040明胶(Serva批号22151，Reinst-研究级明胶-MA分枝菌酸结合物PBS-磷酸缓冲盐水(pH7.4)，含有NaCl(Unilab，化学纯，批号28159)Na2HPO4·12H2O(Merck，化学纯)KCl(Merck，化学纯，批号6420150)KH2PO4(Merck，化学纯，批号6332422)柠檬酸缓冲液(pH4.5)，含有0.1M柠檬酸(Merck，批号775A)0.1M柠檬酸三钠(Merck，批号8533833)酪蛋白(Merck，批号0100336 V279342)邻苯三胺(二氢氯化物)(Sigme，批号59F-5021)甲醇(Saarchem，分析纯，批号3126)羊抗小鼠单克隆抗体-过氧化物酶结合物(Cappel，批号37081)底物8mg脲氢过氧化物酶10mg邻苯二胺，溶于0.1M柠檬酸盐缓冲液。
5只免疫小鼠和三只对照小鼠的血清样品被用于本实验中。
实验动物6周龄雄性Balb-C小鼠用于免疫试验。该小鼠由Johannesburg(约翰内斯堡)南非医学研究所动物中心饲养。
ELISA反应板Nunc Immunoplates(Maxisorp)反应板用于ELISA试验。
反流分离仪实验研究中使用的反流分离仪是由H O POST，InstrumentCompany Inc.，Middle Village，New York生产。方法用于本实验的方法如下菌株培养细菌在37℃用如下培养基培养Dubos肉汤Lowenstein-Jensen培养基(斜面培养基)和Middlebrook 7H-10琼脂培养基(斜面培养基)从细菌样品制备分枝菌酸细菌样品制备包括三步培养获得分枝杆菌细胞，皂化和萃取分枝菌酸按Butler，Jost and Kilburn(1991)所述的方法，对分枝菌酸作皂化，萃取和衍生化处理，方法稍有改进，将在有关的项目下叙述。
用于对分枝菌酸作萃取、衍生化处理和HPLC分析的玻璃器材均用2％(v/v)Contrad(Merck)洗，再用水冲洗，然后用氯仿，水，技术级乙醇，水涮洗，最后用双蒸去离子水冲洗。洗过的玻璃器在热空气干燥箱内干燥。
收集细菌的方法是从培养基斜面表面刮取细菌生物物(用无菌塑料环)。在试剂A中制备同源菌悬液，用无菌玻璃小珠或旋转振摇收集的细菌细胞。
在压力反应器内，121℃下，对试剂A中的分枝杆菌皂化处理1小时。
分枝菌酸的萃取包括如下步骤使样品冷却，每个样品加入1.5ml试剂B。旋转摇均后，检查每个样品的pH，如果需要，用试剂B校准至pH1。
随后，对每个样品加入2.0ml氯仿，并旋转振荡30秒。静置分层。用巴士德吸管吸出底层液转移至WISP小瓶内，在氮气流下，在热功能蒸发器内，85.℃蒸发干燥。为了中和带入的微量酸，对每个样品加入100μl试剂C，再在氮气流下，在热功能蒸发器内85℃蒸发干燥。衍生化处理作HPLC分析的分枝菌酸被萃取的分枝菌酸衍生化处理的方法如下向每个冷却的样品内加入1.0ml氯仿，接着加入50ml试剂D。将此加盖的样品小瓶旋转振摇30秒，在热功能蒸发器内85℃加热20分钟。然后使样品冷却，加入1.0ml试剂E。将样品旋转振摇30秒，静置分层。用巴士德吸管吸出底层液，转移至WISP小瓶内。将此小瓶放入热功能蒸发器内，在85℃用氮气流使样品蒸发干燥。
将此残留物再悬浮于0.212g(相当于160μl)二氯甲烷中，加盖，旋转振摇。向每个重新构成的样品加入5μl HPLC内标物，然后通过0.45μl孔径的膜滤器过滤，使滤液装入琥珀色的WISP小瓶内。将此加盖的小瓶存放于4℃，准备进行HPLC分析。分枝菌酸的HPLC分析和定量从每个样品中取25μl作HPLC分析(操作过程中样品被置于冰上)。每批样品分析之前，先用对照样品，即25μl过滤二氯甲烷，上样分析。如果有大批样品需要分析，为了确认HPLC仪器的可靠性，每分析3个或4个待测样品之后，用对照样品上样分析一次。
反相HPLC分析是用Beckman系统Gold高效液相色谱仪进行的，由下列部件组成泵(Beckman 110B溶剂排送模件)检测器(可编程检测器模件166或168)柱(Nova-Pak C18 4μl 3.9×150mm)及一个与钢管柱配合的未端接头运行条件是流动相溶剂AHPLC级甲醇溶剂BHPLC级二氯甲烷流速2.5ml/分钟柱温30℃检测器设置在260nm波长HPLC的起始梯度包括98％(v/v)甲醇(溶剂A)和2％(v/v)二氯甲烷(溶液B)。在1分钟，梯度线性地增加至80％A和20％B，在10分钟为35％A和65％B，维持30秒钟，然后在大于30秒后下降回到98％A和20％B。在注入下一个样品之前，使这种比率保持4分钟，以便使系统稳定。
通过将测定样品的组合峰面积与引入量的高分子量HPLC内标准品峰面积相比较，可对分枝菌酸作数学定量。分枝菌酸的纯化和其它脂肪酸的组份分离一个包括25管的，编号0-24，反流分布序列被用于本实验。将大约900ml上相液导入缓冲储存器中。
将由大量萃取试验(30-150mg)得到的，溶于10ml下相液和10ml上相液的粗制结核杆菌细胞提取物样品，导入0号管中。将10ml等份量下相液导入其余24个管中。上相液以每次循环10ml的体积自动地分配进0号管中，重复地循环25次以上，运行大约16小时。就这样，进行25次反流循环，每次循环由20次混匀振动和40分钟相分离时间组成。
随着每次转移，凡是来自样品，存在于上相液的溶质都被带入连续排列的管中。完成25次转移之后，被分离的溶质组分将沿着25个序列管分布收集。
为了确定脂肪酸在25支管中的分布，可观察序列管内脂肪酸在上相液和下相液中的乳化式样，并对各组分进行相应的测定。
然后用一支带有Teflon管的50ml注射器，从各管中将反流分离物取出。将分离物依次混合成7个组份，分别置于Buchi蒸发器内，在70℃真空干燥，将干燥物再溶解于氯仿，甲醇或水中(大约5ml)，然后转入琥珀色帽的WISP小瓶内，4℃保存备用。反流分离纯化分枝菌酸的产率为了计算纯化/分离的大致产率，可将反流分离/纯化后得到的样品中分枝菌酸的重量，与导入反流仪的细胞粗提物中这些化合物的重量相比较，从在细胞粗提物HPLC色谱图中分枝菌酸峰群的相对峰面积和标准品的峰面积来计算。分枝菌酸的反流纯化发现按照Butler，Jost和Kilbwrn(1991)提出的分离分枝菌酸的方法，结核杆菌提取物中分枝菌酸的含量小于10％(表1)。为了分枝菌酸具有免疫原性，必须使纯化的分枝菌酸附着在载体分子如牛血清白蛋白上。要做到这点，一个重要的条件是分枝菌酸在适当的溶剂中的可溶性比例。
用上述的相系统，对结核杆菌H37Rv ATCC 27294分枝菌酸粗提物的反流纯化过程，进行了25次以上的循环。
在对序列管作最后的相液混合并使之静置几分钟之后，可以观察乳化式样，它能够相当精确地显示纯化物在序列管中的分布情况。
用HPLC对组分1，2，3，4和5进行了分析，峰1和峰2显示为分枝菌酸特性峰，峰4和峰5为短链脂肪酸特性峰(图1)。
图1显示细胞粗提物，组分1和组4的HPLC分布图。 曲线图1.细胞粗提物(1a)以及反流纯化组分1(1b)和组分4(1c)的HPLC分布图组分6和7由于它们不溶于氯仿，不能用HPLC分析。
质量分布情况(表1)表明，达到了将分枝菌酸从比它更具极性的污染成分中分离的基线分离标准，而8％的产率也与分枝菌酸从粗提物中分离的理论产率相对应，在实验误差范围之内。
图1显然表明，组分1确实含有纯化的分枝菌酸。 反流纯化物第1组分的HPLC分析分枝菌酸-BSA结合物的制备先配制5mg BSA溶于500μl 0.1N NaHCO3(pH8.3)的溶液。将反流纯化的分枝菌酸(4.5mg)样品溶解于450μl氯仿中。再将BSA溶液缓慢地加入200μl分枝菌酸溶液中，在室温下操作，历时超过1分20秒。并在加液过程中，使混合物旋转振摇。加完后继续旋转振摇30秒钟，并将样品在冰浴中放置15分钟。然后加入冰冷却的丙酮(2ml)，加液过程超过2分钟，操作时样品仍在冰浴中。再将此混合物放置半小时。
随后取出1/4的样品液，放入另一小瓶内，用作HPLC分析(0.5mg)，其余样品用3个10秒钟短离心脉冲离心，沉淀用丙酮洗2次。然后将沉淀转移回WISP小瓶中，在空气中干燥，并复盖金属薄膜，4℃保持过夜。将取出用于HPLC分析的样品加热干燥。
按如下方法加入佐剂将AdjuPrime免疫调控因子(10mg)用玻璃棒研磨，加入经干燥处理的分枝菌酸-BSA结合的样品。共同研磨，得到均匀的粉末，称取1mg溶于1ml无菌生理盐水中。剩余的AdjuPrime/BSA-分枝菌酸混合物真空密封，用金属膜包裹，4℃保存。
此生理盐水溶液用Branson超声波细胞搅碎器B-30作超声波处理，先作十次10秒-脉冲循环处理，间隔10秒，接着作一次30秒脉冲循环，得到均匀一致的分散微粒。超声处理过程是在冰浴上进行。按照厂商所附的说明，在用于免疫之前，需将此生理盐水溶液在4℃下放置4小时。
取出免疫动物所需量免疫原之后，向剩余的生理盐水溶液中加入过量的冰冷丙酮，以便使蛋白质沉淀出。用冷丙酮洗沉淀2次，在丙酮内，金属膜容器中4℃贮存。分枝菌酸-明胶结合物的制备制备5mg明胶溶于2ml 0.1N NaHCO3(pH8.3)的溶液。将500μl的一等份明胶液加入到600μl甲醇中，混匀。再先将2mg分枝菌酸溶于50μl氯仿，然后将明胶混合液逐滴加入分枝菌酸溶液中，历时1分20秒以上，同时旋转振摇。然后再将此样品液旋转振摇30秒钟，在冰浴中放置15分钟。
将样品液移至100ml的Schott瓶内，加入80ml冰冷的丙酮。将此Schott瓶及其内容物在冰浴中放置30分钟。生成的含有分枝菌酸吸附于明胶的沉淀用丙酮洗2次。此样品4℃贮存于丙酮内。小鼠免疫按照如下方案对小鼠进行免疫时间 操作种类 操作部位第1天 第1次免疫脚掌第14天第2次免疫皮下第21天第1次采血尾静脉第28天第3次免疫皮下第35天第2次采血尾静脉第49天第3次免疫皮下第59天第3次采血尾静脉每次免疫步骤都同时作对照试验，即对一组2只小鼠仅用载体分子和相应的佐剂注射，以同样的方式、部位注射。第一次免疫时，对5只雌性Balb/C小鼠的双后脚掌注射等量分枝菌酸-结合物的佐剂的混合物。每支脚注射混合物约50μl。在以后的免疫过程中，均以此相同量的分枝菌酸结合物和佐剂的混合物作皮下注射。第一次和以后各次采血，均是从每只小鼠的尾静脉采几滴血，包括对照小鼠也同样操作。对抗体产生的监测制备血清为了监测抗体产生情况，从每只小鼠的尾静脉采集几滴血。第一次采血时，将5只免疫小鼠和3只对照小鼠的血分别混合，分别注入2支Eppendorff’s管中，混匀并使之凝固。用Eppendorff’s台式离心机将血液离心10分钟，分离出血清。收集上层血清，4℃保存。以后采集的血液样品也分别收集血清，分别滴定。制备ELISA试验板用含有BSA或者分枝菌酸-明胶结合物的包被液包被ELISA试验板，包被液中BSA或分枝菌酸-明胶结合物的浓度为10μg/ml，用PBS缓冲液(pH7.4)配制。
对ELISA试验板每孔加入50μl BSA或分枝菌酸-明胶包被液；然后ELISA试验板在室温下温育16小时。
再每孔加入以PBS缓冲液(pH7.4)配制的0.5％(m/v)酪蛋白200μl，在室温下对ELISA试验板封闭处理1小时。轻轻摔去封闭液，使试验板干燥。血清滴定将免疫小鼠的血清用0.5％ m/v酪蛋白PBS缓冲液(pH7.4)稀释，每个稀释度分别加入ELISA试验板的3个孔内。对照小鼠血清，即以BSA AdjuPrime免疫的小鼠血清和非免疫小鼠血清，同样以0.5％m/v酪蛋白PBS缓冲液(pH7.4)稀释，并分别加入ELISA试验板的3个孔内，每孔50μl。
为了证实抗体的特异性，可用抑制试验对以BSA-分枝菌酸结合物免疫小鼠的血清进行直接滴定。在此抑制试验中，BSA-分枝菌酸结合物是作为竞争性抗原，以0.32mg/ml的浓度加入ELISA试验板的抗血清中，并进行温育。
试验板置于摇床上，在室温下温育1小时。然后除去血清，将试验板用Anthos自动冲洗器，以0.5％ m/v酪蛋白PBS缓冲液(pH7.4)冲洗3次。
将1∶4000稀释的过氧化物酶标记羊抗小鼠单克隆抗体加入ELISA试验板(每孔50μl)，并将试验板在摇床上，在室温下温育60分钟。轻轻摔去孔中的过氧化物酶结合物溶液，并用0.5％ m/v酪蛋白PBS缓冲液(pH7.4)冲洗试验板三次，以除去全部剩余的结合物，配制底物，滴加至孔内，每孔50μl。
温育反应1.5小时后，用SLT 340 ATC ELISA测定仪，测定每个孔的光密度。ELISA免疫试验的结果和讨论图3中的图表显示出通过用分枝菌酸-BSA结合物免疫小鼠得到的抗体反应。连续的直框图代表记录的光密度读数(×103)，并标有每个稀释度一式3份的标准差。对BSA载体得到了强反应(右行所示)，对分枝菌酸得到了较弱的反应(左行所示)。
进入免疫程序的第59天后，5只免疫小鼠中的2只，产生了对分枝菌酸具有特异性抗体活性的抗血清，如在与0.32mg/ml可溶性BSA-分枝菌酸结合的混合的，1∶50稀释度的抗血清，对ELISA-信号显示出24％的抑制作用。此抑制作用的产生是由于在溶液中与BSA配位结合的分枝菌酸，阻塞了分枝菌酸特异性抗体的结合位点，因此减少了结合于ELISA试验板的分枝菌酸特异性抗体的数量。
当用BSA作为包被抗原时，得到强ELISA信号，表明5只小鼠具有高免疫度。通过将抗血清与0.32mg/ml的可溶性BSA-分枝菌酸结合物共同温育，可观察到它对从显示抗-分枝菌酸活性的小鼠得到的抗血清1∶50稀释度的信号无抑制作用。这可能是由于存在高浓度的抗-BSA抗体，使对抗-载体BSA抗体的抑制作用，超出了灵敏度范围。
对于抗-分枝菌酸免疫反应，需要一段较长的免疫时间，反应才能达到适当的成熟，这将导致抗体浓度增加和/或对抗体的亲和性增加。此外，还能用小鼠产生对分枝菌酸具有单一特异性的单克隆抗体。 ELISA信号×103(光密度450mm)图3.进入免疫程序第59天后，用ELISA测定的小鼠对分枝菌酸-BSA的免疫反应参考文献Blumberg，L.，B.Miller and H.J.Koornhof，1994。多量药物抗性结核分枝杆菌。结核病-走向2000。文摘书科学讨论会和专题讨论会，关于在发展中国家，特别是非洲，不久将来的结核病，Pretoria，南非，1994，3月，13-17，p9。Butler，W.R.and J.O.Kilburn，1988。通过用高效液相色谱分析其分枝菌酸来鉴定缓慢生长的主要病原分枝杆菌和戈特氏分枝杆菌。
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权利要求
1.一种通过免疫学方法检测样品中至少一种分枝杆菌细胞内分枝杆菌抗原，来检测和鉴定动物生物样品中的分枝杆菌属细菌的诊断测定法。
2.一种根据权利要求1的诊断测定法，其中细胞内分枝杆菌抗原的测定，是通过将生物样品暴露于对细胞内分枝杆菌抗原特异性的抗体。
3.一种根据权利要求1或2的诊断测定法，包括在样品与抗体接触之前，使存在于样品中的至少一些分枝杆菌细胞溶菌的步骤。
4.一种根据权利要求3的诊断测定法，还包括在使分枝杆菌细胞溶菌之前，对生物样品的处理步骤，使分枝杆菌细胞从可能包裹它们的任何器官碎片中释放出来，并使生物样品去污染，清除其中存在的不希望有的微生物。
5.一种根据权利要求1至4中任何一项的诊断测定法，还包括在与标记抗体接触之前，用固相化抗体亲和性处理技术，对样品中细胞内分枝杆菌抗原的浓缩步骤。
6.一种根据前述权利要求中任何一项的诊断测定法，其中细胞内分枝杆菌抗原是存在于分枝杆菌属细菌细胞壁中的分枝菌酸混合物，每种分枝菌酸都具有如下的一般结构
7.一种根据前述权利要求中任何一项的诊断测定法，其中生物样品是痰，血，脑脊液，粪便，尿，胃洗出液，唾液，组织，咽喉拭子或皮肤伤口渗出液。
8.一种从提取的分枝杆菌分枝菌酸和污染成分的混合物中，对具有如下一般结构的分枝杆菌分枝菌酸进行组份分离和进一步纯化的方法， 包括如下步骤将分枝菌酸和污染成分的混合物溶解于双相溶剂中；然后将此混合物进行液-液相分离。
9.一种根据权利要求8的方法，其中纯化的分枝菌酸以后不受化学衍生化处理。
10.一种根据权利要求8或9的方法，其中双相溶剂系统含有氯仿，甲醇和水。
11.一种根据权利要求8至10中任何一项的方法，其中双相溶剂系统包含有上相和下相。
12.一种根据权利要求11的方法，其中的方法也包括使上、下相混合和平衡的步骤。
13.一种根据权利要求11或12的方法，其中上相的组成是12-18％氯仿，45-55％甲醇和20-40％水。
14.一种根据权利要求13的方法，其中上相的组成是15％氯仿，52％甲醇和3％水。
15.一种根据权利要求11至14中任何一项的方法，其中下相的组成是50％-80％氯仿，15-40％甲醇和2-8％水。
16.一种根据权利要求15的方法，其中下相的组成是68％氯仿，27％甲醇和5％水。
17.一种根据权利要求8至16中任何一项的方法，其中纯化过程是用反流分离仪或任何其它液-液萃取装置进行。
18.一种具有如下一般结构，已经按照权利要求8至17中任何一项的方法进行了组分分离和纯化的纯化分枝菌酸。
19.一种针对存在于分枝杆菌属细菌细胞壁中的分枝菌酸混合物分离抗体，每种分枝菌酸都具有如下一般结构
20.一种根据权利要求19的分离抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
21.一种根据权利要求20的分离抗体，是动物来源的多克隆抗体。
22.一种根据权利要求19至21中任何一项的分离抗体，其中分枝菌酸是按照权利要求8至17中任何一项的方法纯化的。
23.一种细胞内分枝杆菌抗原载体结合物，其中细胞内抗原是吸附在载体上。
24.一种根据权利要求23的细胞内分枝杆菌抗原-载体结合物，其中细胞内抗原是分枝菌酸的混合物，每种分枝菌酸具有如下一般结构
25.一种根据权利要求23或24的细胞内分枝杆菌抗原/载体结合物，其中载体是牛血清蛋白，明胶或钥孔帽贝血兰蛋白。
26.一种用于检测生物样品中分枝杆菌属细菌存在的试剂盒，包括一个对分枝杆菌分枝菌酸混合物产生的，并作了可测定标记的抗体，这种分枝菌酸混合物是用根据权利要求8至17中任何一项的方法纯化过的。
27.一种根据权利要求26的试剂盒，还包括适量的，根据权利要求23至25中任何一项中的分枝杆菌分枝菌酸-载体结合物，以及任选地还包括一个固相化抗体。
全文摘要
本发明是关于检测和鉴定存在于人和动物的生物样品中的分枝杆菌属和细胞的一种诊断测定法。该测定法是基于用免疫学方法检测来源于分枝杆菌属细菌的一种或多种抗原。为了检测抗体抗原反应，可以用酶或荧光染料标记这些抗原的特异性抗体，或者使抗体吸附于乳胶颗粒或其他合适的标记物。可以用ELISA进行诊断测定，在实际测定之前，需要或者不需要预行浓缩分析杆菌属细菌抗原。本发明包括选择并获得合适的分枝杆菌种和株，分离纯化抗原并用各种载体分子制备必需的抗原结合物，用于免疫实验动物，建立一种用于监测分枝杆菌抗体产生，对分枝杆菌一种或多种抗原的特异性抗体进行鉴定的检测方法，以及开发建立一种诊断检测法和诊断试剂盒。
文档编号C07C51/48GK1150840SQ95193609
公开日1997年5月28日 申请日期1995年4月13日 优先权日1994年4月14日
发明者J·A·韦斯初尔, S·N·拜伊 申请人:阿德科克因格拉姆有限公司