环己肽及其混合物，其制备方法及其用途的利记博彩app

专利名称：环己肽及其混合物，其制备方法及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及式I化合物及其药用盐环(A-B-C-E-F-(D)-Ala) (I)其中A、B、C、E和F相互独立，相同或不相同，为除半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)以外的天然氨基酸残基，为丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，天冬酰胺(Asn)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酰胺(Gln)，谷氨酸(Glu)，甘乺酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，蛋氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，酪氨酸(Tyr)或缬氨酸(Val)。
式I化合物优选为A和B相互独立，相同或不相同，为Ile、Leu、Val、Phe和Tyr，且C、D和E相互独自，相同或不同，可以是除半胱氨酸和色氨酸以外的天然氨基酸残基。
式I化合物更为优选的化合物是有如下肽顺序环(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)，或环(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)，环(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)其中Xaa代表除Cys及Trp以外的天然氨基酸残基。
天然氨基酸可认为是如在Bell(FEBS-Letters 64(1976)29-35)所述的所有天然存在的游离的或作为蛋白质的结构单元的α-氨基酸。
天然存在的蛋白质中的氨基酸认为是L-氨基酸(甘氨酸除外)，(D)-Ala相当于氨基酸丙氨酸D-构型的残基。
肽可以认为是相互以肽键相连的氨基酸序列，其中肽还有N-端和C-端。
用括弧括起的氨基酸序列是指环状肽，即第1个氨基酸的N-端(氨基)与最后氨基酸的C-端(羧基)相连结。
1.式I化合物的药用盐既可认为是无机盐也可是有机盐，如用于Remington’s Pharmaceutical Sciences(17版，1418页(1985))中所述。适宜的盐尤其为碱金属盐和碱土金属盐，生理可容性胺盐，以及无机酸或有机酸盐如HCl，HBr，H2SO4，马来酸或富马酸。
上述的式I化合物为环己肽，它可按皆知的、于肽化学中常规用的方法加以合成。该环己肽的合成方法例如可按如下进行a)将适当保护的氨基酸衍生物偶联到固体载体上；b)在保留侧键的保护基条件下解离出线型肽；c)于溶液中使肽环合；d)去掉侧键上的保护基。
作为氨基酸保护基的是用于肽合成中常规用的保护基团，例如在Kontakte Merck 3/79，14-22页和1/80、23-35页中所述。用于氨基保护的尿烷基的实例有Pyoc，Fmoc，Fcboc，Z，Boc，Ddz，Bpoc，Z-(NO2)，Dobz，Moc，Mboc，Iboc，Adoc，Adpoc，Msc或Pioc。用酸、碱或还原方法可除去这些氨基酸保护基。
胍基的保护基例如是NO2，甲苯磺酰基，Boc，Z，三苯甲基-2-磺酰基(Mts)，等等。裂解方法可用水解或氢解法。
羧基侧链功能可作为酯基而被保护，优选为甲酯、乙酯或叔丁酯，或苄酯或改性过的苄酯(P-NO2，P-Cl，P-Br等)。去保护基可用碱性或酸性皂化法或氢化法。
羟基保护基例如是叔丁基或苄基。
本发明还涉及通式I的环己肽的混合物。
上述环己肽的混合物的合成可用所谓的“组合合成方法”。借助组合合成方法以简单的方式可合成“肽库”，公布于PCT申请WO92/000091。
制备式I化合物的混合物可按上述a-d步骤实现。然而在应用组合成技术时，不一定要有针对性地合成出所有可能的式I环己肽(在此处所述的环己肽情况下，总共儿乎有1.9百万(185)个不同的化合物，即1.9百万个合成)。而是通过在每一个合成周期时同时加入所有不同的18个氨基酸，可制备式I的环己肽混合物。该方法与常规的合成方法相比较，其优点是显而易见的。例如只经过5次合成周期的操作，每次都加入所有所需的氨基酸，接着对合成肽混合物仅一次环合反应，得到的环己肽混合物中实际上含有1.9百万个可能的环己肽。
然而，与上述方法不同的另一种方法是，无需在所有的合成周期中加入氨基的混合物。例如，在一次合成周期后，可将在其上己合成了肽混合物的载体材料分级分离，并于后面的单独合成反应中于特定的部位引入所需之氨基酸。
按上述方法制备了肽混合物之后，须检测生物活性肽，并鉴定肽的序列。这可用反复再合成法。这用下面的一个混合物的例子加以说明，该混合物中含有式A的环己肽。
环(O1-O2-X-X-X-(D)-Ala) (A)该混合物中含有的环己肽中有三个可变位置(X)，其可被所有的天然氨基酸(Cys和Trp除外)占据。其余的部位被指定的氨基酸(O)(也是天然氨基酸，但Cys和Trp除外)占据，一个位置永远是D-Ala。
环己肽A的混合物可按上述方法制备，经在使用所有18个氨基酸混合物条件下的3次合成周期之后，载体材料和结合在载体上的肽混合物一起被分级分离，接着在324(18×18)个单独的合成中制出式A的环己肽混合物，324种混合物中的每一种又含有大约5800(183)个不同的肽。
该324种混合物中的每一种若在生物试验(见下面)中证明是有活性时，则将其挑选出来，并通过反复地再合成，对进一步确定的位置重新嵌入，以限制其复杂性。反复再合成的每一阶段都需要18次新的合成步骤。最后得到的有确定结构的环己肽的作用用生物测定加以确定。下面的图解对上述程序加以阐明。
含有三个确定位置的肽环(O1-O2-X-X-X-(D)-Ala)1.特定的生物测定(324次试验)2.鉴别活性混合物3.含有4个确定位置的肽的合成(18)含有4个确定位置的肽环(O1-O2-O3-X-X-(D)-Ala)1.特定的生物测定(18次试验)2.鉴别活性混合物3.含有5个确定位置的肽的合成(18)含有5个确定位置的肽环(O1-O2-O3-O4-X-(D)-Ala)1.特定的生物测定(18次试验)2.鉴别活性混合物3.含有6个确定位置的肽的合成(18)含有6个确定位置的肽环(O1-O2-O3-O4-O5-(D)-Ala)1.特定的生物测定(18次试验)2.鉴别活性肽。
环肽混合物原则上也可用常规分析方法进行分离或纯化，如用制备型HPLC或其它色谱方法。
现在发现，通式I的环己肽或其混合物特异性地抑制白介素-4(IL)与白介素-4受体的结合，并抑制了IL-4的活性。因此，本发明物质具有IL-4的抑制剂作用。
本发明化合物或其混合物的IL-4抑制作用既可用无细胞的结合试验，也可用细胞生物试验加以测定。
自德国专利DE 4322330 A1得知，通过抑制IL-4活性可诊断、治疗或(或)处理那些以TH2-型T-辅助细胞的出现增高为特征的疾病。
许多过敏性、病毒性、寄生虫的和细菌性疾病的治疗和预防仍存在很大的问题。在一些寄生虫性、病毒性和细菌性疾病的发病过程中，淋巴细胞和单核细胞的亚群会发生变化。这涉及例如所谓的2型T-助细胞的增加(后面称作TH2细胞)。T细胞通常根据其表面标识和功能可区分成亚型。例如T-助啉巴细胞带有CD4-表面分子，激活后可分泌细胞因子(Cytokine)。
由健康小鼠或由异源细胞刺激的小鼠克隆出的T-助细胞中的细胞因子模式经分析得出，这些细胞产生白介素-2，白介素-4，γ-干扰素，白介素-5，白介素-6，白介素-10和淋巴毒素(由所谓THO型的T助细产生)。
T-助细胞在例如被细菌抗原牛布鲁氏菌或结核分枝杆菌感染后的小鼠内克隆后，大多数克隆被证明会分泌淋巴毒素，γ-干拢素和白介素-2，但很少有或没有白介素-4，-5，-6或-10(所谓THl型T-助细胞)。
T-助细胞在寄生病源体如大型利什曼原虫(Leishmania major)感染的敏感小鼠体内克隆后，所产生的大部分克隆产生更多的白介素-4，-5和-10，而白介素-2和γ-干扰素量降低或未被检出(TH2型T-助细胞)(Mosmann等Immunological Review 1991，No.123,209-229；S.Romagnani，Immunology Today，256-257，Vol.12，No.8，1991)。
在动物和人的一些感染性疾病中已证明TH-2淋巴细胞增多(Else and Grenic，Parasitology Today，Vol.7，No.11，1991，pp.313-316；parasitology Today，Vol.7，No.10，1991，P.261)，并且也在次级参数中反映了出来。被大型利什曼原虫感染的小鼠一般γ-干扰素的产生降低了，而血清中IgE扣嗜曙红细胞大大地增多了。
人体例如患结节性麻疯、利什曼病，血吸虫病和结核分枝杆菌感染后，通常该患者血清中IgE浓度与正常人血清相比大大地增高了。在寄生虫感染过程中常常观测到有嗜曙红细胞。
即时型IgE介导的过敏反应如特应性皮炎和哮喘的一个特征也是这一类型的调节障碍。例如，从特应性皮炎患者的皮肤的皮肤活检而得到的抗原特异性T细胞克隆主要是TH2-型(Kapsenberg等，Immunology Today，vol 12，No.11，1991，392-395)。
本发明化合物及混合物既适于过敏症和感染的治疗和预防，也适于诊断用，特别是病毒性、细菌性以及寄生虫及真菌性感染。优选人体免疫缺陷病毒(HIV)，分枝杆菌(尤其是麻疯分枝杆菌)、李斯特菌、原虫(尤其是利什曼体和疟原虫)、蠕虫(尤其是血吸虫，日本圆线虫和卷虫、鞭虫、毛线虫、螩虫(囊尾蚴)、含珠菌、曲霉的感染。但是，即时型过敏反应，特别是IgE介导的反应也可被诊断、治疗和预防。这些尤其包括特应性皮炎和哮喘。
给药方式通常因不同疾病而异。例如某些疾病以局部应用为宜。例如治疗哮喘用吸入方法，结膜炎用滴眼剂，过敏性皮炎以皮肤或皮内用药为宜，因为病理的TH2-细胞尤其可在局部检查出。
本发明肽或其混合物通常也可作为科研工具，用来抑制白介素4(IL-4)与IL-4-受体的结合作用。
本发明还涉及含有式I的化合物或其混合物的药物剂型。例如该药品可以口服药物制剂形式而被应用，如片剂、包衣剂、硬-或软明胶胶囊剂，溶液剂、乳剂或悬浮剂。药物包结在脂质体内，该脂质体必要时可含其它成分如蛋白质，这也是种适宜的用药形式。也可直肠用药例如用栓剂，或非肠胃给药如注射液。为了制备药物剂型，可将这些化合物与治疗用的惰性有机或无机载体相混合。适用于片剂、包衣剂及硬明胶胶囊剂的载体实例有乳糖、玉米淀粉或其的衍生物，滑石粉、硬脂酸或其盐。制备溶液用的适宜的载体有水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。用于注射液的适宜载体有水、醇、多元醇、甘油和植物油。栓剂的适宜载体有植物油、硬化油、蜡、脂肪和半流动聚醇。药物制剂也可含有防腐剂、溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、色素、调味剂，改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂、抗氧化剂以及必要时的其它有疗效的活性物质。
本发明还涉及制备本发明药物的方法，其特征是，将至少1种式I化合物与适宜的药用和生理相容载体和必要时的其它适宜的有效物质、添加剂或助剂，制成适宜的用药形式。
优选的用药剂型是口服和局部用药，局部用药例如用导管法或注射法。实验部分下面的制备实施例是对本发明作进一步说明，但无意对本发明之范围加以限制。所用的编写含义如下AS 氨基酸BSA牛血清白蛋白DC 薄层色谱DCM二氯甲烷DIC二异丙基碳二亚胺DIPEA 二异丙基乙胺DMF二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亚砜ELISA 酶连结的免疫吸附试验
Fmoc9-芴基甲氧羰基HOBt1-羟基苯并三唑HPLC高效液相色谱huIL人体白细胞介素IL 白细胞介素muIL鼠白细胞介素PBS 磷酸盐缓冲食盐液PBSA磷酸盐缓冲食盐液中的牛血清白蛋白TBTU苯并三唑基-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐TFA 三氟乙酸图例如下

图1竞争性hu IL-4结合试验▲ hu IL-4，● K0021，■ K0022，◆K5933图2竞争性mu IL-4结合试验▲ mu IL-4，● K0021，■K0022，◆K5933图3竞争性hu IL-1ra结合试验
▲ hu IL-1ra，●K0021，■K0022，◆K5933图4依赖于hu IL-4生物测定中肽的试验a)hu IL-4标准曲线(滴定)，■ hu IL-4b)加入肽(滴定)到1ng/ml hu IL-4(恒定)×K5993，◆K0021，▲K0022图5依赖于mu IL-4生物测定中肽的试验a)mu IL-4标准曲线(滴定)，■mu IL-4b)加入肽(滴定)到1ng/ml mu IL-4(恒定)×K5993，◆K0021，▲K0022图6依赖于hu IL-1β生物测定中肽的试验a)hu IL-1β标准曲线(滴定)，■ hu IL-1βb)加入肽(滴定)到0.5U/ml hu IL-1β中(恒定)×K5993，◆K0021，▲K0022环己肽的合成所述的环肽可以以单个肽或是混合物制备，合成方法为a)将适当保护的氨基酸衍生物偶联到固体载体上，b)在保留侧链保护基情况下解离去线型肽，c)肽于溶液中环化d)除掉侧链上的保护基a)线型肽或肽混合物的合成13.1g Fmoc-D-Ala-三苯甲基树脂悬浮于131ml二氯甲烷/二甲基甲酰胺(DCM/DMF)(2∶1)中，取该树脂悬浮液0.4ml(40mg，0.032mmol)转移到制备用反应容器中。反应容器是埃贲道夫管尖(Eppendorfspitzen)，其上以玻璃纤维堵塞，并放入到多重肽自动合成仪的合成组块中(Syntheseblocke)，加入0.7M需要的Fmoc-氨基酸溶液，在用二异丙基碳化二亚胺(DIC)就地活化之后，其中DIC是作为1.5M在DMF/DCM(1∶2)中的溶液以5倍过量加入的，偶联是用五倍过量的Fmoc-氨基酸进行，偶联反应需时50分钟。
用单个的肽复盖的载体物质(聚合珠)混合可得到规定的肽混合物。
在SYRO-自动合成仪上合成周期的记录如下
b)将线型肽或肽混合物自树脂上解离自树脂上(每1g)解离肽或肽混合物在所谓的FalconsR中用30ml乙酸/甲醇/DCM(2∶2∶6)于室温振荡3小时来进行。树脂自解离液中滤除，滤液于真空浓缩器中于300 毫巴/40℃除去DCM/甲醇、1毫巴/40℃除去乙酸。剩余物溶解于叔丁醇/水(4∶1)中，与2当量的0.2N HCl(以氨基计)混合，再于真空浓缩器中浓缩。c)线型肽或肽混合物的环合0.4mmol肽或肽混合物于聚丙烯容器中溶解于250ml DMF(0.0016M)，与4当量的二异丙基乙胺(DIPEA)混合。在振摇下，每个情况下慢慢滴加入3ml 0.4M HOBt/TBTU于DMF的溶液(3当量，1.2mmol)，用DC控制反应过程，5小时后反应终止。于1毫巴/40℃真空浓缩器中过夜蒸除溶剂(15小时)，干燥的剩余物溶解于DCM中，且用5％KHSO4、5％NaHCO3溶液和水振摇萃取(每种3X)。有机相用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。剩余物溶解于叔丁醇/水(4∶1)，冻干。d)侧链保护基的解离于室温下，每100-200mg环肽或环肽混合物用5或10ml解离液(TFA/硫代茴香醚/硫代甲酚，0.95∶0.25∶0.25)处理4小时，以除掉侧链保护基。然后将环肽于乙醚/正庚烷(1∶1)中析出，离心，再用乙醚/正庚烷洗涤2次，溶解于叔丁醇/水(4∶1)，冻干。
实施例1环(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)(K0021)的合成a)合成线型肽混合物环(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)为了合成由下面18个组分构成的线型肽混合物(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)，这些单个的肽是在聚合物载体上借助多重肽合成自动仪而制备的(Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Arg-ValTyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Asn-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Asp-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gln-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Glu-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gly-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-His-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Ile-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Leu-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Lys-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Met-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Phe-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Pro-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Ser-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Thr-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Tyr-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Val-Val-Tyr-(D)-Ala)作为反应容器的聚丙烯过滤柱每次用40mg(＝0.032mmol)Fmoc-D-Ala-2-氯三苯甲基树脂填充。树脂量的配量或用称量干树脂方法或用量液管量取树脂在二氯甲烷/二甲基甲酰胺(2∶1)的悬浮液方法。将0.7M必需的Fmoc-氨基酸溶液和等当量N-羟基苯并三唑(HOBt)于二甲基甲酰胺中的溶液一起加入，该偶联反应是用5倍过量的Fmoc-氨基酸通过用DIC就地活化而进行，DIC作为1.5M的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(2∶1)溶液也是5倍过量应用，偶联反应时间50分钟。
b)线型肽混合物从树脂上解离18个单个己肽-树脂于肽从树脂上解离之前合并成肽混合物(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)(18×40mg＝0.72g肽树脂)，总量共0.72g的肽树脂构成的肽混合物的解离反应是用20ml乙酸/甲醇/二氯甲烷(2∶2∶6)于室温振摇3小时完成的。解离液过滤分离掉树脂，于真空旋转蒸发器(β-RVC，Christ，Osterode)中于200毫巴/40℃(DCM/甲醇)或1毫巴/40℃(乙酸)下去除溶剂。剩余物溶解于叔丁醇/水(4∶1)中，加入2当量0.2N HCl(以氨基计)，于旋转真空浓缩器中浓缩至干。c)环合将0.4mmol肽混合物(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)于聚丙烯容器中溶解于250mm DMF(0.0016M)，加入4当量二异丙基乙胺(DIPEA)，混合物于冷冻箱内放置1小时。振摇下慢慢滴加3ml 0.4M HOBt/TBTU/DMF溶液(＝3当量，1.2mmol)。用TLC控制反应进程(流动相∶氯仿/甲醇/冰醋酸85∶15∶2，Rf(产物)＝0.59)。反应于3小时后终止。于旋转真空浓缩器中于1毫巴/40℃蒸除溶剂，干燥的剩余物溶解于二氯甲烷中，用5％KHSO4溶液和水振摇萃取。Na2SO4干燥有机相，真空蒸除溶剂，剩余物溶解于叔丁醇/水(4∶1)，冻干。d)侧链保护基的解离室温下将环肽混合物(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)(100-200mg)用10ml解离液(TFA/硫代茴香醚/硫代甲酚，0.95∶0.025∶0.025)中处理4小时。搅拌下将解离液慢慢加到乙醚/正庚烷(1∶1)混合液中，离心收集析出的沉淀，沉淀用乙醚/正庚烷通过超声处理洗涤2次，沉淀溶解于叔丁醇/水(4∶1)中，冻干。e)环肽混合物的分析环肽混合物用HPLC和离子喷雾质谱法分析，MS(FAB)环(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)；Xaa＝Gly653,8 (M+H)；Xaa＝Ala；667,8(M+H)；Xaa＝Ser；683,8(M+H)；Xaa＝Pro693,9(M+H)；Xaa＝Val695,9(M+H)；Xaa＝Thr697,9(M+H)；Xaa＝Leu709,9(M+H)；Xaa＝Ile709,9(M+H)；Xaa＝Asn710,9(M+H)；Xaa＝Asp711,8(M+H)；Xaa＝Lys724,9(M+H)；Xaa＝Gln724,9(M+H)；Xaa＝Glu725,9(M+H)；Xaa＝Met728(M+H)；Xaa＝His；733,9(M+H)；Xaa＝Phe743,9(M+H)；Xaa＝Arg752,9(M+H)；Xaa＝Tyr759,9(M+H).
实施例2环(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)(K5993)的合成用相应的氨基酸按实施例1的方法合成环肽混合物环(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)。Xaa＝Gly525,7(M+H)；Xaa＝Ala539,7(M+H)；Xaa＝Ser555,7(M+H)；Xaa＝Pro565,8(M+H)；Xaa＝Val567,8(M+H)；Xaa＝Thr569,8(M+H)；Xaa＝Leu581,8(M+H)；Xaa＝Ile581,8(M+H)；Xaa＝Asn582,8(M+H)；Xaa＝Asp583,7(M+H)；Xaa＝Lys596,8(M+H)；Xaa＝Gln596,8(M+H)；Xaa＝Glu597,8(M+H)；Xaa＝Met599,9(M+H)；Xaa＝His605,8(M+H)；Xaa＝Phe615,8(M+H)；Xaa＝Arg624,8(M+H)；Xaa＝Tyr631,8(M+H).
实施例3环(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)(K0022)的合成用相应的氨基酸按实施例1的方法合成环肽混合物环(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)MS(FAB)cyclo(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Cal-(D)-Ala)；Xaa＝Gly653,8(M+H)；Xaa＝Ala667,8(M+H)；Xaa＝Ser683,8(M+H)；Xaa＝Pro693,9(M+H)；Xaa＝Val695,9(M+H)；Xaa＝Thr697,9(M+H)；Xaa＝Leu709,9(M+H)；Xaa＝Ile709,9(M+H)；Xaa＝Asn710,9(M+H)；Xaa＝Asp711,8(M+H)；Xaa＝Lys724,9(M+H)；Xaa＝Gln724,9(M+H)；Xaa＝Glu725,9(M+H)；Xaa＝Met728(M+H)；Xaa＝His733,9(M+H)；Xaa＝Phe743,9(M+H)；Xaa＝Arg752,9(M+H)；Xaa＝Tyr759,9(M+H).
实施例4用类似方法制备如下的环肽或环肽混合物环(Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Gly-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Gln-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Lys-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Asn-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Ile-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Leu-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Pro-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Phe-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-His-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Ala-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ala-Tyr-Xaa-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Gln-Tyr-Val-(D)-Ala).环(Tyr-Val-Lys-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Glu-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Asp-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Phe-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Gly-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-His-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Asn-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Pro-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Ser-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Val-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Tyr-Tyr-Val-(D)-Ala)环(Tyr-Val-Met-Tyr-Val-(D)-Ala)Hyp代表羟基脯氨酸生物测定中生物活性的测定实施例5在无细胞结合试验中对IL-4结合的特异性抑制作用无细胞结合试验已叙述于EP488 170 Al中，为了进行该试验，用重组体嵌合蛋白，该蛋由通常是膜定位受体的细胞外区组成，并在其羧基末端融合由绞链-、CH2-和CH3区段构成的免疫球蛋白重链的Fc区。这些所谓的受体/Fc融合蛋白在保持特异的受体结合活性的情况下，可结合于预先被例如针对Fc片段的单克隆抗体所复盖的固相上。本实施例所使用的固体相是Nunc型B ELISA板。将受体/Fc融合蛋白溶解于含有10mg/ml BSA的PBS(PBSA)中，然后键合于这些经预处理的板上(huIL-4R/Fc，500ng/ml；mu IL-4R/Fc250ng/ml；hu Il-1R/Fc125ng/ml；室温反应1小时)。洗涤后，肽或各个特异的未标记的配体(huIL-4R/FchuIL-4；muIL-4R/FcmuIL-4；huIL-1R/FchuIL-1ra)以不同的浓度加入后，加入固定浓度(100ng/ml)的生物素标记的(biotinylierender)特异配体。温育在含有PBSA的5％DMSO中于室温进行1小时。冲洗后，该检测板与抗生蛋白链菌素/过氧化物酶(Amersham，12000于PBSA中)室温温育20分钟。检测板在四甲基联苯胺底物溶液(Behringwerke)中反复洗涤后，检测被结合的过氧化物酶。检测板温育30分钟，测定在450nm的吸光度，该吸光度直接反映了与受体结合的生物素标记的(biotinylierter)配体量。图1-3是测得的吸光信号与竞争剂浓度的关系图，是以没有竞争剂存在下的吸光度测定值为100％计算的。
图1表明，在huIL-4结合试验中，未标记的huIL-4与生物素标记的huIL-4竞争与人IL-4受体的结合。同样适用于muIL-4与小鼠IL-4受体的结合试验(图2)，及huIL-lra与人IL-1受体的结合(图3)。然而，肽混合物K5993，K0021和K0022则抑制生物素标记的huIL-和muIL-4与它们相应受体的结合作用(图1和2)，而在IL-lra的结合试验则无显著性影响(图3)。下面是测定的IC50值IC50[μg/ml]环(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala) (K 5993) 37环(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (K 0021) 68环(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala) (K 0022) 220环(Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala)16.7环(Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala)8.3环(Tyr-Va)-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala)17.4环(Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala)62.5环(Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala). 41.3环(Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala). 96.6环(Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala)92.0Xaa＝除Cys和Trp外的天然氨基酸残基。
实施例6对IL-4诱导的增生的影响式I的环己肽或其混合物的生物活性用生物测定法测定。IL-4以种属特异方式结合于IL-4受体上。基于此，使用来源于小鼠的且在其膜上带有小鼠IL-4受体的细胞谱系，该细胞系用对人白介素-4受体的完整基因进行转染。该细胞系同时在功能上表达了小鼠和人的膜定位的受体，该细胞系的增生与小鼠和人的IL-4都有关系(Mpsley等Cell，Vol. 59，335-348，10月20日，1989)。在所有的培养基中都加入1％DMSO，可改善肽的溶解度。
a)对通过人IL-4诱导的增生的影响图4表示了细胞系的增生与人的IL-4(huIL-4)有关(标准曲线)。当使用恒定浓度的huIL-4时，通过每种给定的单独滴定加进的肽混合物对细胞系增生产生依赖于肽浓度的抑制作用(图4)。
b)对通过小鼠IL-4诱导的增生的影响。
图5表示了细胞系增生与小鼠的IL-4(muIL-4)有关(标准曲线)，当使用恒定浓度的muIL-4时，通过每种给定的单独滴定加进的肽混合物对细胞系增生产生依赖于肽浓度的抑制作用(图5)。
实施例7对IL-1诱导的增生的影响使用IL-1依赖的T细胞克隆(D10(N4)M，Hopkins等，J.ofImm.Methods，120，271-276(1989)。培养基中加入1％DMSO以改善肽的溶解度。该细胞的增生与人IL-1β(huIL-1β)相关(图6，标准曲线)。在使用恒定浓度的huIL-1β时，通过上述单独滴定加入的给定肽混合物在给定浓度范围内均末呈现对该细胞系增生的抑制作用。
权利要求
1.式I化合物及其药用盐环(A-B-C-E-F-(D)-Ala) (I)式中A、B、C、E、F相互独立，相同或不相同，可为除半胱氨酸和色氨酸以外的天然氨基酸残基，代表Ala，Arg，Asp，Asn，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Tyr或Val。
2.权利要求1的式I化合物，其特征是，A和B相互独立，相同或不相同，代表Ile，Leu，Val，Phe或Tyr，且C、E和D相互独立，相同或不相同，为除半胱氨酸和色氨酸以外的天然氨基酸残基。
3.下式的化合物及其药用盐环(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)，环(Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)，或环(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)，式中Xaa为除半胱氨酸和色氨酸以外的天然氨基酸残基。
4.根据权利要求1-3中的一项或多项的式I化合物的制备方法，其特征是，a)将适当保护的氨基酸衍生物偶联到固体载体上，b)在保持侧链保护基的条件下，将生成的线型肽自载体上解离，c)线型肽在溶液中环合，d)解离去掉侧链的保护基，并且必要时e)转变成药用盐。
5.含有根据权利要求1-3中的一项或多项的化合物的混合物。
6.制备权利要求5的混合物的方法，其特征是，a)将适当保护的氨基酸衍生物偶联到固体载体上，为了引入到不同的位置，或者加入所有所需氨基酸的混合物，或者将载体与偶联在载体的寡肽(Oligopeptides)一起分成若干份且将每份单独与特定的氨基酸偶联，然后再把组份合并一起，b)在保持侧链上的保护基的情况下，在载体上形成的线型肽的混合物被解离下来，c)在溶液中将线型肽混合物环合，d)除掉侧链上的保护基，并在必要时，e)转变成药用盐。
7.根据权利要求1-3中的一项或多项的化合物用于制备治疗或预防过敏性疾病和感染药物。
8.根据权利要求1-3中的一项或多项的式I的化合物用于制备诊断试剂。
9.根据权利要求1-3中的一项或多项的式I化合物用于制备抑制白介素-4(IL-4)与IL-4受体结合的科学工具。
10.含有有效量的根据权利要求1-3中的一项或多项的式I化合物的药物或诊断试剂。
11.制备药物或诊断试剂的方法，其特征是，根据权利要求1-3中的一项或多项的至少一种化合物与药用载体以及必要时适宜的添加剂和(或)助剂相混合。
12.根据权利要求5的混合物用于制备治疗或预防过敏性疾病和感染的药物。
13.根据权利要求5的混合物用于制备诊断试剂。
14.根据权利要求5的混合物用于制备抑制白介素-4(IL-4)与IL-4受体结合的科学工具。
15.含有有效量的根据权利要求5的混合物的药物和诊断试剂。
16.制备药物或诊断试剂的方法，其特征是，根据权利要求5的一种或多种混合物与药用载体以及必要时适宜的添加剂和(或)助剂相混合。
全文摘要
本发明涉及式I化合物，其混合物及其药用盐环(A-B-C-E-F-(D)-Ala) (I)式中，A、B、C、E和F各自独立，相同或不相同，可为除半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)以外的天然氨基酸残基，制备方法，以及其用于制备过敏症和感染的诊断试剂、治疗药和预防药、以及用于抑制白介素-4(IL-4)与IL-4受体结合的科学工具。
文档编号C07K1/04GK1132210SQ9512058
公开日1996年10月2日 申请日期1995年12月11日 优先权日1994年12月13日
发明者S·亨克, B·乔丹, J·诺尔, L·劳夫尔, S·夫尔塔格, H·H·威斯穆勒, G·朱恩格 申请人:赫彻斯特股份公司