神经胶质细胞促有丝分裂因子，其制备和应用的利记博彩app

专利名称：神经胶质细胞促有丝分裂因子，其制备和应用的利记博彩app
相关申请的参考本申请为如下申请的部分继续申请系列号No.08/036,555，申请日1993-3-24，系列号No.07/965,173，申请日1992-10-23，系列号No.07/940,389，申请日1992-9-3，系列号No.07/907,138，申请日1992-6-30，系列号No.07/863,703，申请日1992-4-3。
本发明的背景本发明涉及存在于脊椎动物中的若干多肽，这些多肽为神经胶质细胞包括施旺细胞的促有丝分裂生长因子。本发明还涉及能够制备这些因子的方法，以及这些因子在治疗上的应用。
脊椎动物神经胶质细胞构成了中央和周围神经系统的特异的连接组织。重要的神经胶质细胞包括施旺细胞，它为神经元提供代谢支援，并为某些周围神经元的轴突提供髓磷脂鞘，因而形成各神经纤维。施旺细胞在邻近的神经元的轴突周围形成同轴的膜层，并围绕轴突生长、扭转，支持神经元，并提供鞘的作用。这些髓磷脂为许多神经纤维的易感因子，而且，施旺细胞的损伤或生长发育的失常，可导致许多周围神经系统疾病和失调，如严重的脱髓鞘或神经退化等病征。在神经系统的发育中，很显然，细胞需有各种因子调节其分化与生长，而近年来各种此类因子已经得到了鉴定，其中包括已发现的一些对于施旺细胞分化或发育起作用的因子。
Brockes等，(另有其它文献)，于“神经科学杂志”(J.Neuroscience，4，(1984)75-83)上描述了一种从牛脑和脑垂体组织的抽提物中得到的蛋白质生长因子，命名为神经胶质生长因子(Glial Growth Factor，GGF)，该因子刺激在含10％牛胎血清培养基中培养的鼠的施旺细胞分化。该因子据描述分子量为31,000道尔顿并易形成二聚体。在“酶学方法”(Meth.Enz.，147(1987)，217-225)中描述了一种以施旺细胞进行的GGF试验。
Brockes等，(文献同上)，还描述了一种使GGF明显均质的纯化方法。简要地，其描述的一种大量纯化的方法包括从冷冻牛前叶中抽提，得到的样品材料进行层析，从CM-纤维素上用NaCl梯度洗脱。然后用Ultrogel柱进行凝胶过滤，接着用磷酸-纤维素柱洗脱，最后是小量SDS-凝胶电泳。方法也可变动，以CM-纤维素材料直接应用于磷酸纤维素柱，收集过柱组分并以天然制备凝胶电泳纯化，随后进行最后的SDS凝胶电泳。
Brockes等发现以前的报道的凝胶过滤实验中(Brockes等(“生物化学杂志”J.Biol.chem.225(1980)8374-8377)，生长因子的活性主峰迁移至分子量56,000道尔顿，而在上述的前一种流程中，更具活性的部分为分子量31,000道尔顿。据称，在此流程中经过CM-纤维素梯度洗脱后，使得GGF二聚体被大大地去除了。
Benveniste等(PNAS，82(1985)，3930-3934)描述了一种T淋巴细胞衍生的神经胶质生长促进因子。这种因子在还原条件下，SDS-凝胶上呈现出明显的分子量变化。
Kimura等(“自然”，Nature，348(1990)，257-260)描述了从一坐骨神经鞘肿瘤中得到的一种因子，称之为神经鞘瘤衍生生长因子(Schwannoma-derived growth factor，SDGF)。作者称SDGF并不刺激氚标记的TdR进入施旺细胞，而与之相反，在同样条件下，含有GGF的部分纯化的脑垂体组分却有此活性。SDGF的表观分子量处于31000D至35000D之间。
Davis和Stroobant(细胞生物学杂志，J.Cell.Biol.，110(1990)1353-1360)描述了对若干候选促有丝分裂剂的筛查。实验使用大鼠施旺细胞，培养基含有10％FCS(牛胎血清)，在加入或不加入forskolin的条件下，测试各待测样品对施旺细胞中DNA合成的刺激能力。这些被测试的因子之一为GGF-羧甲基纤维素组分(GGF-CM)，当FCS存在，不论有否forskolin，它都具有促细有丝分裂作用。这项工作揭示，在forskolin存在下(主要条件，也需其它)，血小板衍生的生长因子(PDGF)对施旺细胞是一有效的促有丝分裂剂。PDGF从前曾被以为对施旺细胞没有作用。
Holmes等(“科学”，Science(1992)2561205)和Wen(“细胞”，Cell(1992)69559)称，编码与受体(p185erbB2)结合的蛋白质DNA序列，与多种人类肿瘤相关。
p185erbB2蛋白是一185KD的跨膜蛋白，具有色氨酸激酶活性。该蛋白由erbB2原癌基因编码(Yarden和Ullrich“生化年评”Ann.Rev.Biochem.57443(1988))。erbB2基因，也称HER-2(在人细胞中)，和neu(在鼠细胞中)，它与表皮生长因子(EGF)的受体紧密相关。近来的证据表明与p185erbB2相互作用的蛋白(和激活p185erbB2激酶的蛋白)能诱导携带p185erbB2受体的细胞的增殖(Holmes等Science 2561205(1992)；Dobashi等Proc.Natl.Acad.Sci.888582(1991)；Lupu等Proc.Natl.Acad.Sci.892287(1992))。再有的证据是，表达p185erbB2结合蛋白的基因产生许多大小不同、差异剪切的RNA转录产物，因而产生一系列的蛋白质，它们具有不同的长度，但具有一些共同的肽序列和特定的肽序列。人乳腺癌(MDA-MB-231)中得到的差异剪切的RNA转录产物支持了这点(Holmes等Science 2561205(1992))。更进一步的支持是作为p185erbB2受体的配体的蛋白(本发明公布于此)，该蛋白具有宽广的长度变化范围(见下文)。
本发明概述总体上，本发明提供了刺激神经胶质细胞(尤其是施旺细胞和中央神经系统的神经胶质)有丝分裂的方法，以及呈现这种神经胶质细胞促有丝分裂活性的新型蛋白。此外，本发明还提供了编码这些蛋白DNA，和编码与之或相关蛋白结合的抗体的DNA。
本发明的新型蛋白包括编码由已知多肽的序列经可变的剪切而成的产物。总的来说，这些已知蛋白为GGF/p185erbB2蛋白家族的成员。
特别指出，本发明提供了含有一特异通式的若干多肽，以及编码这些多肽的DNA序列。这些多肽含有如下的通式WYBZCX其中，WYBAZCX由如图3l所示氨基酸序列组成(SEQ ID Nos.136-139，141-147，160，161，173-178，42-44，77)；；其中的W含有多肽片段F，或不含有；其中的Y含有多肽片段E，或不含有；其中的Z含有多肽片段G，或不含有；其中的X含有多肽片段C/D HKL，C/DH，C/D HL，C/D D，C/D′HL，C/D′HKL，C/D′H，C/D′D，C/D C/D′HKL，C/DC/D′H，C/D C/D′HL，C/D C/D′D，C/D D′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HL，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL或C/D C/D′D′HKL；在此情况下，要么a)F，Y，B，A，Z，C，或X至少其中之一为牛来源的；或者b)Y含有多肽片段E；或者c)X含有多肽片段C/D HKL，C/D D，C/D′HKL，C/D C/D′HKL，C/D C/D′D，C/DD′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL，C/D C/D′D′HKL，C/D′H，C/D C/D′H，或C/D C/D′HL。
再有，本发明包括含有编码片段5′FBA3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如图31所示(SEQ ID Nos.136，138，139，173-175)的相应的多肽片段；含有编码片段5′FBA′3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如图31所示(SEQ ID Nos.136，138，140，173，174)的相应的多肽片段；含有编码片段5′FEBA3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如图31所示(SEQ ID Nos.136-139，173-175)的相应的多肽片段；含有编码片段5′FEBA′3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如图31所示(SEQ ID Nos.136-138，140，173，174)的相应的多肽片段；以及含有编码GGF2HBS5的cDNA克隆片段的DNA序列(ATCC保藏号No75298，保藏日1992-9-2)。
本发明还包括通式FBA，FEBA，FBA′，FEBA′代表的多肽，以及编码这些多肽的DNA序列，其中这些多肽片段的相应的氨基酸序列如图31所示，各自对应SEQ ID Nos.(136，138，139，173-175)，(136-139，173-175)，(136，138，140，173，174)，和(136-138，140，173，174)。纯化的GGF-II多肽(SEQ ID No.167)也包括在本发明之内。
作为本发明的一方面还包括，用于治疗神经胶质，特别是用于治疗中央神经系统的少突神经胶质细胞、小胶原细胞和星形胶原细胞疾病的这些多肽与为其编码的DNA，及其给药方法。
本发明还包括成熟的GGF肽及编码其的DNA，不包括N-末端的信号序列，它可用于中央神经系统的治疗以及制备对上述多肽特异的抗体。这些抗体可用来纯化本文描述的多肽及诊断。
本发明还包括带有编码上述氨基酸的DNA序列的载体。本发明还包括带有编码上述氨基酸的DNA序列的宿主细胞。本发明还包括那些与p185erbB2受体结合并且具有体内或/和体外刺激神经胶质细胞有丝分裂的化合物。
本发明的再一方面为抗本文描述的新型多肽的抗体。此外，本文所述的多肽的抗体可用于纯化本发明的多肽；该多肽的抗体也可用于抑制神经胶质细胞有丝分裂的治疗。
本发明还提供了一种方法，用于刺激神经胶质细胞有丝分裂。该方法中用如下通式定义的多肽与神经胶质细胞接触WYBAZCX其中，WYBAZCX由如图31所示氨基酸序列组成(SEQ ID Nos.136-139，141-147，160，161，173-178，42-44，77)；；其中的W含有多肽片段F，或不含有；其中的Y含有多肽片段E，或不含有；其中的Z含有多肽片段G，或不含有；其中的X含有多肽片段C/D HKL，C/DH，C/D HL，C/D D，C/D′HL，C/D′HKL，C/D′H，C/D′D，C/D C/D′HKL，C/DC/D′H，C/D C/D′HL，C/D C/D′D，C/D D′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HL，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL或C/D C/D′D′HKL。
本发明还包括神经胶质细胞促有丝分裂因子的制备方法。其中包括上述在允许表达本发明的DNA序列的条件下将修饰后的宿主细胞的培养。
利用本发明肽还可制成药剂用于人和动物。此外，药剂可以单位剂量形式与可接受的稀释剂、载体或赋形剂合用。
用上述作为神经胶质细胞有丝分裂剂的多肽接触神经胶质细胞以刺激其有丝分裂的方法也是本发明的一部分。本发明还包括采用一定的有效剂量的多肽给药使脊椎动物(最好为哺乳动物，首推人)神经胶质细胞进行有丝分裂的方法。
本发明的又一方面为利用所述的多肽治疗疾病或失调的方法。例如，用如述多肽有效治疗或预防神经疾病或神经失调的方法。对所限定的多肽敏感或有反应的细胞所属的神经系统的病理生理状况的预防和治疗方法也为本发明的一个部分。
本发明还包括治疗有关周围神经系统损伤、中央神经系统损伤、神经退化失调、周围或中央神经系统髓鞘化、或施旺细胞、少突神经胶质细胞、小神经胶质细胞和星型神经胶质细胞的损伤或缺失等情况的方法。例如，感觉或运动神经纤维的神经病，或神经退化失调的治疗都包括在内。所有这些病例中，治疗包括以有效剂量多肽给药。
本发明还包括采用上述的多肽的有效剂量给药来诱导神经再生和/或修复的方法。这种治疗方法是采用该多肽和一种药物有效载体一起给药。
本发明包括将上述多肽用于制造药品。
本发明还包括将上述多肽用于--免疫哺乳动物生产必要时用于治疗或诊断的抗体--通过竞争试验对具有相当于这些多肽的受体结合特性的分子作鉴定或定量；和/或--利用上述多肽和能与多肽特异结合的受体一起接触样品，以检测与多肽结合的竞争抑制性--在一亲和分离程序或亲和层析中用来分离相应的受体。
本发明还包括神经胶质瘤的预防和治疗方法。该方法包括施用一种能抑制上述多肽结合的物质的有效剂量。
本发明还包括刺激神经胶质细胞有丝分裂活性的方法，通过对神经胶质细胞施用一种--来自人乳腺细胞系MDA-MB231的30KD的多肽因子；或--来自大鼠转化成纤维细胞系I-EJ的35KD的多肽因子；或--来自人乳腺细胞系SKBR-3的75KD的多肽因子；或--来自大鼠转化成纤维细胞系I-EJ的44KD的多肽因子；或
--来自活化的小鼠腹膜巨噬细胞的25KD的多肽因子；或--来自人乳腺细胞系MDA-MB231的45KD的多肽因子；或--来自人T-细胞系ATL-2的7至14KD的多肽因子；或--来自牛肾细胞的25KD的多肽因子；或--来自脑的42KD的多肽因子(ARIA)；或本发明还包括分别采用如图38至43和序列号154至159的多肽EGFL1，EGFL2，EGFL3，EGFL4，EGFL5和EGFL6在体内和体外刺激神经胶质细胞有丝分裂的方法。
本发明还包括采用具有如图45所示序列的多肽GGF-II来刺激神经胶质细胞有丝分裂。
本发明的另一方面还包括采用上述的多肽刺激施旺细胞产生生长因子，这些生长因子可收集起来用于科研和治疗。
更进一步，这里所述的肽类可用于诱导中央神经胶质增殖和髓鞘再生来治疗疾病，特别是治疗需要髓鞘再生的疾病，如MS。
本发明的另一方面为上述的新型多肽可用于刺激乙酰胆碱受体的合成。
如上所述，本发明提供了来自包括牛和人的哺乳动物的新型的神经胶质细胞生长因子，它们与已知的因子不同。这些因子对生长在胎牛血浆(FCP)条件下的施旺细胞有促有丝分裂的作用。本发明还提供了制备这些因子的方法流程以及限定这些因子和其它因子活性的改进方法。这些因子的在治疗学上的应用是本发明的更重要一个方面。
因此，本发明的重要部分是(a)一个在提供胎牛血浆时具有刺激神经胶质细胞，特别是施旺细胞有丝分裂活性的基本多肽因子，其分子量约30KD至36KD，其氨基酸序列包括一个或多个如下的多肽序列FKGDAHTEASLADEYEYMXKTETSSSGLXLKASLADEYEYMRKAGYFAEXAR
TTEMASEQGAAKEALAALKFVLQAKKETQPDPGQILKKVPMVIGAYTEYKCLKFKWFKKATVMEXKFYVPKLEFLXAK；和(b)一个在提供胎牛血浆时具有刺激神经胶质细胞特别是施旺细胞分裂活性的基本多肽因子，其分子量约55K至63KD，其氨基酸序列包括一个或多个如下的多肽序列VHQVWAAKYIFFMEPEAXSSGLGAWGPPAFPVXYWFVVIEGKASPVSVGSVQELQRVCLLTVAALPPTKVHQVWAAKKASLADSGEYMXKDLLLXVEGKVHPQRRGALDRKPSCGRLKEDSRYIFFMEELNRKNKPQNIKIQKK
从较小分子量的多肽因子和较大分子量的多肽因子衍生而来的上述新型多肽的序列，也是本发明的权益内容。这些来源于本发明的多肽因子的序列可制作成探针，用于从不同物种中探查、分离或制备这些因子(或相关基因序列)，或通过重组技术制备这些因子，或用传统技术产生相应抗体，(优选单克隆抗体)，它们本身可用作为探查工具，甚至可能用于治疗。本发明还包括分离到的编码神经胶质细胞促有丝分裂活性剂的基因序列或其片段，它们可通过利用本发明上述所提供的用于制备新型多肽的序列的方法而得到。
从本发明中高度纯化的因子得到的短肽，可以使其它序列得以确定(见下面的实施例)。
因此，本发明还包括一个具有神经胶质细胞促有丝分裂活性的多肽因子，并包括一个由如下描述所编码的氨基酸序列(a)分别为图28a，28b，或28c，序列号133-135所示的DNA序列(b)图22序列号89所示的DNA序列(c)图28a序列号133所示核苷酸281-557序列中代表的DNA序列，或(d)与(a)，(b)或(c)中任一DNA序列杂交的DNA序列。
本发明还包括与上述序列有大于60％(优选大于80％)同源性的序列。
尽管目前的发明没有限定一特殊的杂交条件，但下面的方案可在需要时作为总的指导方法通过缺口翻译或按Schowalter和Sommer(“分析生化”Anal.Biochem.，17790-94，1989)的PCR反应给DNA探针标记高度比活性(大致108至10932Pdmp/ug)，经G-150Sephadex柱脱盐纯化。探针变性(沸水浴10分钟，接着浸入冰水中)后，按106dpm32P/ml用量加入到含10％硫酸葡聚糖的80％缓冲液B(2g聚乙烯吡咯烷，2g Ficoll-400，2g牛血清蛋白，50ml 1M Tris HCl(pH7.5)，58g NaCl，1g焦磷酸钠，10g二烷基磺酸钠，950ml H2O)杂交液，于60℃孵育过夜(16小时左右)。于60℃洗涤膜，先在缓冲液B中洗15分钟，接着在2×SSC，0.1％SDS中洗3次每次20分钟，然后在1×SSC，0.1％SDS中洗20分钟。
在其它方面，本发明提供了(a)一个来自牛脑垂体物质的基本多肽因子，无论是否还原条件，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察其分子量在30KD至36KD左右，所用的分子量标准为
溶菌酶(鸡蛋白)14400大豆胰蛋白酶抑制剂21500碳酸酐酶(牛) 31000卵清蛋白(鸡蛋白) 45000牛血清蛋白66200磷酸酶B(兔肌肉) 97400在提供胎牛血清时，该因子具有包括刺激大鼠施旺细胞分裂的促神经胶质细胞有丝分裂活性，经反相HPLC分离，于4℃保存在0.1％三氟乙酸中十周后，仍保留至少50％的上述活性。
(b)来自牛脑垂体的一个基本多肽因子，在非还原条件下，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察其分子量在55KD至63KD左右，所用的分子量标准为溶菌酶(鸡蛋白)14400大豆胰蛋白酶抑制剂21500碳酸酐酶(牛) 31000卵清蛋白(鸡蛋白) 45000牛血清蛋白66200磷酸酶B(兔肌肉) 97400所述等同的人因子是由此文阐述的DNA克隆GGF2HBS5所编码，该因子具有神经胶质细胞促有丝分裂活性，其中包括在胎牛血浆存在条件下刺激大鼠施旺细胞分裂。并且经反相HPLC分离后，在0.1％三氟乙酸溶液中于4℃保温4天后，仍保持有至少50％的活性。
为了便于说明，本发明的低分子量和高分子量因子在下文中分别以“GGF-I”和“GGF-II”来表示。“GGF2”是指各种分离出的、包含有源于GGF-II蛋白的多肽序列的克隆(即GGF2HBS5，GGF2BPP3)。
应该指出本文所引用的分子量范围并不精确，依特殊多肽因子的来源不同而有细微的改变。例如，差异达10％对于不同来源的材料而言并非不可能。
本发明的另一重要方面是指编码具有神经胶质细胞促有丝分裂活性的多肽的DNA序列，它包括(a)图28a、28b或28c中所示的任一DNA序列，SEQ IDNo.133-135；(b)图22所示之DNA序列，SEQ ID.No.89；(c)图28a所示的281位到557位核苷酸所表示的DNA序列，SEQ ID No.133；(d)可同上文(a)、(b)或(c)中所示序列中任何一个杂交的DNA序列。
本发明的另一方面应用了这一事实，即神经胶质生长因子和P185erbB2配体蛋白为同一基因所编码。由此基因衍生出各种各样的信使RNA剪切变异体(及其所致蛋白)，其中许多蛋白产能结合并激活P185erbB2。已使用该基因(GGF-II)的几种产物显示具有促施旺细胞有丝分裂活性。本发明提供了将GGF/P185erbB2配体基因的所有已知产物作为施旺细胞促有丝分裂剂的用途。(于上文所列参考文献中说明)。
本发明也涉及其它非天然分离出的神经胶质生长因子基因的剪切变异体。图30，给出了通过聚合酶链式反应实验(由反转录RNA进行)和cDNA克隆分析(如文中提供)而得知的剪切形式，以及由已发表的编码P185erbB2配体蛋白的序列(Peles等，《细胞》69205，1992和Wen等，《细胞》69599，1992)所得知的剪切形式。连同其它在本文中公开的剪切形式，这些形式代表了存在的可能剪切形式。因此本发明的另一方面涉及编码由此基因而来的新型蛋白因子的核苷酸序列。本发明也提供了这些因子的制备方法。这些新因子的治疗应用是本发明的另一个方面。
因此，本发明的其它重要方面是(a)一系列具有促神经胶质细胞有丝分裂活性包括刺激施旺细胞分裂的人和牛多肽因子。这些肽序列于图31、32、33和34，SEQ ID Nos 136-137，173中分别列出。。
(b)一系列具有促神经胶质细胞有丝分裂活性并能刺激施旺细胞分裂的多肽因子，它们已经纯化并鉴定。其方法参见下列文献LuPu等，《Science》2491552，1990；LuPu《美国国家科学进展》USA892287，1992，Holmes等，《科学》2561205，1992；Peles等，69205，1992；Rarden和Peles，《生物化学》303543，1991；Dobashi等，《美国国家科学进展》，888582，1991；Davis等，《生化及生物物理研究通讯》，1791536，1991；Beaumont等，PCT专利申请PCT/US91/03443，1990；Greene等，PCT专利申请PCT/US91/02331，1990；Usdin和Fischbach，《细胞生物学杂志》103493-507，1986；Falls等，《冷泉港生物专题季刊》，55；397-406，1990；Harris等，《美国科学进展》887644-7668，1991；和Falls等，《细胞》72801-815，1993。
(c)一种具有神经胶质细胞促有丝分裂活性并能刺激施旺细胞分裂的多肽因子，其氨基酸序列示于图32，SEQ ID.No.148，它由图32SEQ.ID.No.148所示牛DNA序列所编码。
上文所述并在图31、32、33、34、SEQ.ID.Nos136-150，173-176，178，42-44，77中分别列出的新型人多肽序列代表了一系列能从天然来源<适宜组织中制备的cDNA文库>的以全长互补DNAs(cDNAs)形式分离出的剪切变异体，或者由该领域中技术人员从单个外显子<例分离出的外显子>组合成DNA构建体。
能同P185erbB2受体特异结合的其它化合物，特别是肽类，也可按照本发明用作神经胶质细胞促有丝分裂剂。某种推荐化合物可按P185erbB2结合与否作常规筛选，如果结合，则可用本文中所阐述的方法筛选其神经胶质细胞促有丝分裂活性。
本发明包括任何不显示明显降低活性的上述多肽因子的修饰或等同物。例如，氨基酸组成或顺序发生改变但对活性并无大的不利影响的修饰包括在内。依照说明的方法，天然蛋白的突变在EP-A109748中加以公开，其中通过以中性氨基酸替换天然序列中与生物活性无关的任一半胱氨酸的方法避免了不需要的二硫键。本文中所包括的效果和应用的陈述均据此构思，使那些运用修饰或等同物的效果和应用成为本发明的一部分。
本发明中的新序列体现了重组技术的益处，本发明包括下列方面(a)包括上面所限定的DNA序列的DNA构建体，由该构建体转化选定的突主细胞之后，在该宿主内，该DNA序列位于载体内可操作的读框位置(其定位相对控制序列而言可使序列表达)含可控起动子的控制序列，如色氨酸起动子)。应该注意到起动子和调控序列(如果有)的选择均是本技术领域中技术人员的一般性选择知识。
(b)经导入在(a)中所述的构建体而被修饰的宿主细胞，该所述的DNA序列可在所述的宿主细胞中得到表达-宿主细胞的选择并不关键，被选细胞可以是原核或真核，也可以是经本领域的已知方法遗传上加以修饰而导入了特定构建物的细胞；(c)制备前文所指定的因子的过程包括在能使该DNA序列得以表达条件下培养经修饰的宿主细胞，这些条件可由重组DNA技术领域中的技术人员针对任何指定实施方案很容易的确定。通过本方法制备的神经胶质细胞促有丝分裂剂均被包含于本发明中。
在本领域中，没有任何其它种因子具备本新型多肽因子所有的各项特性。
如文中所述，用于鉴定本因子的施旺细胞试验采用了胎牛血浆的基本成分。除了以10％FCP代替10％FCS外，该试验在所有其它方面均与Brockes等在《酶学方法》(同上)中所说明的方法一致。这种差异在试验中是相当重要的，因为胎牛血浆(相对于血清)中无血小板来源的因子可通过消除了可能源自其它因子的假效应，从而能给出一个严谨的作用于施旺细胞的活性的定义。
本发明还包括文中所指定的多肽的制备过程，其中包括抽提脊椎动物脑材料获取蛋白，将所得的抽提物经羟基磷灰石HPLC层析纯化，然后将各组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集具有可观测到的分子量范围在30KD到36KD，和/或55KD到63KD的组分。在两种情况下，将各组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并使用下列分子量标准
溶菌酶(鸡蛋清)14,400大豆胰蛋白酶抑制剂21,500碳酸酐酶(牛) 31,000卵清白蛋白(鸡蛋清)45,000牛血清白蛋白 66,200磷酸化酶B(兔肌肉) 97,400对于小分子量组分，可进行还原或非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，而大分子量组分，则进行非还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后在胎牛血浆条件测试各组分刺激大鼠施旺细胞分裂的活性。
优选的是上述过程通过进行羧甲基纤维素层析如从牛垂体材料中分离各相关组分开始的，最好也在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳前进行羟基磷灰石HPLC，阳离子交换层析，凝胶过滤和/或反相HPLC纯化。在该过程的每一步骤中，可基本上按Brockes在《酶学方法》(同上)中所说明的方法，除了以10％FCP代替10％FCS进行试验，用施旺细胞掺入放射性碘脱氧尿嘧啶来测试其活性。如前文提及，本实验中对CNS或PNS细胞，例如施旺细胞的促有丝分裂效果本身而言也是本发明的方面之一。
因此，本发明同时也包括了对神经胶质细胞促有丝分裂活性的试验，其中胎牛血浆本底被用作评估所试验物质刺激神经胶质细胞中DNA的合成情况。
本发明的另一方面是由上文所定义的任一因子，必要时佐以可接受的稀释剂，载体、赋形剂或以单一药剂形式制成药剂以供人或动物使用。在应用本发明因子时，可实施传统的医学实践以提供合适的配方或组合物。
因此，本发明所配药剂可用于大肠道形式给药，例如静脉内、皮下、肌肉内、眼眶内、眼内、心室内、颅内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、以及局部，鼻孔内、气雾剂形式、划痕式、口腔、面颊、直肠，阴道等方式给药。
本发明所制药剂也可通过在病人体内转植入表达本发明DNA的宿主细胞的方式给药，或者通过外科手术植入该药以在病人体内释放。
非肠道药可以是液体或悬浊液；口腔给药则可是片剂或胶囊；鼻腔给药则可以是粉剂，滴鼻液或气雾剂。
本领域所周知的制配成药的方法可在如“Remington药物科学”中找到。非肠道药可含例如赋形剂、无菌水、盐水或聚乙二醇类物质，如聚乙烯乙二醇、植物油、水化萘，以及生物相容并可被降解的交脂类多聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，以用于控制本发明因子的释放。其它潜在可用的非肠道释放系统可辅以包括乙烯-醋酸乙烯脂共聚颗粒、渗透泵、移植性输注系统和脂质体。用于吸入式给药的配方可包括赋形剂，如乳糖，也可是液体制剂，如含聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐、脱氧胆酸盐，或者是油状液制剂用以滴鼻液方式给药，又或是以胶形式施于鼻内。非肠道给药配方也可包含甘氨胆酸盐以用于面颊给药，含甲氧水杨酸脂以用于直肠内，或者含柠檬酸以用于阴道内。
本发明因子可作为唯一活性成分使用，也可与其它活性成分结合使用，例如，能促进神经疾病中神经元存活的其它生长因子，或是肽酶，蛋白酶抑制剂能与之结合使用。
本发明药剂中该因子的浓度将依据各种因素加以改变，包括用药剂量，以及用药途径。
一般情况下，本发明因子将以含有0.1％到10％的化合物的生理缓冲液形式用于非肠道方式给药。一般剂量范围是每天每公斤体重1mg到1g；优选剂量范围是每天每公斤体重0.01mg到100mg。给药优选剂量可依病人的病理类型及进展程度、病人总的健康状况、药的组成及给药途径而定。
如上文提及，施旺细胞(周边神经系统的神经胶质细胞)在本发明因子的刺激下进行分裂。周边神经系统的施旺细胞参与支持神经元并构建围绕单个神经纤维的髓磷脂鞘。该鞘对于电冲动从感觉受体到肌肉的正确传导是很重要的。
在许多周边神经疾病中施旺细胞和神经纤维被损坏，或为主要，或为次要原因。许多神经疾病中同时损坏感觉和运动纤维(Adams和Victor，《神经学原理》)。这些疾病中最重要的可能是与糖尿病、多发性硬化症、兰-格-巴氏综合症相关的神经疾病，以及癌症和有毒试剂(其中一些是用于治疗癌症)所引起的神经疾病。
本发明是针对一些普通的原因如感染或外伤引起的神经系统受到损害的情况而进行治疗或预防。因此，本神经胶质细胞生长因子不仅可用于治疗脱髓鞘或丧失施旺细胞的神经系统疾病，同时对周边神经损伤所引发的神经系统疾病也有相当价值。在周边神经受损后，再生过程是以施旺细胞的生长和重建为先导，其后才是神经纤维的再生到其靶位。通过加速施旺细胞的分裂，就能促进损伤后的再生进程。
类似方法可用于治疗中枢神经系统(脑和脊髓)的损伤和神经变性的疾病。
有许多神经胶质细胞瘤，其中最普遍的一种可能是神经纤维瘤，它是由神经胶质细胞过度生长而形成的斑状小肿瘤。同时，也可注意到非常相似于GGF的活性在一些施旺细胞瘤中也存在，因此本因子与其受体作用的抑制剂提供了一种对神经胶质肿瘤的治疗方法，即施用有效量的物质以抑制上述因子与受体的结合。
总的来说，本发明包括该多肽因子在由对该因子敏感或具反应性的细胞参与的神经系统的任何病生理状态的预防和治疗中的作用。
本发明的多肽因子也可作为免疫原以制造抗体，例如按标准技术制造的单克隆抗体，这类抗体也包括于本发明中。这些抗体随后可用于治疗或诊断目的。因此，那些与该因子水平不正常相关的状态也可用这类抗体检查到。利用标准方法，体外技术也可用于对分离出的样品进行分析。成像技术也可用于其中，例如将抗体以放射性同位素标记，利用肿瘤成像的最新技术可于体外成像。
本发明也包括本因子作为神经胶质细胞促有丝分裂剂在体内及体外的一般应用及被应用的这类因子本身。通过注射有效剂量的本发明因子而在脊椎动物体内产生神经胶质细胞有丝分裂效果的方法即为其一特殊实施方案。本发明优选实施方案即是那种预防或治疗神经系统紊乱或疾病的方法。
本发明的更普通的方面是本发明因子在制药中的应用，尤其是用于制造用作神经系统疾病或紊乱的治疗或神经的修复、再生的药物。
本发明同时也包括了该因子在鉴定和定量具有相应于该多肽的受体结合特性的分子的竞争性试验中的应用。该多肽可选择性的用放射性同位素标记。竞争性试验能鉴定相关受体的拮抗剂和促进剂。
另一方面，本发明提供了该因子在亲合分离过程选择性地包括亲和层析中的应用，用于分离各相应受体。这一分离相应于蛋白的受体的方法为本领域所熟知，并且有相当多的技术可应用于本发明因子。例如，就IL-6和INFr而论，读者可参考Novick.D.等，《层析杂志》1990，510331-7。关于促性腺激素释放激素可参考Hozum.E.，《层析杂质》1990，510233-8。关于G-CSF可参考Fukunaga.R.等《生物化学杂志》，26513386-90。关于IL-2可参考Smart.J.E.等，1990，《皮肤病研究杂志》，94158s-163s。关于人γ-干扰素可参考Stefanos.S.等，1989，《干扰素研究杂志》9719-30。
附图的简述图将被首先说明。


图1到图8与实施例1相关，并简述如下图1为羧甲基纤维素层析得到的产物的分离图谱。
图2为羟基磷灰石HPLC层析得到的产物的图。
图3为Mono S FPLC层析得到的产物的分布图。
图4为凝胶过滤FPLC层析得到的产物的分布图。
图5和图6为反相HPLC层析得到的两种部分纯化的多肽产物的图。
图7和图8说明的是以胎牛血浆为背景经反相HPLC纯化的GGF-I和GGF-II组分的剂量-反应曲线。
图9到图12列出了源于GGF-I和GGF-II的肽段序列。SEQ ID.Nos 1-20，22-29，32-53和169，(参见下文实施例2)，图10和图12特别说明了新的序列。
图10表A中，列出了用于设计简并寡核苷酸探针和简并PCR引物的GGF-I肽段序列。(SEQ ID Nos 20，1，22-29和17)。表A中的一些序列也可用于设计合成肽，表B列出了那些太短(少于6个氨基酸)而不能用于设计简并探针和PCR引物(SEQ ID Nos 17和25)的新型肽序列。
图12表A中，列出了用于设计简并寡核苷酸探针和简并PCR引物的GGF-II肽段序列(SEQ ID Nos45-52)。表A中的一些序列也可用于设计合成肽，表B列出了那些太短(少于6个氨基酸)而不能用于设计简并探针和PCR引物(SEQ ID No.53)的新型肽序列。
图13到图20同实施例3相关，下文中说明了本发明因子的促有丝分裂活性。
图21到图28(a、b和c)同实施例4相关，简述如下图21列出了由图10表A和图12表A中的新型肽序列设计而来的简并寡核苷酸探针(SEQ ID Nos54-88)图22(SEQ ID No.89)列出了一段源自重组牛基因组噬菌体GGF2BG1的推测的牛GGF-II基因序列，包括了简并寡核苷酸探针609和650(分别参见图21，SEQ ID Nos.69和72)的结合位点。此图为该DNA序列的编码链以及由第三读框推导出的氨基酸序列。由因子2(实线)来的第12肽序列是66个氨基酸开放读框(核苷酸75-272)的一部分。
图23是指简并PCR引物(表A，SEQ ID Nos.90-108)和用于实验中从垂体后叶中分离出的以RNA形式存在的牛GGF-II编码序列片段的特定PCR引物(表B SEQ ID Nos 109-119)图24列出了9个特异的相邻的牛GGF-II cDNA结构，以及利用图7表A和表B所列引物，和从垂体后叶分离出的RNA进行PCR扩增实验所得到的序列。本图最上一行是在cDNA特定结构中起作用的编码序列的简图。
图25是牛重组唾菌体GGF2BG1的物理图谱，其中牛的区段约20kb长，含有牛GGF-II基因的2个外显子(实线)。XbaI、SpeI、NdeI、EcoRI、KpnI和SstI的切割位点已经标在该图谱上，阴影部分是指被亚克隆的以用于测序的片段。
图26为推测的牛GGF-II基因的三种可替换基因产物的结构简图。外显子按其被发现的顺序从A到E列出。另一种的剪切形式1、2和3产生3种可导出的重叠蛋白结构。(GGF2BPP1、2和3)它们示于图28a、b、c中(如下文所述)。
图27(SEQ ID Nos 120-132)是在图28a、28b和28c(如下所述)所示的推导出的蛋白序列中所鉴定的GGF-I和GGF-II与列于图10和图12中新型肽序列的比较。本图表明了九种新型GGF-II肽序列中的六种可由这些推测的蛋白序列加以说明，同时也可找到两种类似于GGF-I序列的肽序列。
图28a(SEQ ID No.133)列出了编码链DNA序列以及由图26中所示的剪切形式所得到的cDNA推导出的氨基酸序列。这一推测的牛GGF-II基因的部分cDNA编码一个长206个氨基酸的蛋白。粗体表示的肽是从图10和图12中列出的肽中鉴定出的。可能的糖基化位点以底下划线表示(连同聚腺苷化信号AATAAA)。
图28b(SEQ ID No.134)是一个编码链的脱氧核糖核酸序列及从在图26中剪切形式No.2获得的cDNA推导得到的氨基酸序列。推定的牛的GGF-II基因的这部分cDNA编码长281个氨基酸的蛋白质。粗体形式表示的肽链是在图10和12列出的序列中鉴定得到的。潜在的糖基化位点加下划线标著(连同聚腺苷化信号AATAAA)；图28c(SEQ ID No.135)是一个编码链的脱氧核糖核酸序列及从在图26中剪切形式No.3获得的cDNA推导得到的氨基酸序列表。推定的牛的GGF-II基因的这部分cDNA编码257个氨基酸长度的蛋白质。粗体表示的多肽是在图10和12的列出的序列中鉴定的。潜在的糖基化位点加下划线(连同聚腺苷化信号AATAAA)；图29，涉及实施例6，是一张通过southern blot显示推定的牛GGF-II基因序列和许多哺乳动物脱氧核糖核酸的基因序列的交叉杂交分析放射自显影照片。滤膜上包含了图上所列各种被EcoRI消化的脱氧核糖核酸(每泳道5微克)。探针在每一种脱氧核糖核酸样品中都检测到单一的强带，包括一个由图25中的物理图谱所预测的牛脱氧核糖核酸中4kb的片段。也可以观察到一些相对弱小强度的条带，可以代表相关脱氧核糖核酸序列。从每个其它哺乳动物脱氧核糖核酸样品得到的强杂交带大概地代表那些种类的GGF-II同源性。
图30是一个典型的剪切突变体的图。
由F，E，B，A，G，C，C/D，，C/D′，D，D′H，K，和L代表这些编码区段，得自纯化的蛋白质的多肽序列的定位被指定位“0”。
图31(SEQ ID Nos.136-147，160，161，173-178，42-44，77)是脱氧核糖核酸序列和预测的GGF的编码区段的肽序列的列表。
第1行是预测的牛GGF基因序列的氨基酸序列的列表，第2行是牛GGF的核苷酸序列，第3行是人类GGF(heregulin)的核苷酸序列(核苷酸碱基的配对以竖线表示)。第4行是预测的人类GGF/heregulin的氨基酸序列的列表。编码区段E，A′和K仅仅代表牛类的序列，编码区段D′仅仅代表人类(heregulin)序列。
图32(SEQ ID No.148)是预测的GGF之氨基酸序列和BPPS的核苷酸序列。上行是核苷酸序列而下行是预料的氨基酸序列。
图33(SEQ ID No.149)是预测的GGF2BPP2的氨基酸序列和核苷酸序列。上行是核苷酸序列而下行是预料的氨基酸序列。
图34(SEQ ID No.150)是预测的GGF2BPP4的氨基酸序列和核苷酸序列。上行是核苷酸序列而下行是预料的氨基酸序列。
图35(SEQ ID Nos.151-152)以人类EGF(hEGF)校正两个GGF多肽序列(GGF2bpp4和GGF2bpp5)。星号表明保守的半胱氨酸位置。
图36描述GGF活性水平(施旺细胞促有丝分裂实验)和一个约200KD的蛋白质酪氨酸磷酸化反应与GGF量增长相对应的情况(抗磷酸化酪氨酸多克隆抗体做的Western Blot放射自显影照片上200kd条带的强度)。
图37是一个从图31中的序列衍生的剪切变异体。
图38是EGFL1(SEQ ID No.为154)预测的氨基酸序列(底部)和核酸序列(顶部)。
图39是EGFL2(SEQ ID No.为155)预测的氨基酸序列(底部)和核酸序列(顶部)。
图40是EGFL3(SEQ ID No.为156)预测的氨基酸序列(底部)和核酸序列(顶部)。
图41是EGFL4(SEQ ID No.为157)预测的氨基酸序列(底部)和核酸序列(顶部)。
图42是EGFL5(SEQ ID No.为158)预测的氨基酸序列(底部)和核酸序列(顶部)。
图43是EGFL6(SEQ ID No.为159)预测的氨基酸序列(底部)和核酸序列(顶部)。
图44是该克隆的大规模编码区段图谱。T3指的是细菌噬菌体的启动子，用于从克隆产生mRNA。R是限制性内切酶EcoRI位点。5′UT指5′非翻译区。E，B，A，C，C/D′，以及D指的是编码区段。0是翻译的启始的位点。^是与牛的E片段同源的5′限制区(参见实施例6)和3′UT指的是3′非翻译区。
图45是预测的GGF2HBS5的氨基酸序列(中间)和核酸序列(顶部)(SEQ IDNo.167)。底部(间断的)序列代表从GGF-II制剂推知的多肽序列。(参见图11，12)。
图46是一张描述重组人和牛胶质生长因子的施旺细胞促有丝分裂活性的图表。
图47是一个剂量反应曲线，描述以CHO细胞条件培养基的不同剂量样品给药后施旺细胞增殖活性的数据。
图48是一个剂量反应曲线，描述利用含有GGF2HBS5的cDNA克隆的杆状病毒转染的SF9昆虫分泌到胞外培养基中的促神经细胞有丝分裂的活性。
图49是用GGF多肽抗体进行的重组CHO细胞的条件培养基的Western blot。
图50(A)是一从阳离子交换柱洗脱下来的重组(COS细胞产生)人GGF-II(γhGGF-II)促施旺细胞增殖的活性的图；图(B)是用针对rhGGF-II特异肽段的多克隆抗体对重组GGFII峰进行的免疫印迹分析。
图51(A)是一用阳离子交换柱对γhGGF-II(CHO细胞产生)进行纯化得到的组分的图表；(B)是用γhGGF-II的特异抗体与(A)中所述的组分样品进行Western blot的照片。
图52是一张描述在用重组神经胶质生长因子处理施旺细胞时的酪氨酸磷酸化作用的凝胶照片。
图53是GGFHBS5，GGFHFBI和GGFBPP5多肽序列(SEQ ID NO.170，171，和172)。
图54是CHO细胞表达载体pcDHFRpolyA的图谱。
图55是cDNA编码的成熟的hGGF2的氨基酸序列(SEQ ID NO.179)。
本发明祥述本发明涉及新的神经胶质生长因子的分离和纯化和编码这些因子的DNA序列的克隆。本发明的其他部分是几种基因剪切变异体，它们潜在地编码一系列神经胶质细胞生长因子。特别是GGF2HBS5，编码与牛的GGF-II等效的人GGF的一种变异体。很明显，编码GGF蛋白和p185erbB2结合蛋白的基因产生很多大小不同的，被不同程度剪接的RNA转录物，它们可产生一系列长度不同，同时又含有共同序列及一些特定序列的蛋白。经过不同程度剪接过的序列可以从牛的脑垂体后叶RNA，人乳腺癌RNA(MDA-MB-231)(Holmes et al.“科学”Science 2561205(1992))和鸡脑中的RNA(Fall et al“细胞”Cell.721-20(1993)重新获得(如这里所述)。进一步的证据来自那些有着广泛大小范围的蛋白质，它们既可以作为施旺细胞的有丝分裂刺激原(在下面公开)，也可作为p185erbB2受体的配体(见下文)通过对比编码GGF和p185erbB2的基因的核苷酸序列，两者同源的事实得到了进一步证明(科学，Science256(1992)，1205-1210)。Holmes等人论述一种分子量为.45千道尔顿的可以和p185erbB2受体蛋白特异结合的蛋白的纯化方法。受体蛋白p185erbB2和几种人的恶性肿瘤相关。几种编码Heregulin-α的互补DNA克隆已经被分离出来。Peles等(“细胞”Cell 69205(1992))和Wen等(“细胞”Cell 69559(1992))论述了从大鼠细胞分离出1.互补DNA，此DNA编码一个被称为“神经分化因子”(NDF)的蛋白。NDF互补DNA的转录产物具有和p185erbB2结合的活性。Usdin和Fischbach，细胞生物学杂志，J.Cell.Biol.103493-507(1986)；Falls等，冷泉港生化分析会议录55397-406(1990)；Harris等“美国国家科学进展” ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA887664-7668(1991)；Falls等，“细胞”Cell72801-815(1993)论述了一个分子量为42KD的糖蛋白的纯化，它可以和受体蛋白p185erbB2相结合，并论述了几种互补DNA克隆的纯化(Falls等“细胞”72801-815(1993))。另外几组研究人员已经报道了具有p185eroB2结合活性的各种分子量大小不同的蛋白的纯化。这些科学工作者包括Lupu等，1992，“美国国家科学进展”892287；Yarden和Peles(1991)“生物化学”303543；Lupu等(1990)“科学”2491552；Dobashi等(1991)“生物化学和生物物理研究通讯”Biochem.Biophys.Res.Comm.，1791536；Huang等(1992)“生物化学杂志”J.Biol.Chem.25711508-11512。其他实施方案本发明包括和图31(SEQ ID No.136-147，160，161，173-178，42-44，77)中的编码片段实质上同源的任何蛋白，也包括其它自然产生的GGF多肽。还有的是等位基因突变，自然突变，诱导突变，在任何高或低水平的严格的条件下，与自然产生的核酸杂交的DNA所编码的蛋白(对高或低严格条件的定义见“当代分子生物学指导”，JohnWiley&Sons，NewYork，1989，6.3.1-6.3.6详见参考文献)，以及被抗GGF多肽的血清特异结合的多肽或蛋白。该术语也包括含有来自图31的GGF肽段的嵌合多肽。
以下的实施例并不是为了限制本发明而同样是为了给出一个有用的说明，并为有效的制备技术提供特别的指导。
如在实施例3中看到，此种因子对一些细胞类型表现出促有丝分裂的活性。与成纤维细胞相关的活性表明它的伤口修复功能，而本发明包含了这种应用。有关制剂和/或药物及其制造的本发明的简洁陈述将清楚地逐一体现在适当的产品和应用中。这显然是一个合理的展望，所给出的报告是和成纤维生长因子FGFs具有相似活性。参见，例如，Sporn等，“多肽生长因子及它们的受体”中的396页(Baird和Bohlen)，题为“伤口愈合和组织修复中的FGFs”实施例1从牛的脑垂体纯化GGF-I和GGF-III.CM因子组分的制备将4000个冷冻的完整的牛的脑垂体(约12kg)过夜融化，水中轻洗，分批在有同体积的0.15M硫酸铵溶液的一个搅拌器中匀浆。用1.0M的HCL将匀浆液pH调至4.5并在1×4900g离心80分钟。上清中的任何脂质都可在通过玻璃丝时被滤去。当用1M的NaOH将上清的pH调至6.5后，加入固体硫酸铵至饱和度36％。搅拌数小时后，4900g离心80分钟，沉淀弃去。用玻璃丝过滤后再向上清中加入固体硫酸铵至溶液饱和度为75％，再搅拌数小时后，4900g离心80分钟沉淀重悬于两升0.1M的磷酸钠pH6.0溶液中，并在40升同样的缓冲液中透析3次，当确定电导率小于20.0西门子时，以每分钟2ml的流速上样于装有羧甲基纤维素(CM-52，华特曼)的生物处理柱(120×113mm，Pharmacia)。柱子先用两倍体积pH为6.0的0，1M的磷酸钠溶液冲洗，接着是两倍体积50mM的NaCL溶液，最后是两倍体积含有0.2MNaCL的同样的缓冲液冲洗。在最后的步骤，收集到10ml(5分钟)的组分，将从第78到118份的样品合在一起，用10倍体积的10mM的Ph6.0的磷酸钠溶液透析两次，然后以100000g离心60分钟澄清。II.羟基磷灰石柱HPLC至今为止，HPLC羟基磷灰石柱并不是一种用于分离神经胶质细胞生长因子的技术，但在本发明中却证明为一种有效的方法。从以上CM纤维素凝胶色谱柱获得的样品，先经过0.22μm滤膜(Nalgene)过滤后，室温上样于一个装有预柱(15×25mm，Biorad)的高效羟基磷灰石柱(50×50，Biorad)上，该柱已用10mM磷酸钾pH6.0的溶液平衡，然后以2ml/分的流速和如下线性梯度进行洗脱时间(分)B％ 溶剂A10mM磷酸钾，pH6.00.0 0 溶剂B1.0M磷酸钾，pH6.05.0 07.0 2070.020150.0100180.0100185.00在梯度洗脱中，以每份6.0ml(3分钟)的量按份收集，39-45份合并在一起，并在10体积的50mM的Ph6.0的磷酸钠溶液透析。III Mono S FPLC柱对一浓度较高的样品，经过Mono S FPLC柱之后，可以为其后的凝胶过滤做好准备。
从羟基磷灰石柱上收集下来的样品以100,000g自旋澄清的方式除去其中的任何颗粒状物质，再上样于一个HR10/10 Mono S阳离子交换制备柱(100×10mm，Phamacia)，在常温下以1.0ml/min的流速用pH6.0的50mM的磷酸钠溶液再平衡。在此条件下，结合的蛋白用以下的所示的线性梯度程序来洗脱。时间(分) ％B溶剂A 50mM磷酸钾 pH6.00.0 0 溶剂B 1.2M氯化钠 50mM磷酸钠 pH6.070. 030240.0100250.0100260.00在整个梯度洗脱中以每份1ml(1分)来按份收集。99-115份收集在一起。IV凝胶过滤柱FPLC这一步涉及本发明两个因子的分离，然后进行最终纯化，得到含量丰富的组分。
为达到这一目的，按照厂商指导说明，填充了一个Superose 12 FPLC制备柱(510×20mm，Pharmacia)。为标定此制备柱，根据厂商指导说明，检测其理论塔板数，测得其值为9700理论塔板数。
在室温下，从Mono S洗脱下来的样品以2.5ml等分的量上样于Superose12 FPLC柱，此制备柱于50mM磷酸钠，0.75NaCL PH6.0(预先经过一个C18反相柱)洗脱，流速1.0ml/min。加样后35分钟，以每份1ml(0.5分钟)按份收集，每次循环的第27份至41份(GGF-II)和42份至57份(GCF-I)分别收集在一起。V反相HPLC上述Superose12柱收集的GGF-I和GGF-II分别被分成三等份，每一份上样于一个C8反相柱(Aquapore RP-300 7μ C8 220×4.6mm，应用生物系统)以一个保护筒保护(RP-8，15×3.2mm，应用生物系统)，并且以0.5ml/min流速在40℃平衡，蛋白按照这些条件和利用下面的线性梯度洗脱。时间(分) ％B溶剂A0.1％三氟乙酸(TFA)0溶剂B90％乙腈，0.1％的三氟乙酸6066.662.0 10072.0 10075.0 0在梯度洗脱开始后15.2分钟，200ml(0.4分钟)份收集在硅化过的管子中(Multitube管，Bioquote)VI.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在这一步应用了低范围的蛋白分子量标准，目录号161-0304，此标准品出自英国Watford，Bio-Rad有限实验室，采用的蛋白和分子量标准都在以前列出过。
从反相柱上所得的47份至53份(GGF-I)和61份至67份(GGFII)分别合并。7μl此反应物和等体积的0.0125M Tris-HCL，4％SDS，20％甘油，和作用于GGF-I的10％β-巯基乙醇一起煮沸5分钟，并上样于有4％积层胶的11％聚丙烯酰胺Laemmli凝胶。加50伏电压后，电泳16小时。然后固定并以银染法染色(Amersham)。在此条件下，能看到各因子有分散的几条带，根据蛋白标准品，能判断出相对分子量30000道尔顿至36000道尔顿(GGF-I)和55000道尔顿至63000道尔顿(GGF-II)。从染色的胶上能见到能见到从反相柱上所得样品中有少量相当于GGF-I，GGF-II水平的其他蛋白。VII三氟乙酸中的稳定性在三氟乙酸存在下，获得了本发明因子的稳定性资料，如下所述GGF-I从反相HPLC柱上制备的物质，置于0.1％三氟乙酸和乙腈中。
在上柱的12小时期间和这之后的于40℃孵育10周内，一直分析此样品，发现在孵育之后GGP-I仍保留的活性至少是从柱上直接下来的样品活性的50％。GGF-II从反相HPLC柱上制备的样品，放于0.1％的三氟乙酸和乙腈中，保存于-20℃。在其解冻后和40℃孵育4天之后，再检测此样品。孵育之后，GGF-II仍有至少为刚刚解冻样品活性的50％。
用于上述研究中的三氟乙酸浓度是反相色谱柱中最常用的浓度。VIII活性的分析条件除非特别指出，所有的操作都在37℃进行，并参照图1和图6。在每个阶段的活性检测都使用经如下方法修正的Brockes(Meth.Enz.Supra)技术。即在准备施旺细胞时，除了加上DMEM培养基(Dulbecco改进的伊格尔氏培养基)，PCS和GGF之外，还加上5mM的forskolin。
在分析中应用的细胞是无成纤维细胞并且传代次数少于10次的施旺细胞。这些细胞用胰蛋白酶从试管中转移并按每孔3300细胞的方式铺板于96孔板的底部。
在检测溶液加入之后最后24小时再加入[125I]IUdR，每个分析掺入的背景(未刺激)小于100个cpm，并且依施旺细胞培养的批次和传代次数，最大掺入量是背景的20-200倍。
从如上所述的反相HPLC得到的GGF-I和GGF-II的收集液，用和上述完全一样的每个因子的曲线，以及用每种分析方法修改的上述方法，所不同的是用牛胎血浆代替牛胎血清而得到其它因子的曲线，得到了针对每种因子的两条剂量反应曲线。结果如图7和8所示。实施例2 纯化的GGF-I和GGP-II的氨基酸序列氨基酸序列分析研究是用高度纯化的牛垂体GGF-I和GGF-II来进行。以传统的单字母密码描述序列。对还原化且羟基甲基化的样品用赖氨酸肽内切酶及V8蛋白酶消化得肽段，其中GGF-II的赖氨酸肽内切酶降解是利用从11％SDS-PAGE的55-65 RD区(分子量相当于以上引用的分子标准)洗提得到的材料进行的。
降解GGF-I得到总共21种肽序列(见图9，SEQ ID Nos 1-20，169)，其中12种肽(见图10，SEQ ID Nos.1，22-29，17，19和32)不存在于现有的蛋白数据库中，因此代表着一些独有的序列。对于GGF-II得到总共12种肽序列(见图11，SEQ ID Nos.33-39，51，52，164-166)，其中10种肽(见图12，SEQ ID Nos.45-43)不存在于现有的蛋白数据库，因此是一些独有序列(有一例外是肽GGP-II06，它显示许多蛋白具有的相同序列，因此在给予少量残基的情况也许它没有意义)。这些新序列非常可能和GGFsI及II的部分真实氨基酸序列相一致。
GGFI-I07和GGF-II12的序列尤其值得重视，此两者显然是非常相关，这种相似性说明这些肽的序列几乎肯定是GGF族蛋白，不可能来自污染蛋白。
另外，在肽段GGF-II02，序列XSS与位点X的天冬氨酸上N连接的碳水化合物成分的出现相一致。
一般在图9和图11中，X代表一个测序周期中无法确定称呼的位置上未知的残基，这是因为该测序周期同一位置可能有多个相同大小的信号或者因为就没有信号。星号指示那些最后一个氨基酸与现在所示肽段所说的最后一个氨基酸相同的肽段。在剩余的肽段中，所述最后一个氨基酸的信号强度没有足够的能力将序列持续到那条肽的末端。右边一拦表示用GCG软件包中的FASTA和TFASTA程序进行计算机数据库检索，来分析NBRF和EMBL序列数据的结果。在这一栏中，只要肽段序列中不同的氨基酸不超过两个，即可认为是相同名称的蛋白。问题标记表明有3个不同错配也是允许的。它们的简写如下所示。
HMG-1 高变动性蛋白-1组HMG-2 高变动性蛋白-2组LH-α黄体化激素α亚基LH-β黄体化激素β亚基实施例3 纯化后的GGF-I和GGF-II的促有丝分裂活性对于经过高度纯化的含有GGF-I和GGF-II的样品的促有丝分裂活性的测定采用一种定量的方法，此法只需一个微培养就可以进行DNA合成，细胞形态，细胞数目以及细胞抗原表达的检测。这项技术是由Muir等人以前发表的一种方法(分析生物化学185，377-382，1990.)改进而来。主要的改进在于1)使用非包被的滴定板，2)每孔的细胞数，3)用5％的胎牛血浆(FBP)代替10％的胎牛血清(FCS)，4)在同时加入培养基的有丝分裂剂和溴脱氧尿苷(BrdU)存在时的孵育时间。此外单层细胞在固定前不清洗以避免细胞损失，同时鼠抗BrdU的单克隆抗体同过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白抗体的孵育时间也加倍以增加测定的灵敏性。这种适用于大鼠坐骨神经施旺细胞的测定方法在对细胞培养条件作适当修改后也可用于几种其它的细胞系的测定方法。I.有丝分裂检测方法第一天，纯化后的施旺细胞接种于含5％FBP/DMEM的非包被的96孔板(5,000细胞/孔)，第二天，向培养物中加入GGFs或其它测试因子，同时加入BrdU至终浓度为10mM。48小时后(第四天)吸出培养基以终止BrdU的掺入，加入200μl/孔70％的乙醇，室温固定细胞20分钟。接着用水清洗细胞，用100μl 2N HCl 37℃温育10分钟使DNA变性，吸出液体后，向每孔中加入pH9.0，0.1M硼酸缓冲液中和残余的酸，用磷酸缓冲盐水PBS清洗细胞，将细胞用50μl封闭缓冲液(PBS含0.1％Triton X 100和2％正常山羊血清)37℃处理15分钟。吸出液体后，加入鼠抗BrdU单克隆抗体(Dako公司，Santa Barbara，CA)(50μl/孔，在封闭缓冲液中稀释至1.4g/ml)并在37℃温育2小时。用含0.l％Triton X-100的PBS清洗三次除去未结合的抗体，再加入过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG抗体(Dako公司，Santa Barbara，CA)(50μl/孔，在封闭缓冲液中稀释至2μg/ml)37℃温育1小时。PBS/Triton清洗三次，再用PBS清洗一次后，加入100μl/孔含0.05％可溶性色素原氧-苯二胺(OPD)及0.02％过氧化氢的50mM磷酸/柠檬酸缓冲液，pH5.0。室温反应5-20分钟后从每孔中吸出80l液体转至一个含40μl/孔2N硫酸的干净的96孔板以终止反应。用Plate reader(Dynatech Labs)记录490nm的光吸收值，含单层细胞的测试板经PBS清洗两次后加入100μl/孔的底物二氨基联苯胺(DAB)和0.02％过氧化氢以产生不溶性的产物对BrdU-DNA进行免疫细胞化学染色，10-20分钟后用水清洗终止染色反应，用倒置显微镜对BrdU4-阳性的核进行观察和计数，某些情况下可用0.001％的甲苯胺蓝对阴性核进行负染，计数方法如前所述。II.用于检测有丝分裂的细胞系Swiss 3T3纤维母细胞细胞来源于Flow Labs，在补充了10％FCS，青霉素和链霉素的DMEM培养基中于37℃含10％CO2的潮湿空气中培养。细胞每两天补加培养基或传代一次。对于促有丝分裂活性检测，将细胞以5,000细胞/孔的密度接种于完全培养基中并温育一星期直至细胞汇合并休眠。移去含血清的培养基，用无血清的培养基清洗单层细胞。每孔加入100μl含有丝分裂剂及10μM BrdU的无血清的培养基并温育48小时。对与GGFs和血清或PDGF(作为阳性对照)反应的不同剂量均进行测定。
BHK(幼龄仓鼠肾)21 C13纤维母细胞细胞来源于欧洲动物细胞培养收藏中心(ECACC)，在含5％磷酸胰蛋白胨，5％FCS，青霉素和链霉素的GMEM培养基(Glasgow Modified EagleMedium)中在含5％CO2的潮湿空气中于37℃培养，细胞每二至三天补加培养基或传代一次。对于促有丝分裂活性检测，将细胞以3,000细胞/孔的密度接种于完全培养基中并培养24小时，移去含血清的培养基，并用无血清培养基清洗，代之以100μl含0.1％FCS的GMEM或仅用GMEM。加入GGFs和FCS或bFGF作为阳性对照，同时加入10μM BrdU，温育48小时。细胞培养物处理方法如前述的施旺细胞。
C6大鼠胶质瘤细胞株在39代收获的细胞，在含5％FCS，5％马血清(HS)，青霉素和链霉素的DMEM培养基中在含10％CO2的潮湿空气中于37℃培养。细胞每三天补加培养基或传代一次。对于促有丝分裂活性检测，将细胞以2,000细胞/孔的密度接种于完全培养基中培养24小时。用无血清的培养基清洗后，以1∶1的DMEM与含0.1％FCS的F12培养基取代原有培养基。对与GGFs，FCS和aFGF反应的各种剂量均进行测定，细胞ELISA测定方法如前述的其它细胞株。
PC12(鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)细胞来源于ECACC，在含10％HS，5％FCS，青霉素及链霉素的RPMI1640培养基中于37℃含5％CO2的潮湿空气的胶原包被的培养瓶中培养。细胞每三天补加80％的新鲜培养基以替换原有培养基。对于促有丝分裂活性检测，将细胞以3,000细胞/孔的密度接种于含完全培养基的经胶原包被的96孔板(50μl/胶原，Vitrogen Collagen公司，1∶50稀释，37℃30分钟)中，温育24小时。之后用新鲜的RPMI培养基或含1mM胰岛素或1％FCS的RPMI培养基取代该培养基。如前例对与作为阳性对照的FCS/HS(1∶2)及与GGFs反应的各种剂量进行测定。48小时后固定细胞如前所述进行ELISA测定。III.促有丝分裂测定结果本例中所有实验样品均为经过Sepharose12层析纯化法(见实施例1，section D)高度纯化过的含GGF-I和GGF-II(GGFs)的样品。
首先，将BrdU掺入测定结果与由J.P.Brockes(酶学方法147217，1987)发表的基于[125]I-UdR掺入分裂细胞DNA的经典的对施旺细胞的促有丝分裂测定法相比较。
图13表示了这两种方法在对同样细胞培养条件下(5,000细胞/孔，在GGFs存在时，在5％FBP/DMEM中温育48小时)所得到的结果的比较。可以清楚地看出，结果很相似，但是从图中曲线左侧的移动趋势可以看出，BrdU掺入法表现得更灵敏一些，例如可以降低GGFs的浓度。
正如“促有丝分裂的检测方法”一节中所描述的，通过测量OPD过氧化物酶反应产生的可溶性产物密度而对具免疫活性的BrdU-DNA定量后，含单层细胞的初始测定平板还可以进行第二次反应，以产生可将BrdU阳性的核染色的不溶性的DAB产物。培养平板还可以再在倒置显微镜下检测以观察细胞形态，BrdU-阳性核及阴性核的数目。
在图14a和14b中，由测定490nm处的吸收值而得出的BrdU-DNA的免疫活性，分别与BrdU-阳性的细胞核数目及在相同的培养物中BrdU-阳性的细胞核占每孔细胞总数的百分比相比较，标准偏差小于10％。这两种评估方法表现出很好的相关性并且这两者在GGFs最高剂量值的差别可以解释为两种方法中可被检测为BrdU-阳性细胞的DNA合成程度的差别。
与[125]I-UdR掺入法相比，BrdU掺入测定法还可以额外提供有关多肽对于施旺细胞的生物活性的有用的信息。例如，图15中的数据显示GGFs可以作用于施旺细胞诱导其DNA合成，但低剂量的GGFs却可以增加48小时后平板培养中阴性细胞的数目。
这种测定方法被用于几种不同来源的细胞株。图16比较了施旺细胞和Swiss3T3纤维母细胞对GGFs的促有丝分裂反应；尽管3T3纤维母细胞获得的反应较弱，仍能在培养物中检测到清楚的BrdU阳性核。同时平行做了在几种不同剂量的FCS和人重组PDGF存在下的对照培养物表明细胞可对适当的刺激作出反应(未列出)。
利用BHK21 C13细胞株对纤维母细胞对GGFs的反应能力进行了进一步的测定，这种来源于肾脏的纤维母细胞在汇合时并未表现出接触抑制或进入休眠状态，因此设计的实验条件在不损伤细胞活性的前提下能得到一个非常低的增殖背景。如图17和图18所示，GGFs对BHK21 C13细胞具有明显的促有丝分裂活性，图17表示的是在0.1％FCS存在下由GGFs刺激BHK21 C13细胞而掺入到DNA中的BrdU。这种在FCS存在下的良好的有丝分裂反应表明细胞培养条件不是限制因素。图18中GGFs的促有丝分裂活性表示为BrdU-阳性与BrdU-阴性细胞数和每孔计数的细胞总数，这两个实验的数据均由重复两次的结果综合而来，每孔细胞最少取三个视野计数。正如所观察到的在低剂量时对施旺细胞有增殖效应，GGFs还增加了非反应细胞的存活数。随着加入至培养基中的GGFs的量不断增加，BrdU-阳性细胞的百分率也成比例地增加。当更高剂量的GGFs存在时，48小时后细胞总数最少增加了一倍，证实GGFs能诱导BHK C13细胞的DNA合成及增殖。在相同条件下，当存在2％FCS时，细胞温育48小时后可以增殖6倍(未列出)。
C6神经胶质瘤细胞为研究神经胶质细胞特性提供了一个很有用的模型，细胞所表现出的表型似乎依赖于细胞代数，在早期细胞表型更接近于星形细胞，晚期(超过70代)更接近于少突神经胶质细胞。这几次实验所用的C6细胞为39代到52代之间，C6细胞是一个具有高度增殖倾向的群体，因此可将实验条件优化至BrdU掺入的背景很低。由对FCS发生反应的剂量(图19)可以看出，0.1％血清的存在对保持细胞活性而不明显损伤促有丝分裂反应是十分必要的。
图20中对aFGF(酸性纤维母细胞生长因子)和GGFs的促有丝分裂反应表示为FCS存在下(8％)所得到的BrdU最大掺入的百分比，该值是两个试验中的两个平行试验的平均值。GGFs的效应可以与纯化后的aFGF制剂相比，据报道，aFGF是C6细胞的一种特异性的生长因子(Lim R.et al.，细胞调节1741-746，1990)，因此被用作阳性对照。由于平板培养中的细胞密度很高，对BrdU阳性细胞和阴性细胞直接计数是不可能的，与迄今为止所报道的其他细胞株成对比的是，当PC12细胞处于可以与sera(常规用作保存细胞的FCS与HS的混合物)反应的培养条件下时，PC12对GGFs不表现出任何明显的反应。然而每孔接种的细胞数似乎能影响PC12细胞的反应行为，因此还需要做更多的实验。实施例4 编码包括GGF-I与GGF-II多肽的蛋白质的核苷酸序列的分离及克隆GGF-II核苷酸序列的分离与克隆按此处描述的方法进行，利用肽的序列信息和文库扫描，按如下方法进行。令人满意的是能以图4和图5中的肽为起点按下述技术路线分离并克隆GGF-I序列，事实上，图21，序列号No.54-88显示了用于此目的可能的简并寡核苷酸探针，图23序列号No.90-119列出了可能的PCR引物。至于GGF-II也应用此方法得到其DNA和多肽序列、插入此DNA序列的DNA构建体和表达载体及由于导入此构成物/载体而改变遗传特性的宿主细胞和培养这种细胞后得到的蛋白。本发明包括此类主题。
I.寡核苷酸探针和引物的设计与合成.
简并寡聚DNA探针是由氨基酸序列(由来源于纯化的GGF蛋白质的肽得到)反转翻成核苷酸序列设计的。寡聚物可以是DNA序列的编码链，也可以是非编码链。当设计的寡聚核苷酸中包含丝氨酸、精氨酸或亮氨酸时，两种不同的合成物分别制备以免混淆。例如在537和538位或609和610位的丝氨酸由TCN或AGY编码，对于精氨酸或亮氨酸(例如544，545位)也采取类似的不同简并密码子分别合成.寡聚DNA是利用Biosearch 8750 4-柱DNA合成仪以0.2微摩尔的合成规模操作的β-氰乙基化学法合成的。寡聚核苷酸从柱子(500埃CpG树脂)上洗脱后在浓缩的氢氧化胺中于55-60℃去保护6-24小时，去保护后的寡聚核苷酸在真空干燥后，在15％丙烯酰胺凝胶(20mono1bis)于含7M尿素的50mMTris-硼酸-EDTA缓冲液中电泳纯化。通过紫外线照射探测凝胶中全长的寡聚核苷酸，切下相应的条带在1.5ml H2O中振荡4-16小时以洗脱DNA寡聚体。洗脱液干燥后重溶于0.1ml水中，测定其260nm的吸收值。
由以下公式计算DNA浓度(A 260×units/ml)(60.6/长度＝XM)加水将所有的寡聚核苷酸浓度调至50μM。
按上述方法设计的简并探针如图21，序列号No.54-88.
PCR引物的制备方法除下述的修改外大体与探针合成相同，在简并寡聚核苷酸的5′端包括含有限制性位点的13个核苷酸的连接子用于克隆入载体。用1,000埃CpG树脂以1微摩尔的规模合成DNA，在所有四个核苷酸正常地掺入简并探针的位置处，使用inosine.PCR引物的纯化包括乙醇沉淀及凝胶电泳纯化。II.文库构建及筛查牛基因组DNA文库由Stratagene(目录号945701)购买.文库包括2×106个15-20kb左右的克隆到Lamda DashII载体的牛DNA Sau3A1部分酶切片段，牛脑全cDNA文库从Clonetech(目录号BL10139)购买。由牛的整个大脑，牛的脑垂体及牛的后垂体制备的mRNA用于构建cDNA文库(In Vitrogen；Stratagene)。In Vitrogen制备了两种cDNA文库一个文库用Lambda g10载体，另一个文库用pcDNAI载体(一种质粒文库)，在Lambda unizap载体制备Stratagene文库，它们同都包括1.4×107个原始重组噬菌体。
牛基因组文库以150,000到200,000个噬菌斑/板的密度接种于长有E.coli K12宿主菌LE392的23×23cm平板(Nunc)，每个平板大约相当于一个牛的基因组的DNA。37℃温育过夜后，平板冷却后按Maniatis等人的方法(260-81)转膜，从每板用未带电荷的尼龙膜(Pall Biodyne A或MSI Nitropure)从每板转四个噬菌斑。DNA经紫外线照射5分钟或80℃真空烘烤两小时使之交联固定于膜上，DNA探针经T4多聚核苷酸激酶(NewEngland Biolabs)用r32P ATP(New England Nuclear；6500Ci/mmol)标记，方法见供应商的说明书。简单地说，50pmol简并DNA寡聚体与600μCi r32P-ATP和5单位T4多聚核苷酸激酶于37℃温育30分钟，反应中止后，加入凝胶电泳上样缓冲液，通过电泳纯化放射性标记的探针。从凝胶上切下32P标记的探针并洗脱至水中。另一种方法是按Schowalter和Sommer，发表在生物化学分析17790-94(1989)上的方案利用PCR扩增掺入a-32P-dATP或a-32P-dCTP来标记DNA探针，PCR反应标记的探针用Sephadex G-150柱脱盐纯化。
预杂交和杂交均在GMC缓冲液(0.52M NaPi，7％SDS，1％BSA，1.5mM EDTA，0.1M NaCl，10mg/ml tRNA)中进行。用Oligowash(160ml 1M Na HPO，200ml 20％SDS，8.0ml 0.5M EDTA，100ml 5M NaCl，3632ml H O)洗膜。一般地，将相当于10个牛基因组DNA重复拷贝的20张膜(每张400平方厘米)置于200ml杂交液中与100pmol简并寡聚核苷酸探针(128-512位的折叠)温育.杂交反应于比由简并探针计算出的最低熔点低5℃的温度下过夜，最低熔点温度的计算假设一对AT为2℃，一对CG为4℃。
在杂交温度下的4-5小时中滤膜用反复更换的oligowash清洗，最终在3.2M氯化四甲铵，l％SDS清洗两次，每次30分钟，清洗时的温度依赖于探针的长度。对20聚体，最终清洗温度为60℃。滤膜安装好后，用增感屏(Dupont Cronex Lightening Plus)对X光胶片(Kodak XAR3)曝光，通常情况下，对于文库的筛查在负80℃下胶片曝光3到5天对探测二重信号是足够了。分析结果后，滤膜可以被洗脱并再次用探针杂交。滤膜的洗脱方法是在含10mM EDTA pH8的1％SDS中用微波炉的最大功率连续煮两次，每次15分钟。滤膜可以经受最少三到四次洗脱并与不同的探针杂交。III.重组噬菌体的分离、生长及DNA的制备具体步骤见《重组DNA》(Maniatis等，260-281)的标准方法。IV.利用DNA消化和Southern印迹分析对分离的克隆进行分析重组噬菌体DNA样品(2微克)按限制性内切酶供应商(New England Biolabs)推荐的条件消化，37℃温育4小时后，反应产物在0.1M醋酸钠存在下，用三倍体积乙醇沉淀。离心收集DNA沉淀，用75％乙醇漂洗，干燥。所有重溶的样品均上样至琼脂糖凝胶(常在1％TAE缓冲液中，0.04M Tris醋酸，0.002M EDTA)。凝胶以1伏/厘米的场强电泳4到20小时。分子量标记包括Lambda DNA的HindIII酶切片段和/或X174 DNA的HaeIII酶切片段(New England Biolabs).凝胶用0.5微克/ml溴乙锭染色并照相。对于Southern杂交，纯化DNA首先在凝胶中用0.125 N HCl处理，于0.5N NaOH中变性，在20×SSC(3M NaCl，0.03M柠檬酸钠)中转移至非变性尼龙膜吸印6-24小时，用0.5M Tris HCl pH7.5，0.15MNaCl中和滤膜，再用50mM Tris-硼酸EDTA轻微漂洗。
交联时，滤膜先用透明塑料膜包裹，DNA的一面暴露于紫外光下5分钟，杂交和清洗方法如文库筛查中所述(见本实施例第二节)，为了用杂交分析来决定是否在其他物种中存在类似基因，作一些轻微的改动。DNA滤膜由Clonetech购买(目录号7753-1)，每一泳道含有5微克EcoRI消化了的从各种不同物种得来的DNA，探针按前面第二节描述的用PCR扩增反应标记，在含10％硫酸右旋糖苷的80％缓冲液B(2g聚乙烯吡咯烷酮，2gFicoll-400，2g牛血清白蛋白，50ml 1M Tris-HCl(pH7.5)，58gNaCl，1g焦磷酸钠，10g SDS，950ml H O)中杂交。探针在沸水浴10分钟后立即置于冰水浴中冷却而使探针变性，探针按106dpm32P/ml加入至杂交缓冲液中，60℃温育过夜.滤膜先在60℃用缓冲液B漂洗，再依次用含0.1％SDS的2×SSC和含0.1％SDS的1×SSC漂洗。对于高严格条件，最后一次清洗应在含0.1％SIDS的0.1×SSC中漂洗，然后温度升至65℃洗涤。
Southern杂交的结果被用于制备基因组克隆的限制性酶切图谱，并显示哪一个亚片段与GGF探针杂交(适于做亚克隆)。V.与杂交探针同源的DNA片段的亚克隆DNA消化产物(例如5微克)上样至1％琼脂糖凝胶中电泳，染色后从凝胶上切下相应的条带，按厂商(Bio 101)提供的方案将DNA吸附于玻璃微珠并洗脱以使之纯化。用T4连接酶(New England Biolabs)将回收的DNA片段(100-200ng)连接入去磷酸化的线性载体，如来源于PUC18的pT3T7(Ambion)。载体上带有大肠杆菌β-内酰胺酶基因，因此可在含氨苄青霉素的平板上筛选转化子，载体还可以给宿主细胞补充B-半乳糖苷酶，因而非重组子(蓝斑)可以用异丙基硫代半乳糖苷和Bluogal(Bethesda Research Labs)检测。连接反应的一部分产物用于转化大肠杆菌K12 XL1 Blue感受态细胞(Stratagene目录号200236)，在含50微克氨苄青霉素/ml的LB平板上检测转化子，挑选白色克隆并小量制备质粒DNA用于DNA酶切及DNA测序。再次鉴定所挑选的克隆是否插入了能与GGF探针杂交的DNA片段。VI.DNA测序按标准方案从5ml培养物中制备双链质粒DNA模板，依照厂商的方案(对Sanger等人发表在PNAS；USA745463(1977)的方法的一个改进)用测序酶2.0和一个双脱氧核苷酸试剂盒(US Biochemical)采取双脱氧链终止法进行测序。此外，测序还可在DNA热循环仪(Perkin Elmer型号4800)上利用循环测序试剂盒(来自新英格兰生物技术公司科研实验室)进行。操作依照说明书进行，所用引物是经过5’端标记的。测序所需引物或者由试剂盒中提供或者根据从克隆测定的序列来合成。测序反应物上样并溶解于0.4mm厚的浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶。胶于燥后曝光于X光片。通常情况下，利用标准测序试剂盒时掺入35S，32P末端标记的引物用于测序循环反应。序列输入DNA序列编辑器，输入方向由胶底部至顶部(5’至3’方向)。数据分析用Genetics Computer Group(GCG，威斯康辛大学)提供的软件。VII.RNA的制备和PCR扩增在基因组DNA检到的并且含有编码GGF肽的序列的开放阅读框是通过垂体RNA的PCR扩增延伸的。RNA是按照胍-中性CsCl法制备(Chirgwin等，生物化学；185294，1979)从冰冻牛组织(Pelfreeze)中提取的。通过进行oligo-dT纤维素柱层析选择Poly A RNA(Aviv和Leder，PNAS(美国)691408，(1972))。
特异性DNA靶序列的扩增是用逆转成cDNA的来自总RNA或PolyA RNA的样品和利用Perkin Elmer公司PCR/RNA试剂盒，批号N808-0017开始的。第一链的逆转录反应用1ug模板RNA，和加有限制酶识别位点接头的Oligo dT引物或加有限制酶吸附位点的从克隆序列测定的特异反义链引物进行的。为产生第二条链，引物之一被引入链特异序列如同用于3’RACE反应的(Frohman等.PNAS(美国)858998，(1988))，如果第二靶位点已被末端转移酶，在dATP参与下加尾于第一链反应产物。(例如，5’race反应，Frohman等，同前)则另一引物为加有限制酶识别位点的Oligo dT，另一方面，在描定PCR反应中第二链是简并的，因此，代表独特的肽序列。
扩增的程序如下(1)95℃浸泡5分钟；(2)95℃热循环1分钟；降温至退火温度45℃、50℃或55℃，1分钟；持续退火温度一分钟，快速升温至72℃超过1分钟，72℃延伸1分钟或1分10秒自动延伸。(3)72℃延伸循环5分钟，(4)4℃浸泡，时间不定。热循环周期(#2)，通常反应30轮。从100ul扩增反应液中取16ul，在2％Nusieve；1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液是TAE，电压为4伏/厘米，电泳3个小时。凝胶染色然后吸印到无电荷尼龙膜上，用作为引物内部序列的标记的DNA探针检测。
特异扩增的DNA产物能从印进杂交实验中被检测出来。它们在胶上的位置可为纯化和再扩增提供指导。如果合适的话，选定样品的其余部分上样到制备凝胶。电泳完毕后，从凝胶上切取0.5mm厚(它括特系产物的预定位置)的4-5片凝胶，切碎后浸入0.5ml电泳缓冲液中。40℃浸泡2-16小时。离心2分钟除去凝胶，上层水相转移入另一新管中。
再扩增是在相同于原始反应的引物和反应条件下，取5ul经洗脱的模板物质(大约是产物的1％)完成的。当扩增完成后，样品用氯仿抽提并转至新管。向反应体系中加入浓缩的限制酶缓冲液及酶，以便在接头的限制酶位点处切开。经过消化的PCR产物经凝胶电泳纯化，亚克隆至上述亚克隆毫节中描述的载体上DNA测序如上所述。VIII DNA序列分析应用区段装配软件装配DNA序列并应用GCG的Gel Assemble，Map和Tramslate软件应用推导氨基酸序列。推导出的氨基酸序列作为铀间序列利用Word Search检查蛋白质序列数据库。分析是在VAX Station3100上进行，工作站在VMS5.1下运行。应用GCG7.0版进行数据搜寻，软件为Swissprot，公开号码为21。IX编码GGF-I和GGF-II基因的克隆和测序结果如上所提到的，为了鉴定编码牛GGF-II的DNA序列。从GGF-II肽序列设计简并寡核苷酸探针。通过赖氨酰内肽酶降解纯化的GGF-II制剂(见图11和12)产生肽(序列号No.44)显示与GGF-I07(序列号No.39)有很强的氨基酸序列同源性，后者是胰酶降解纯化GGF-II制剂的产物。因此GGF-II12被用以设计10个简并寡核苷酸探针(请看oligo.609，610和649至656，如图21所示，序列号分别为69、70、71和79)。编码两个GGF-II12的重叠区域的两套探针(一套为609，610，另一套为649-5656)用于探测两套带有目标基因的滤膜，杂交信号能被观察到，但只有一个克隆与两套探针杂交。该克隆(记为GGF2BG1)被纯化了。
来自噬菌体的克隆GGF2BG1经Southern印迹分析确证两套探针均与牛DNA序列杂交。近一步显示两套探针均能与克隆内同套DNA片段杂交，基于这些实验，原克隆中一个4Kb的EcoR1酶切亚片段被鉴定、亚克隆和部分测序。图22表示其核苷酸序列，(序列号No.89.)和从起始DNA序列推导出的氨基酸序列，其中包括了探针609和650的杂交位点并确证该部分牛基因组DNA编码肽12(KASLADSGEYM)。
近一步的序列分析显示GGF-II12位于有66个氨基酸的开放阅读框内(如下)，它成为分离代表预测的牛GGF-II基因和cDNA的重叠序列的起点。
几个PCR反应被用于获得推测的牛GGF-II基因的另外的编码序列。总RNA和寡聚dT选择的(含多聚A)RNA样品从牛的总垂体、垂体前叶、垂体后叶及下丘脑被分离出来。利用图23，序列号109-119中列出的引物，以单侧PCR反应(RACE)同时在3’和5’方向扩增cDNA末端，锚定PCR反应用代表其它GGF-II肽的简并寡核苷酸引物进行。图24概括了从这些实验中得到的邻近的DNA结构和序列。从3’RACE反应得到了三个相应的剪切过的cDNA序列，它们已被克隆和测序。5’RACE反应导致发现另外一个外显子，它含有编码至少52个氨基酸的编码序列。通过对推导出的氨基酸序列分析发现GGF-II-6和与GGF-I-18序列相近的一个序列(如下)，锚定PCR反应鉴定出在300bp的另一个cDNA片段内含有肽GGF-II-1，2，3和10的编码序列。这个片段(即，片段E，见图31)的5’端限制是被编码GGF-II-1肽和被用于PCR反应的寡核苷酸决定的(另外5’序列数据参见实施例6描述的人基因的克隆)。因此，这个克隆包含的核苷酸序列编码全部九个新GGF-II肽序列中的六个。
克隆基因首先以GGF2BG1物理图谱的形式描述，使我们如被发现的(见下文图25)那样确定编码序列的位置。从上述编码序列中设计的DNA探针已被用于鉴定该噬菌体克隆存在的含有外显子的DNA片段，以及鉴定在两个方向上与之有重叠的克隆。推测到的牛的GGF-II基因可分为至少5个编码区域。编码区域被定义为不连续长度的DNA，可利用通用遗传密码翻译成多肽序列。编码区域在图31中有描述，现在应用的是(1)存在于GGF基因内的特殊外显子(例如编码区域a)或(2)从两套或更多外显子得来，这些外显子出现在mRNA特殊亚类，每套都能被翻译成特定多肽片段，如在基因产物显示的。在权利要求书中提到的多肽片段是编码区域DNA类似物的翻译产物。仅有编码区域A和B已被定义为外显子并被测序和制作成图。图26概括了所鉴定的连续编码序列。外显子依其被发现的顺序被列出来(α、β)。从内含子/外显子的界限看，这是很明显的即外显子B可能包含于cDNA内，它将编码区域E和A连接起来。也就是说为了不破坏阅读框外显子B不能被剪切。因此我们建议三种剪切形式能形成推测的牛GGF-II cDNA序列1，2，3。这些编码序列被分别命名为GGF2BPP1.CDS，GGF2BPP2.CDS和GGF2B PP3.CDS。如图28a(序列号No.133)、28b(序列号13.4)、28c(序列号135)所示，图中同时列出由各种cDNA推导出的氨基酸序列。
推导的三种结构编码长度依次为206，281和257个氨基酸的蛋白质。被推导的蛋白质序列的前183个氨基酸残基在三种基因产物中是相同的。在184位克隆有显著相差。编码甘氨酸的密码子GGT在GGF2BPP1中也作为GGF2BPP2和GGF2BPP3的剪切供体，或者可分别加到外显子C、C/D，C/D’和D或C，C/D和D。如图33所示(序列号No.149)，GGFIIBPP1是一个截短基因的产物，它的产生是由从编码区域A剪切接合阅读进入下一个插入序列(内含子)完成的。在图31中被表示为编码序列A’(序列号No.140)，转录终点邻接典型的AATAAA多聚腺苷序列。提示这个截短的基因产物代表真正的成熟转录，另外两个较长的基因产物拥有相同3’未转译序列和多聚腺苷酸位点。
所有这三种分子包含九个新GGF-II肽序列中的六个(见图12)并且另一个肽是与GGF-I-18(见图27)高度同源的。这些发现为这些重组分子编码至少一个牛GGF-II区域提供了极大的可能性。近一步看这三种多肽计算出的等电点与GGF-I和II的物理特性是一致的。由于GGF-II的分子量大约为60KD，这三种cDNA中最长的应编码具有近一半预计数目的氨基酸的蛋白质。
包括B和A外显子的探针通过PCR扩增被称记并用作筛查从牛垂体后叶分离的RNA制备的cDNA文库。一个克隆(GGF2BPP5)显示在图30中描述的方式垂直包含另一DNA编码序列(G)，其处于编码片段A和C之间。整个核酸序列如图32所示(序列号No.148)。来自最长的开放阅读框的预测翻译产物有241个氨基酸组成。第二个cDNA(GGF2BPP4)的一部分也从牛垂体后叶cDNA文库中分离到，所用探针如上。图30显示克隆的位置图。这个克隆在5’端是不完全的，在某种意义上说它是一个缺少编码序列G和D的剪接变异体。BPP4也显示除C/D区外具有H.KL区的新的3’末端。BPP4序列如图34所示(序列号150)。实施例5 不同种属中的GGF序列数据库检索没有显示任何预计的GGF翻译产物与现有已知蛋白质序列相似之处，这提示GGF-II是一个新的蛋白家族或总家族中的第一位成员。在用其他哺乳动物DNA进行的高度严格的交叉杂交研究中(DNA印迹实验)中，我们明显地发现牛重组分子来源的DNA探针在各种被试样品中能检测到特异序列。一段高度同源的序列在人基因组DNA中也被检测到。放射自显影如图29所示，各泳道杂交信号表示大鼠和人的GGF基因与探针的杂交情况。编码该基因的许多cDNA序列最近由Holmes等报告(科学2561205，1992)及Wen等(细胞69559 1992)。实施例6 编码人GGF2人序列的分离几种包含有牛GGFII编码区域E的人基因克隆由通过筛查从人脑干制备的人cDNA文库分离到(Stratagene，catalog#935206)，这项策略的实施是基于大多数GGF2肽和从包含牛的E区域片段的克隆预测的肽序列之间有很强的关联这个事实。这个文库的筛查按实施例4第二部分进行。所用寡探针914-919如下914TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA915TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT916ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA917TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA918AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA919ATGARGTGTGGGCGGCGAAA用这些探针检测到的克隆进一步用分子杂交分析。来源于编码序列A(见图21)的探针(通过标记片段A的聚合酶链反应(PCR)产物产生的)也被用于初级文库的筛查。能与A和E衍生的探针杂交的克隆被选出。一个特定的GGF2HBS5克隆被选出来做进一步分析。这些克隆是以其编码片段的形式表示的(如EBACC/D’D图31所示)。克隆中的E片段是如图37所示的截短形式牛中的E片段的人的等同物。GGF2HBS5所描述的所有“推测的”GGF-II候选者中最有可能编码GGF-II的候选物。编码区E的长度是由786个核苷酸和264个不翻译的碱基序列组成。GGF2HBS5所编码的蛋白质的预测大小是由423个氨基酸组成(约45KD，见图45，序列号No.167)，它类似于脱糖基形式的GGF-II(见实施例16)的大小。另外，列于图27中的7个GGF-II多肽与从E片段预测的蛋白质序列类同。II-6和II-12多肽是例外，其分别位于B编码片段和A编码片段。编码GGF2HBS5蛋白质的RNA产生于体处翻译系统，该系统由居于质粒载体(Bluescript sk(stratagene公司))，的T2噬菌体启动子下启动(见图44)，该载体含有GGF2HBS5插入物。翻译是在无细胞翻译系统(兔网织红细胞)中完成的。蛋白质产物的大小为45kd。在刺激施旺细胞的促有丝分裂活性检测中分析该无细胞产物以确定其生物活性。用限制性培养基处理的施旺细胞通过125I-尿苷的掺入显示其增殖提高并且也能对185Kd区域的蛋白质的酪氨酸磷酸化有所提高。
因此，在图12中显示GGF2HBS5所编码的产物大小和编码与图12显示的牛的肽高度同源的人肽的DNA序列的存在确证GGF2HBS5编码牛GGF2的人类同物。由用GGFIIHBS5克隆转化的细胞制备的限制性培养基有刺激施旺细胞有丝分裂活性。证实其基因产物是分泌型的(与BPP5基因产物不同)。另外，GGFIIBPP5基因的产物似乎通过P185erbB2这样的酷氨酸激酶受体或相关受体介导施量细胞增殖(见实施例14)。实施例7 在昆虫和哺乳细胞中表达人重组GGF2编码人GGF2(如实施例6及HBS5)的GGF2HBS5 cDNA被克隆入载体pcDL-SRα296(Takebe等分子细胞生物学8466-472，1988)并在100mm平皿中转染COS-7细胞，转染方法为DEAE-dextran法(Sambrook等分子克隆实验指南，第二版，CSH实验室NY，1989)。转染后培养3或4天收获瞬时表达的COS细胞的裂解液或条件培养基。为了制备细胞裂解产物，单层细胞用PBS洗涤，从培养皿中刮下，然后加150ul 0.25M Tris -hclPH8.0缓冲液，冻融三次而裂解，离心沉淀细胞裂解碎片，回收上清。收集到上层限制培养液上清7ml，浓缩并依使用说明(Amicon，Beverly，MA)利用Centiprep-10和Centricon-10将缓冲系统换为10mM Tris-Hcl PH7.4。取自大鼠神经的施旺细胞被用于DNA合成前体的掺入实验如实施例3所描述。限制培养液和细胞裂解物样品被用于施旺细胞增殖实验如实施例3描述。促有丝分裂活性数据列于图46。编码GGF2的cDNA GGF2HBS5指导蛋白质产物分泌于培养基中。利用细胞裂解物进行的分析确定，细胞内有可检的微量总活性。GGF2HFB1和GGFBPP5 cDNA没有指导产物分泌到胞外培养液中，只在其细胞裂解物中检测到这些克隆的GGF活性(图46)。
重组GGF2也在CHO细胞中得到表达。编码GGF2的GGF2HBS5cDNA克隆到pcdhfrpoly A(图54)的EcorI位点并转染到无DHFR产生的CHO细胞株(DG44)，转染方法为磷酸钙共沉淀法(Graham&Van Der Eb.病毒学52456-467(1973))。在96孔板在无核苷和核苷酸的α培养基(Gibco)中选择克隆。3周后，来自单个克隆的细胞培养液用施旺细胞增殖活性测试(如实施例3描述)筛查其表达的GGF，选择在培养基中大量分泌GGF的稳定克隆。以取自不同体积CHO细胞培养液得到的施旺细胞增殖活性数据而制备如图47所示剂量反应曲线(Graham&Van Der Eb，Virology52456，1973)。用Western印迹分析该物质，探针是抗GGF2特异肽的多克隆抗血清。在约69-90Kd较宽范围内的谱带被特异标记(垂体来源的GGF2到较高分子量的糖蛋白形式)。(图49，Lane12)利用杆状病毒表达体系在昆虫细胞中也可表达重组GGF2。用携带GGF2HBS5 cDNA克隆的杆状病毒(baculovirus)感染以3-5的多重感染性(106细胞/毫升)后培养于Sf900-II培养基(Gibco)。刺激施旺细胞的促有丝分裂活性物质被分泌到胞外培养液中(图48)。在无forskolin条件下，不同体积的昆虫细胞培养液被用于施旺细胞增殖实验。数据制成剂量反应曲线如图48所示。
用Western所述分析该物质(图47)，探针是上述的GGFII特异性抗体。去糖基化形式的GGF-II的大小，45kd处条带被观察到(见实施例16)在此实施例中所用的方法如下重组人和牛神经胶质细胞生长因子刺激施旺细胞增殖的有丝分裂促进剂活性按如下决定培养的施旺细胞的对促有丝分裂剂的反应是在5μM forskolin存在下进行的。所用的是来源于哺乳动物细胞瞬间表达实验的粗制重组GGF制品。与从转染的或假转染的COS细胞获得的物质的曝光18-24小时之后测定[125I]-尿嘧啶的掺入，四套数据的均数和标准差如示。对部分纯化的天然牛垂体GGF(羧甲基纤维素组分；Goodearl等人，submitted)促有丝分裂反应作为百分之百活性标准。
cDNA(图53)被克隆入pcDL-SRα296载体(Takebe，et al.，Mol.Cell Biol.8466-472(1982))，并在100mm平皿中转染COS7细胞。所用方法为DEAE-dextran法(Sambrook et al，In MolecularCloning.A Loboratory Mannual，2nd.ed，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)在转染后3-4天收集细胞裂解液或限制性培养液。为了制备细胞裂解物，首先用PBS洗涤单层细胞，从培养皿刮出，加入150μl 0.25M Tris-Hcll PH8.0，冻融三次裂解细胞。沉淀细胞碎片并回收上清培养液，收集限制性培养液(7ml)，浓缩并利用制造商描述Centriprep-10和Centricon-10单位(Amicon，Beverly，MA)换缓冲系统为10mM Tris-Hcl PH7.4。取自大鼠神经的施旺细胞被用于DNA合成掺入实验(Davis&Stroobant，细胞生物学杂志110135)-1360 1960；Brockes等，大脑研究，165105-118；1979)重组CHO细胞限制性培养液的Western印迹分析如下，重组CHO克隆培养于7ml MCDB302无蛋白限制培养基中，培养3天，取2ml限制性培养液浓缩并换缓冲系统为10mM Tris-HCL PH7.4，冷干。沉淀重悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液，进行还原性SDS-凝胶电泳，用GGF肽抗体进行Western印迹分析。CHO培养液对照用未经转染的CHO-DG44宿主的限制性培养液。用重组克隆细胞的限制培养液分析CHOHBS5。实施例8 有关牛GGF的其他人序列的分离实施例5和6的结果显示人GGF相关序列能很容易地用牛GGF序列衍生的DNA探针分离。另一种方法可用Holmes描述的方法(科学2561205，1992)。在本例中结合并活化P185erbB2受体(和与GGF相关)的人蛋白(heregulinα)是从一株肿瘤细胞系中得到并纯化。可用其衍生的肽序列设计寡核苷酸探针，用于克隆编码heregulin的cDNA。P185erbB2受体的活化的生化试验有别于施旺细胞的增殖实验。它类似于实施例1-4中从垂体cDNA中克隆GGF序列，heregulin蛋白和对应的cDNA按下列方法从肿瘤细胞系中分离出来。heregulin的分离是从生长于Percell Biolytica微载体珠(Hyclone Labs)上的MDA-MB-231乳癌细胞(ATCC#HTB26)的限制性培养液中得到的。10升培养液通过膜(10KD截止值)(Millipore公司)过滤浓缩25倍，并通过离心和过滤(0.22um)而澄清，滤过液加到肝素sepharose亲合柱(Phamacia)。蛋白洗脱用0.3，0.6，0.9M的用磷酸盐缓冲液溶解的NaCl逐级洗脱。各层析组分的活性由MCF-7乳腺癌细胞(ATCC#HTB22)上P185erB2受体酪氨酸磷酸化的程度计算。MCF-7细胞被置于24孔Costar板中的F12(50％)Dulbecco’s最低基本培养基(50％)(该培养基包含10％血清)(105细胞/孔)中培养并使其结合至少24小时。实验前，首先将细胞转移到没有血清的培养液中培养至少1小时。过柱样品(10到100μl)37℃培养30分钟。吸出上清液，加入SDS-PAGE样品缓冲液100μl停止反应。各样品在100℃加热5分钟后，一部分(10-15μl)上样到Tris-甘氨酸凝胶(4-20％)(Novex)，电泳之后，将疑胶上的蛋白电转换至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后用溶于Tris缓冲盐溶液并加有Tween-20(0.05％)(TBST)的牛血清蛋白(5％)封闭。室温，稀释于磷酸酪氨酸(高层次生物技术公司(Upstate Biotechnology)的单克隆抗体(1∶1000稀释)作探针标记印迹，至少1小时。室温条件下，用TBST洗膜。用结合有碱性磷酸酶(Promega公司)(1∶7500稀释)的小鼠免疫球蛋白G抗体进行探测，至少30分钟。杂交条带在5-溴-4-氯-3-吲哚-1-磷酸溶液和氮蓝四唑中显色观察。免疫印迹可通过Scan Jer Plus光密度计扫描。未刺激的MCF-7细胞信号强度有20-30单位。全刺激的的P185erbB2产生的信号强度为180-200单位。具有最大活性的0.6M NaCl加到事先经含30％乙醇的17mM磷酸纳溶液(PH6.8)平衡过的聚天冬氨酸(PolyLC)柱子。溶于平衡缓冲液中的浓度从0.3M到0.6M的NaCl线性梯度用于洗脱结合蛋白。活性峰值样品(NaCl为0.45M)再进一步用经含0.1％TFA和15％乙腈的缓冲液平衡过的C4反相柱分馏(Syn Chropak RP-4)分馏。经过60多分钟，用25-40％梯度浓度的乙腈将蛋白从柱中洗脱下来。收集样品(1ml)，检测活性。在Tris-甘氨酸凝胶(4-20％Novex)上的SDS-PAGE进行分析。
HPLC-纯化的HRG-α用含有赖氨酸C的0.1％SDS，10mM二硫苏糖醇，0.1碳酸氢铵(PH8.0)溶液37℃消化20小时，消化片段经Synchrom C4柱(4000A°，0.2×10cm)溶解。该柱经0.1％TFA平衡，用含有梯度浓度1-丙醇的0.1％TFA溶液(W.J.Henzel，J.T.Stults，C.Hsu，D.W.Aswad，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264.15905(1989))洗脱。色谱测得的峰值样品真空干燥，测序。其中一个肽(-24％1-丙醇洗脱)的序列为[A]AEKEKTF[c]VNGGEXFMVKDLXNP(SEQ ID No.162)。括号中的残基尚未确定，X表示不可能确定其中氨基酸的循环。初产量为8.5pmol，测出的序列与现已知的蛋白序列不一致。残基1，9，15和22后来在cDNA序列分析中被确定为半胱氨酸。对经超载凝胶电泳并转膜到VDF膜上的45KD条带直接测序显示，由于初产量低(0.2pmol)，所以只显示低丰度序列被测出XEXKE[G][R]GK[G]K[G]KKKEXGXG[K](SEQ ID No.30)。这与heregulin-α(图31)2到22位氨基酸残基相对应，提示丝氨酸2是proHRG-α的氨基端。尽管氨基端被封闭。但可看到偶有少量常规封闭的蛋白不是转译后修饰的。氨基端序列排布是通过光谱仪测定被溴化氰消化的蛋白而确定的。分离蛋白的羧基端还没有明确确定；可是，对蛋白裂解的混合物测序后发现成熟序列不超过241个残基。氨基酸残基如下A，Ala；C，Cys；D，Asp；E，Glu；F，Phe；G，Gly；H，His；I，Ile；K，Lys；L，Leu；M，Met；N，Asn；P，Pro；Q，Gln；R，Arg；S，Ser；T，Thr；V，Val；W，Trp；Y，Tyr.作为cDNA克隆的起源，用MDA-MB-231细胞中纯化的mRNA(J.M.Chirwin，A.E.Przbyla，R.J.Mac Donald，W.J.Rutter，生物化学(Biochemistry)18，5294(1979)构建了寡(dT)-引物-λgt10(T.V.Huynn，R.A.Young，R.W.Davis，λgt10和λgt11DNA克隆技术一种实验方法，D.Glover主编(IRC印刷，牛津，(1984))的cDNA文库(U.Gubler和B.J.Hoffman，基因(Gene)25，263(1983))。在人类密码子最高出现频率的基础上设计了编码13-氨基酸序列AEKEKTFCVNGGE(SEQ ID No.31)(13)的如下八个简并反义脱氧寡核苷酸(R.Lathe，分子生物学杂志(J.Mol，Biol)183，1(1985))并进行了化学合成5′-CTCGCC(G或T)CC(A或G)TTCAC(A或G)CAGAAGGTCTTCTCCTTCTCAGC-3′(SEQ ID No.40)。为了设计探针，将半胱氨酸放入该氨基酸序列的未知残基上。磷酸化作用标记探针并在低严格度条件下与cDNA文库进行杂交。在该文库中，proHRG-α蛋白得以确定。HRB-β1的cDNA是通过用proHRG-α5′端和3′端衍生的序列对一个第二个寡(dT)-引物引导的λgt10文库进行探针检测而确定的，所述文库是从MDA-MB-231细胞的mRNA中制备。克隆13(图2A)是通过用5′HRG-α序列对并引发的(5′-CCTCGCTCTTCTTCTTGCCCTTC-3′引物(SEQ ID No，41)；proHRG-α反义核苷酸33到56)MDA-MB-231λgt10文库筛选产生的。对应于克隆13的5′端的序列作为探针用于鉴定来源于MDA-MB-231细胞mRNA的第三个寡(dT) -引物引导的λtg10文库中的proHRGβ2和proHRGβ3。编码四个HRGs中每一个HRG的二个cDNA克隆已被测序(F.Sanger，S.Milken，A.R.Coulson，美国科学院科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.)74，5463 1977)。另一个命名为克隆84的cDNA具有与proHRGβ2至第420氨基酸之间相同的氨基酸序列。421位终止密码子之后紧跟着一个不同的3′-未翻译序列。实施例9分离再剪切变异体实施例6中的方法产生四个紧密相关的序列(heregulinα，β1，β2，β3)，这四个序列的产生是剪切变异的结果。Peles等(细胞(Cell)69，205(1992))和Wen等(细胞(Cell)69，559(1992))已经分离出另一个剪切变异体(从大鼠中)，他们使用了相似于实施例1-4及6中叙述的用于与P185erbB2结合的蛋白纯化和克隆方法。cDNA克隆通过如下方法获得(通过对来源于转化大鼠成纤维细胞系的P185erbB2结合蛋白纯化并测序获得)。
P185erbB2结合蛋白通过如下方法从限制性培养液中纯化出来。从三个500nl离心瓶中得到的混合限制性培养液(共120升)经过0.2μ滤膜过滤澄清并通过用20kd截止分子大小的膜，用Pelicon超滤系统对样品浓缩30倍。所有的纯化步骤都使用Pharmacia的快速蛋白液体色谱分离系统进行。浓缩后的样品直接上样到肝素-Sepharose柱子(150ml，先用磷酸缓冲盐溶液(PBS)预平衡)。用含0.2M NaCl的PBS溶液冲洗柱子直到280nm波长吸收值为零时。用连续NaCl梯度浓度梯度(从0.2M到1.0M)洗脱被结合蛋白，收集5ml样品。合并样品，0.01ml收集的组分，用于定量检测激酶激活活性，将三个柱子(总体积360ml)所得的活性样品混合，用YM10超滤膜(Amicon，Danvers，MA)浓缩至25ml并加入硫酸铵至终浓度为1.7M。离心澄清之后(10,000xg，15分钟)将混合样品上样到苯基-Superose柱上(HR，10/10，Pharmacia)。用溶于0.1MNa2PO4(PH7.4)溶液中的45ml(NH4)2SO4梯度浓度(从1.7M到0)溶液，展开柱子，收集2ml样品，测定(0.002ml/样品)激酶激活性性(实施例6中所用方法)。收集活性主要峰值样品并混合，用50mM磷酸钠缓冲液(PH7.3)透析。Mono-S阳离子交换柱(HR5/5，Pharmacia)用50mM磷酸钠预先平衡。活性物(0.884mg蛋白，35ml)上样后，用起始缓冲液冲洗，然后以1ml/分钟流速，用NaCl浓度梯度展开。激酶激活活性在0.45-0.55M盐浓度时恢复，按2ml一份收集到的样品中有4份有活性。将这些样品混合，直接上样到Cu2+螯合柱上(1.6ml，HR2/5螫合Superose，Pharmacia)。绝大多数蛋白被吸附在树脂上，但他们逐步被约30ml氯化铵(0-1M)线性梯度浓度的溶液洗脱下来。蛋白单峰值洗脱下的活性物对应在0.05到0.2MNH4Cl处。从各纯化步骤收集的样品进行凝胶电泳分析，之后用ICN(Costa Meta，CA)试剂盒银染，蛋白含量通过使用Bio-Rad公司(Richmond，CA)试剂盒进行考马斯亮兰结合试验测定。
在200μl 0.1M碳酸氢铵缓冲液(PH7.8)中，重新构建p44蛋白(10ug)。在酶∶样品量为1∶10比例，37℃条件下，用L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮处理过的胰蛋白酶(Serva公司)消化18小时。消化后的肽混合物通过反相HPLC柱分离并使用Vydac C4微型柱(2.1mm i.d.x15cm，300A°)及经装有二极管装置检测器和工作站的HP1090液相色谱系统监测215nm处光吸收值。柱子先用0.1％的三氟乙酸(流动相A)平衡，用线性梯度浓度0％-55％流动相B(90％乙腈于0.1％三氟乙酸中)洗脱70分钟。洗脱流速为0.2ml/分钟，柱子的温度控制在25℃。从HPLC系统手工收集到的肽峰样品的1/3通过Edman降解分析N-端序列进行检测。27.7分钟后(T27.7)洗脱的样品含有混合氨基酸序列，在还原之后按下述方法再进行色谱测定肽组分的70％真空干燥并重溶于100μl 0.2M碳酸氢钠缓冲液(PH7.8)中。向溶液中加入DTT(终浓度2mM)，并在37℃保温30分钟。减少了的肽混合液由Vydac柱(2.1mm i.d.x15cm)的反相HPLC分离。洗脱条件及液相流速同前所述。用Model 477蛋白测序仪(Applied Biosystems，Inc.Foster City，CA)对肽进行氨基酸序列分析，该分析仪装有在线乙内酰苯硫脲(PTH)氨基酸分析设备和Model900资料分析系统(Hunkapiller等(1986)发表于蛋白微量检测方法(Methods of ProteinMicrocharacterization)，J.E.Shively编辑，Clifton，New JerseyHuman PressP.233-247)。将蛋白上样到三氟乙酸处理过的，事先经poly-brene和NaCl循环过的波动纤维盘上。用微量色谱系统(Model 120)分析PTH-氨基酸，该系统采用双注射泵和反相(C-18)狭孔柱(Applied Biosystems.2.1mm×250mm)。
用标准程序从Ratl-EJ细胞中分离RNA(Maniatis等，分子克隆实验手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor，NewYork(1982))并使用mRNA分离试剂盒(Clontech Lab.Inc.Palo Alto.CA)筛选出poly(A)+。用Superscript试剂盒(BRL Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)合成cDNA。从柱中洗脱的双链cDNA连接到SalI和NotI消化过的pJT-2质粒载体中(该载体来源于pCD-X载体(Okayama和Berg，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol3280(1983))并通过电穿孔将载体转入DH10BE.coli中(Dower等，核酸研究(Nucl Acids Res)166127(1988))。用来源于NDF(残基5-24)和T40.4胰蛋白肽(残基7-12)N-端的蛋白序列作为二个寡核苷酸探针，筛选出将近5×105的初始转化物。它们对应的序列如下(N表示全部4nt)(1)5′-ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG GTC NCC CTC NGCATAGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA GCC TCT-3′(2)5′-TTT ACA CAT ATA TTC NCC-3′C G G C(1SEQ ID No.167；2SEQ ID No.168)用T4聚核苷酸激酶对合成寡核苷酸末端用[r32-P]ATP标记。用该探针筛选重复的硝酸纤维素膜。杂交液含有6×SSC，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，2×Denhard’s液，50μg/ml鲑鱼精DNA，20％甲酰胺(用于探针1)或无甲酰胺(用于探针2)。50℃用0.5×SCC，0.2％SDS，2mM EDTA(用于探针1)洗膜或37℃用2×SSC，0.2％SDS，2mMEDTA洗膜(用于探针2)。膜上的放射自显影信号表明有10个克隆与两个探针都杂交。这些克隆通过上述再培养和探针杂交而纯化。使用Applied Biosystems373A自动DNA测序仪和Appled Biosystems Taq Dye DeoxyTMTerminator循环测序试剂盒，按厂家说明进行cDNA克隆测序。有些实验使用[35S]dATP(Amersham)和美国Biochemicals公司的SequenaseTM试剂盒按制造商的说明获得序列。克隆44cDNA的两条链都是以合成的寡核苷酸为引物而测定的。最大的5’350nt序列是在七个互无关系的cDNA克隆中测定的。得到的克隆证实了图30(NDF)中方式。实施例10 检测其它可能的剪切变异体的策略推测的牛的cDNA克隆的氨基酸的序列及其PCR产物和已发表的人(图31)及大鼠的序列显示了高度相似性，表明这些序列来源于三种生物的同源基因。在cDNA/PCR产物水平上测定的信使RNA转录数量上的差异可能是由于广泛的组织特异剪切引起的。图30所显示和获得的方式提示有另外的剪切变异体存在。可能的剪切变异体列于图37中。这其中的许多变异体可通过来源于不同组织的cDNA文库中特异探针编码片段和针对特殊编码片段的引物引导的PCR而获得的。另外，可利用已知的剪切技术在特异cDNA克隆，PCR产物或基因组DNA区域制备变异体。例如，用一个共同编码片段(e.g.A)的稀有限制酶切位点可将GGF2BPP5的FBA氨基末端与GGF2BPP1，GGFBPP2，GGFBPP3，GGFBPP4的羧基端序列连接。不管编码片段E和/或G存在与否，为基因提供益处，这些编码片段都包括在表达结构中。这些突变序列可在重组体系统中表达，并且重组体产物可用于检测施旺细胞促有丝分裂活性水平及该细胞结合和激活P185erB2受体的能力。实施例11 GGF功能因子的检测推测的GGF序列家族结构表明最长的组成(以GGF2BPP4为代表部分编码跨膜蛋白，其中，细胞外的部分区域)含有装配表皮生长因子(参看Carpenter和Wall的肽生长因子和它们的受体I(Peptide Growth Factors and Their Receptors I)69-133页，Springer-Velag，NY1991)的一个区域。编码片段C和C/D或C/D肽序列中的半胱氨酸残基保留着与表皮生长因子(EGF)肽序列中类似残基(见图35，SEQ ID NOs.151-153)。这就提示胞外功能是作为受体识别和生物激活位点。少数突变体缺少H、K和L编码片段，这可能被表达为分泌的传导生物活性的蛋白。编码包含EGF-Like区(EGFL)的多肽的GGFDNA序列具有激活神经胶质细胞促有丝分裂活性的全部生物学活性。蛋白的膜结合形式可包括施旺细胞的增生是在胚胎期还是在神经再生期于神经元表面表达(神经元表面最初与再生施旺细胞接触的地方)。
分泌的(与膜不结合)GGFS具有典型的可扩散因子的作用，该因子能够在距分泌处一定距离内与施旺细胞发生作用。由于组织损伤和细胞破裂，另一些形式的GGFs可从细胞内释放出来。被分泌的GGF的一个例子是被GGF2HBS5编码的蛋白(见实施例6)；这是人们所知道的被直接分泌到细胞外的唯一GGF(见实施例7)。通过E区域发现的N-末端疏水序列对分泌进行调节，该疏水序列位于GGF2HBS5编码的重组体的N-末端区域。
另一些GGF’s看起来是非分泌(见实施例6)。这些GGFs可能是损伤应答形式，它们只有组织遭到破坏时才释放。
GGF-II(由GGF2HBS5编码)的预测蛋白结构的其它区域和含有B和A区域的其它蛋白与人类基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白相似(参考)。ADSGEY肽在GGF’s中紧挨C2免疫球蛋白折皱的第二个半胱氨酸，在层状蛋白底层出现C-2重复的概率为9/22。这些结果强有力地说明，这些蛋白可能与基体蛋白例如与神经元和神经胶质有关的蛋白相连，同时提出了在靶位点分离神经胶质生长因子的方法。实施例12 从重组细胞中纯化GGFs为了获得全长或部分GGFs以测定其生物活性，使用克隆的DNA可制备过量蛋白。可使用的方法有几种。可构建含有上述序列的重组大肠杆菌细胞。按照厂商提供的程序，表达系统例如pHN8a或pHH16a(Stratagene Inc.)可用于此目的。另外这些序列可插入哺乳动物的表达载体并建立高产细胞系。例如，为此目的编码一个GGF的DNA，克隆GGF2BPP5已在COS细胞和中国仓鼠卵巢细胞(见实施例7)中表达(生物化学杂志(J.Biol.Chem.263，3521-3527，(1981))。用已有的方法可将含有GGFDNA序列的载体转入宿主细胞。
瞬间表达可被检测出，或者在氨甲蝶呤存在时，培养G418-抗性克隆用于筛选扩增dhfr基因(存在于pMS XND载体上)的细胞，在此过程中可同时一起扩增相邻的GGF蛋白的编码序列。因为CHO细胞可在完全无血清，无蛋白的培养液中存活(Hamilton和Ham，体外(In Vitro)13，537-547(1977)，所需的蛋白可直接从培养液中纯化出来。使用实施例9中产生的抗血清进行Western杂交分析，可检测细胞过度生长的限制性培养液中存在的所要蛋白。
按如下方法所说，从瞬时表达型COS细胞的限制性培养液中纯化所要蛋白(rGGF-II)。从限制性培养液中收取rGGF-II蛋白，用阳离子交换层析(POROS-HS)进行部分纯化。用PH6.0的33.3mM MES平衡柱子。以10ml/分钟的流速度上样于限制性培养液。含有施旺细胞增殖活性和免疫反应活性(使用按上述的GGFII肽的多克隆抗血清)的峰值样品是用50mM Tris，1M Nacl PH8.0溶液洗脱下来的(分别对应于图50A和50B)。
rGGF-II也在稳定的中国仓鼠卵巢细胞系中表达。从收集的限制性培养液得到的rGGF-II经阳离子交换层析(POROS-HS)得到部分纯化。用PH7.4PBS平衡柱子。以10ml/分钟上样于限制性培养液。含有施旺细胞增强活性和免疫反应活性(用GGFII多克隆抗血清)的峰值样品是用50mM Hepes，500mM Nacl PH8.0洗脱下来的。另一个峰是用500mM Hepes，1M Nacl PH8.0洗脱下来的，该峰值样品同样具有增殖和免疫反应活性(图51)。
rGGF-II可进一步用作为一个高分辨力步骤的疏水反应色谱分析法；阳离子交换/反相色谱法(如有必要作为第二个高分辨力步骤)；病毒失活法和DNA切割法例如阴离子交换色谱法进行纯化。
操作步骤详细描述如下从阳离子交换柱上洗脱下的重组GGF-II峰的促施旺细胞增殖活性用如下方法测定在5M Forskolin存在下，用5mM Tris，1M Nacl PH8.0洗脱的峰对培养的施旺细胞促有丝分裂反应进行测定。在201，101(1∶10)101和(1∶100)101时加入洗脱峰。18-24小时接触后可测定掺入的125I-尿苷并表示为(CPM)。
GGF-II肽的多克隆抗体免疫杂交方法如下10μl不同的样品在4-12％梯度凝胶上电泳。将疑胶转移到硝酸纤维素膜上，用5％BSA封闭硝酸纤维膜印迹，用GGF-II-特异抗体(1∶250稀释)探针检测。125I蛋白A(1∶500稀释，比活性＝9.0/Ci/g)用作第二抗体。免疫杂交在Kodak X-光胶片上曝光6小时。1M Nacl洗脱峰样品在65-90Kd处显示了一个宽厚的免疫反应条带，这正预期大小范围的GGFII和较高分子量的糖原。
GGF-II在阳离子交换柱上纯化过程如下表达rGGFII的CHO细胞的限制培养液以10ml/分钟的流速上样到阳离子交换柱上。柱子用PH7.4PBS平衡。用50mM Hepes)500mM Nacl及50mM Hepes，1M NaCl pH8.0分别进行洗脱。用这里叙述的测定施旺细胞增生的方法(CPM)对所有洗脱样品进行分析。用BSA作标准由布来得福特(Bradford)方法测定蛋白浓度(mg/ml)。
从各样品中取10μl进行Western杂交，正如图51A和51B指出的免疫反应活性和施旺细胞活性一起迁移。
这里所叙的施旺细胞促有丝分裂分析可用于检测全长克隆或其任何具有生物活性的部分的表达产物。全长克隆GGF2BPP5已在OCS细胞中瞬间表达。采用实施例1中所描述的施旺细胞增殖对转染的COS细胞内抽提物进行检测，抽提物显示生物活性。另外，编码GGF2HBS5的全长克隆已在CHO和昆虫(实施例7)细胞中瞬间表达。这时，两种细胞的抽提物和限制性培养液都对在实施例1中所述的施旺细胞增殖试验中显示生物活性。从GGF基因(包括Heregulins)衍生出的剪切变异体互补DNA的家族的任何成员都能以这种方式表达，并由熟悉这一技术的人员进行施旺细胞增殖活性检测。
除此之外，重组物质可以按照Wen等的方法(细胞，69，559，(1992))与其它变异体分开。Wen等在COS-7细胞中表达了剪切突变体Neu分化因子(NDF)。插入pJT2真核质粒载体的cDNA克隆受到SV40早期启动子的控制，并在3′端一侧与SV40的终止多聚腺苷酸信号相连。通过如下电穿孔方法将pJT-2质粒DNA转染进COS-7细胞6×106个细胞(悬于0.8ml的DMEM和10％FEBS)转移到一个0.4厘米的小杯中，与溶于10μlTE溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)的20μg质粒DNA混合，用一脉冲控制系统设定为200欧姆的Bio-Rad基因脉冲装置，在室温下以1600V和25uF进行电穿孔。随后，细胞用20mlDEME，10％FBS稀释，并转移到一个T75瓶中(Falcon)。于37℃孵育14小时后，用DMEM，1％FBS替换培养基，继续孵育48小时。收集该细胞的含有重组蛋白的限制性培养基，证明表达该蛋白受体的细胞系中有生物活性。这一细胞系(培养的人乳癌细胞系AU565)用重组物质处理。处理的细胞显示出标志erbB2受体活性特征的形态变化。这类限制性培养液也可用施旺细胞增殖试验进行检测。实施例13 结合于p185erbB2受体的其它蛋白的纯化和分析I、gp30和p70的纯化Lupu等(科学，249，1552(1990))及Lippman和Lupu(专利申请号PCT/US91/03443(1990))，已从人乳癌细胞系MDA-MB-231限制性培养液中纯化出一种蛋白，在此特将该参考文献引入本文，方法如下采用众所周知的程序收集限制性培养液，用一个Amicon超滤膜过滤细胞(YM5膜)(Amicon，Danvers，MA)将培养基浓缩100倍。一旦澄清并浓缩，就把培养基保存在-20℃，同时在接下来的几天里进行连续收集。利用Spectra/porR管道系统(Spectrum Medical Industries，洛杉玑，加州)，在4℃下于100倍体积的0.1M乙醇透析浓缩培养液两天以上。透析过程中沉淀下来的物质在4℃以4000rpm离心30分钟除去，加入蛋白酶抑制剂。将澄清的样品冻干。
冻干的培养基重新溶于1M乙酸中，终浓度达到总蛋白量约25mg/ml。不溶物质经10000rpm离心15分钟除去。样品上样SephadexG-100柱(XK16，Phamacia Piscataway，NJ)，用1M乙酸平衡并在4℃以30ml/小时的流速用1M乙酸进行洗脱。从4ml浓缩100倍的培养基中得到100ng的蛋白。3ml的洗脱液部分冻干后重悬于300μl PBS用于分析，并作进一步纯化。
经Sephadex G-100纯化后的 物质上样反相高压液相色谱(HPLC)。第一步中包含一个陡的乙腈梯度，较陡的乙腈梯度处理和所有其综HPLC步骤都于室温下，在经水相(HPLC级)的0.05％TFA(三氟乙酸)平衡的C3-反相柱上进行。样品上样后以流速1ml/min用线性梯度(0.05％TFA中含0-45％的乙腈)洗脱30分钟。在280nm测光吸收值，以1ml部分收集并冻干，然后分析EGF受体竞争活性。
第二个HPLC步骤包含一个平缓的乙腈梯度，上一步骤HPLC处理的活性组分重新过同一根柱进行层析，采用0.05％TFA中含0-18％的乙腈洗脱5分钟，接着用0.05％TFA中含18-45％乙腈的线性梯度洗脱30分钟，流速为1.0ml/min，以每组分1ml部分收集。人TGFα类似因子在30-32％乙腈浓度处洗脱RRA可检测的单峰。
Lupu等(Proc.Natl，Acad，Sci，89，2287(1992))纯化了结合在p185erbB2受体上的另一种蛋白。这一特殊蛋白为p75，是从用于 SKBr-3(一种人乳癌细胞系)生长的限制性培养基中纯化得到的，所述培养液是由SKBr-3在补充有10％胎牛血清(GIBCO)的改良Eagle培养基(IMEMGIBCO) 中繁殖。采用p185erbB2受体亲和柱从浓缩(100x)的限制性培养基中纯化出p75。94千道尔顿的p185erbB2受体(结合p75)胞外区的产生是经重组表达，并与多聚丙烯酰胺肼-Sepharose亲和层析基质偶联，偶联后的基质用冰预冷的1.0M HCl充分洗涤，再用0.5M NaNO2活化珠，0℃保持20分钟，然后过滤并用冰预冷的1.0M HCl洗涤。500ml浓缩的限制性培养液自然流过基质，柱上用pH从4.0到2.0的1.0M柠檬酸洗涤并逐级洗脱(使得erbB2和p75解离)。所有部分都在Pharmacia PD10柱上脱盐，纯化过程在pH3.0到3.5的洗脱范围产生一75KD的同源多肽(通过SDS/PAGE银染分析确定)。
II.gp30与p185erbB2的结合纯化的gp30蛋白用一试验测试其是否结合在p185erbB2上。该试验为抗p185erbB2的单克隆抗体进行的竞争试验。gp30蛋白代替抗体结合在SK-BR-3和MDA-MB-453细胞(表达p185erbB2受体的人乳腺瘤细胞系)的p185erbB2。gp30的施旺细胞增殖活性也可以通过用实施例1-3所述的分析程序用纯化的gp30处理施旺细胞细胞培养物而加以证明。
III.p75与p185erbB2的结合为了确定从SKBr-3限制性培养液所得的75KD的多肽(p75)是否确实是SKBr-3细胞的erbB2癌蛋白的配体，采用了上述gp30的竞争试验。结果发现p75显示出结合活性，而来自其它层析部分的物质没有显示出该活性(数据未显示)。流出物显示出一些结合活性，这可能是流出的erbB2ECD造成的。
IV.其它p185erbB2配体Peles等(“细胞”，Cell69，205(1992))也已从大鼠细胞中纯化出一种刺激p185erbB2的配体(NDF，方法见实施例8)。Helmes(“科学”Science，256，1205(1992))已从人细胞中纯化出能结合并激活p185erbB2的Heregulinα(见实施例6)。Tarakovsky等(“癌基因”，Oncogene6218，(1991))证明从活化的巨噬细胞分离出的25KD多肽结合于Neu受体(一种p185erbB2同源物)特此该参考文献引入本文。
VI.DNF分离Yarden和Peles(“生物化学”Biochemistry30，3543(1991))已确定一种能刺激p185erbB2受体的35KD的糖蛋白。按如下程序在限制性培养基中鉴定这一蛋白。大鼠I-EJ细胞在175平方厘米的培养瓶(Palcon)中长至粘合，单层细胞用PBS洗涤，并在无血清的培养基中保留10-16小时。弃去该培养基，换用从培养3天的培养物收集的新鲜的无血清培养基，该限制性培养基经低速离心去沉淀，用带YM2膜(截留分子量2000)的Amicon超滤器浓缩100倍。限制性培养基中neu刺激活性的生化分析表明配基是一热稳定但易降解35KD糖蛋白。这一因子用高盐浓度或酸性乙醇可沉降下来。通过选择性沉降，肝素-琼脂糖层析和稀酸中的凝胶过滤部分纯化该分子产生一个活性配体，它可以刺激原致癌受体，但对有组成型活性的neu蛋白无效。然而这一纯化部分保留了同时刺激EGF相关受体的能力，这提示此两种受体通过双向机制功能性地偶联在一起。或者，假定的配体同时和此两种受体相互作用。利用这一因子具有的生化特性，可能可以得到该因子的完全纯化产物，并用以研究上述的可能性。
在其他出版物，Davis等(“生物化学生物物理研究通讯”Biochem Biophys.Res.Commun，179，1536(1991)，“美国国家科学进展”88，8582(1991)和Greene，PCT专利申请PCT/US91/02331(1990)描述了从人T-细胞系(ATL-2)的限制性培养液纯化了一种蛋白。
ATL-2细胞系为一种IL-2-非依赖型的HTLV-1(+)T-细胞系。无菌质的AT-2细胞在含10％FCB的RPMI1640培养基(10％FCS-RPMI1640)中，于37℃和5％CO2湿润空气中培养。
为纯化该蛋白类物质，ATL-2细胞用1×PBS洗涤两次，以3×105ml在无血清的RPMI1640培养基12mML-谷氨酰胺中培养72小时，接着收集细胞沉淀，如此得到的培养物上清称之为“限制性培养液”(C.M)。
用一截留1000D的YM-2Diafol膜(Amicon Boston，MA)将C.M.浓缩100倍，即从1000ml到10ml。为了用于一些测试，含有大于1000MW的浓缩C.M重新用PRMI培养基稀释至原体积。将来自一升制备液的这两个柱的一些纯化物质经聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(Integrated Separation Systems，Hyde Park，MD或Phorecast System by Amersham，Arlington Heights，IL)及银染显现出至少4至5条带，其中10KD和20KD带为这一物质所特有。含有小于1000MW的组分的过滤膜C.M.不需稀释直接应用。
浓缩的限制性培养液用0.45μ的uniflo滤器(Schleicher和Schuell，Keene，NH)过滤除菌，采用一个经10mMTris-HCl pH8.1浓缩的C.M.预平衡的DEAE-SW阴离子交换柱(Waters，Inc.，Milford，MA)进一步纯化。每次HPLC相当于1升的原ATL-2限制性培养液的蛋白，该蛋白吸附到柱子上后，用0mM-40mM NaCl的线性梯度以4ml/min的流速洗脱，用体外免疫复合物激酶试验分析10％DEAE组分(一个柱子纯化的样品)，或用1％C18组分(两个柱子纯化的样品)的体外收集组分。用此方法测得的以剂量依赖方式增加p185c-neu的酪氨酸激酶活性的活性峰洗脱为在220-240nm NaCl附近，横跨4-5个组分(36-40)的一主峰neu。HPLC-DEAE纯化之后，有活性部分的蛋白被浓缩和集中，用C18 (Million Matrix)反相柱层析(Waters，Inc.，Milford，MA)(称为C18#1步骤或双柱纯化物)处理。以含有0.1％TFA的异丙醇线性梯度洗脱。所有收集物在RPMI1640培养基中透析以除去异丙醇，并在下文用体外免疫复合物激酶试验，和1％浓度的合适组分进行分析。增加了的p185c-neu的酪氨酸激酶活性在两个峰中洗脱。一个洗脱于11-13组分，而另一个活性较弱的峰洗脱于20-23组分。这两个峰合各自相应于5-7％的异丙醇和11-14％异丙醇的浓度。C18#1产生的11-13组分用于特性研究。从第二个层析步骤得到的活性组分集中后作为蛋白类物质样品。
用这一纯化策略处理20升制备液，35-41的DEAE活性组分集中后进行上述C18层析。C18#1的11-13和20-23组分都有剂量依赖活性。11-13组分集中液再进行一次C18层析(称为C18#2步骤或三柱纯化物)。再一次，11-13和20-23组分都有活性。组分23的剂量应答通过实施例8所述的体外免疫复合物激酶试验，通过加入0.005％体积的23组分和0.05％体积的23组分得到确定，这表明已达到最高纯度。
根据凝胶过滤层析和超滤膜分析确定分子量范围。保留了几乎相等量的酪氨酸激酶活性，并通过10,000分子量截留滤膜。几乎所有活性都通过了30000D的截留滤膜。通过采用相同的条件，对含剂量依赖性neu激活活性的组分与一系列蛋白分子量标准品(sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的洗脱曲线轮廓加以比较，确定层析活性部分的分子量范围。活性的低分子量范围确定在7000-14000D之间。活性的第二个范围为14000-24000D之间。
经聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(Integrated Separation Systems，Hyde Park，MD或Phorecase System by Amersham，Arlington Heights，IL)之后，三柱纯化(C18#2)用商品化银染色试剂盒(BioRad，Rochkville Centre，NY)银染。来自20升制备液的C18#2纯化收集的21、22、23和24组分与标准品同时电泳，22和23组分显示出对185erbB2(neu)激酶试验(见下文)最强的剂量效应能力，选择的分子量部分与185erbB2的相互作用由免疫复合物激酶试验加以证实。
Huang等(1992，“生物化学杂志”J.Biol.Chem，25711508-11512)已从牛肾中分离了另一种neu/erbB2配体生长因子，在此作为参考文献。25KD的多肽因子用柱分步分离，接着在DEAE/纤维素(DE52)、Sulfadex(硫酸化的Sephadex G-50)、肝素-Sepharose 4B和Superdex 75(快速蛋白液相层析)进行一系列柱层析。NEL-GF这一因子刺激neu/erbB2基因产物的酪氨酸特异性自磷酸化。VII、结合于p185erbB2的配体的免疫复合物试验NDF该试验反映了通过用不同用量的ATL-2限制性培养液(C.M.)或蛋白类物质进行PN-NR6细胞的预孵育而导致的免疫沉淀p185的自磷酸化活性的差别。下文中将此活性称为neu-激活活性。
用于免疫复合物激酶检测的细胞系按Kokai等(“细胞”Cell，55，287-292(July28，1989))公布的方法获得、制备和培养，特此引入参考文献，其中有完整的说明，同时并上美国申请序列号386，820，申请日1989-7-27，以Mark I.Green的名义，题为“治疗含抗受体的抗体的癌细胞的方法”。
细胞系于37℃含5％CO2的湿润环境下保存于含5％FCS的DMEM培养基中。
在150mm皿培养的细胞中用冷PBS洗涤两次，刮至10ml冻融的缓冲液(150mM NaCL，1mM MgCl2，20mM Hepes，pH7.2，10％甘油，1mM EDTA 1％ Aprotinin)，离心(600×6，10分钟)。细胞沉淀重悬于1ml裂解缓冲液(50mMHepes，pH7.5，150mM NaCl，3％Brij35，1mM EDTA，1.5mM MgCl2，1％ Aprotinin，1mMEGTA，20μM Na3VO4，10％甘油)，于4℃旋转30分钟。除非特指，所有的化学试剂都来Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO。不溶物质通过40,000×g离心30分钟除去。清亮的上清作为细胞裂解液留用。
细胞裂解液与50μ的50％(体积比)蛋白A-Sepharose(Sigma Chemical Co.，St，Louis，MO)共同孵育15分钟，离心2分钟使裂解液清亮，50μl液相的预清亮的细胞裂解液与限制性培养液、蛋白类物质或其特殊因子(终体积至1ml)在冰上孵育15分钟。样品与5μg的识别p185neu和p185c-neu的胞外区的7.16.4单克隆抗体或其它相应抗体一起保温于冰上20分钟。加入50μl 50％(V/V)A-Sepharose，4℃振荡20分钟，离心收集免疫复合物，用500μl漂洗缓冲液150mM Hepes pH7.5，3％Brij35，150mM NaCl，2mM EDTA，1％Aprotinin，30μMNa3VO4)洗涤2次，于27℃孵育样品20分钟，若样品的纯度高，也可于4℃孵育25分钟。终止反应时加入3×SDS样品缓冲液(含2mM ATP，2mM EDTA)并于100℃孵育5分钟。上样于10％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。之后，取凝胶染色、干燥，借助增感屏使凝胶曝光于Kodak XAR或XRP胶片。VIII、诱导乙酰胆碱受体的活性物(ARIA)的纯化ARIA是一种能刺激乙酰胆碱受体合成的分子量为42KD的蛋白质，已在Gerald Fischbach实验室得到分离。(Fall等“细胞”Cell 72801-805(1993)。ARIA能诱导分子量为185KD的肌细胞跨膜蛋白的酪氨酸磷酸化，而该跨膜蛋白与p185erbB2结构相类似。并且，ARIA还能刺激培养的胚胎肌小管的乙酰胆碱受体的合成。对编码ARIA的cDNA克隆进行测序分析，表明ARIA是该蛋白质的GGF/erbB2配体家族中的一员，它可用于刺激神经胶质细胞的有丝分裂，在其它应用方面与本文所述的GGF2相类似。实施例14 在施旺细胞中GGF介导的蛋白酪氨酸磷酸化作用大鼠施旺细胞用足量的神经胶质细胞生长因子诱导增殖处理后，显现出能刺激蛋白质酪氨酸磷酸化(图36)。按照实施例3所述的程序将不同量的部分纯化的GGF加入大鼠施旺细胞的初级培养物中，施旺细胞培养于覆有多聚D-赖氨酸的24孔板的DMEM/10％胎牛血清/5μM forskolin/每ml0.5μg GGF-CM(每孔0.5ml)培养液。一旦粘合，每孔细胞加入0.5ml DMEM/10％胎牛血清，培养过夜至静止期。第二天，给细胞加入0.2ml的DMEM/10％胎牛血清，孵育1小时。接着将测试样品按要求以不同的浓度加入培养液中并作用不同的时间。细胞随后在沸腾的裂解缓冲液(5mM磷酸钠，pH6.8，2％SDS，5％β-巯基乙醇，0.1M二硫苏糖醇，10％甘油，0.4％溴酚蓝，10mM矾酸钠sodiumvanadate)中裂解，沸水浴10分钟后直接分析或于-70℃冻存。样品经7.5％SDS-PAGE凝胶电泳分析，按照Towbin等(“美国国家科学进展”Proc.Natl.Acad.Sci.764350-4354，1979)描述的标准方法电转移到硝酸纤维素膜。将转移后的硝酸纤维素用抗磷酸化酪氨酸抗体探测。Kamps和Selton(1989)(癌基因Oncogene2305-315)描述的标准方法结合探针的斑点过夜曝光于放射自显影胶片，采用标准的实验室程序冲洗胶片。用Ultrascan XL激光增强密度计(LKB)测密度，对照前面染色的高分子量标准(Sigma)确定分子量。蛋白磷酸化与施旺细胞增殖的剂量效应非常相似(图36)。磷酸化后的条带的分子量与p185erbB2的分子量非常接近。用来自带有GGF2HBS5克隆的COS细胞限制性培养液处理施旺细胞，也得到相似的结果。这些结果与预期的GGF的作用和p185erbB2的活化很好地吻合。
该实验用重组GGF-II重复。来自GGF-II克隆(GGF-2HBS5)稳定转化的CHO细胞系的限制性培养液，用上述试验方法可刺激蛋白酪氨酸磷酸化。无效转染的CHO细胞没有这种刺激活性(图52)。实施例15 来自MDA-MB-231细胞系的蛋白质因子对施旺细胞增殖的测试施旺细胞的增殖是由来自人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的限制培养液介导的。在测试的第一天，将104个初级大鼠施旺细胞铺于96孔板的每孔的100μl添加了5％胎牛血浆的Dulbecco’s ModifiedEagle’s培养基。第二天，每孔加入10μl限制性培养液(来自人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，按实施例6所述培养)。第六天，用酸性磷酸酶测定每板施旺细胞数(按Connolly等程序，“分析化学”Anal.Biochem.152”136(1986)。用100μl磷酸缓冲液(PBS)洗板后，每孔加入100μl的反应缓冲液(0.1M乙酸钠pH5.5，0.1％ Triton X-100，10mM对硝基苯磷酸盐)。板置于37℃孵育2小时，加入10μl 1N NaOH终止反应。测每个样品在410nm的光密度值。发现其施旺细胞数是用来自对照细胞系(HS-294T，不产生erbB2配体)的限制性培养液处理后的细胞数的38％。此结果表明，MDA-MB-231细胞系分泌的蛋白(分泌p185erbB2结合活性)刺激施旺细胞的增殖。实施例16 GGF的N-糖基化从GGF-II候选克隆GGF2BPP1，2和3的cDNA序列预测的蛋白序列包括一些N-糖基化同感基序。在GGFII02的多肽序列中一个缺口恰好和其中一个基序中的天冬酰胺残基相吻合，表明糖类可能结合在这一位点。
通过观察与N-糖解酶一起孵育后SDS-PAGE的迁移变化来研究GGF的N-糖基化，N-糖解酶切割蛋白中糖与天冬酰胺的共价键。
GGF-II经N-糖解酶处理后产生一条分子量为40-42KD的主带和一条分子量为45-482KD的弱带。非还原下的活性洗脱实验显示在约45-50KD有一单独的活性去糖基化特异带。
用GGF-I进行的活性洗脱实验也证明用N-糖解酶处理后增加了其电泳迁移率，产生一分子量为26-28KD的活性特异带。尽管由于所用样品背景着色而无法指出N-去糖基化的条带，但是银染能证实其迁移率的改变。实施例17一旦蛋白GGF2从转染细胞表达并分泌出来，为测定此成熟蛋白进行了进一步的实验。
编码人GGF2的cDNA被克隆到一个扩增载体pcdhfrpoly A上并转染到CHO-DG44细胞中稳定地表达rhGGF2被分泌到限制性培养基之中。重组GGF2的被分泌能力通过氨基末端疏水片段如信号序列所介导。根据信号假说，生成着的蛋白链一旦开始穿过粗面内质网转运出来，信号序列在特异位点被从成熟蛋白上切割下来。表达和纯化的rhGGF2氨基末端的分析表明切割位点在50位的丙氨酸和51位的甘氨酸之间，前50位的氨基酸残基被从成熟蛋白上切割下来，这样rhGGF2由373个氨基酸所组成，cDNA编码的hGGF2的氨基酸序列见图55。
该蛋白质氨基末端的前15个氨基酸残基经氨基末端序列分析确定，如表1所示表1rhGGF2的氨基末端序列分析循环数# 一级序列 pMoles1 GLY(G)210.62 Asn(N)1633 Glu(E)1494 Ala(A)2205 Ala(A)1806 Pro(P)1737 Ala(A)1778 Gly(G)154.99 Ala(A)l62.410 Ser(S)65.411 Val(V)132.712 Val(V) (Cys)*11.713 Tyr(Y)112.714 Ser(S)47.615 Ser(S)27.1氨基末端的分析采用Edman降解法，半胱氨酸残基在此法中降解，不能被检查到。保藏编码GGF-II蛋白(实施例6)的核酸(cDNA，GGF2HBS5)在质粒pBluescript 5K中，处于T7启动子控制之下，它于1992年7月2日被保藏在马里兰，美国典型培养物收集中心。ATCC No.75298。申请者必须接受如下责任从专利颁发时起到它的有效期结束之前，他有义务在质粒不能传代存活时更换新的质粒并通知ATCC有关此专利的的发布情况，那时，此品种将向大众提供.在此之前，按照37CFR§1.14和USC S112有关条例，此存品将提供给专利委员会。
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/124表(1992年7月)
权利要求
1.一种碱性的具有促进神经细胞有丝分裂活性的多肽因子，其中所述的多肽因子缺失氨基末端信号序列。
2.权利要求1所述的碱性多肽因子，其中所述的多肽因子具有如图55(SEQ ID NO.179)所示从氨基酸序列的51位到422位的氨基酸序列。
3.分离的编码具有促进神经细胞有丝分裂活性因子的脱氧核糖核酸序列，其中所述DNA序列缺失氨基末端信号肽的序列。
4.一种分离的DNA序列，编码权利要求2所述的多肽因子。
5.一种促进神经胶质细胞有丝分裂的方法，所述方法包括将所述的神经胶质细胞和有效剂量的权利要求1中所述的多肽接触。
6.一种预防或治疗哺乳类动物的神经系统处于病理状态的方法，此状态包括一种对权利要求1所述多肽敏感或易感的细胞类型，所说的方法包括给上述哺乳动物以有效剂量的上述多肽。
7.一种具有促进神经胶质细胞有丝分裂活性的多肽，其中所述多肽由权利要求3的DNA序列编码，所述的多肽可以用一种方法获得，这种方法包括在允许上述DNA序列表达的条件下，培养修饰过的宿主细胞。
8.一种鉴定样品中是否存在权利要求1所述多肽受体的方法，包括将所述样品与所述多肽相混合并确定它们的结合，这种结合即可表明受体的存在。
9.一种预防或治疗患者的神经胶质细胞瘤的方法，此方法包括给患者施用有效剂量的抑制权利要求1所述的多肽和受体结合的药物。
10.一种药用或兽用的制剂，包括权利要求1所述的多肽和一些合适的稀释剂，载体或赋形剂一起配制和/或以剂量单位形式使用。
11.一种治疗哺乳类动物的外周神经损伤的方法，此方法包括把有效剂量的权利要求1所述多肽和外周神经相接触。
12.一种预防或治疗哺乳类动物的神经胶质细胞脱髓损伤或损失的方法，此方法包括将上述神经细胞与效量的权利要求1所述蛋白接触。
13.权利要求12方法，其中中所说的哺乳动物的疾病状态是指运动神经纤维或者感受器的神经疾病。
14.一种预防或治疗哺乳类动物的神经变性紊乱的方法，此方法包括将哺乳类动物神经胶质细胞与有效剂量的权利要求1所述的多肽接触。
15.一种诱发哺乳类动物的神经再生或神经修复的方法，此方法包括给予哺乳类动物神经以有效剂量的权利要求1所述的多肽。
16.一种诱发成纤维细胞繁殖的方法，此方法包括给予成纤维细胞以有效剂量的权利要求1所述的多肽。
17.一种修复哺乳类动物伤口的方法，此方法包括给予伤口以权利要求1所述的多肽。
18.一种药剂的配制方法，此方法包括将权利要求1所述的多肽和药理上一种适当的载体相混合。
19.一种产生抗体的方法，次方法包括用权利要求1所述的多肽免疫哺乳动物。
20.一种监测能和权利要求1所述的多肽结合的受体的方法，此方法包括以所述多肽作为亲合配体对样品进行亲合分离。
21.一种预防或治疗患者神经瘤的方法，此方法包括给予患者以有效剂量的物质，该物质可以抑制权利要求1所述的蛋白和受体的结合。
22.一种检查，分离或制备一种促神经细胞有丝分裂素或其编码基因的方法，此方法包括将按权利要求19制备的抗体与组织制备物或样品相混合。
23.一种用于分离编码具有促神经胶原细胞有丝分裂活性的分子的核酸的方法，此方法包括将细胞的样品与神经胶质细胞促有丝分裂剂特异抗体混合以测定该促有丝分裂剂在样品中的表达并从有表达活性的细胞中分离该核酸序列。
24.一种诱发神经细胞髓鞘化的方法，所述方法包括把神经细胞和权利要求1所述多肽相接触。
25.一种在细胞中诱导合成乙酰胆碱受体的方法，所述方法包括将权利要求1所述多肽与细胞相接触。
26.一种权利要求1中所定义的多肽的抗体。
27.一种纯化具有促神经胶原细胞有丝分裂能力的蛋白质的方法，所述方法包括将权利要求26所述抗体与细胞抽提物相接触。
28.一种治疗哺乳动物所患神经胶质细胞增生疾病的方法，此方法包括将权利要求26所述的抗体施用给哺乳动物。
29.一种包含权利要求3所述DNA序列的载体。
30.一种包含权利要求3的分离DNA的宿主细胞。
31.一种制备神经胶质细胞促分裂因子的方法，此方法包括在允许所述DNA序列表达的条件下，培养权利要求30所述宿主细胞。
32.权利要求1所述多肽用作为神经胶质细胞的促有丝分裂素。
33.一种预防或治疗患者多种硬化的方法，此方法包括给患者施用有效剂量的能抑制权利要求1所述多肽和其受体结合的物质。
34.一种作为促神经细胞分裂素的多肽.其由权利要求3所述的DNA序列编码，其制备方法由制备一种促神经胶质细胞分裂因子方法所组成，此方法即在允许所述DNA序列表达的条件下培养修饰的宿主细胞。
全文摘要
本发明公开了对编码若干多肽的DNA的鉴定与纯化，这些多肽用于刺激神经胶质细胞(尤其是施旺细胞)的有丝分裂和治疗神经胶质细胞瘤。本发明还公开了这些DNA的序列，其编码的新型多肽可用于刺激神经胶质细胞的有丝分裂和治疗神经胶质细胞瘤。本发明提供了用于神经胶质细胞相关疾病治疗和诊断目的的已知和新型多肽的合成、纯化和检测的方法。本发明还提供了利用这些多肽制备用于治疗和诊断神经胶质细胞相关疾病的抗体探针的方法。
文档编号C07K14/82GK1150390SQ95193290
公开日1997年5月21日 申请日期1995年5月25日 优先权日1994年5月26日
发明者安德鲁·大卫·古德尔, 保罗·斯特鲁本特, 路易莎·明盖蒂, 迈克尔·沃特菲尔德, 马克·马尔基翁尼, 陈麦苏, 伊恩·希尔斯 申请人:路德维格癌症研究所, 坎布里奇神经科学