专利名称：：Hla-a2.1组合肽及其用途的利记博彩app
技术领域：
：本发明申请为USSN08/159,184的部分继续申请，而USSN08/159,184又是USSN08/073,205的部分继续申请，后者又是USSN08/027,146的部分继续申请。所有上述申请结合于此作为参考。技术背景本发明涉及用于预防、治疗或诊断多种病理状态如病毒性疾病或癌症的组合物和方法。具体地，本发明提供了能与选定的主组织相容性复合基因(MHC)分子结合并诱导免疫应答的新颖的肽。MHC分子为I类或II类分子。II类MHC分子主要在引发和维持免疫应答中涉及的细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等上表达。II类MHC分子被辅助(helper)T淋巴细胞识别，诱导辅助T淋巴细胞的增殖和放大对该特异的免疫原性肽的免疫反应。I类MHC分子在几乎所有的有核细胞中都表达并且被细胞毒性T淋巴细胞(CTLS)所识别，后者再摧毁带有该抗原的细胞。CTLS在肿瘤识别和对抗病毒感染方面尤为重要。CTL识别抗原的方式是通过被结合于I类MHC分子的肽片段，而不是直接接触外来抗原本身。抗原必须通常是由细胞内源性合成的、而且一部分蛋白质抗原在细胞质中被降解成小的肽片段。一些这种小肽片段被转移至前一高尔基体处并与I类重链发生作用以协助适当的折叠并和亚单位β2微球蛋白相连。接着肽一I类MHC复合物被传送至细胞表面，以便表达并可能被特异的CTL识别。对人的I类MHC分子HLA-A2.1的晶体结构的研究表明，通过I类重链的α1和α2区域的折叠产生了肽结合槽(groove)(Bjork-manetal.，Nature329506(1987))。然而，在这些研究中没有确定与该槽结合的肽的特征。Buus等人(Science2421065(1988))首先描述了从MHC将结合肽洗脱的酸洗脱法。随后，Rammensee及其同仁(Falketal.，Na-ture351290(1991))开发了一种确定天然处理的、与I类分子结合的肽的特性的方法。其他研究者对各种HPLC洗脱部分中较丰富的肽成功地实现了氨基酸直接测序，即用传统的自动测序法对来自B型的I类分子中洗脱的肽(Jardetzky，etal.，Nature353326(1991))和对A2.1型的I类分子(Hunt，etal.，Science2251261(1992))的洗脱而得的肽用质谱法测序。Rotzschke和Falk已对I类MHC中天然处理的肽的特性作了回顾(RotzschkeandFalk，Immunol.Today12447(1991))。Sette等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.863296(1989))证明，MHC等位基因的特异性基本模式(motif)能用来预测MHC的结合能力。Schaeffer等人(Proc.Natl.Acad.SciUSA864649(1989))证明MHC的结合与免疫原性相关。另几个作者(DeBruijnetal.，Eur.J.Immunol.，212963—2970(1991)；Pameretal.，991Nature353852—955(1991))已提供了I类的结合基本模式(motif)在动物模型中能用于鉴别潜在的免疫原性肽的初步证据。但对某给定的I类同型的大量的人的等位基因特异的I类基本模式需要加以描述。如果这些不同的等位基因的结合频率足够高，以便能覆盖相当大一部分或几乎是大多数远系婚配人群，则这是合乎需要的。尽管在本领域中已有所进展，但是目前还没有在这些工作的基础上开发出有用的基于人肽的疫苗或治疗剂。而本发明提供了这些和其他好处。发明概述本发明提供了含有HLA-A2.1分子的结合基本模式的免疫原性的肽的组合物。结合于适当的MHC等位基因的免疫原性肽最好长度为9—10个残基并且在某些位置上有保守性的残基，比如2位和9位上。此外，如此处所述，该肽在其他位置上(位点)，比如当肽长为9个氨基酸时在1，3，6，和/或7位；当肽长为10个氨基酸时在1，3，4，5，7，8，和/或9位上，不含有起负结合作用的结合残基。本发明限定了基本模式中的位置，从而能够选择那些能与HLA-A2.1有效结合的肽。用本发明的肽能鉴别出大量免疫原性靶蛋白上的抗原决定簇(表位)。适当的抗原的例子包括前列腺癌特异性抗原(PSA)，乙型肝炎核心及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，I型人类免疫缺陷病毒(HIV1)和乳头瘤病毒抗原。因此，这些肽对体内和体外治疗和诊断应用的药物组合物是有用的。定义术语“肽”与“寡肽”在本说明书中可互换使用，指一系列互相连接的残基，通常为L-氨基酸，通常是通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键一个与另一个相连。本发明的寡肽长度小于约15个残基，通常为约8—11个残基，最好为9或10个残基。“免疫原(性)肽”是含有等位基因特异性基本模式的肽，从而该肽会与MHC分子结合并诱导CTL应答。本发明的免疫原性肽能结合适当的HLA-A2.1分子并诱导细胞毒性T细胞对产生免疫原性肽的抗原的应答反应。用本发明的算法能方便地鉴别出免疫原性肽。该算法是一套数学程序，它产生能用于选择免疫原性肽的评分。通常，人们和“结合阀”一起使用该算法评分，从而能够选择出在一定亲和力下具有高结合可能性并且会因此成为免疫原性的肽。该算法基于MHC与肽特定位点上的特定氨基酸的结合效应，或基于与含有基本模式的肽的特定替代物的结合效应。“保守性残基”是在某肽的特定位点上以远大于随机分布所预期的频率存在的氨基酸。典型地，保守性残基是位于MHC结构提供的与免疫原性肽的结合点处的残基。具有限定的长度的肽上的1—3个，最好2个，保守性残基限定了免疫原肽的基本模式。这些残基通常与肽结合槽(groove)紧密接触，其中它们的侧链被埋在槽(groove)的特异包(pocket)中。典型地，免疫原肽会具有可多达3个保守性残基，更常见为2个保守性残基。如本文所用，“负作用结合残基”是这样一些氨基酸，如果存在于某些位点(如九聚物的1，3，和/或7位)上会导致肽不能结合(非结合物)或结合性差(差的结合物)，从而不能成为免疫原性的肽，即不能诱导CTL应答。术语“基本模式”是指将能被特定的MHC等位基因识别的在指定长度(通常为约8—11氨基酸)的肽上的残基基本模式。典型地，对于每个人的等位基因，肽基本模式都不相同而且在高度保守性残基和负作用残基的模式上有差别。对等位基因的结合基本模式能越来越准确地加以限定。在一种情况下，所有的保守残基都位于肽上的正确位点而且在位点1，3和/或7上没有负作用残基。词语“分离的”或“生物纯的”是指材料大致或基本上不含有那些在自然状态下常与其伴随的成分。因此，本发明的肽不含有在原来环境中通常与其相伴的物质，即抗原存在细胞上不含MHCI分子。尽管蛋白质已被分离成均质的或主要条带，但仍有5—10％与所需蛋白质共纯化的天然蛋白质等痕量污染物。本发明的分离肽不含有这种内源性的共纯化蛋白质。术语“残基”指通过酰胺键或类酰胺键掺入寡肽的氨基酸或类氨基酸。图1是HLA-A纯化方案流程图。图2是根据用于九聚物肽的“分组比率”算法而绘制的相对结合的对数的散布图。图3是根据用于九聚物肽的平均“结合的对数”算法评分而绘制的相对结合的对数的散布图。图4和图5是在2位和10位上含有优选残基的一组十聚物肽的散布图，用“分组比率”和“结合的对数”算法进行评分。优选例子的描述本发明涉及确定人I类MHC(有时称为HLA)等位基因亚型的等位基因特异性的肽基本模式，尤其是能被HLA-A2.1等位基因识别的肽基本模式。这些基本模式接着被用于定义来自任何所期望的抗原的T细胞抗原决定簇，尤其是那些与人的病毒性疾病，癌症或自体免疫疾病相关的抗原决定簇。对于这些疾病，人们已经知道潜在的抗原或自体抗原靶的氨基酸顺序。位于大量潜在靶蛋白质上的抗原决定簇能用这种方式鉴别。合适的抗原的例子包括前列腺特异抗原(PSA)，乙型肝炎核心和表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如MAGE-1)，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原和人乳头瘤病毒(HPV)抗原。本发明的肽还可用于缓解自体免疫疾病的症状、治疗或防止自体免疫疾病的发作或再发，这样的疾病包括，例如多发性硬化症(MS)，类风湿关节炎(RA)，斯耶格伦(Sjogren)综合症，硬皮病，多肌炎，皮肤肌炎，系统性红斑狼疮，青年性类风湿性关节炎，关节强硬性脊椎炎，重症肌无力(MG)，大疱性类天疱疮(有对位于皮-表皮连接处的基膜的抗体)，天疱疮(有针对粘多糖蛋白复合体或细胞间胶质的抗体)，肾小球性肾炎(有对肾小球基底膜的抗体)，古德帕斯彻(Goodpasture′s)综合症，自体免疫性溶血性贫血(有对红血球的抗体，淋巴瘤性甲状腺肿(Hashimoto′s)(有对甲状腺的抗体)，恶性贫血(有对体内因子的抗体)，自发性血小板减少性紫癜(有对血小板的抗体)，格雷夫斯(Grave′s)病和阿狄森(Addison′s)病(有对甲状腺球蛋白的抗体)等。与许多这些疾病相关的自体抗原已被鉴别出。例如，在实验室诱导的自体免疫疾病中，在疾病发生中涉及的抗原已经被特征化在小鼠和大鼠的关节炎中，在胶原蛋白诱导的关节炎鉴别出天然II型胶原蛋白，在佐剂性关节炎中鉴别出分支杆菌热休克蛋白；在小鼠实验性变态反应性甲状腺炎(EAT)中鉴别出甲状腺球蛋白；在实验性变态反应性重症肌无力(EAMG)中鉴别出乙酰胆碱受体(AchR)；在小鼠和大鼠的实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中鉴别出髓磷脂基蛋白(MBP)和蛋白脂类蛋白(PLP)。此外，已在人中鉴别出靶抗原人类风湿性关节炎中的II型胶原蛋白；和重症肌无力中的乙酰胆碱受体。含有来自这些抗原的表面决定簇的肽已被合成，接着在试验中测试其与适当的MHC分子的结合能力，其中使用例如纯化的I类分子和放射性碘标记的肽和/或表达空白I类分子的细胞并通过例如免疫萤光染色法和流式显微萤光分析法，依赖肽的I类集合试验法(assemblyassays)以及由于肽竞争而对CTL识别的抑制。对于那些与I类分子结合的肽进一步评估其作为来自感染或免疫过的个体的CTLS的靶目标的能力，以及它们作为潜在治疗剂诱导原发体外或体内CTL应答的能力，这种CTL应答能导致CTL群的增加，而此CTL群能与病毒感染的靶细胞或肿瘤细胞反应。MHCI类抗原由HLA-A，B和C位点编码。HLA-A和B抗原以大致相同密度在细胞表面表达，而HLA-C的表达则低得多(也许可低至10倍之多)。这些位点的每一个都具有大量等位基因。本发明的肽结合基本模式对于每种等位基因亚型都是相对特异的。对于肽基疫苗，本发明的肽最好具有能被在人群中具有广泛分布的一种MHCI分子识别的基本模式。因为在不同的人种和种族中MHC等位基因存在的频率不同，所以对靶MHC等位基因的选择应取决于选定的靶人群。表1显示了在不同种族中位于HLA-A位点产物的各种等位基因的频率。例如大部分白种人群可以被与四种HLA-A等位基因亚型(具体的为HLA-A2.1，A1，A3.2，和A24.1)结合的肽所覆盖。同样，大部分亚洲人群可以通过添加与第三种等位基因HLA-A11.2结合的肽而加以包括。表1A等位基因/亚型N(69)*A(54)C(502)A110.1(7)1.8(1)27.4(138)A2.111.5(8)37.0(20)39.8(199)A2.210.1(7)03.3(17)A2.31.4(1)5.5(3)0.8(4)A2.4———A2.5———A3.11.4(1)00.2(0)A3.25.7(4)5.5(3)21.5(108)A11.105.5(3)0A11.25.7(4)31.4(17)8.7(44)A11.303.7(2)0A234.3(3)—3.9(20)A242.9(2)27.7(15)15.3(77)A24.2———A24.3———A251.4(1)—6.9(35)A26.14.3(3)9.2(5)5.9(30)A26.27.2(5)—1.0(5)A26V—3.7(2)—A28.110.1(7)—1.6(8)A28.21.4(1)—7.5(38)A29.11.4(1)—1.4(7)A29.210.1(7)1.8(1)5.3(27)A30.18.6(6)—4.9(25)A30.21.4(1)—0.2(1)A30.37.2(5)—3.9(20)A314.3(3)7.4(4)6.9(35)A322.8(2)—7.1(36)Aw33.18.6(6)—2.5(13)Aw33.22.8(2)16.6(9)1.2(6)Aw34.11.4(1)——Aw34.214.5(10)—0.8(4)Aw365.9(4)——表中数据得自B.DuPont，ImmunobiologyofHLA，Vol.I，HistocompatibilityTesting1987，Springer-Verlag，NewYork1989.*N＝黑人；A＝亚洲人；C＝白种人括号内的数字为分析中包括的人数。用于描述肽化合物的术语按照传统的习惯，其中氨基在每个氨基酸残基的左侧(N-端)而羧基在右侧(C-端)。在表示本发明的选定的特殊例子的式子中。尽管没有特别标出氨基端和羧基端基团，但它们处于在生理pH值下所取的形式，除非另加说明。在氨基酸结构式中。各残基通常用标准的三字符或单字符表示。L型的氨基酸残基用大写的单个字母或第一个字母大写的三字母符号表示。那些具有D-型的氨基酸的D型用小写的单个字母或小写的三字符表示。甘氨酸没有不对称碳原子，全部用“Gly”或“G”表示。用于鉴别本发明的肽的程序一般按照Falketal.，Nature351290(1991)公开的方法，该文献在此引用作为参考。简言之，该方法涉及从适当的细胞或细胞系中大规模分离MHCI类分子，典型地是通过免疫沉淀法或亲和层析法。对于本领域技术人员而言同样公知的用于分离所需的MHC分子的其他方法的例子包括离子交换层析法，外源凝集素层析法，分子大小排阻层析法(sizeexclusion)，高效液相色谱法，以及所有上述技术的组合形式。在典型情况下，用免疫沉淀法分离所需的等位基因。可以依据使用的抗体的特异性而采用大量技术方案。例如对于亲和纯化HLA-A，HLA-B1和HLA-C分子，可以使用等位基因特异性单克隆抗体(mAb)试剂。已有数种用于分离HLA-A分子的mAb试剂，单克隆BB7.2适用于分离HLA-A2分子。用利用标准技术而制备的mAb亲和柱可以成功地纯化各HLA-A等位基因产物。除了等位基因特异性mAb，可以在下面实施例中所述的另外的亲和纯化方案中使用活性更广的抗-HLA-A，B，CmAb，例如W6/32和B9.12.1，和抗-HLA-B，CmAb，B1.23.2。典型地使用酸处理来洗脱结合于分离的MHC分子肽结合槽上的肽。还可用大量标准的变性手段使肽与I类分子解离，例如通过热、pH，去污剂、盐、离液序列高的试剂或其组合。再用反向高效液相色谱法(HPLC)可将肽部分(片段)与MHC分子分开，并测序。可以用技术人员熟知的大量其他标准方法分离肽，其中包括过滤，超滤，电泳，分子排阻色谱，用特异性抗体沉淀，离子交换层析，等电聚焦等。可以用标准方法进行分离的肽的测序工作，例如用Edman降解法(Hunkapiller，M.W.，et.al.，MethodEnzymol.91，399(1983))。其他适用于测序的方法包括上述的单个肽的质谱分析法测序(Hunt，etal.，Science2251261(1992))，该文献在此引用作为参考)。来自不同的I类分子有大量各种各样的肽(如收集HPLC流分)的氨基酸测序表明，各种I类等位基因都有特征性的顺序基本模式。对不同的I类等位基因特异性基本模式的定义使得能够鉴别来自氨基酸顺序已知的抗原蛋白的潜在的肽表位。典型地，潜在的肽表位的鉴别最初是使用计算机扫描所需的抗原的氨基酸顺序进行的，以确定是否存在基本模式。然后，合成表位顺序。再用各种不同方法测量结合MHCI类分子的能力。一种方法是在下面的实施例4中描述的I类分子结合试验法。其他在文献中描述过的方法包括抑制抗原存在(Sette，etal.，J.Immunol.1413893(1991))，体外集合试验法(Townsend，etal.，Cell62285(1990))，和使用突变细胞如RMAS基于FACS的试验(Melief，etal.，Eur.J.Imminol.212963(1991))。接着，对在MHCI类结合试验中呈阳性的肽测试其体外诱导特异性CTL应答的能力。例如，已和某肽一起保温的存在抗原的细胞可测试其诱导应答者细胞群中的CTL应答的能力。存在抗原的细胞可以是正常细胞和外周血单核细胞或树突细胞(Inaba，etal.，J.Exp.Med.166182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol.18219(1988))。另外，可以按常规使用突变的哺乳动物细胞系(在使I类分子负载内加工的肽能力方面有缺陷)，比如小鼠细胞系RMA-S(Karre.etal.，Nature319675(1986)；Ljunggrenet.al.，Eur.J.Im-munol.212963—2970(1991))，和人体细胞T细胞杂交细胞，T-2(Cerundolo，etal.，Nature345449—452(1990))以及已用适当的人I类基因转染的细胞，当向它们加入肽时，测试肽诱导体外初级CTL应答的能力。其他可使用的真核细胞系包括多种昆虫细胞系如蚊子幼虫(ATCC细胞系CCL125，126，1660，1591，6585，6586)，蚕(ATCCCRL8851)，黏虫(ATCCCRL1711)，蛾(ATCCCCL80)，和果蝇属细胞系如Schneider细胞系(参见SchneiderJ.Em-bryol.Exp.Morphol.27353—356(1927))。在对正常供血者或病人进行简易的静脉穿刺或白细胞除去之后，可以按常规分离外周血淋巴细胞，用作CTL前体的应答者细胞源。在一个例子中。将适当的存在抗原的细胞与10—100μm无血清介质中的肽在适宜的培养条件下一起孵育4小时。然后将负载肽的存在抗原的细胞于最佳培养条件下与应答者细胞群进行体外孵育7—10天。阳性CTL激活可由测试培养物中是否存在能杀死放射标记靶细胞的CTL而确定，包括特异性的肽脉冲(peptide-pulsed)靶以及表达相关病毒或肿瘤抗原(肽顺序来自这些抗原)的内加工形式的靶细胞。CTL的特异性和MHC限制性是通过测试对表达适当或不适当的人MHCI类分子的不同肽的靶细胞的作用而测出的。在MHC结合试验中呈阳性并导致特异性CTL应答升高的肽在此处被称为免疫原肽。免疫原肽可以用合成法或重组DNA技术制得，或从天然材料如完整的病毒或肿瘤中获得。尽管肽最好基本上不含其他天然存在的宿主细胞的蛋白质或其片段。但在某些例子中肽可以通过合成而连于天然片段或颗粒。寡肽或肽可以是各种长度的，以中性(不带电荷)形式或以盐形式存在，可以不含修饰(如糖基化，侧链氧化或磷酸化)或者含有这些修饰，并经受那些此处所述的修饰不会破坏聚肽生活性的情况。较佳地，肽应尽可能小同时又尽可能维持基本上大肽的所有生物活性。若可能，将本发明的肽优化至长度为约8—10氨基酸残基是有利的，这在大小上相当于在细胞表面上结合于MHCI类分子的内加工的病毒肽或肿瘤细胞肽的长度。具有所需活性的肽可以按需要进行修饰以提供某些需要的特性如改进药理学特性，并同时提高或至少基本保留未修饰的肽结合于所需的MHC分子并激活适当T细胞的全部生物活性。例如，肽可以经过多种改变，比如保守或不保守的替代，而这些改变可能会提供某些用途上的好处比如改进MHC结合。“保守替代”是指一个氨基酸残基被另一个生物学和/或化学上相似的氨基酸残基替代，比如用憎水性残基替代另一个憎水性残基，或用极性残基替代另一个极性残基。替代包括某些组合如Gly，Ala；Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。单一氨基酸替代的效果可以使用D-氨基酸进行探测。这些修饰可以用公知的肽合成方法进行，比如在例如本文引用作为参考的下列文献中描述的方法Merri-field，Science232341—347(1986)，BaranyandMerrifield，ThePeptides，GrossandMeienhofer，eds.(N.Y.，AcademicPress)，pp.1—284(1979)；andStewartandYong，SolidPhasePeptideSynthesis，(Rockford，Ill.，Pierce)，2dEd.(1984)。还可以通过延长或缩短化合物的氨基酸顺序而修饰肽，例如通过增加或删去一些氨基酸。本发明的肽或类似物还可以通过改变某些残基的次序或组合而加以修饰，但应很容易理解，某些对于生物活性必须的氨基酸残基，比如位于关键接触点的残基或保守性残基，它们通常不被改变以不对生物活性产生有害影响。非关键氨基酸不必局限于那些天然存在于蛋白质的种类如L-α-氨基酸或其D-异构体，而应包括非天然氨基酸，如β-，γ-，δ-氨基酸以及许多L-α-氨基酸的衍生物。典型地，采用一系列具有单一氨基酸替代的肽以确定静电电荷、憎水性等对结合的影响。例如，沿肽长度方向制备了一系列带正电荷(如Lys或Arg)或负电荷(如Glu)的氨基酸替代物，以揭示对各种MHC分子和T细胞受体的不同的敏感度模式。此外，可以使用利用小而且较中性的部分如Ala，Gly，Pro或类似残基而制得的多重替代物，替代物可以是均聚物或异聚物。用于替代或添加的残基的数目和类型取决于关键接触点间所必须的间隔以及某些所想要达到的功能特性(如憎水性/亲水性)。与亲本肽的亲和力相比，对MHC分子或T细胞受体的更高的结合亲和力可以通过这样的替代而实现。在任何情况下，这种替代应采用那些选定的氨基酸残基或其他分子片段以避免例如可能会破坏结合的空间或电荷方面的干扰。氨基酸替代典型地为单个残基的替代。可以综合替代、缺失、插入或其任何组合以达到最终的肽。替代突变体是那些至少去除肽的一个残基并且在该位置上插入一个不同的残基的突变类型。当需要微小地调节肽的特性时，通常可以根据下表2进行这种替代。表2原来的残基典型替代AlaSerArgLys，HisAsnGlnAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisLys；ArgIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；HisMetLeu；IlePheTyr；TrpSerThrThrSerTrpTyr；PheTyrTrp；PheValIle；Leu获得功能上的重大改变(如对MHC分子或T细胞受体的亲和力)是通过选择那些比表2中列出的更不保守的替代。例如通过选择在对维持下列的效果方面差别更大的残基(a)在替代区域的肽主链的结构，如片状或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或憎水性，或(c)侧链的体积。通常预期会产生肽性能最大改变的替代是那些(a)亲水性残基如丝氨酰基与憎水性残基如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基之间的替代；(b)具有正电荷的侧链的残基如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基与具有负电荷的残基如谷氨酰基，天门冬氨酰基之间的替代；或(c)侧链体积大的残基如苯丙氨酰基与没有侧链的残基如甘氨酰基之间的替代。肽可以包括免疫原性肽中两个或多个残基的等排物(isostere)。如此文所定义，等排物是二个或多个残基的某种顺序，它可用于替代第二种顺序因为第一种顺序的立体构象与第二种顺序特异的结合点相适配。该术语特别包括本领域技术人员熟知的肽主链方面的修饰。这种修饰包括酰胺氮原子、α-碳原子、酰胺羰基的修饰、酰胺键的完全替换、缺失、延伸或主链交联。一般可参见，Spatola，ChemistryandBiochemistryofAminoAcids，PeptidesandProteins，Vol.VII(Weinsteined.，1983)。含各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸的肽的修饰在提高肽在体内的稳定性方面特别有用。稳定性可用许多方法测定。例如，已使用肽酶和各种生物介质如人血浆和血清测试稳定性。参见，例如，Ver-hoefetal.，Eur.J.DrugMetabPharmacokin.11291—302(1986)。本发明的肽的半衰期可用25％人血清(V/V)试验方便地加以测定。该方案通常如下所述。在使用前经离心使混合的人血清(AB型，非热灭活的)脱脂。接着用RPMI组织培养基将血清稀释至25％，再用其测试肽的稳定性。按预定的时间间隔取出少量反应溶液，加入6％三氯乙酸水溶液或乙醇。将混浊的反应样品在4℃冷却15分钟，再离心使已沉淀的血清蛋白集聚成块。再使用稳定性—特异性的色谱条件通过反相HPLC确定肽的存在与否。本发明的具有CTL激活活性的肽或其类似物可以被修饰以提供除了改进血清半衰期之外的所需的性能。例如，通过连接于含有至少一个能诱导T辅助细胞应答的表位的序列，可以提高肽诱导CTL活性的能力。在某些情况下，T辅助肽是一种在大多数人群中被T辅助细胞识别的肽。这可以通过选择结合于大多数、绝大多数或所有MHCII类分子的氨基酸顺序而实现。这些就是已知的“MHC不严格限制的”(looselyMHC-restricted)T辅助顺序。MHC不严格限制的氨基酸顺序的例子包括来自如破伤风毒素的抗原位点830—843(QYIKANSKFIGITE)的顺序，来自恶性疟原虫CS蛋白的抗原位点378—398(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)的顺序，以及来自链球菌18kD蛋白抗原位点1—16(YGAVDSILGGVATYGAA)的顺序。另外，可以使用自然界没有的氨基酸顺序，按MHC不严格限制方式制备人工合成的能激活T辅助淋巴细胞的肽。这些合成的化合物被称为泛-DR-结合表位(PADRE)，它们是在与大多数HLA-DR(人MHCII类)分子的结合能力基础上进行设计的(见未审定的专利申请USSN08/121,101)。特别优选的免疫原性肽/T辅助结合物通过间隔物相连。间隔物典型地包括较小的、中性的分子，如氨基酸或氨基酸类似物，它们在生理条件下基本上不带电荷。间隔分子典型地选自如Ala，Gly或其他非极性氨基酸或极性氨基酸的中性间隔分子。应理解，可有可无的间隔分子不必含有相同的残基，因而可以是均聚物或杂聚物。当存在时，间隔分子通常至少含1个或2个残基，更常见含3—6个残基。或者，CTL肽也可以不用间隔分子而连于T辅助肽。免疫原性肽可以直接或通过间隔分子在CTL肽的氨基端或羧基端连于T辅助肽。免疫原性肽或T辅助肽的氨基端可以是酰基化的。典型的T辅助肽包括破伤风类毒素830—843。流感307—319，疟疾环状体382—298和378—389。在某些例子中，在本发明的药物组合物中含有至少一种引发(prime)CTL的成分是有利的。经鉴别，脂类能作为在体内引发CTL抗病毒抗原的制剂。例如，棕榈酸残基可以连于Lys残基的α-和ε-氨基。然后再通过例如一个或多个连接残基如Gly，Gly-Gly-，Ser，Ser-Ser等而连于免疫原性肽。脂化的肽接着可以直接以胶粒形式注射，掺入脂质体或在佐剂如不完全的Freund佐剂中乳化。在一个优选实例中，特别有效的免疫原含有连于Lysα-和ε-氨基酸的棕榈酸，它再通过如Ser-Ser的连接方式连于免疫原性肽的氨基末端。作为脂类引发CTL应答的另一例子，大肠杆菌的脂蛋白，如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)可用于在共价连于适当的肽时引发病毒特异性CTL。参见，Deres，etal.，Nature，342561—564(1989)，该文献在引作为参考。本发明的肽能偶连于例如P3CSS，然后脂肽可以施用于人体以特异性地引发对靶抗原的CTL应答。此外，因为还可以用具有一个适当表位的偶连于肽的P3CSS产生中和抗体，所以两种组合物可以混合使用以便更有效地引发体液和细胞介导的对感染的应答。此外，为了方便地将肽互相连接，为了偶连于载体支承物或更大的肽，为了修饰肽或寡肽的物理或化学性能等，可以在肽的末端添加额外的氨基酸。可将诸如酪氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天门冬氨酸之类的氨基酸引入肽或寡肽的C-或N-端。某些情况下在C末端的修饰会改变肽的结合性能。此外，肽或寡肽的顺序可与天然顺序不同，例如通过烷酰基(C1—C20)或巯基乙醇酰基化作用，使末端-NH2酰化，或用氨或甲基胺等，使末端羧基酰胺化等而加以修饰。在某些情况下，这些修饰提供了结合于支承物或其他分子的位点。本发明的肽可以用各种广泛而不同的方法进行制备。由于其相对较小的尺寸，可以在溶液或固相载体上用常规技术合成这些肽。已有各种市售的、可以根据已知的技术方案使用的自动合成仪。参见，例如StewardandYoung，SolidPhasePeptideSynthesis，2d.ed.，PierceChemiealCo.(1984)，Supra。或者，也可以使用重组DNA技术。其中，编码感兴趣的免疫原性肽的核苷酸顺序被插入适当的表达载体，转化或转染入适当的宿主细胞，并在适宜表达的条件下培养。这些技术都是本领域通晓的，如一般在Sambrooketal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1982)中所述，该书在此引用作为参考。因此，含有一个或多个本发明的肽顺序的融合蛋白能用于提供适当的T细胞表位。因为用于此处规定长度的肽的编码顺序可以用化学方法如Matteucci等人的磷酸酯法(J.AmChem.Soc.1033185(1981))进行合成，因此，通过替代编码天然肽顺序的核苷酸中的适当碱基可以方便地进行修饰编码顺序并再配上合适的接头并连入本领域常见的表达载体。然后使用该载体转化合适的宿主以产生所需的融合蛋白。现在已有大量这样的载体和合适的宿主系统。为了表达融合蛋白，可以给编码顺序配备可操作连接的起始密码子和终止密码子，起动子和终止子区域而且通常配备一个可复制的系统以便提供一个在所需的细胞宿主中表达的表达载体。例如在含有方便的可供插入所需编码顺序的限制性酶切位点的质粒中，可以提供与细菌宿主相容的起动子顺序。将得到的表达载体转化至合适的细菌宿主中。当然若采用合适的载体和调控顺序，还可以使用酵母或哺乳动物细胞宿主。本发明的肽和药物及疫苗组合物适用于哺乳动物，特别是人使用，以治疗和/或预防病毒感染和癌症。可以用本发明的免疫原性肽治疗的疾病包括诸如前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、爱滋病、肾癌、宫颈癌、淋巴瘤，CMV和尖锐湿疣。有趣的是，对于药物组合物，本发明的免疫原性肽能适用于已得癌症或被病毒感染的个体，那些处于感染的潜伏期或急性期的病人可以单独地用免疫原性肽进行治疗或结合其他治疗手段(如果合适的话)进行治疗。在治疗中将组合物施用于病人，其用量足以引发有效的对病毒或肿瘤抗原的CTL应答，并且治愈或至少部分阻止症状和/或并发症。足以实现该目的的用量被定义为“治疗有效剂量”。用于该用途的有效量取决于，例如肽组合物，施用方式，被治疗的疾病所处的阶段和严重性，病人的体重和健康的总体状态以及开处方的医生的判断。但是作为最初免疫(即用于治疗或预防性施用)，对于70kg病人，其量通常为约1.0μg至约5000μg肽，随后加强剂量为约1.0—1000μg肽，在数周至数月内按照加强治疗方案施用，这种加强方案取决于病人的应答及病情(通过测量病人血中特异性CTL活性而知)。应记住，本发明的肽和组合物通常可用于严重的疾病状态也就是危及生命或可能危及生命的状态。在这种情况下考虑到尽可能减少外来物质及肽的相对无毒性，让经治疗医生施用大大过量的肽组合物是可行而且是合乎需要的。作为治疗用途可以在病毒感染首发症状或确诊或手术去除肿瘤时或在刚诊断出急性感染后不久便开始施用。随后使用加强剂量直到至少症状基本消退并且维持一段时间。在慢性感染中需要在负荷剂量后接着用加强剂量。用本发明的组合物治疗感染的个体可以加速急性感染个体的感染状态的消退，对于那些容易(或素质易于)发展成慢性感染的个体，该组合物在防止从急性感染向慢性感染的演变中特别有用。当易感个体在感染之前或感染中被诊断出时(例如此处所述)，便可将组合物用于他们以减少施用于更大人群范围的需要。肽组合物还可用于治疗慢性感染和刺激免疫系统以消除携带者体内病毒感染的细胞。在配方中提供一定量具有免疫增强作用的肽和足够有效激活细胞毒性T细胞应答的施用方式是至关重要的。因此对于治疗慢性感染代表性的剂量，对于70kg重的病人而言每次剂量为约1.0—5000μg，较佳为5—1000μg，免疫剂量后按规定间隔在1—4周内施用加强剂量是需要的，有时可能需要更长时间以便有效地使个体产生免疫。在慢性感染中可以连续施用直到至少临床症状或实验室检查表明，病毒感染已被清除或基本消退并维持一段时间。用于治疗处理的药物组合物可以非肠道施用、表皮施用、口服或局部施用。较佳的药物组合物是通过非肠道施用。比如静脉施用。皮下施用，真皮内施用或肌内施用。因此本发明提供了非肠道施用的组合物，它包括溶于或悬浮于可接受的载体，最好是水质载体中的免疫原性肽溶液。大量可以使用水质载体如水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以用已知的常规灭菌技术进行灭菌或灭菌过滤。得到的水溶液可以按原样进行包装以供使用，或冻干。冻干制剂在施用之前与无菌溶液进行混合。组合物还可以含有类似生理状态所需的药学上可接受的辅助性物质，例如pH调节及缓冲剂，张力性调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸脱水山梨醇酯、三乙醇胺油酸酯等。在药物配方中本发明的CTL刺激肽的浓度可以在大范围中变动，如从小于约0.1％，通常为或至少为约2％至高达20％—50％或更高(按重量计)，而且根据选用的特定施用方式可以主要通过流体体积、粘度等进行选择。本发明的肽还可以通过脂质体进行施用，脂质体将肽送至特定的组织，例如淋巴组织或选择性地送至感染细胞，它还会提高肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫剂、胶粒、不溶性单分子层、液晶、磷酸脂分散剂、片状层等。在这些制剂中待输送的肽作为脂质体的一部分掺入，单独或连同结合于如淋巴细胞中普遍存在的受体的分子，例如结合于CD45抗原单克隆抗体或者和其他治疗或免疫组合物一起使用。因此填入的或用本发明的所需要的肽修饰的脂质体可以被导向淋巴细胞所在部位，在该部位脂质体释出选定的治疗/免疫用肽组合物。用于本发明的脂质体可以用标准的成泡脂类制成，其通常包括中性或带电荷的磷酸脂和甾醇，如胆固醇。脂类的选择通常考虑如脂质体大小，酸不稳定性和在血流中脂质体的稳定性。已有各种制备脂质体的方法如Szokaetal.，Ann.Bey.BiophysBioeng9467(1980)，美国专利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369所述。这些文献在此被引用以作参考。为了导向免疫细胞，掺入到脂质体中的配基可以包括例如对于所期望的免疫系统细胞的细胞表面决定簇特异的抗体或其片段。含有肽的脂质体悬浮液可以静脉施用，局部施用或表面施用，其用量可以根据例如施用方式、被输送的肽、以及被治疗的疾病所处的阶段而改变。对于固体组合物可以使用常规的无毒性的固相载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素，葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服，可以通过掺入任何一种通常采用的赋形剂例如前面列出的那些载体而形成药学上可接受的无毒性组合物，它通常含有10％—95％活性成分(即一种或多种本发明的肽)，更佳的浓度为25％—75％。对于气雾剂施用法，免疫原性肽最好和表面活性剂及推进剂一起以精细分散的形式提供。肽的典型百分比为0.01—20％(重量)，更佳为1—10％。当然，表面活性剂必须无毒性、而且最好溶于推进剂中，这样的试剂的代表是含有6—22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸)与α脂族多元醇或其环状酐形式的酯或部分酯。可以使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物的0.1—20％(重量)，更佳为0.25—5％，组合物的其余部分通常为推进剂，如果需要还可包括一种载体，和例如用于鼻内给药的卵磷酯。本发明另一方面涉及疫苗，它含有致免疫有效量的本文所述的免疫原肽作为活性成分。可将肽引入某宿主(包括人)，其形式可以是连于其自己的载体或者作为活性肽单元的均聚物或杂聚物。这种聚合物具有下列优点提供免疫反应，而且当使用不同的肽构成聚合物时还具有诱导能与病毒或肿瘤细胞的不同抗原决定簇反应的抗体和/或CTL额外能力。可以使用的载体是本领域公知的而且包括例如甲状腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白，破伤风类毒素，聚氨基酸，如聚(赖氨酸谷氨酸)，流感、乙型肝炎病毒核心蛋白，乙型肝炎病毒重组疫苗等。疫苗还可含有生理上可接受的稀释剂如水、磷酸盐缓冲盐水、或盐水，更典型的还含有佐剂。诸如不完全Freund佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，或明矾之类的佐剂是本领域公知的材料。而且如上所述通过将本发明的肽偶连于脂类如P3CSS，可以刺激CTL应答。一旦通过注射，气雾剂，口服，皮内或其他途径施用，用此处所述的肽组合物进行免疫，则宿主的免疫系统会通过产生大量针对所需抗原特异性的CTL而对疫苗作为应答，因而宿主至少对以后的感染有部分免疫力或能防止演变为慢性感染。含有本发明的肽的疫苗组合物可以施用于易感或处于病毒感染或癌症威胁的病人。可引发针对抗原的免疫应答，并因此增强病人自身的免疫应答能力。这样的用量被定义“致免疫有效剂量”。在这样应用中精确的用量同样取决于病人的健康状况和体重，施用方式，配方的性质等，但对于每一70kg病人而言通常为1.0μg至约5000μg，更常见为每70kg体重约10—500μg。在某些情况下将本发明的肽疫苗和能诱导针对感兴趣的病毒尤其是病毒包膜抗原的中和抗体应答的疫苗一起混合使用是有利的。对于治疗或免疫用途，本发明的肽还可以由减毒的病毒宿主如牛痘或鸡痘(fowlpox)病毒进行表达。这种方法涉及使用牛痘疫苗作为载体以便表达编码本发明的肽的核苷酸序列。一旦引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，重组的牛痘疫苗便表达免疫原性肽，从而引起宿主的CTL应答。用于免疫方案中的牛痘载体和方法在例如以专利4,722,848中有所描述，该文献在此引用作为参考。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover等人的著作中(Nature351456—460(1991))有所描述，该文献在此引用作为参考，结合上面的描述，本领域的熟练技术人员将能显而易见地找到大量其他的能用于治疗性施用或免疫施用本发明的肽的载体。如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)载体等。抗原肽还可以用来在体外引发CTL。得到的CTL能用于治疗病人的慢性感染(病毒性或细菌性)或肿瘤。而这些病人对其他常规的治疗方法不产生应答或者对于治疗中的肽疫苗方法不会产生应答。对特定病原(感染因子或肿瘤抗原)的体外CTL应答，其诱导可以通过在组织培养物中将病人的CTL前体细胞(CTLp)和某来源的存在抗原的细胞的细胞(APC)及适当的免疫原性能一起孵育。孵育适当时间后(典型为1—4周)，在此期间CTLp被激活并成熟并膨胀成效应CTL，将细胞输回病人。在病人体内它们会摧毁其特异性靶细胞(感染细胞或肿瘤)。本发明的肽可以用于诊断试剂，例如本发明的肽可以用于确定特定个体对采用肽或相关肽的治疗方案的易感性，因而能够有助于修改已有的治疗方案或有助于对受染的个体预先作出确定。此外该肽还可以用于预测哪些个体会受到演变或慢性感染的真正危险。下面提供起阐述作用而不是限制作用的实施例，以进一步阐述本发明。实施例1I类抗原的分离图1给出了HLA-A抗原纯化方案的流程图。简言之，大量培养载有合适等位基因的细胞(6-8升得到约5×109个细胞)，离心收集并洗涤。将所有细胞系保存于加有10％胎牛血清(FBS)和抗生素的RPMI1640介质(Sigma)。为大规模培养，将细胞在含10％FBS或10％马血清和抗生素的RPMI1640滚筒瓶培养液中培养。在装有259转子的IEC-CRU5000离心机中于1500RPM下离心收集细胞，并用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(0.01MPO4、0.154MNaCl，pH7.2)洗涤三次。细胞成团，贮于-70℃，或用去污剂细胞溶解液制成去污剂溶胞液。在细胞团中(预先计数过)以每毫升去污剂溶液50～100×106个细胞的比例加入库存去污剂溶液[1％NP-40(Sigma)或Renex30(AccurateChem.Sci.Corp.，Westbury，NY11590)，150mMNaCl，50mMTris，pH8.0]制成细胞溶胞液。在加入细胞团前，即刻在预定体积的库存去污剂溶液中加入蛋白酶抑制剂混合物。蛋白酶抑制剂混合物的加入产生如下终浓度苯甲基磺酰氟(PMSF)，2mM；抑肽酶，5μg/ml；亮肽素，10μg/ml；抑肽素，10μg/ml；磺乙酰胺，100μM；EDTA，3ng/ml。在周期性搅拌下，于4℃下进行1小时细胞溶解。按常规，在50～100ml去污剂溶液中溶解5～10×109个细胞。4℃，15,000×g离心30分钟，使溶胞液变澄清，接着，上清液部分通过一0.2μ的滤器单元(Nalgene)。用以结合了mAb的琼脂糖珠制成的亲和柱达到HLA-A抗原的纯化。为制备抗体，在大组织培养瓶(Corning25160-225)中用含10％FBS的RPMI培养细胞。用硫酸铵分级分离，再在A蛋白—琼脂糖(Sigma)上亲和层析，从澄清的组织培养基中提纯抗体。简言之，搅拌下将饱和硫酸铵缓缓加入组织培养上清液中，至45％(体积/体积)，4℃过夜以沉淀免疫球蛋白。10,00×g离心30分钟收集沉淀的蛋白质。然后将沉淀溶于最小体积的PBS，并转入透析管(Spec-tro/Por2，分子量截值12,000-14,000，SpectumMedicalInd.)用PBS(≥20倍蛋白质溶液的体积)进行透析，4℃下经24-48小时，换4～6次透析缓冲液。透析后的蛋白质溶液离心(10,000×g，30分钟)使澄清，用1NNaOH将溶液pH调到pH8.0。按制造商的说明，将A蛋白—琼脂糖(Sigma)水合化，并制备A蛋白—琼脂糖柱。典型的是10ml珠体积的柱结合50～100mg小鼠IgG。加入大体积时用蠕动泵，加入小体积时(＜100ml)靠重力将蛋白样品加到A蛋白—琼脂糖柱上。用几倍体积PBS洗涤，洗脱液用分光光度计于A280检测，直至达到基线。在合适的pH(用1NNaOH调至合适的pH)下用0.1M枸橼酸洗脱被结合的抗体。小鼠IgG-1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0。用2MTris碱中和洗脱液。将含抗体(用A280检测)的流分合并，以PBS透析，再用AmiconStirredCell系统(含YM30膜的AmiconModel8050)进行浓缩。抗A2mAb，BB7.2对亲和钝化是有用的。用以结合有mAb的琼脂糖珠制成的亲和柱提纯HLA-A抗原。用上述亲和纯化的mAb与A蛋白琼脂糖珠(Sigma)孵育，制备亲和柱。每ml珠5-10mgmAb为较佳比例。用硼酸盐缓冲液(硼酸盐缓冲液100mM四硼酸钠，154mMNaCl，pH8.2)洗涤结合了mAb的珠，直至洗液在A280显示基线。加入庚二酰亚氨酸二甲酯(20mM)(在200mM三乙醇胺中)以将结合mAb共价交联到A蛋白琼脂糖珠上(Schneideretal.，J.Biol.Chem.25710766(1982)。在旋转器上室温下培养45分钟后，用10～20ml20mM乙醇胺(pH8.2)洗珠二次，除去剩余的交联试剂。在每次洗涤之间，将浆状物于室温下放在旋转器上5分钟。用硼酸盐缓冲液洗珠和用加0.02％叠氮钠的PBS洗涤。然后，将细胞溶解液(5～10×109细胞当量)缓慢通过5～10ml亲和柱(流速0.1～0.25ml/分)，使抗原与固定的抗体结合。在使胞溶液通过亲和柱后，用20倍柱体积去污剂库存液加0.1％十二烷基磺酸钠、20倍柱体积0.2MNaCl、20mMTris(pH8.0)和10倍柱体积20mMTris(pH8.0)相继洗柱。用碱性缓冲液(50mM二乙胺水溶液)洗脱结合在mAb上的HLA-A抗原。或者，也可用诸如0.15～0.25乙酸等酸溶液洗脱结合的抗原。取出一份洗脱液(1/50)，用比色测定(BCA测定，Pierce)或SDS-PAGE，或同时采用两种方法作蛋白定量。SDS-PAGE分析按Laemmli所述(Laemmli，U.K.，Nature227680(1970))，用已知量的牛血清白蛋白(Sigma)作蛋白标准品进行测定。用等位基团特异性抗体纯化特异的MHC分子。在HLA-A2的情况下，用mAbBB7.2。实施例2天然处理肽的分离和测序对于来自碱(50mM二乙胺)洗脱原液(Protocol)的HLA-A制备，洗脱液立即用1N乙酸中和到pH7.0～7.5。在Amicon搅拌室[8050型，装有YM3膜(Amicon)]中，将中和的洗脱液浓缩到1～2ml体积。加10ml乙酸铵(0.01M，pH8.0)到浓缩器中除去不挥发性盐，将样品浓缩到约1ml。如上所述，取出一份小样品(1/50)用于蛋白定量。剩下的转到15ml聚丙烯锥形离心管(Falcon，2097)(BectonDickinson)中。加入冰醋酸，达到醋酸终浓度10％。将此酸化的样品放在沸水浴上5分钟，使结合肽解离。将样品在冰上冷却，回到浓缩器中，收集滤液。再加一份10％乙酸(1-2ml)到浓缩器中，将此滤液与原滤液合并。最后，加1-2ml蒸馏水到浓缩器中，同样合并此滤液。存留物含大量HLA-A重链和β2—微球蛋白，而滤液含天然处理的结合肽和分子量小于约3000的其他成分。将合并的滤液材料冷冻干燥以使浓缩肽流分。样品准备就绪，用于进一步分析。为作肽部分的HPLC(高效液相色谱)分离，将冻干样品溶于50ml蒸馏水或0.1％三氟乙酸(TFA)(AppliedBiosystems)水溶液，用Stone和Williams描述的梯度系统(Stone，K.L.andWilliamsK.R.，in，MacromolecularSequencingandSynthesis；SelectedMethodsandApplications，A.R.Liss，NewYork，1988，pp.7—24)注入C18反相窄孔柱(BeckmanC18Ultrasphere，10×250mm)。缓冲液A为0.06％TFA水溶液(Burdick—Jackson)，缓冲液B为0.052％TFA(在80％乙腈中)(Burdick—Jackson)。流速为0.250ml/分，梯度如下0～60分钟，2～37.5％B；60～95分钟，37.5～75％B；95～105分钟，75～98％B。对于此目的，Gilson窄孔HPLC型是特别有用的，尽管其他型同样好地起作用。在214nm处的吸收检出大量峰，其中很多峰显示低丰度。是否一个特定峰代表单一肽或肽混合物尚未确定。然后，如下所述，将收集的各流分进行测序以确定对各等位基因特异的基本模式。用AppliedBiosystemsModel477A自动测序仪通过Edman自动测序分析上述制备的收集的肽流分。测序方法基于PehrEd-man50年代为蛋白质和肽连续降解以测定氨基酸组分的序列而开发的技术。在氩气吹扫的加热反应室中，将要测序的蛋白质或肽装在12mm直径多孔玻璃纤维滤盘上。滤器通常用BioBrenePlusTM预处理，然后循环通过Edman反应的一次或几次重复，以减少污染和改善其后样品测序的效能。滤器预处理后，将样品蛋白质或肽(10pmol-5nmol范围)的溶液加到玻璃滤器上并使之干燥。这样，样品便埋置在预处理过的盘的膜上。样品与滤器的共价结合通常是不必要的，因为Edman化学利用相对非极性的溶剂，蛋白质和肽很少溶于其中。简言之，Edman降解反应有三个步骤偶联、裂解和转化。在偶联步骤，加入异硫氰酸苯酯(PITC)。PITC在碱性环境中与蛋白质游离氨基末端氨基酸定量地反应，生成苯基硫代氨基甲酰—蛋白质。在偶联步骤的一段时间后，萃提过剩的化学物质，用高挥发性有机酸三氟乙酸(TFA)从蛋白质氨基末端裂解PITC—偶联的氨基酸残基，得到氨基酸的苯氨基噻唑啉酮(ATZ)衍生物。留下蛋白质/肽的其余部分有新的氨基末端，准备下一轮Edman循环。萃取ATZ氨基酸并转到转化烧瓶，在转化烧瓶中加入25％TFA水溶液后，ATZ氨基酸被转化为更稳定的苯基海硫因(PTH)氨基酸，后者可在自动注入采用分析用微孔C-18反相HPLC柱的120型PTH分析仪后被定性、定量。在本方法中，将肽混合物装在玻璃滤器上，因此通常得不到单一氨基酸顺序，而呈现不同得率的氨基酸混合物。当特殊残基保存在待侧序的肽中时，观察到该氨基酸得率增加。实施例3A2.1特异性基本模式的定义在一种情况下，如上述实施例2所述制得的集合肽流分得自于HLA-A2.1纯合子细胞系，例如，JY。集合流分是相应于7％～45％CH3CN的HPLC流分。对于I类分子，该色谱区富含肽。如下所述，将独立的实验的数据进行平均。对四个独立实验的氨基酸顺序分析进行分析，结果见表3。用前面Falk等所述方法的改良方法，对除了位点1外的各位点进行资料分析，以比较不同HLA型的实验。该改良方法将涉及同一HLA型的不同实验的数据平均，得出定量的、标准化的数值。将原始测序仪数据转化为10行(每行代表一次Edman降解循环)和16列(每列代表20个氨基酸之一，由于技术原因删去W、C、R和H)的单一表格。对应于第一行(第一个循环)的数据不作进一步考虑，因为该循环通常被游离氨基酸严重污染。每行数值相加得到该特定循环的总pmol值。然后对于每一行，将每个氨基酸的值除以相应的总得率值，以确定每个循环总信号中那部分可归属于一个氨基酸。这样做的结果，产生了“绝对频率”(AbsoluteFrequency)表。此绝对频率表可校正每一循环下降的得率。表3A2.1库测序频率从绝对频率表出发，得到“相对频率”(RelativeFrquency)表，可在不同氨基酸中进行比较。为此，将每列数据相加，然后平均。每个数值再除以列平均值，得到相对频率值。这些数值以标准化方式对于不同的16个氨基酸类型的每一个，其每一循环的增加和减少进行定量。因而，从不同实验的数据而形成的表可加在一起以产生平均相对频率值(及其标准差)。然后可将所有标准差加以平均以估测可适用于每个表的样品的标准差值。超出两个标准差以上1.00的任何特定值都被认为相应于一个明显的增加。实施例4定量结合试验用如上实施例2所述制得的分离的MHC分子进行定量结合试验。简言之，在1～3μMβ2M和蛋白酶抑制剂混合物(终浓度1mMPMSF，1.3mM1.10二氮杂菲，73μM抑肽素A，8mMEDTA，200μMN-α-P-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲酮)存在下，将如上分离到的一定量MHC在含约5nM放射标记肽的0.05％NP40-PBS中培养。在不同时间后，用TSK2000凝胶过滤法(如A.Setteetal.，J.Immunol.148844(1992)所述)分离游离和结合的肽，该文献引入本文作为参考。用ChloramineT方法(Buusetal.，Science2351352(1987))标记肽，该文献结合于此作为参考。将HBC18～27肽HLA结合肽作放射标记并提供(5～10nM)给1μM纯化的HLAA2.1。在蛋白酶抑制剂混合物和1～3μM纯化的人β2M存在下，23℃保温2天后，用Setteetal.，inSeminarsinImmunology，Vol.3，Gefter，ed.(W.B.Saunders，Philadelphi-a，1991)，pp195—202中关于II类肽结合试验所描述的分子排阻色谱法测量I类MHC结合放射性的存在，该文献引入本文作为参考。用这一方案，在存在纯化HLAA2.1分子的所有情况下均检出高度结合(95％)。为了揭示结合的特异性，发明者测定了结合是否可被过量未标记肽抑制，如果被抑制，50％抑制浓度(IC50％)为多少。这一实验的理论基础有三方面其一，为了证明特异性，这一实验是决定性的；其二，对于高容许能力的定量结合试验，敏感的抑制试验是最可行的选择；其三，经Scatchard分析的抑制数据可给出相互作用平衡常数(K)和能结合配基的受体分子部分(％占领)的定量评估。例如，在肽HBC18～27和A2.1相互作用抑制曲线的分析中，确定IC50％为25nM。进行更多实验以获得Scatchard图。对于HBc18～27/A2.1，用6个不同MHC制备物进行的6个不同实验得到KD为15.5±9.9×10-9M，占领值为6.2(±1.4)。若干报告证明，I类分子(不象II类分子那样)对于其识别的肽表位大小高度敏感。不同肽和不同的I类分子，其最适大小在8～10个残基之间变动，尽管长达13个残基的MHC结合肽已被鉴定。为阐明严格的大小要求，合成了一系列肽HBc18-27的N-和C-端截短/伸长类似物，作A2.1结合试验。以前的研究证明，此肽CTL识别部位的最适大小为十聚体HBc18～27(Setteetal.supra)。现已发现，分子C末端一个残基的去除或添加导致结合容量30-100倍的下降。另一残基的再去除或添加使结合完全消失。同样，在分子的N未端，一个残基从最适HBc18～27肽去除和缺失则完全取消A2.1结合。本说明书中，结果均以术语IC50值表示。实验在给定条件下进行，即限制MHC和标记肽的浓度，这些值接近KD值。应当注意，如果试验条件改变，IC50可以改变，常常是显著地和依据使用的特殊试剂(例如I类制备物等)而改变。例如，MHC的过量浓度会增加给定配基的表观测定IC50。为了避免这些不确定性，表示结合数据的可选择的方法为与参比肽的相对值。每一试验均包含参比肽。由于特殊试验敏感性变大或变小，受试肽的IC50值可有些变化。但是，相对于参比肽的结合不会改变。例如，在参比肽的IC50增加10倍的条件下进行试验，所有IC50值也会提高约10倍。因此，为避免模棱两可，评价肽是否是好的、中等的、弱的或负性结合物，应当根据它相对于标准肽IC50的IC50。本文所述HLA-A2.1试验的参比肽指具有FLPSDYFPSV顺序的941.01。在所采用的试验条件下，得到平均IC50为5(nM)。如果在一特定试验中测得标准肽的IC50不同于表中报道的值，那就应当理解，用于确定好，中等、弱和负性结合物的阀值应当用一相应的因子来修正。例如，如果在A2.1结合试验中，A2.1标准(941.01)的IC50测得为8nM，而不是5nM，那么只有当肽配基的IC50小于80nM(即8nM×0.1)，而不是通常的截值50nM时，才被称为好的结合物。实施例5HLA-A2.1结合基本模式和算法对于九聚体和十聚体肽，限定了肽结合于A2.1的结构要求。采用两个方法。称作“聚-A法”的第一种方法用九聚体原型聚-A结合物(ALAKAAAAV)的单一氨基酸替代模式，聚A结合物是用于测试A2.1结合的聚-A结合物，用上面实施例4的方法测定锚位(an-chorposition)的衰减程度和非锚位对A2.1结合的可能影响。第二种方法，“基本模式库方法”，采用选自病毒和肿瘤来源的潜在靶分子的顺序、用上面实施例4的方法试验A2.1结合的肽的大库。分析在好的结合物和非结合物的每一部位出不同氨基酸的频率以进而限定九聚体和十聚体上非锚位的作用。九聚体肽的A2.1结合聚A法选择在2位上含A2.1基本模式L(Leu)和在9位上含V(Val)的聚-A九聚体肽作为原型结合物。在4位上含K(Lys)残基以增加溶解度。合成原型亲本九聚体的91个单一氨基酸替代类似物并试验A2.1结合(表4)。阴影部分表示相应于母体肽结合能力减少大于10倍的类似物。结合减少大于10倍用“—”表示。聚A类似物的2和9锚位首先测定锚位2和9上单一氨基酸替代的效应。在这些位点上的大多数替代对结合能力有极有害的影响，从而证实了它们对结合的作用。更具体地，在位点2，只有L和M在10倍范围内结合(“较佳残基”)。有类似特性的残基，如I、V、A和T是耐受性的，但结合比亲本肽弱10～100倍。剩下的全部替代物(残基S、N、D、F、C、K、G和P)是不耐受的，结合减少大于100倍。对于位点9，观察到比较严格的要求，在该位点上，V、L和I较佳，A和M是耐受的，而残基T、C、N、F和Y实质上取消了结合。按照这一列肽，可限定最适2-9基本模式，位点2上是L、M，位点9上是V、I或L。表4含MOTIF的聚A肽类似物的A2.1结合聚-A类似物上的非锚位1和3-8所有非锚位比锚位2和9更容许不同的替代，即大多数残基是耐受的。在不同部位观察到对某些替代物的结合显著降低。更具体地，在位点1，负电荷(残基D和E)或P大大降低结合能力。除了残基K外，位点3上大多数替代物是耐受的。在位点6上引入负电荷(D、E)或带正电荷的残基(R)也可见显著的降低。不同单一氨基酸替代的这些效应概括于表5。表5比值＞0.1比值0.01-0.1比值＜0.01“基本模式库法”为了进一步评估非锚位对结合的重要性，筛选了病毒和肿瘤来源潜在靶分子肽以检出含最适2-9锚式图(an-chormotif)的顺序的存在。位点2上含L或M、位点9上含V、L或I的一系列161个肽被选出、合成和试验结合性能(见实施例6)。这些肽中仅11.8％以高亲和力结合(比值≥0.10)；22.4％是中等结合物(比值≥0.01)。多达36％是弱结合物(比值＜0.01～0.0001)，31％是非结合物(比值＜0.0001)。含最适锚式图(anchormotif)的非结合物数量之多表明在这一系列肽中还有2、9位点外的锚影响A2.1结合能力。附录1阐明用于这一分析的具有2-9基本模式的所有肽及这些肽的结合数据。为更具体地限定在非锚位上的影响，一方面对好的和中等的结合物、另一方面对非结合物计算了每一非锚位上每一氨基酸的出现频率。将类似化学特性的氨基酸放在一起。弱结合物不再考虑作下面的分析。对于好的结合物和非结合物，计算在每一非锚位上每一氨基酸的出现频率(表6)。几个引人注目的倾向变得明显起来。例如，在位点1上，仅3.6％A2.1结合物和高达35％非结合物携带负电荷(残基D和E)。这一观察与前面在聚-A类似物系列上的发现有很好的相关性，在这些类似物上D或E替代显著影响结合。同样，在非结合物上残基P的频率为好的结合物上的8倍多。相反，与非结合物相比，芳族残基(Y、F、W)出现的频率在A2.1结合物上大大增加。表6A.2.1九聚体肽肽的数目161好的结合物1911.8％中等结合物3622.4％弱结合物5836.0％非结合物4829.8％100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0按本方法，将类似结构特性的氨基酸放在一起。然后，对于结合物与非结合物计算每一位点上每一氨基酸组的频率(表7)。最后，将聚合物组的频率除以非结合物的频率，得到“频率比”。此比值表示某氨基酸或残基组优先出现在好的结合物(比值＞1)还是非结合物(比值＜1)的特定位点上。表7A2.1九聚肽肽的数目161肽的结合物1911.8％中等结合物3628.4％弱结合物5836.0％非结合物4829.8％***表示无负结合物不同的残基影响A2.1结合为了分析某些残基对A2.1结合的最引人注目的影响，对表7中的比值设了一个阀水平。在好的结合物中显示大于4倍以上频率的残基被当作较佳的残基(+)。在A2.1结合物中显示比在非结合物中低于4倍频率的残基被认为是不好的残基(-)。按此方法，显示对结合最显著的正效应或负效应的残基列于表8。此表确定在每一非锚位上影响结合最显著的氨基酸组。一般来说，大多数负效应见于带电荷的氨基酸。在位点1，在好的结合物中未见带电荷氨基酸，即那些氨基酸在位点1是负结合残基。在位点6则相反，在该位点上只有碱性氨基酸对结合是决定性的，即为负结合残基。此外，在A2.1结合物中在位点3和7上均未见酸性和碱性氨基酸。当P在位点1上时，见到非结合物频率增加大于4倍。表8A2.1基本模式库，九聚体的总结＝比值≥4倍(-)＝比值≤0.25在几个非锚位，特别是位点1、3和5，芳香族残基一般较适宜。在位点4，以小的残基如S、T和C为宜，在位点7以A为宜。改良的A2.1九聚体基本模式用上述资料得到令人信服的A2.1基本模式。此基本模式是建立在非锚位1和3～8的效应的明显部分上。在不同位点上的氨基酸的不规则分布反映某些残基(主要是带电荷残基)对结合亲和力的特异优势负结合效应。产生一系列规则以鉴定位点2和9上的合适锚(固定)残基和位点1和3-8上的负结合残基，使高亲和力结合免疫原性肽的选择成为可能。这些结果概括于表9。为了证实上面定义的并在表9中显示的基本模式，对已公开的天然处理的并由A2.1分子提供的肽顺序进行了分析(表10)。仅考虑含2～9锚残基的九聚体肽。分析这些肽的频率时，发现它们一般遵循概括于表9的规律。更具体地，位点1上未发现酸性氨基酸或P，位点3上仅发现一个酸性氨基酸而无碱性，位点6和7未显示带电荷残基。然而，位点8上频繁发现酸性氨基酸，按发明者对A2.1基本模式的定义，在该位点上它们是耐受性的。因此，天然处理的肽的顺序分析揭示了＞90％的肽遵循关于完整基本模式的限定规则。该资料确认了对A2.1结合的锚位和9之外的位点的作用。对结合的大多数有害效应是由非锚位的带电荷氨基酸引起的，例如，占据位点1、3、6或7的负结合残基。表9九聚体肽的A2.1图表10A2.1天然处理的肽十聚体肽的A2.1结合“基本模式库”法前面的资料清楚地表明十聚体也可结合于HLA分子，即使其亲和力比九聚体低一些。由于这个原因，发明者将其分析扩展到十聚体肽。因此，从病毒和肿瘤来源的已知靶分子顺序选择含最适基本模式组合(MotifCombination)的170个肽十聚体“基本模式库”系列，并按上面关于九聚体所描述的那样进行分析。在这一系列中，发现5.9％好的结合物，17.1％中等结合物，41.2％弱结合物和35.9％非结合物。这一系列肽的真正顺序、来源和结合能力包括在附录2中。这一系列十聚体用来测定a)十聚体肽与A2.1结合的规则，b)与关于九聚体所定规则的异同，和c)如果可鉴定出插入位点，则对于九聚体和十聚体可用可迭加的共同的基本模式。如上面关于九聚体肽所描述的那样，关于十聚体每一位点各种氨基酸组产生氨基酸频率和频率比，将放在一起的残基分别列于表11和12。以类似于对九聚体所用的方式，从十聚体得到较佳/不利残基和规则的总结也分别列于表13和14。分析结合物和非结合物中不同位点上不同氨基酸组的频率比并与对九聚体分析所得的相应比值进行比较，出现令人注目的相似性和明显的差异(表15)。在九聚体和十聚体的N末端和C末端，相似性占优势。例如，在十聚体位点1，P残基和酸性氨基酸也是不耐受的。除了十聚体的位点1外，在A2.1结合物中常见芳香族残基。在九聚体和十聚体中，在位点3，常见酸性氨基酸，伴有差的结合能力。然而，令人感兴趣的是，位点3上的芳香族残基常见于九聚体，脂肪族残基(L、V、I、M)常见于十聚体。表11肽的数目170弱结合物7041.2％好的结合物105.9％非结合物6135.9％中等结合物2917.1％100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0表12A.2.1十聚体肽肽的数目170好的结合物105.9％中等结合物2917.1％弱结合物7041.2％非结合物6135.9％+++表示无负结合物表13A2.1基本模式库十聚体总结(+)＝比值≥4倍(-)＝比值≤0.25表14十聚体肽图>表15九聚体和十聚体A2.1结合的比较<对于十聚体，肽的C末端上，位点7上碱性氨基酸不适宜，位点8上酸性和碱性氨基酸均不适宜。这与在九聚体位点6和7上发现的同样模式的观察惊人地一致。令人感举趣的是，两个肽的大小之间适宜的残基不同。在十聚体位点8上芳香族(Y、F、W)或脂肪族(L、V、I、M)残基较好，而在九聚体相应的位点7上A残基较好。相反，在肽的中心，十聚体在位点4、5和6上，九聚体在位点4和5上，未观察到频率选择的相似性。更有趣的是，在受试肽的中心最适宜残基中，位点4和6上是G，在结合物中未观察到位点5上的P。所有这些残基已知可显著地影响肽的全面的二级结构，特别是可被预言能强烈影响十聚体采取“折叠型”或“伸展型”构象的倾向。带电荷的残基对结合是突出有害的，常见于九聚体和十聚体的非结合物。但是，对九聚体和十聚体有益的残基是不同的。在十聚体肽的中心，甘氨酸有益而脯氨酸是不利的，但九聚体的情况就不一样了。这些资料确立了在九聚体跨越2个位点(4、5)，在十聚体跨越3个位点(4、5、6)的“插入区域”的存在。这一插入区域是更许可的区域，在该区域很少观察到在九聚体和十聚体抗原肽之间残基的相似性。而且，除了高度保守的锚位2和9，对于九聚体和十聚体N末端位点1和3上的不利残基和十聚体C末端位点7～10、九聚体C末端位点6～9上的不利残基，存在“锚区域”。实施例6预测九聚物肽与HLA-A2.1的结合的算法在由2、9基本模式确定的潜在的A2.1结合肽群中，如上述实施例所述，只有一部分肽是真正好的或中等的结合物，而且因此具有潜在免疫原性。从上述数据中可以明显看出，在2位和9位之外的位置上的残基可以影响，而且常常是深刻地影响着肽的结合亲和力。例如，位于位点1处的酸性残基对于A2.1肽而言似乎是耐受性的。因此，位点2和9之外肽顺序上每个位点上不同残基的效应，可以更准确地预测结合。更具体地，我们使用了在筛选我们的全部含9聚物肽的A2.1基本模式过程中获得的数据库，开发了一种算法，它对肽各位点上的各种氨基酸都给出一评分。各残基的分数作为该残基在好的或中等结合物中的出现频率与该残基在非结合物中出现频率之比。在该“分组比率”算法中，残基按相似性进行分组。这样避免了遇到某些稀有残基的问题，例如色氨酸，这些氨基酸出现频率太低，不能得到有统计学意义的比率。表16是评分表，对含有最佳2/9基本模式的九聚物肽按位点对20种氨基酸的每一种进行分组。在“分组比率”算法中肽的评分为其各残基的评分之和。在除位点2和9之外的位点上，用仅在位点2和9上含有优选残基的一系列肽而得出评分。为了能使我们将“分组比率”算法扩展到那些在位点2和9上含有的残基不是优选残基的肽，可以通过一套在位点2和9上具有单一氨基酸替代的肽而得出对2和9位的评分。图2显示了其相对结合的对数对“分组算法”关于来自上述实施例的全部九聚物肽给出的评分的散布图。60表16<p>该”分组比率”算法能用来预测好的结合物具有最高出现频率的肽群。例如，如果完全仅靠2(L，M)和9(V)基本模式来预测能与A2.1结合的九聚肽，则预测结果会是我们数据库中的全部160种肽都是好的结合物。事实上，这如上面所述，这些肽中仅12％是好的结合物；22％的肽是中等的结合物而由这种2，9基本模式预测的肽中的66％是弱结合肽或非结合肽。相反，使用上述的“分组比率”算法并选定分数1.0为阈值，选出了41种肽。其中27％是好的结合肽，49％是中等结合肽，仅有20％是弱结合肽，而且仅5％是非结合肽(表17)。该算法是使用结合物/非结合物之比来测量在肽各位点上特定残基的影响。本领域的一般熟练技术人员会立刻明白，还有许多替代方法可以产生类似的算法。使用在位点具有某一氨基酸(或氨基酸类型)的所有肽的平均结合亲和力的算法，其优点在于在分析中包括了所有的肽，而不仅仅是好的/中等的结合肽和非结合肽。此外，与更简易的“分组比率”算法相比，它给出了更定量化的亲和力的测量值。这种算法的创建是通过对每种氨基酸按位点计算其结合对数的平均值，当该特定残基存在于含有2，9基本模式的我们的那套160种肽时。这些值列于表18。对某肽的算法评分为对各种残基按位点得到的分数之和。图3显示了相对结合的对数对“结合对数”算法评分的平均值的散布图。表17显示了两种算法预测肽在不同水平下结合情况的能力，作为截值(cut—off)评分的函数。2，9基本模式在同一套肽中预测结合的能力也一起列出作为参考。从比较中可以清楚地看出，本发明的两种算法都具有比单独的2，9基本模式更强的预测能力，能预测更多出现频率的优良结合肽群。在此处分析的这套肽中，“分组比率”算法和“结合对数”算法之间的差别很小。但是，的确表明，“结合对数”算法是比“分组比率”算法更好(如果好的程度有限)的预测算法。结合对数算法还可以按二种方法进行修改。首先可以在无法得到通过筛选大的肽库而得到数据的场合，对于在扩展基本模式中包括的残基将聚丙基酸(poly—A)数据加入到锚位的算法中。其次，可以在算法中加入“锚需要条件筛选过滤器”。Poly—A法在上面已详细描述过了。“锚需要条件筛选过滤器”是指一种算法，其中残基在锚位上被评分，从而提供筛选去除那些在锚位没有优选的或可接受残基的肽的能力。该算法是这样实现的赋于锚位上不可接受的残基一个分数，该评分很高从而能防止任何含有这些残基的肽获得一个可能被认为是潜在结合肽的总评分。对九聚物和十聚物的结果列于表26和27。在这些表中，数值是如下分组值A；G；P；D，E；R，H，K；L，I，V，M；F，Y，M；S，T，C；和Q，N，除非在表中另加说明。表17标准截值好的结合肽中等结合肽弱结合肽负结合肽总计2.9基本模式19(12％)36(22％)58(36％)48(30％)161(100％)分组比率算法1.55(83％)1(17％)0(0％)0(0％)6(100％)1.258(67％)4(33％)0(0％)0(0％)12(100％)110(50％)9(45％)1(5％)0(0％)20(100％)0.512(32％)17(46％)7(19％)1(3％)37(100％)012(23％)26(49％)12(23％)3(6％)53(100％)-117(18％)35(37％)33(35％)10(11％)95(100％)-219(15％)36(29％)50(40％)21(17％)126(100％)-319(13％)36(24％)56(38％)38(26％)149(100％)无截值19(12％)36(22％)58(36％)48(30％)161(100％)结合对数算法-195(100％)0(0％)0(0％)0(0％)5(100％)-208(73％)3(27％)0(0％)0(0％)11(100％)-2115(43％)15(43％)5(14％)0(0％)35(100％)-2217(26％)27(41％)21(32％)1(2％)68(100％)-2318(19％)35(37％)34(36％)7(7％)94(100％)-2418(16％)36(30％)47(39％)17(14％)119(100％)-2519(14％)36(26％)55(39％)30(21％)140(100％)无截值19(12％)36(22％)58(36％)48(30％)161(100％)表18实施例7使用算法来预测十聚物肽与HLA—A2.1的结合使用上述实施例中所述的方法，开发一套类似的用于预测十聚物肽结合的算法。表19显示了用于十聚物肽的“分组比率”算法中用的评分，表20显示了用于十聚物肽的“结合对数”算法评分。表21为应用两种不同算法选择结合肽的比较。图4和图5分别为用“分组比率”算法和“结合对数”算法评分的一套在位点2和位点10含有优选残基的十聚物肽的散布图。表19表21标准截值好的结合中等结合弱结合负结合总计2，10基本模式10(6％)29(17％)70(41％)61(36％)170(100％)分组比率算法41(100％)0(0％)0(0％)0(0％)1(100％)31(25％)2(50％)1(25％)0(0％)4(100％)26(24％)13(52％)6(24％)0(0％)25(100％)110(21％)21(45％)16(34％)0(0％)47(100％)010(15％)28(42％)26(39％)2(3％)66(100％)-110(11％)29(32％)42(46％)11(12％)92(100％)-210(9％)29(25％)54(47％)23(20％)116(100％)-310(7％)29(22％)63(47％)32(24％)134(100％)无截值10(6％)29(17％)70(41％)61(36％)170(100％)结合对数算法-242(50％)2(50％)0(0％)0(0％)4(100％)-255(56％)3(33％)1(11％)0(0％)9(100％)-267(47％)5(33％)3(20％)0(0％)15(100％)-2710(32％)9(29％)12(39％)0(0％)31(100％)-2810(17％)19(33％)29(50％)0(0％)58(100％)-2910(12％)25(30％)48(58％)0(0％)83(100％)-3010(10％)29(28％)59(57％)5(5％)103(100％)-3110(8％)28(22％)66(51％)24(19％)129(100％)-3210(7％)29(19％)70(47％)40(27％)149(100％)无截值10(6％)29(17％)70(41％)61(36％)170(100％)实施例8A2.1算法预测的肽的结合实施例6和7的结果表明，可以用算法来选择能充分结合HLA-A2.1，从而有很高的机率具有免疫原性的肽。为了测试该结果，我们在大量的(超过1300个)来自不同来源的丰富但又相互无关肽上对算法进行了测试。在用我们的算法对该批肽进行评分后，我们选了41种肽(表21)供合成，并测试其与A2.1的结合。这批肽由21个算法评分高的肽和20个算法评分低的肽组成。结合数据和分类数据总结分别列于表22和23。结合与算法评分的相关性为0.69。从表23可以明显看出，在算法评分高的肽与那些算法评分低的肽之间存在极大的差异。有76％得高评分的肽但无一个得低评分的肽是好的或中等的结合肽。这种数据表明了本发明的算法的应用价值。表22A2.1算法评分序列来源结合coreMMWFVVLTVCMV0.76346YLLLYFSPVCMV0.75312YLYRLNFCLCMV0.72169FMWTYLVTLCMV0.68336LLWWITILLCMV0.49356GLWCVLFFVCMV0.471989LMIRGVLEVCMV0.45296LLLCRLPFLCMV0.421356RLLTSLFFLHSV0.34859LLLYYDYSLHSV0.28390AMSRNLFRVCMV0.151746AMLTACVEVCMV0.089411RLQPNVPLVCMV0.048392VLARTFTPVCMV0.044196RLLRGURLCMV0.037494WMWFPSVLLCMV0.036362YLCCGITLLCMV0.0211043DMLGRVFFVHSV0.0111422ALGRYQQLVCMV0.0089184LMPPPVAELCMV0.0066416LMCRYTPRLCMV0.0055414RLTWRLTWLCMV0.0052250AMPRRVLHVCMV0.0014628ALLLVLALLCMV0.0014535AMSGTGTTLCMV0.0005602MLNVMKEAVCMV0.00390.00031TMELMIRTVCMV0.00290.0013TLAAMHSKLHSV0.00080.0019TLNIVRDHVCMV0.00050.00021ELSIFRERLHSV0.00020.0020FLRVQQKALHSV0.00020.00099ELQMMQDWVCMV0.00010.0020QLNAMKPDLMr0.00010.0017GLRQLKGALCMV0.00010.0010TLRMSSKAVHSV0.00010.00085SLRIKRELLCMV00.00041DLKQMERVVCMV00.00026PLRVTPSDLCMV00.0019QLDYEKQVLCMV00.0012WLKLLRDALCMV00.0012PMEAVRHPLCMV00.0011ELKQTRVNLCMV00.00053NLEVIHDALCMV00.00050ELKKVKSVLHSV00.00033PLAYERDKLCMV00.00017表23批好的结合肽中等结合肽弱结合肽负结合肽总计高评分者11(52.4％)5(23.8％)5(23.8％)0(0.0％)21(100％)低评分者0.(0.0％)0(0.0％)10(50.0％)10(50.0％)20(100％)总计11(26.6％)5(12.2％)15(36.6％)10(24.4％)41(100％)实施例9细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外诱导从HLA型病人，用静脉穿刺或去除白细胞(apheresis)法(取决于所需的CTLp的最初量)分离得外周血单核细胞(PBMC)。再用Ficoll—Paque(Pharmacia)通过梯度离心进行纯化。通常，对于每毫升外周血可获得1百万个PBMC，或者典型的去除白细胞(a-pheresis)操作法能产生高达总数为1-10×1010个的PMBC。分离和纯化的PBMC与适当数目的存在抗原的细胞(APC)一起培养。这些APC已先与适当数目的合成的肽(含有HLA结合基本模式和该抗原序列)一起孵育过(或称“脉冲过(pulsed))。在培养基如RPMI—1640(带自身的血清或血浆)或无血清的培养基AIM-V(Gibco)中，PBMC通过以1～2×106细胞/ml进行孵育。APC的使用浓度通常为1×104-2×105细胞/ml，取决于使用的细胞的类型。可能的APC来源包括(1)自身的树状细胞(dendriticcell，DC)，它可以从PBMC中分离并按Inaba，etal.，J.Exp.Med.166182(1987)的方法进行纯化；和(2)突变的或通过遗传工程产生的能表达“未被占用的(empty)”HLA分子(它们对病人的等位基因HLA-型是同基因的，即遗传上是相同的)的哺乳动物细胞，如小鼠RMA-S细胞系或人T2细胞系。已知含有未被占用的HLA分子的APC是强有力的CTL应答的诱导物。这可能是因为肽与未被占用的MHC分子的相连比与那些早被其他肽占据的MHC分子结合更为容易(DeBruijn，etol.，Eur.J.Immunol212963-2970(1991))。在那些不使用自身APC的情况下，细胞必须用一定剂量伽马辐照过(例如使用放射性的铯或钴)以防止在体外或再输回病人时细胞增殖。含有PBMC，APC和肽的混合培养物在适当的培养容器中如塑料T形烧瓶，或透气的塑料袋或滚动瓶(rollerbottle)中，于37℃在湿空气/CO2培养箱中保温。在培养的活化阶段后(通过在最初3-5天发生)，通过在培养物中加入重组DNA技术得到的生长因子如白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)或白细胞介素7(IL-7)，可以进一步增殖得到的效应者CTL。扩增培养可再额外保持5-12天，这取决于特定病人所需的效应者CTL的数目。此外，扩增培养可用空心的纤维人造毛细系统(Cellco)进行，在该系统中可维持更高的细胞数目(高达1×1011)。在细胞被输回病人之前，测量其活性、存活度、毒性、和无菌性。得到的CTL的细胞毒活性可用标准的51Cr-释放试验(Biddison，W.E.1991，CurrentProtocolsinImmunology，p7，17.1—7.1).5，Ed.J.Coliganetal.，J.WileyandSons，NewYork)测定，其中利用表达适当MHC分子的细胞作为靶细胞，并在存在和缺少免疫原性肽下进行测定。通过活细胞对台盼篮(锥虫蓝)染料的排斥作用测定存活度。用常规技术测试细胞是否存在内毒素。最后，细胞或真菌污染的存在用适当的微生物学方法(巧克力琼脂等)进行测定。一旦细胞通过所有的质量控制和安全性测试，便经洗涤，并置于适当大灌输溶液中(林格氏液/葡萄糖乳酸盐)然后再通过静脉灌输回病人。实施例10CTL活性试验1.肽的合成肽合成是通过在AppliedBiosystems(FosterCity，CA)430A肽合成仪上，用标准的Fmoc偶连循环(软件版本1.40)按顺序偶连N-α-Fmoc-保护的氨基酸而完成的。所有的氨基酸、试剂、和树脂都得自AppliedBiosystems或Bachem。溶剂得自Burdick&Jackson。固相合成从合适替代的Fmoc-氨基酸-Sasrin树脂开始。起始树脂的载量为0.5～0.7mmol/克聚苯乙烯，每次合成使用0.1或0.25毫克当量。典型的反应循环的过程如下(1)用25％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液除去N-末端的Fmoc基团5分钟，然后再用25％哌啶的DMF溶液处理15分钟。树脂用DMF洗涤5次。向树脂加入4～10倍过量于预先生成的适当的Fmoc-氨基酸的1-羟基苯并三唑酯的N-甲基吡咯烷酮(NMP)，让混合物反应30～90分钟。在制备过程中将树脂用DMF洗涤，以便进行下一个延伸循环。全保护的、连于树脂的肽再经过一个哌啶循环以去除末端的Fmoc基团。产品用二氯甲烷洗涤并干燥。然后树脂在适当清除剂存在下用三氟乙酸，[如5％(v/v)水条件下]于20℃处理60分钟。在蒸去多余的三氟乙酸之后，粗产品肽用二甲醚洗涤，溶于水再冻干。再通过反向HPLC，用含0.2％TFA调节剂的H2O/CH3CN梯度，在Vydac，孔径为300，C-18制备柱上纯化肽至＞95％均一性。合成的肽的纯度在分析级的反向柱上分析，且其组成通过氨基酸分析和/或测序加以确认。肽按常规以20mg/ml浓度溶于DMSO。2.培养基含有10％小牛血清(FCS)，2mG谷氨酰胺，50mg/ml庆大霉素和5×10-5M2-巯基乙醇的RPMI—1640被用作培养基并称为R10培养基。含有25mHHepes缓冲液并被补充2％FCS的RPMI—1640被用作细胞洗涤液。3.大鼠伴力豆球蛋白A上清液在75cm2组织培养瓶中将得自路易斯大鼠(Spragne—Dawley)的脾细胞按5×106细胞/ml浓度悬浮于补充有5mg/mlConA的R10培养液中。37℃48小时后，收集上清液，补充1％α-甲基-D-甘露糖苷，再过滤除菌(0.45μm的过滤器)，样品冻存于-20℃。4.LPS-激活的原淋巴细胞在75cm2组织培养瓶中将鼠的脾细胞以1-1.5×106细胞/ml浓度重新悬浮于补充有25μg/mlLPS和7μg/ml葡聚糖硫酸的R10培养液中。于37℃72小时后，离心收集原淋巴细胞备用。5.原淋巴细胞的肽外层LPS激活的原淋巴细胞的外层是通过将30×106原淋巴细胞和含100μg肽的1mlR10培养液于37℃保温1小时而形成。洗涤细胞一次，然后再按所需浓度悬浮于R10培养液中以用于体外CTL活化。6.JurkatA2/Kb细胞的肽外层肽外层的形成是通过将10×106辐照过(20,000rads)的JurkatA2.1/Kb细胞与含20μg肽的1mlR10培养液于37℃保温1小时而得到。洗涤细胞三次，再按所需浓度重新悬浮于R10培养液中。7.体外CTL活化1～4周后充填的脾细胞(5×106细胞/孔或30×106细胞/T25烧瓶)与同基因的、辐照过的(3000rads)、带有肽外层的原淋巴细胞(2×106细胞/孔或10×106细胞/T25烧瓶)在R10培养液中于37℃一起培养，得到的终体积为24孔平板上的2ml或是T25绕瓶中的10ml。8.效应细胞的再刺激在最初的体外(在上面段落7中有描述)活化7～10天后，一部分效应细胞用辐时过的(20,000rads)、具有肽外层的JurkatA2/Kb细胞(0.2×10b细胞/孔)，在3×106“供应细胞”/孔(C57B1/6辐照过的脾细胞)存在下，于R10培养液中进行再刺激。其中R10培养液中补充有5％大鼠ConA上清液以协助提供最佳效应细胞生长所需的全部细胞激肽(cytokine)。9.细胞毒活性的试验在200μl铬(51Cr)酸钠中于37℃孵育靶细胞(3×106)。60分钟后，洗涤细胞三次，重悬浮于R10培养液中。按所需浓度加入肽。对于该试验，将104个51Cr标记的靶细胞加入至U形底96～2311板中不同浓度的效应细胞中(终体积为200μl)。在37℃孵育6小时后，从各孔中取出0.1ml的上清液，在显微医学自动伽马计数仪中测量放射性。用下列公式确定特异性释放溶解的百分比特异性释放％＝100×(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)在进行肽滴定时，给定的肽(为了比较)的抗原性表示为在给定的ET下诱导40％特异性51Cr释放所需的肽浓度。转基因小鼠在其尾部的基部处皮下注射一种不完全的Freund佐剂乳剂。该乳化剂含有50nm含有A2.1基本模式的假设的CTL表位和50nm乙型肝炎核心T辅助细胞表位。8～20天后，杀死动物，其脾细胞再用带假设的CTL表位的同基因的LPS原淋巴细胞进行体外再刺激。在该试验的第6天加入IL-2(大鼠ConA上清液)使终浓度为5％，并在第7天测量CTL活性。这些效应T细胞的溶解带肽外层的、表达A2KB分子(JurkatA2KB)的靶细胞的能力用溶解单位进行测量。结果列于表24。该实验结果表明，结合力至少为0.01的肽能诱导CTL。所有在附录1和2中具有至少约0.01的结合力的肽是免疫原性的。表24结合和免疫原性HBV聚合酶(ayw)肽结CTL算法合**活性123456789FLLSLGIHL0.5263-20.8GLYSSTVPV0.1510-21.9HLYSHPIIL0.1310-21.1WILRGTSFV0.018-+-20.9NLSWLSLDV0.0136-24.7LLSSNLSWL0.005--21.7NLQSLTNLL0.003--23.9HLLVGSSGL0.002--24.7LLDDEAGPL0.0002--25.5PLEEELPRL0.0001--26.1DLNLGNLNV-*--25.7NLYVSLLLL---23.6PLPIHTAEL---25.04*-＝＜0.0001**相对结合力，与IC50＝52mM，xxx溶解单位/106细胞的标准品比较，1溶解单位＝给出30％51Cr释放所需的效应细胞的数目-，-+测不出细胞毒活性。实施例11免疫原肽的鉴别使用上述对HLA-A2.1等位基因鉴定的基本模式，对来自肿瘤相关蛋白即黑色素瘤抗原(MelanomaAntigen-1，MAGE-1)的氨基酸序列进行分析，确定是否存在这些基本模式。靶抗原的序列来自Genbank数据库(特许证71.0；3/92)。使用“FINDPATT-ERNS”程序鉴别基本模式(Devereuxetal.，NucleicAcidResearch12387—395(1984))。还以分析其他病毒或肿瘤相关蛋白是否存在这些基本模式。在人乳头瘤病毒(HPV)，前列腺特异性抗原(PSA)，p53致癌基因，EB核抗原1(EBNA-1)和c-erb2致癌基因(又称HER-2/neu)等情况下，氨基酸序列或核苷酸序列的编码产物得自GenBank数据库。乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HVC)和人免疫缺陷病毒(HIV)，存在若干种毒株/分离株而且许多序列已被置于GenBank中。对于HBV，结合基本模式经鉴别为adr，adw和ayw型。为了避免复制相同的序列，将所有的adr基本模式和那些来自adw和ayw且又不存在于adr中的基本模式加到肽的清单中。对于HCV，从9个病毒分离株中得到了残基1—782的一致序列。在91上分离株之间没有或仅有很小(一个残基)变化的区域鉴别基本模式。同样分析了5个病毒分离株的残基783—3010间的序列。鉴别出这些分离株共同的基本模式并添加至肽清单中。最后，对于1型HIV从LosAlamos国立实验室数据库获得北美病毒分离株(1—12种病毒)的一致序列(1991年5月出版)，并加以分析以鉴别出那些在大多数病毒分离株中恒定的基本模式。有变化(一个残基，两种形式)的基本模式也被列在肽清单中。附录1和2提供了对下列抗原cERB2，EBNA1，HBV，HCV，HIV，HPV，MAGE，p53，和PSA)的研究结果。与实施例5所述的试验中的标准肽相比，只有至少具有1％结合亲和力的肽才被列出。与标准肽相比的结合程度列在最后侧的一列。标为“Pos”的列列出了序列在抗原蛋白中的位置。实施例12免疫原肽的鉴别使用此处公开的基本模式，筛选来自不同抗原的氨基酸序列以确定是否有其他基本模式。按实施例11所述进行筛选。表25和26提供了对下列抗原cERB2，CMV，流感A，HBV，HIV，HPV，MAGE，p53，pSA，HuS3核糖体蛋白，LCMV和PAP的研究结果。与实施例5所述试验中的标准肽相比，只有结合亲和力至少为1％的肽才被列出。以每种肽列出了与标准肽相比较而得的结合程度。表25<p>表25(续)<tablesid="table21"num="021"><tablewidth="477">序列抗原分子A2结合VTTEVAFGLFLU-AM10.0360MVTTTNPLIFLU-AM10.0150FTFSPTYKAHBVPOL0.0190YLHTLWKAGIHBVPOL0.0280LMLQAGFFLVHBV(a)ENV(a)0.6300RMLTIPQSVHBV(a)ENV(a)0.0580SLDSWWTSVHBV(a)ENV(a)0.1000FMLLLCLIFLHBV(a)ENV(a)0.0450LLPFVQWFVHBV(a)ENV(a)0.6500LMPFVQWFVHBV(a)ENV(a)0.8300FLGLSPTVWVHBV(a)ENV(a)0.0300SMLSPFLPLVHBV(a)ENV(a)0.9700GLWIRTPPVHBV(a)ENV(a)0.3600NLGNLNVSVHBV(a)ENV(a)0.0160YLHTLWKAGVHBV(a)POL(a)0.1500RLTGGVFLVHBV(a)P0L(a)0.1600RMTGGVFLVHBV(a)POL(a)0.1500RLTGGVFLVHBV(a)ENV(a)0.1600ILGLLGFAVHBV(a)ENV(a)0.0600GLCQVFADVHBV(a)ENV(a)0.0300WLLRGTSFVHBV(a)ENV(a)0.1000YLPSALNPVHBV(a)ENV(a)0.3200LLVPFVQWFAHBVadr0.2600FLPSDFFPSIHBVadr0.2100VVSYVNVNMHBVadr0.0100HLPDRVHFAHBVadr0.0160SLAFSAVPAHBVadr0.0340</table></tables>表25(续)表25(续)表25(续)表25(续>表25(续)<表25(续)注ENV＝外壳PreCore＝前核心Core＝核心表26表26(续)<<p>表26(续)<p>实施例13自身抗原中免疫原肽的鉴定如上面所述，本发明的基本模式也可在与自身免疫性疾病有关的抗原中筛选。用上面关于HLA-A2.1所鉴定的基本模式，分析了来自髓磷脂蛋白脂质(PLP)、髓磷脂基础蛋白(MBP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)和人胶原蛋白II型和IV型的等位基因氨基酸顺序以证实这些基本模式的存在。抗原的序列得自Trifilieffetal.，C.RSceancesAcad.Sci.300241(1985)；Eyleratal.，J.Biol.Chem.2465770(1971)；Yamashitaetal.，Biochiem.Biophys.Res.Comm.1921347(1993)；Suetal.，NucleicAcidsRes.179473(1989)和Pihlajaniemietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84940(1987)。基本模式的鉴定采用实施例5所述方法和实施例6和7的算法。表27提供这些抗原检索的结果。用实施例4的定量结合试验，再测试肽结合MHC分子的能力。用T细胞增殖标准试验法测定肽抑制自身反应性T细胞增殖应答能力。例如，Milleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89421(1992)所述的方法是适宜的。为作进一步研究，可用自身免疫性疾病的动物模型来证明本发明的肽的能力。例如，在HLA转基因小鼠身上通过注射MBP、PLP或脊髓匀浆(用于MS)、胶原蛋白(用于关节炎)可引起自身免疫模型疾病。此外，某些小鼠自发性地患有身身免疫性疾病，(例如，患糖尿病的NOD小鼠)。将本发明的肽注入适当的动物体内以鉴定较好的肽。表27人PLP肽位点AAP1P2P3P4P5P6P7P8P9P10等位基因基本模式39LLECCARCLA2.1(LM)2；(LVI)c239GLCFFGVAL399ALTGTEKLI1349SLERVCHCL1459WLGHPDKFV1589ALTVVWLLV1649LLVFACSAV2059RMYGVLPWI210GLLECCARCL310LLECCARCLV1010CLVGAPFASL16310WLLVFACSAV25010TLVSLLTFMI649VIHAFQYVI算法809FLYGALLLA1579YALTVVWLL1639WLLVFACSA2349QMTFHLFIA2519LVSLLTFMI2539SLLTFMIAA2599IAATYNFAV8410ALLLAEGFYT15710YALTVVWLLV16510LVFACSAVPV21810KVCGSNLLSI25310SLLTFMIAAT表27续人胶原IV型肽位点AAP1P2P3P4P5P6P7P8P9P10等位基因基本模式59ALMGPLGLLA2.1(LM)2；(LVI)c119GLLGQIGPL239GMLGQKGEI2319PLGQDGLPV310TLALMGPLGL2410MLGQKGEIGL5910PLGKDGPPGV13910PLGLPGASGL人胶原II型肽位点AAP1P2P3P4P5P6P7P8P9P10等位基因基本模式7949GLAGQRGIVA2.1(LM)2；(LVI)c179VMQGPMGPM算法表27续人GAD肽位点AAP1P2P3P4P5P6P7P8P9P10等位基因基本模式569SLEEKSRLVA2.1(LM)2；(LVI)c1169FLLEVVDIL1179LLEVVDILL1509GMEGFNLEL1579ELSDHPESL1689ILVDCRDTL1909QLSTGLDII2299TLKKMREIV2759GMAAVPKLV3009ALGFGTDNVA2.1(LM)2；(LVI)c4099VLLQCSAIL4109LLQCSAILV4169ILVKEKGIL4669LMWKAKGTV5349KLHKVAPKI5469MMESGTTMV5829FLIEEIERL4210KLGLKICGFL11610FLLEVVDILL13810VLDFHHPHQL14710LLEGMEGFNL21210NMFTYEIAPV27510GMAAVPKLVL30010ALGFGTDNVI32810ILEAKQKGYV38110LMSRKHRHKL40910VLLQCSAILV43510LLQPDKQYDV46510WLMWKAKGTV48510ELAEYLYAKI54510LMMESGTTMV2529GAISNMYSI算法3679NLWLHVDAA5679RMVISNPAA29910AALGFGTDNV40610MMGVLLQCSA42310ILQGCNQMCA实施例14在A2.1转基因小鼠上HPV肽的免疫原性用实施例10所述的方法，在HLA-A2.1转基因小鼠上筛选了一组14个HPV肽(包括9个潜在表位加3个低结合肽，1个非结合肽为对照)的免疫原性。为了测试肽的潜在免疫原性，给HLA-A2.1转基因小鼠注射各种HPV肽50μg/鼠和辅助肽(HBV核心128—140(TPPAYRPPNAPIL))140μg/鼠。这些肽加在1∶1乳剂IFA中注入小鼠尾根部。每组用三只小鼠。用在各种实验中引起强烈CTL应答的HBV多聚酶561—570肽作为阳性对照。在这些结果(表28)的基础上，认为下面4个无关的肽是最有免疫原性的，它们是TLGIVCPI，LLMGTLGIV，YMLDLQPETT和TIHDIILECV。在前面的结合试验中发现，TLGIVCPI和YMLDLQPETT是好的HLA-A2.1结合物，而LLMGTLGIV和TIHDIILECV是中等结合物。表28可能用于临床试验的HPV-16肽>*△溶解单位，几何平均值X＋SD(3/鼠肽)**“—”表示△几何平均值≤0.2的溶解单位选择的HPV表位的混合物CTL肽的辅助肽组合起来，测试其提高免疫反应的能力。分别注射4个单个的肽，以便比较只含2个好的结合物或只含2个中等结合物的注射剂的免疫原性。而且，将4个肽一起注射。为了进一步评估有不同的亲和力降低的肽组合起来的免疫原性，在本实验中引入另一对照。将2个好的结合物的混合物以不同于2个中等结合物混合物的注射部位注入同一小鼠的尾根部。各组CTL表位均与HB-Vc辅助表位一起注身，有两组例外，其中所有4个HPV均与2个不同剂量PADRE辅助肽(aKXVAAMTLKAAa，其中a为d-丙氨酸，X为环己基丙氨酸)1μg/鼠或0.05μg/鼠一起注射。所有4个肽单独注射并用以合适的肽标记的靶细胞进行试验，均引起强烈的CTL应答(表29)。TLGIVCPI证明是最强的表位，一个观测资料确认了上述结果。当注射所有4种肽的混合物，用脉冲式给予每个肽的靶细胞在体外刺激应答并进行测试时，所有的组合均显示强烈的CTL应答。比较2种辅助表位时，未观察到明显差异。这可能部分地由于本实验所用的最高PADRE剂量低于HBV辅助肽的剂量140倍。注射2种好的结合物的混合物或2种中等结合物的混合物这两种情况均导致很低的CTL应答，即使各肽单独注射都是高效的。但是，这些结果是由于脾细胞培养6天后细胞回收数目很低。因此认为是初步的。表29HPV肽单独和组合*△溶解单位30％几何平均值(＋x离差)将肽溶于50％DMSO/H2O，达到贮备浓度20mg/ml，再溶于灭菌PBS。肽溶液以1∶1与IFA混合，用于A2.1转基因小鼠尾根部皮下注射。HPV-CTL肽的注射量为50μg/鼠，与140μg/鼠HBV核心肽875.23或指定量的PADRE一起注射(3鼠/组)。第11天取脾，用脉冲加入HPV-CTL表位1μg/ml的经辐射的LPS-Blasts体外重复刺激脾细胞。6天后，在适当的-HPV表位肽存在或不存在下，用JurkatJA2Kb细胞(A)或MBB17(B)作为标记了51Cr的靶细胞，进行细胞毒性试验。提供上面的实施例是用于阐述本发明而不是限制其范围。本发明的其他改变对于本领域普通技术人员中很容易明了的，它们包括在所附的权利要求中。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均结合于此作为参考。附录I九聚物肽<p>附录I九聚物肽附录I九聚物肽附录I九聚物肽附录I九聚物肽<<p>附录I九聚物肽<p>附录I九聚物肽附录II十聚物肽<p>附录II十聚物肽附录II十聚物肽附录II十聚物肽p><p>附录II十聚物肽权利要求1.一种组合物，其特征在于，含有具有HLA-A2.1结合基本模式的免疫原性肽，其中免疫原性肽具有9个残基和下列残基位于从N-末端起第2位上的第一个保守残基选自I，V，A和T；以及位于C-末端位置上的第二个保守残基选自V，L，I，A和M。2.一种组合物，其特征在于，含有具有HLA-A2.1结合基本模式的免疫原性肽，其中免疫原性肽具有9个残基和下列残基位于从N-末端起第2位上的第一个保守残基选自L，M，I，V，A和T；位于C-末端位置上的第二个保守残基选自A和M。3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，位于位置1的氨基酸不是选自由D和P组成的组的氨基酸。4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，位于位置1的氨基酸不是选自由D和P组成的组的氨基酸。5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，位于从N-末端起位置3的氨基酸不是选自由D，E，R，K和H组成的组的氨基酸。6.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，位于从N-末端起位置3的氨基酸不是选自由D，E，R，K和H组成的组的氨基酸。7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，位于从N-末端起位置6的氨基酸不是选自由R，K和H组成的组的氨基酸。8.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，位于从N-末端起位置6的氨基酸不是选自由R，K和H组成的组的氨基酸。9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，位于从N-末端起位置7的氨基酸不是选自由R，K，H，D和E组成的组的氨基酸。10.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，位于从N-末端起位置7的氨基酸不是选自由R，K，H，D和E组成的组的氨基酸。11.一种组合物，其特征在于，含有具有HLA-A2.1结合基本模式的免疫原性肽，其中免疫原性肽含有约10个残基位于从N-末端起第2位上的第一个保守性残基选自由L，M，I，V，A和T组成的组；和位于C-末端位置的第二个保守残基选自由V，I，L，A和M组成的组；且第一个和第二个保守残基被7个残基隔开。12.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于位置1的氨基酸不是选自由D，E和P组成的组的氨基酸。13.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于从N-末端起位置3的氨基酸不是选自由D和E组成的组的氨基酸。14.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于从N-末端起位置4的氨基酸不是选自由A，K，R和H组成的组的氨基酸。15.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于从N-末端起位置5的氨基酸不是P。16.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于从N-末端起位置7的氨基酸不是选自由R，K和H组成的组的氨基酸。17.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于从N-末端起位置8的氨基酸不是选自由D，E，R，K和H组成的组的氨基酸。18.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，位于从N-末端起位置9的氨基酸不是选自由R，K和H组成的组的氨基酸。19.一种药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体和治疗有效量的一种能与HLA-A2.1分子结合并在哺乳动物中诱导免疫应答的肽。20.如权利要求19所述的药物组合物，其特征还在于，肽的结构式为TLGIVCPI。21.如权利要求19所述的药物组合物，其特征还在于，还含有一种具有下式的肽YMLDLQPETT。22.如权利要求19所述的药物组合物，其特征还在于，还含有一种T辅助肽。23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征还在于，T辅助肽具有下式结构aKXVAAWTLKAAa，其中a为D-丙氨酸和X为环己基丙氨酸。全文摘要本发明提供了选择免疫原性肽的手段和方法，以及能够特异性地与HLA-A2.1等位基因编码的糖蛋白结合并在受A2.1等位基因限制的T细胞中诱导T细胞活化的免疫原性肽组合物。这些肽能用于引起针对所需抗原的免疫应答。文档编号C07K7/00GK1118572SQ94191364公开日1996年3月13日申请日期1994年3月4日优先权日1993年3月5日发明者H·M·格雷,A·塞特,J·悉尼,W·M·卡斯特申请人:萨依特尔有限公司