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专利名称：一种磷脂酶a的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种新的夸特罗霉素(quartromicin)、其衍生物及其可药用盐、以及产生酶抑制和抗病毒活性的方法。
更具体地说，本发明包括一种新的磷酸酶A2(PLA2)抑制剂A87689，该抑制剂可以从Amycolatopsis mediterranei的发酵培养物中以基本纯净的形式分离出来。本发明还包括治疗还原病毒感染，特别是HIV(以及治疗由该病毒所致的获得性免疫缺陷综合症(爱滋病))和致癌病毒如人T细胞白血病毒等感染的方法。本发明还涉及含有A87689化合物的药物制剂，以及单独使用或与其他试剂组合使用本发明化合物以抑制PLA2和控制还原病毒感染的方法。
炎症在致衰疾病中占很大的比例。许多炎症如关节炎、牛皮癣、哮喘，可能还有动脉粥样硬化，起因于关节、皮肤和血管的炎性反应。人们普遍认为，在炎性反应中起核心作用的是称为类二十烷的磷脂代谢物的生成。类二十烷是一类重要的介体，如白三烯、前列腺素、脂氧素(lipoxins)、羟基二十碳四酸、凝血噁烷。据信类二十烷的生成依赖于花生四烯酸的可得性，而花生四烯酸是由磷脂酶A2(PLA2)作用于磷脂而释放出来的。
PLA2是磷脂2-酰基水解酶的俗名，该酶催化磷酸甘油酯的sn-2-酰基酯键的水解，生成等摩尔量的溶血磷脂和游离脂肪酸(Dennis，E.A.，The Enzymes第16卷，Academic Press，New York，1983)。PLA2酶存在于所有生物中，形成一个多样化的酶家族。已对四十多种PLA2酶进行了结构鉴定，这些酶显示出高度的顺序同源性(J.Chang，J.H.Musser和H.McGregor，“磷脂酶A2功能和药理调节作用”，Biochem，Pharm，36∶2429-2436，1987)。
鉴定得最详细的几种PLA2酶为分泌形式，它们释放到细胞外环境中而有助于消化生物物质。分泌形式的分子量约为12-15，000(Chang等，同上)。相反，细胞质PLA2少量存在于细胞内，在形成血小板激活因子和类二十烷的生物合成途径中起关键作用(Mobilio，D和Marshall，L.A.，“磷脂酶A2抑制剂设计和评价的最新进展”，Ann，Reports in Med.Chem.，24∶157-166，1989)。细胞质PLA2的分子量大致为85，000(Clark，J.D.，Lin，L.L.，Kriz，W.，Ramesha，C.S.，Sultzman，Lin，A.Y.，Merlona，N.，Knots，J.L.，Cell65∶1043-1051，1991)。游离的花生四烯酸是生成类二十烷的限速前体，而且是通过细胞质PLA2的作用而从其膜磷脂库中释放出来的(Dennis，E.A.，“磷脂酶A2作用机制抑制作用及在花生四烯酸释放中的作用”，Drug，Dev，Res，10∶205-220，1987)。该酶促步骤还生成溶血磷脂，这些溶血磷脂可以发生转化而形成血小板激活因子。因此，相信细胞质PLA2对炎症的强效脂介体生物合成途径的调节起核心作用。
由于细胞质PLA2在发炎过程中起核心作用，所以希望能对该酶的新抑制剂进行鉴定和表征。这类抑制剂可能会给关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、以及皮肤炎症(如牛皮癣)和肠炎(如应激性肠道综合症)的治疗带来新疗法。这些特异性PLA2抑制剂的鉴定可能有助于使医学界达到控制炎症的目标。
自从1980年分离出第一个人还原病毒即人T细胞白血病毒(HTLV，现定为HTLV-1)后，已积累了大量的知识。现已把还原病毒与许多疾病联系起来，这些疾病包括速发性恶性肿瘤和长潜伏期恶性肿瘤、消耗性疾病、神经病、免疫缺陷、以及无任何明显症状的终身病毒血症(参见例如FundamentalVirology，Fields，B.N.等编，1991)。分类为还原病毒科的病毒在分类学上又细分为三个不同的亚科，即致癌病毒亚科、慢病毒亚科和发泡病毒亚科。致癌病毒亚科中最引人注目的是人T细胞白血病毒。发泡病毒亚科包括许多人和灵长类分离物(如猿发泡病毒)，但一般被认为是良性的。还原病毒科的第三个亚科即慢病毒亚科，包括人免疫缺陷病毒(HIV)。
更具体地说，HIV(也称为爱滋病毒)以前被称为LAV、HTLV-Ⅲ或ARV，现在定名为HIV-1。与HIV-1密切相关的其他变异体包括HIV-2和SIV(猿免疫缺陷病毒)。本说明书通篇所使用的术语“HIV”包括HIV-1和HIV-2，除非另外指出。
获得性免疫缺陷综合症(爱滋病)这种综合性疾病包括免疫系统的进行性破坏以及中枢和外周神经系统的退化。HIV似乎优先侵袭辅助T细胞(T淋巴细胞或携带OKT4的T细胞)及人体的其他细胞，如大脑内的某些细胞。辅助T细胞受到病毒的侵入，使该T细胞变为HIV病毒生产者。辅助T细胞迅速遭到破坏，在人体内的数量减少，其减少的程度使体内的B细胞及在正常情况下受辅助T细胞刺激的其他T细胞，不再正常行使功能或产生足以破坏入侵病毒或其他入侵微生物的淋巴细胞活素和抗体。
HIV本身虽然并不一定引起死亡，但它却使人的免疫系统受到严重抑制，以致使人易发各种其他疾病，如疱疹、巨细胞病毒、卡波济肉瘤、EB病毒相关淋巴瘤等。这些继发性感染分别用其他常规疗法来治疗。在紧接感染后的时期内，HIV携带者看上去并没有什么症状，但有持续的感染。在发病后期，患者患有轻度的免疫系统抑制，并伴有体重减轻、不适、发热和淋巴结肿胀等各种症状。以这些症状鉴定的综合症称为持续全身性淋巴结病综合症(PGL)和爱滋病相关综合症(ARC)。在所有情况下，人们都认为爱滋病毒感染者对他人有永久的感染性。另外，爱滋病和爱滋病相关综合症在一段时间后是致命的。
R.Yarchoan和S.Broder的一篇文章对病毒感染其宿主的机理作了描述(“获得性免疫缺陷综合症和相关疾病的抗还原病毒疗法的进展”，NewEnglandJouranlofMedicine，316∶557-564，1987)。
在通过抑制HIV复制所需的HIV反转录酶来控制HIV方面正在做大量的工作(V.Merluzzi等，“用非核苷类反转录酶抑制剂抑制HIV-1复制”，Science，25∶1411，1990)。例如，目前使用的一种有治疗作用的化合物即AZT(美国专利4，724，232)，是一种病毒反转录酶抑制剂。遗憾的是，许多已知化合物都有毒性问题、生物利用率差、产生病毒抗性、体内半寿期短，或同时有几种问题。
所以，本发明提供对用于治疗由未抑制PLA2引起的临床适应症的药用化合物库的改进，此外还提供这些化合物在预防和治疗哺乳动物的还原病毒感染中的应用。具体地说，这些改进包括新的A87689化合物、其衍生物及其可药用盐、生产这些化合物的方法、这些化合物的上述多种用途、可用于抑制PLA2和控制哺乳动物的还原病毒感染的治疗制剂。
本领域专业人员将会从以下的描述和权利要求书中看出其他目的、特征和优点。
A87689及其示例性盐和衍生物的红外吸收光谱(KBr片)示于如下的

图1-5图1A87689钙盐。
图2A87689游离酸。
图3A87689四乙酸钙盐。
图4A87689四甲基醚钙盐。
图5A87689五钠盐。
图6是根据脂肪酸分布用计算机画出的树状图。
本发明涉及一种已被定名为“A87689”的新发酵产物。主要用作抑制剂的A87689，一般是以碱土金属盐如钙盐的形式从培养基中纯化出来的。本发明的另一些方面是通过培养微生物A.mediterranei的新菌株而生产A87689的方法，以及能产生A87689的A.mediterranei菌株的生物纯培养物，所述新菌株选自NRRL18815和NRRL18851或其A87689生产变异株。发酵领域的专业人员将会认识到，虽然该化合物一般是以碱土金属盐的形式从微生物中分离出来的，但也可在分离后通过在实验室中进行衍生化而生成其他形式的化合物，如下所述。
应该注意的是，A87689生产微生物的名称于1986年作了变动，当时从诺卡氏菌型放线菌中分出了两个新属。Lechevalier等人在当时鉴定出了新属Amycolata和Amycolatopsis(M.P.Le-chevalier，H.Prauser，D.P.Labeda，J.Ruan，“诺卡氏菌型放线菌的两个新属Amycolata新属和Amycolatopsis新属”，Int，J.Syst.Bacteriol.，36∶29-37，1986)。
在实用性的讨论中，化合物的给药形式将称作诸如“A87689的钙盐”或“A87689的游离酸”等;如果所讨论的是一种或一种以上的衍生物，则可能统称为“A87689化合物”。
A87689的钙盐为白色结晶物，具有下列特性分子量1222.418经验式C66H70O20CaFAB-MS(M+1)实测值1223.4175计算值1223.4254溶解性在pH7的水中溶解度甚微(1mg/ml);在pH12.0或更高的水溶液中相当易溶;易溶于DMSO(4mg/ml);微溶于甲醇;不溶于有机溶剂，如乙酸乙酯、丙酮、乙醚、烃类、氯仿、高级醇类。
A87689钙盐的红外光谱(KBr片)示于附图1。最有意义的最大吸收出现在下列频率(cm-1)3402，1711，1609，1534，1449，1078，1006，792。
A87689能够成盐，并至少有四个羟基能够酯化或形成醚衍生物。因此，C1-6烷酰基酯和C1-6烷基醚衍生物，以及A87689和这些衍生物的盐(A87689化合物)，也是本发明的一部分，例如四乙酸盐和四甲基醚衍生物，包括其游离酸和盐。A87689化合物可作为减轻炎症的药剂使用。可药用的盐类特别有用。
碱加成盐包括由无机碱衍生的碱加成盐，所述无机碱的例子有氢氧化铵、碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等。因此，这类可用于制备本发明盐类的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、碳酸钙等。特别优选钾盐、钙盐和钠盐形式。
术语“C1-6烷酰基”指1-6个碳原子的直链或支链单价脂肪族酰基，包括例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、α-甲基丙酰基、戊酰基、α-甲基丁酰基、β-甲基丁酰基、新戊酰基等。
术语“C1-6烷基”指1-6个碳原子的直链或支链脂族链，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。
术语“酯”和“醚”保留其本领域已知的定义。
为便于进行分类学讨论，A.mediterranei培养物NRRL18815和NRRL18851将分别称为A87689和A87689.1。培养物A87689.1是从一种土壤混合物中分离出来的(稀释法)。衍生菌株A87689.1是用化学诱变法产生的。由A87689和A87689.1培养物制备的新化合物将称为“A87689”。
所以，本发明还涉及选自NRRL18815或NRRL18851的微生物A.mediterranei的生物纯培养物，或其A87689生产突变株。这些微生物因其产生PLA2抑制剂或具有抗还原病毒作用的A87689化合物而具有使用价值。
培养物A87689和A87689.1已按照《布达佩斯条约》保藏在美国农业部农业研究服务局中西部北方地区研究中心的原种培养物保藏中心(1815NorthUuiversityStreet，Peoria，Illinois，61604)，并成为该保藏机构的一部分，该保藏机构给这两个培养物指定的登记号分别为NRRL18815和NRRL18851。
培养物A87689和A87689.1的分类学研究由利利研究实验室的FrederickP.Mertz进行。基于这些研究，把微生物A87689和A87689.1分类为A.mediterranei的新成员。这一分类依据的是直接的实验室观察和对已发表的出版物中对类似物种的描述所作的考察。
所用的方法所采用的分类方法为国际链霉菌项目(ISP)所推荐的鉴定链霉菌的方法(Shirling，E.B.和Gottlieb，D.，“鉴定链霉菌的方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.16∶313-340，1966)及所推荐的鉴定诺卡氏菌的方法(Gordon，R.E.，Barnett，D.A.，Handerhan，J.E.，Pang，C.H.，“空腔诺卡氏菌、自养诺卡氏菌及诺卡氏菌素菌株”，Int，J.Syst，Bacteriol.24(1)∶54-63，1974)。用ISCC-NBS矩心色图第2106号标准样品来判定背面和气生菌丝的颜色名称(美国商业部国家标准局，1958)。
用光学显微镜和扫描电子显微镜(SEM)进行形态学研究。用Becker等人(Becker，B.，Lechevalier，M.P.，Gordon，R.E.和Lechevalier，H.E.，“用全细胞水解液纸色谱法快速鉴别诺卡氏菌和链霉菌”，Appl.Microbiol.12∶421-423，1964)及Lechevalier和Lechevalier(Lechevalier，M.P.和Lechevalier，H.，AUniversityLaboratoryApproach,Dietz和Thayer编，SocietyforIndustr-ialMicrobiologySpecialPublicationNO.6，Arlington，VA，第227-233页)的色谱法确定全细胞水解液中的二氨基庚二酸(DAP)异构体和碳水化合物。
用Lechevalier等人的方法测定磷脂(Lechevalier，M.P.，Stern，A.E.和Lechevalier，H.A.，“放线菌分类学中的磷脂”，Actinomycetes，Schaal和Pulverer编，Zbl.Bakt，Suppl.11GustavFischerVerlag，1981)。
按照R.M.Kroppenstedt(ChemicalMethodsinBacterialSystematics，M.Goodfellow和D.E.Min-nikin编，1985，第173-196页)和M.D.Collins(同上，第267-285页)的方法测定甲基萘醌组成。用Miller和Ber-ger的HP5898A微生物鉴定系统进行脂肪酸分析(Miller，L.和Berger，T.，“用全细胞脂肪酸气相色谱法进行细菌鉴定”，Hewlett-PackardApplicationNote228-41，8pp，1985)。
由在同样条件下培养的冷冻干燥全细胞制备脂肪酸甲酯。用Minnikin提出的方法测定霉菌酸(Minnikin，D.E.，Hutch-inson，I.G.和Caldicott，A.B.，“含霉菌酸细菌的甲醇解产物的薄层色谱”，J.Chromatography188∶221-233，1980)。
培养特征培养物A87689在复合培养基和合成培养基上生长良好。培养物A87689除了在ISP4号培养基上产生微量的白色气生菌丝外，不产生气生菌丝。背面有特殊的橙色色素沉积。在ISP2号培养上产生不明显的浅棕色可溶性色素释放到培养基内。表1概括了这些培养特征。
表1 A87689的培养特征1培养基生长情况背面颜色气生体可溶性色素ISP 2号培养基旺盛50.s.O无浅棕色ISP 3号培养基不生长无ISP 4号培养基2旺盛 50.s.O 微量无ISP 5号培养基不生长无ISP 7号培养基差90.gy.Y无无ATCC 172号良好50.s.O无无贝内特尚好53.m.O无无苹果酸钙旺盛48.V.O无无蔡氏旺盛50.s.O无无TPO3旺盛 71.m.OY 无无(1)在30℃下培养28天。
(2)菌丝体颜色263.白色。
(3)马铃薯糊燕麦粉琼脂。
形态特征培养物A87689未显示出断裂现象。菌丝分隔成若干分生孢子子实体长链，这些分生孢子子实体排列成非链霉菌放线菌所特有的典型蛛网状形态。分生孢子子实体为圆柱形，表面光滑，平均为1.4×0.4mm。不存在孢子囊或游动细胞。
生理特征培养物A87689由下列碳水化合物产酸阿东糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、甘油、糖原、肌肌醇、菊粉、乳糖、D-麦芽糖、甘露糖醇、D-甘露糖、蜜二糖、棉子糖、L-鼠李糖、D-核糖、蔗糖、海藻糖、D-木糖。
A87689不从下列物质产酸纤维素、糊精、半乳糖醇、乙醇、肌赤癣糖醇、D-松三糖、甲基-D-葡糖苷、水杨苷、山梨糖醇、L-山梨糖、木糖醇。
培养物A87689在用ISP 9号培养基作基础培养基时利用下列碳水化合物L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、肌醇、D-甘露糖醇、D-棉子糖、L-鼠李糖、水杨苷、蔗糖、D-木糖。培养物A87689利用下列有机酸的钠盐(作为供其能量和生长的唯一碳源)乙酸、丁酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、苹果酸、粘酸、草酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸。培养物A87689不能利用苯甲酸和酒石酸。A87689分解酪蛋白、次黄嘌呤和L-酪氨酸。它不能水解腺嘌呤和黄嘌呤。A87689产生七叶苷酶、明胶酶、H2S、磷酸酯酶和脲酶。它不产生类黑素色素。A87689在15℃和42℃之间生长。A87689耐受最高达4%的NaCl。该培养物对溶菌酶敏感。
细胞壁分析经过水解的全细胞含有内消旋二氨基庚二酸(DAP)。全细胞提取物中的特征糖类为阿拉伯糖和半乳糖。所存在的磷脂有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、二磷脂酰甘油(DPG)。A87689的细胞壁组成为IV型，全细胞糖分布为A型(Lechevalier，M.P.和Lechevalier，H.，“化学组成作为好气放线菌的分类原则”，Int.J.Syst.Bacteriol.20∶435-443)，磷脂分布为PⅡ型(Lechevalier，M.P.，Stern，A.E.，Lechevalier.H.A.，“放线菌分类学中的磷脂”，Actinomycetes，Schaal和Pulverer编，Zbl.Bakt.Suppl.Ⅱ Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，New York)。全细胞水解液中不存在霉菌酸。检测到的主要甲基萘醌为MK-9(H4)，加上少量的MK-8(H4)、MK-9(H6)和MK-10(H4)。
A87689的本性培养物A87689是一个非链霉菌菌株，其细胞壁为IV型，全细胞糖分布为A型，磷脂分布为PⅡ型，无霉菌酸。这些化学分类特征加上其培养和形态特性，使A87689被归入Amycolatopsis属。该属中有6个种和1个亚种A.azurea、A.fastidiosa、A.mediterranei、A.orientalis、A.orientalislurida亚种、A.rugosa、A.sulphurea。和这些现存的菌株比较，培养物A87689与A.mediterranei最为相近，在培养特征上几乎是相同的。由于没有气生菌丝，所以其形态特征很少，但其初期生长情况与A.mediterranei相同。A87689和A.mediterranei的生化特征也几乎相同。表2列出了A87689和A.mediterranei之间的差别。
表2A87689和A.mediterranei的区别特征特征A87689A.mediterranei分解L-酪氨酸+-耐受4%NaCl+-在42℃下生长+-产酸:
阿东糖醇+-菊粉+-对A87689和现有的所有Amycolatopsis菌株进行了脂肪酸分析。表3列出了脂肪酸百分含量的比较。根据脂肪酸分布用计算机制作的树状图示于图6。该树状图表明了用欧氏距离量度的A87689与其他Amycolatopsis属物种的关系。相关性在10.00以下的培养物被视为同义，也就是说，为同一物种。A87689与A.mediterranei的相关性水平为12.00。
主分量分析是多变量统计学的一个分支，它研究的是一组变量的内部关系。在这一分析中，原始数据或试验结果内的最大差异以主分量表示(Alderson，G.“非分级法在细菌分类学中的应用和相关性”，Computer-Assistedbacterialsystematics，Goodf-ellow，M.，Jones，D.，Priest，F.G.编，AcademicPress，NewYork，1985)。这样便可制做出一条表示散布和变异性的曲线。这样便可通过考察这一差异来评价相关关系，并可以鉴定微生物种群。根据脂肪酸制做一条二维主分量曲线，该曲线表明培养物A87689与A.mediterranei分在一组。虽然A87689和A.mediterranei之间有差异，但这种差异是菌株的差异而非种的差异。所以，培养物A87689被分类为A.mediterranei的一个菌株(Lechevalier，M.P.，Hauser，H.，Labeda，D.P.，Ruan，J.S.，“诺卡氏菌型放线菌的两个新属Amycolata新属和Amycolatopsis新属”，Int.J.Syst.Bacteriol.，36∶21-37)。
衍生菌株的比较A87689.1菌株与A87689菌株在宏观上的相似足以使其被分类为A.mediterranei的一个菌株。这两个菌株的不同之处在于A87689的产量不同。A87689.1菌株的A87689化合物产量大致比A87689菌株的产量多两倍。
A87689的生产方法是，在合适的培养基中，在深层通气条件下培养A.mediterranei的A87689生产菌株，直到产生可回收量的A87689。可以用本领域所了解的各种分离纯化方法回收A87689。
用于培养A.mediterranei培养物的培养基可以是多种培养基中的任何一种。但就生产上的经济、达到最佳产率及便于产物的分离而言，优选某些培养基。例如，在大规模发酵中优选的碳源是葡萄糖和麦芽糖，但也可以使用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露糖醇、可溶性淀粉、马铃薯糊精、油酸甲酯、油类如豆油等。
优选的氮源为棉子粉、凝块乳和消化大豆粉，但也可以使用鱼粉、玉米浸液、酵母提取物、酶解酪蛋白、牛肉膏等。
可加入到培养基中的营养无机盐有，能够生成锌、钠、镁、钙、铵、氯、碳酸根、硫酸根、硝酸根等离子的常见可溶性盐。
培养基中还应含有生物体生长发育所需的必需微量元素。这些微量元素一般是作为杂质存在于培养基的其他组成成分中，但其量足以满足生物体的生长要求。
为优化A87689的大量生产，优选在搅拌生物反应器中进行深层通气发酵。少量的A87689可用摇瓶培养法制取。由于用孢子形式的生物体接种大型生物反应器一般会造成生产上的时滞，所以优选使用营养接种物。营养接种物的制备方法是，用孢子形式的生物体或该生物体的菌丝体碎片接种少量培养基，得到新鲜的、旺盛生长的生物体培养物。然后把营养接种物转移到较大的生物反应器中。营养接种物的培养基可以和较大规模发酵所用的培养基相同，但其他培养基也是适宜的。
在约27℃和约32℃之间的温度下培养A87689生产菌，即可产生A87689化合物。生产A87689的最佳温度似乎在30℃左右。
象深层通气培养方法中所常见的那样，在用常规涡轮式叶片搅拌培养基的同时，从容器底部向容器内放入无菌空气。一般来说，通气速度和搅拌速度应足以维持溶解氧水平至少为45%空气饱和，容器内压为5大气压。
在发酵过程中，可通过测试培养液提取物中的PLA2活性来跟踪A87689化合物的生产。下述的蛇毒(Naja naja)PLA2分析体系可用于此目的。
在深层通气发酵条件下生产出A87689化合物后，可以用本领域所用的方法从发酵培养基中回收之。在A87689生产菌的发酵过程中产生的A87689主要存在于培养液中。
A87689可用多种技术从菌体中回收。一种优选的技术涉及，用助滤剂如硅藻土过滤全发酵液。然后将所得滤液吸附到聚苯乙烯型的多孔高聚物吸附剂上，如DIAION HP-20(日本东京三菱化成工业株式会社)或AMBERLITE XAD-2或AMBERLITE XAD-4(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)。将吸附剂用水洗，用有机-水溶液如甲醇-水洗脱。将流出液冰冻干燥并浓缩。在一种优选的分离方法中，将冰冻干燥物溶解在二甲亚砜(DMSO)中，在反相硅胶吸附剂(C8或C18)上进行色谱分离。用有机-水缓冲液如乙腈乙酸铵洗脱出各级分。
磷脂酶A2抑制活性本发明的化合物可用于减轻组织的炎症，因为这些化合物能抑制PLA2，而PLA2参与组织炎症的调节。
A87689化合物已在许多特异性检测PLA2活性的试验中显示出抑制活性。更具体地说，在用分离的蛇毒(Naja naja)PLA2进行的体外试验中，在用纯化的人细胞质PLA2进行的体外试验中，以及在检测磷脂代谢物(白三烯和凝血噁烷)分泌抑制作用的全细胞体外试验中，这些化合物都有活性。
具有重要意义的是，要求保护的化合物在5-脂氧化酶试验中进行测试时无活性，表明这些化合物对PLA2有特异性。
另外，这些化合物还在抗炎活性体外试验中显示出活性。具体地说，这些化合物在三种佐剂诱导的关节炎模型中有活性。
在生物试验中测试了A87689的两种盐形式。一种形式既溶于水也溶于DMSO。这种形式是A87689的钠盐。另一种形式不溶于水但溶于DMSO。这种形式是A87689的钙盐。后一种形式或者以DMSO溶液形式进行测试，或者以在1%羧甲基纤维素(CMC)中的悬浮液形式进行测试。
另外，在其中一种生物试验即蛇毒(Naja naja)PLA2试验中，将A87689衍生物和盐的活性作了比较。
因此，本发明还涉及一种减轻动物炎症的方法，该方法包括，给予动物炎症抑制量的A87689化合物。
本发明的一个优选实施方案是一种减轻患关节炎的动物所出现的肿胀的方法，该方法包括给予动物足以减轻肿胀量的A87689化合物。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种治疗哮喘的方法，该方法包括，给予动物足以减轻哮喘动物出现的呼吸系统炎症量的A87689化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗牛皮癣的方法，该方法包括，给予患牛皮癣的动物能有效减轻牛皮癣损害量的A87689化合物。
还原病毒活性A87689化合物一旦生产并分离出来，在给予哺乳动物时就可用于预防该哺乳动物的还原病毒感染，可用于治疗被还原病毒感染的上述哺乳动物，或者两种用途都有。
由于A87689化合物具有这种抗还原病毒感染活性，所以本说明书通篇所用的还原病毒感染的“控制”这一术语，包括了对由一种或更多种还原病毒引起的初期或再发性感染进行预防，也包括了对已受到初期或再发性还原病毒感染的哺乳动物进行治疗。
本发明的另一实施方案包括一种控制哺乳动物体内的致癌病毒亚科的还原病毒，特别是人T细胞白血病毒的方法，该方法包括，给予所述哺乳动物致癌病毒控制量的一种选自A87689化合物的化合物或其可药用盐。
本发明的一个特别优选的实施方案包括一种控制人体内HIV的方法，该方法包括，给予所述人体HIV控制量的选自A87689化合物的化合物或其可药用盐。
A87689化合物还能控制爱滋病还原病毒。于是，本发明的另一个特别优选的实施方案包括一种控制人体爱滋病的方法，该方法包括，给予所述人体爱滋病控制量的一种选自A87689化合物的化合物或其可药用盐。
尽管目前已知的抗HIV药和抗爱滋病药被公认具有治疗潜力，到目前为止也已作了大量的研究工作，但仍未出现有生命力的单一治疗剂。所以，本发明的另一个特别优选的实施方案包括一种控制人体内HIV和爱滋病的方法，该方法包括，给予所述人体HIV或爱滋病控制量的第一组分和有效量的第二组分，第一组分选自A87689化合物或其可药用盐，第二组分是一种或更多种抑制HIV和/或爱滋病的化合物或其可药用盐。
特别有用的第二组分化合物包括核苷类反转录酶抑制剂，如3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧胸苷(AZT;美国专利4，724，232);2′，3′-二脱氧胞苷(DDC)和2′，3′-二脱氧肌苷(DDI;Mitsuya，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83∶1911-1915，1986)等。其他可用的第二组分化合物包括四氢咪唑并〔4，5，1-jk〕〔1，4〕苯并二氮杂Amycolatopsis mediterranei-2(1H)-酮和硫酮的非核苷衍生物等(TIBO衍生物;Debyser等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88∶1451-1455，1991)。但TIBO衍生物只具有抗HIV-1复制活性。另一些可用的第二组分化合物包括HIV蛋白酶抑制剂。例如，EPA 361 341、EPA 346 847、EPA 402 646和EPA 337 714都公开了据说可用作HIV蛋白酶抑制剂的化合物。与作为第一组分化合物给药的A87689化合物不同的那些第一组分化合物，也可以作为第二组分化合物使用。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种药物制剂，该制剂包含有效量的如上所述的第一组分和如上所述的第二组分，以及可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
以上及本说明书通篇所用的术语“有效量”，是指足以对特定的临床症状达到治疗效果的活性化合物剂量。
本说明书通篇所使用的术语“活性化合物”，是指选自A87689、其衍生物、或其可药用盐的至少一种化合物，以及抗HIV和/或抗爱滋病药剂或其可药用盐。
对治疗特定症状而言，可以原样给予含或不含第二组分化合物的第一组分化合物，也可将其制成单位剂型的药物组合物，供肠胃外给药、经皮给药、直肠给药、经鼻给药或静脉给药，优选口服给药。这些药物组合物以本领域公知的方式制备，包含至少一种选自A87689化合物的活性化合物，还可以视需要而包含一种或更多种第二组分化合物及药用载体。在这样一种组合物中，活性化合物和第二组分化合物(如果有的话)称为活性成分。制备这些组合物时，通常将活性成分与载体混合，或用载体稀释，或包在载体内，载体的形式可以是胶囊、香囊、纸或其他容器。载体起稀释剂作用时，可以是对活性成分起媒介物、赋形剂或介质作用的固体、半固体或液体物质。因此，该组合物的形式可以是片剂、丸剂、粉剂、糖锭剂、香囊剂、扁囊剂、酏剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、混悬剂、软硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌包装粉末。
适宜的载体、赋形剂和稀释剂的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、黄蓍胶、明胶、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸镁、水、矿物油。这些制剂还可以含有润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。这些组合物可以配制得使其在用本领域公知方法给予患者后，能使活性成分快速释放、持续释放或延缓释放。就口服而言，可将化合物(还可能含有第二组分化合物)与载体和稀释剂混合成型为片剂，也可包在明胶胶囊内。也可将这些混合物溶解在诸如10%葡萄糖水溶液、等渗盐水、无菌水等液体中，静脉给予或注射给予。
组合物最好配制成单位剂型，每个剂量含有约1至500mg活性成分，更常见的是约5至300mg活性成分。术语“单位剂型”是指适于作为人类或其他哺乳动物单元剂量的物理上独立的单位，每个单位含有经计算能产生预期疗效的预定量的活性物质，以及所需的可药用载体。这些组合物可以含有A87689化合物作为活性成分，也可以含有A87689化合物加第二组分化合物作为活性成分。“可药用”是指载体、稀释剂或赋形剂必须可与制剂的其他成分配伍，对受药者无损害。
下列制剂实施例仅是说明性的，决不是要限制发明范围。术语“活性成分”的含义限定如上。
制剂1用下列成分制备硬明胶胶囊量(mg/胶囊)活性成分250干燥淀粉200硬脂酸镁10总计460mg
制剂2用以下成分制备片剂量(mg/片)活性成分250微晶纤维素400烘制二氧化硅10硬脂酸5总计665mg将各组分混合后压制成片剂，每片重665mg。
制剂3制备含有下列组分的气雾剂溶液重量活性成分0.25乙醇25.75抛射剂22(-氯二氟甲烷)70.00总计100.00将活性化合物与乙醇混合，将该混合物加到一部分抛射剂22中，冷却到-30℃，转移到装填装置中。然后将所需量送入不锈钢容器中，用剩下的抛射剂稀释。然后在该容器上装配阀门装置。
制剂4如下制备每片含60mg活性成分的片剂活性成分60mg淀粉45mg
微晶纤维素35mg聚乙烯吡咯烷酮(10%水溶液)4mg羧甲基淀粉钠4.5mg硬脂酸镁0.5mg滑石1mg总计150mg使活性成分、淀粉和纤维素通过45目美国筛并充分混合。使所得粉末与含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液混合，然后使该混合物通过14目美国筛。将所制成的颗粒在50℃下干燥，并通过18目美国筛。然后在颗粒中加入已预先通过60目美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，混合后在压片机上压制成每片重150mg的片剂。
制剂5如下制备每胶囊含80mg活性成分的胶囊剂。
活性成分80mg淀粉59mg微晶纤维素59mg硬脂酸镁2mg总计200mg将活性成分、纤维素、淀粉和硬脂酸镁混合后通过45目美国筛，再填装到硬明胶胶囊中，每胶囊装200mg。
制剂6如下制备每剂含225mg活性成分的栓剂。
活性成分225mg
饱和脂肪酸甘油酯2，000mg总计2，225mg使活性成分通过60目美国筛，并悬浮在预先用所需的最少热量熔化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将该混合物倾入额定容量为2g的栓剂模中，令其冷却。
制剂7如下制备每5ml剂量含50mg活性成分的混悬剂。
活性成分50mg羧甲基纤维素钠50mg糖浆1.25ml苯甲酸溶液0.10ml调味剂适量着色剂适量纯化水加至总量为5ml将活性成分通过45目美国筛并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合，形成均匀糊状物。将苯甲酸溶液、调味剂和着色剂用一部分水稀释后在搅拌下加入。然后加入足够的水达到所需体积。
制剂8可如下制备静脉用制剂活性成分100ml等渗盐水1，000mlA87689化合物在很宽的剂量范围内都有效。例如，日剂量通常在每千克体重约0.1至50mg范围内。对成人进行治疗时，优选剂量范围为约5至25mg/kg(单次或分次剂量)。但应该理解，实际给予的化合物的量将由医师根据有关条件来确定，有关条件包括疾病的相对严重程度、所要给予的化合物的选择、年龄、体重、患者的个体反应，所选择的给药途径。所以，上述剂量范围决不是要限制本发明的范围。第二组分化合物的剂量范围是本领域所已知的，应遵照使用。
A87689在体外磷脂酶A2模型中体外蛇毒(Najanaja)试验在该试验中，通过用膜滤器(截留分子量为10，000，Centr-icon)过滤从培养液中除去微生物产生的内源性磷脂酶。将培养液(100ml)在总体积为0.54ml的反应混合物中于37℃保温1小时。反应混合物的组成为0.24mM 1-棕榈酰基-2-〔6-〔〔7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基〕己酰基〕磷脂酰胆碱(PLA2生色底物，Avanti，Polar-Lipids，Inc.，Alabas-ter，AL)、0.76mM磷脂酰胆碱、10mM曲拉通X-100(表面活性剂，Sigma)、10mM CaCl2、37mM TRIS-HCl，PH8.5(Sigma)、0.07单位/ml Naja naja PLA2(Sigma)。加入0.2ml 0.25M乙二胺四乙酸(EDTA)停止反应。用高效液相色谱法从底物中分离出产物即〔(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基〕己酸。用C8防护管将试验混合液(20ml)注入C8柱(0.46×15cm，ZORBAX)上(溶剂∶乙腈∶水∶乙酸(40∶60∶1);流速1.5ml/分;产物检测453nm紫外;保留时间3.72-3.76分钟)。表4和表5示出了A87689化合物在本试验中的作用。
人细胞质PLA2试验用从人U937成单核细胞中纯化出的细胞质PLA2来测试A87689的体外抑制活性。该试验如Kramer等人所述进行(Kramer，R.M.，Roberts，E.F.Manetta，J.和Putnam，J.E.，“C2+a敏感性细胞质磷脂酶A2是人U937成单核细胞中的100KD蛋白质”，J.Biol.Chem.266(8)∶5268-5272)。简言之，把试验化合物溶解在150ml试验缓冲液中，形成不同微摩尔浓度，向其中加入50ml经过超声处理的脂质体，脂质体中含有1-棕榈酰基-2-〔14C〕花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二油酰基甘油(摩尔比为2∶1)。上述试验混合物中含有1mM CaCl2、2mM 2-巯基乙醇、150mM NaCl、50mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)PH7.5和1mg/ml牛血清清蛋白(BSA)。在每管中加入酶(5ml，稀释到能使底物达到10-20%水解)，将该混合物于37℃下保温15分钟。用Doles试剂停止反应(Zhang，Y.Y.，Deems，R.A.和Den-nis，E.A.，Methods in Enzymology，第197卷第457页，Academic Press，New York，1991)。用己烷∶水(1.2∶1)提取游离的花生四烯酸标记物。将上相移至装有0.1g硅胶的管中，混合后在1500×g下离心，移出上清液进行闪烁计数。对每个药物浓度计算抑制度并作图，抑制度以抑制最大反应50%的量(IC50)来表示。A87689在该试验中的作用示于表4。在该试验中，A87689化合物的效力比蛇毒或胰PLA2的经典抑制剂(如对溴苯甲酰甲基溴、袂杷克扔或迈诺阿利德(manoalide))要强得多。
全细胞PLA2试验人前髓白血细胞(HL-60)如在1.5%DMSO存在下进行培养，则被诱导分化成粒细胞样细胞，这种细胞在对钙离子载体A23187的刺激作出反应时释放白三烯B4(LTB4)和凝血噁烷B2(TXB2)。用PLA2抑制剂迈诺阿罗格(manoalogue)((E，E)-2-〔3-(2，5-二氢-2-羟基-5-氧-3-呋喃基)亚丙基〕-6，10-二甲基-5，9-十一碳二烯醛)处理这些细胞，能抑制上述类二十烷的释放。迈诺阿罗格是分泌形式PLA2(Reyn-olds等，J.American Chemical Society 110∶5172，1988)和细胞内形式PLA2(Dennis等，J.Biol.Chem.264∶8520，1989)的抑制剂。
HL-60细胞试验的程序如下将得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的HL-60细胞悬浮培养在添加有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)中，培养于37℃下在5%CO2的潮湿气氛中进行。在1.5%DMSO存在下培养7天，诱导细胞分化成粒细胞样细胞。于4℃下离心5分钟收集细胞，在添加有0.1%BSA、1.1mM MgCl2和1mM CaCl2的118mM NaCl、4.6mM KCl、24.9mM NaHCO3、1mM KH2PO4和11.1mM D-葡萄糖、5mM HEPES，PH7.4中洗涤一次。将洗过的细胞重新悬浮至浓度为1×106个细胞/ml，并在开始试验前预热至37℃并保温5分钟。将细胞与抑制剂一起预保温5分钟，然后与钙离子载体A23187一起保温5分钟。离心终止反应。倾出上清液并进行处理，以进行酶免疫测定(EIA)。进行白三烯B4和凝血噁烷B2酶免疫测定时的终体积为150ml，其中含有100mM磷酸钾缓冲液，PH7.4、0.4M NaCl、1mM EDTA、1.5mM NaN3和0.1% BSA，其中测定LTB4时样品的体积为5ml，测定TXB2时样品的体积为50ml。然后在96孔微量滴定板(用每孔5mg的小鼠抗免IgG抗体预涂)中将样品与抗体和示踪物一起于室温下保温过夜。洗去过量的抗体和示踪物后，在小孔中加入200ml Ellman试剂(免疫测定试剂盒，Cayman Chemical Company)，将样品于25℃下保温4小时。测量405nm处的光密度。将抑制剂、钙离子载体A23187和试验化合物溶解在DMSO中作为贮液(10mM)，以10ml的总体积以不同的浓度加到各试验中。A87689在该试验中的作用示于表4。
表4 A87689在PLA2体外试验中的活性IC50试验钙盐游离酸蛇毒(Naja naja)PLA28.0mg/ml 6.3mg/ml纯化人细胞质PLA222mg/ml 17.2mg/ml全细胞HL-60细胞试验无活性*＊游离酸在10mM时有一些活性，但抑制活性稳定在30-40%抑制。
表5A87689化合物在蛇毒(Naja naja)PLA2试验中的活性化合物 IC50游离酸6.3mg/ml四乙酸钙盐9.5mg/ml五钠盐6.7mg/ml
A87689在体内关节炎模型中在为测试抗炎活性而设计的三种不同的体内关节炎模型中测试A87689。在其中的每个动物模型中，给大鼠的后爪注射一种能诱发爪关节炎样状态的物质，这种状态的表现是出现肿胀的发炎软组织和骨损伤。这种状态是诱发性关节炎的一种形式，具有抗炎活性的药剂能通过组织炎症的减轻和骨损伤的减轻而得以鉴定。
口服并在腹膜内和皮下注射试验化合物。优选口服，但A87689在肠胃外给药时也产生良好的抗炎活性。许多刺激性物质在腹膜内注射时都常常导致腹膜炎。这种腹膜炎与通过软组织炎症减轻而表现出的抗炎活性相关。另外，皮下注射刺激性物质还会导致非特异性抗炎活性。每个实验与非特异性刺激物对照(如1%角叉胶或稀乙酸)平行进行，以观察有多少抗炎活性是非特异性的。
类脂叔胺诱发的关节炎模型类脂叔胺(lipoidalamine)诱发的关节炎试验，是一种由悬浮在矿物油中的佐剂物质N，N-二(十八烷基)-N′，N′-二(2-羟基乙基)丙二胺(LA)诱发的全身性炎症和关节炎模型。所致的疾病与用弗氏完全佐剂(FCA)处理过的大鼠所发生的疾病很类似(Chang，Y.，Pearson，C.M.和Abe，C.，“佐剂多关节炎IV合成佐剂的诱发作用免疫、组织病理及其他研究”，Arth.Rheum23∶62-71，1980)。许多组织都出现炎症，但脾和关节最显著。测试化合物在已确立的疾病中调节脾和关节炎症的能力(在第9天开始治疗)。
将动物(Lewis/SpragueDawley，雄性，200-220克)分成若干组，每组5只，圈养在挂起的笼子中，随时可取食饲料和水。在第0天，在动物尾巴基部皮下注射7.5mgLA。第9天给动物称重并开始给予化合物。用组织匀浆器将化合物悬浮在1%CMC溶液中。口服筛选剂量为50mg/kg。每天给予化合物一次，共给予5天(第9-13天)，第14天不给药。第15天给动物再次称重，用水压表测量后爪体积。然后将动物麻醉，通过心脏穿刺放血。无痛处死动物后，摘出脾并称重，在踝关节正上部摘下后爪并称重。分析各血样中的纤维蛋白原。然后计算所有这些参数的平均值和标准差，计算出与患病(LA)对照的差异百分比。利用对原始数据进行的DunnetT计算确定统计显著性。LA关节炎试验的阳性对照为地塞米松。口服剂量为0.1mg/kg的地塞米松将抑制爪肿胀80-90%，抑制脾重90-100%。对纤维蛋白原的影响较为不定，但通常抑制50-70%。
对那些对爪肿胀或脾重显示出统计抑制作用的化合物以50mg/kg的剂量再次实验，如果活性得到验证，则进行剂量反应实验。还可以在下边讨论的两种完全弗氏佐剂诱发的大鼠关节炎模型中测试这些化合物。
如果在本试验中以14mg/kg(在DMSO中)的剂量皮下给予A87689的钙盐，则注射后爪肿胀被抑制46%。
如果在本试验中将A87689的钠盐溶解在水中并以20mg/kg的剂量皮下给予，则抑制爪体积肿胀30%。同样，如将A87689钠盐溶于DMSO并以10mg/kg的剂量腹膜内给予，则抑制爪肿胀15%。但如将该钠盐溶于DMSO并以10mg/kg的剂量皮下给予，则抑制爪肿胀65%。
弗氏完全佐剂诱发的多关节炎所用的两种体内模型是基于从足底向大鼠后爪引入弗氏完全佐剂，并测量所产生的炎症。用三种方法给予A87689化合物腹膜内(IP)、口服(PO)和皮下(SC)。这两个基于向鼠爪内引入弗氏完全佐剂的模型为“形成试验”和“确立试验”。
在形成试验中，用体重220-240克的雄性Wistar-Lewis大鼠(HarlanSpragueDawleyLaboratories)进行测试。动物在使用前先适应实验室条件7天。给动物随时提供PurinaLabChow饲料和水，并进行12小时光照和无光照循环。用矿物油1∶6稀释PERRIGEN(佐剂，Calbiochem)，使终浓度达到0.083%，制得弗氏完全佐剂。第0天给大鼠右后爪一次足下注射0.1ml弗氏完全佐剂悬浮液。以五只为一组将动物分组并称重。在形成试验中，在第0天开始用试验化合物进行治疗。正常对照和弗氏完全佐剂对照给予无效媒液。用电放大排水仪测量爪体积，每周测三天。第14天把动物再次称重并对治疗剂量作适当调整。第28天停止试验，然后把动物再次称重，测量爪体积，制作两个后爪的射线照片。制作注射爪和未注射爪的体积曲线，计算曲线下的面积。把这些面积与弗氏完全佐剂对照作比较，由弗氏完全佐剂对照计算出抑制百分率。对射线照片进行分析，根据骨膜隆凸、关节腔收缩和钙沉积情况确定骨损伤评分。
在形成试验中，当以25mg/kg口服A87689钙盐(在1%CMC溶液中)时，抑制爪肿胀59%。当以10mg/kg腹膜内给予A87689钙盐(在DMSO中)时，抑制爪肿胀98%。
当以5mg/kg腹膜内给予A87689钠盐(在DMSO中)时，抑制爪肿胀108%，但接受这种治疗的大鼠出现腹膜炎。同样条件下但以10mg/kg给药，A87689钠盐抑制爪肿胀101%(该组中有两只大鼠死于腹膜炎)。
“确立试验”是“形成试验”的一种变式，其中所有条件都相同，只是直到第14或15天才开始用化合物治疗，此时大鼠的未注射爪至少肿胀0.5ml，表明已患有确立疾病。
在确立试验中，A87689钙盐在以50mg/kg(在1%CMC中)腹膜内给予时，抑制确立损伤部位爪肿胀58%。
本说明书所描述的用A87689化合物所做的试验还证实了这些化合物对人T细胞白血病毒和HIV-1的活性。以下描述的是在分析A87689化合物对这些疾病的效果时所用的试验体系。
莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MuLV)体外试验用如Rowe，W.P.等人(Virol.42∶1136-1139，1970)所述的XC试验体外测试A87689化合物对莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MuLV，Clone E7，The Salk Institute，La Jolla，California)的活性。一般做法是，将3-5×103个SC-1细胞(CRL-1404;美国典型培养物保藏中心(ATCC)接种在96孔微量滴定板的每个小孔中的最低必需培养基中，培养基中添加有5%胎牛血清、青霉素(150单位/ml)、链霉素(150μg/ml)、溴化己二甲铵(2μg/ml)。第二天，每小孔用MO-MuLV感染(感染复数＝10PFU/细胞)。
使病毒与细胞吸附1小时后，向细胞中加入含有连续稀释的A87689化合物的培养基。未使用半固体培养基。
培养5天后(此时细胞汇合)，将SC-1细胞紫外照射10秒钟，每孔加入5-8×104个XC细胞(CCL-165，ATCC)。通常需要再培养两天，以达到充分的病毒诱发的细胞致病作用。A87689化合物在本试验中的作用与表4重合。
为评价A87689化合物的杀病毒活性，将所要评价的化合物经连续稀释后与MO-MuLV一起于37℃下预保温1小时。然后用两倍稀释的各种A87689化合物-病毒混合物感染SC-1细胞。在37℃下使病毒与细胞吸附1小时后，用Hank氏平衡盐溶液(HBSS;GIBCO，GrandIsland，N.Y.)将病毒感染的细胞洗涤三次，用如上所述的XC细胞试验监测细胞是否出现细胞致病作用。
体外HIV抗病毒试验在人T淋巴细胞系“H9”中繁殖HIV-1的HTLV-ⅢB株(popovic，M.等，Sience，224∶497-500，1984)。病毒接种物由H9-ⅢB生产培养物的上清液组成。
用MT-2(Harada等，Sience，229∶563-566，1985)和CEM(Nara等，Nature，332∶469-470，1988)细胞系进行常规筛选。在RPMI 1640培养基中培养细胞。为繁殖H9细胞，在RPMI培养基中添加胎牛血清，浓度为20%(V/V)。为在试验过程中稀释化合物及保持培养物，用于繁殖MT-2细胞系的培养基中添加10%(V/V)胎牛血清。每个培养基中还含有100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和25mM HEPES缓冲液。在37℃下，在含有5%CO2的潮湿空气中，将培养物保持在一次性使用的实验室组织培养器械中。
试验前的准备工作还包括配制用于以量热法评价细胞成活率的XTT-PMS试剂，配制方法是将200μg/ml的XTT(四唑试剂，DiagnosticChemicals，Oxford，CT.)与0.02mMPMS(吩嗪甲基硫酸酯，SigmaChemical，St.Louis，MO)混合。
将A87689化合物以40mg/ml溶于DMSO中，或以2mg/ml溶于无菌去离子水中。特别是将A87689的钙盐和游离酸溶于DMSO。溶于DMSO的化合物先在培养基中稀释至浓度为0.2mg/ml，而溶于水的化合物则先在培养基中稀释至浓度为0.2mg/ml。随后进行对数或半对数连续稀释。
为评价细胞毒性，将每个稀释液以100μl/孔的量加到微量板中。用感染细胞测试A87689化合物时，每个稀释液用三个平行小孔进行重复试验，用未感染细胞测试时，每个稀释液二个平行小孔。
在准备感染细胞和未感染细胞之前，用台盼蓝对所要使用的细胞进行活细胞计数。
将所需总数的细胞置于50ml锥形离心管(无菌且一次性使用)中，加入病毒使MT-2细胞的感染复数达0.03TCID50/细胞，CEM细胞的感染复数达约0.12 TCID50/细胞。加入新鲜培养基将细胞密度调整到1×105个细胞/ml，在铺平板前将病毒-细胞悬浮液于37℃下保温1-2小时。以同样方式但不加病毒制备未感染细胞。
接着，将感染细胞和未感染细胞以100μl/孔的量加到平板中，使起始细胞数为1×104个细胞/孔。然后在含5%CO2的潮湿空气中，将以上述方式准备的微量板保温7天。
为对病毒的细胞致病作用(CPE)进行定量并测定A87689化合物的活性，在每小孔中加入50μl XTT-PMS溶液，将微量板再送回到CO2培养箱中保温4小时。然后从板上取下盖，换上粘性密封板。将盖着密封板的微量板放入VMax平板读数仪中，于450nm和650nm处读出读数。A87689化合物在该试验中的作用示于表5。
表6A87689化合物在莫洛尼氏鼠白血病毒体外试验中的活性A87689 IC*50钙盐0.4μg/ml游离酸0.4μg/ml五钠盐0.5μg/ml四乙酸游离酸0.2μg/ml＊IC50＝抑制CPE 50%所需的A87689化合物浓度。
表7A87689化合物在HIV体外试验中的活性A87689 IC*50游离酸8.5μg/ml五钠盐18.8μg/ml＊IC50＝抑制CPE50%所需的A87689化合物浓度。
下列实施例进一步说明本发明的化合物。这些实施例决不是要限制发明范围，不应造成误解。
实施例1A87689的发酵A.摇瓶用培养物A87689即NRRL18815的冰冻干燥粉或保存在液氮中的悬浮液，接种具有营养培养基A组成的营养培养基营养培养基A成分量(%)葡萄糖1.0马铃薯糊精3.0大豆粉2.0棉籽粉＊2.0CaCO30.2自来水加至1升未调节PH＊PROFLO Flour，Traders Protein，P.O.Box 8407，Memphis，TN 38108培养物保存在液氮中时，将营养培养物(30℃培养48小时)悬浮在悬浮培养基中达培养体积，用营养培养物的菌丝体制备安瓿。悬浮培养基中含有乳糖(100g)、甘油(200ml)、去离子水(加至1升)。
用液氮安瓿接种装在250ml培养瓶中的50ml营养培养基。将培养物置于以250rpm沿二英寸(5.08cm)圆周转动的摇床上，于30℃下培养48小时。
用营养培养物(2%V/V接种物)接种50ml具有下列组成的生产培养基
生产培养基Ⅰ成分量(%)葡萄糖3.0蛋白胨＊0.75赤糖糊糖蜜0.5CaCO30.2去离子水加至1升未调节PH＊BACTO PEPTONE，Difco Laboratories将接种后的生产培养基置于250ml锥形瓶中，在以250rpm沿二英寸圆周旋转的摇床上，于30℃下培养5-6天。
B、搅拌生物反应器发酵为提供较大体积的接种物，用15ml如A部分所述制备的经过培养的第一期营养培养物，接种60ml组成与第一期营养培养基相同的第二期营养培养基。将第二期培养物置于2升广口锥形瓶中，在以250rpm沿二英寸圆周旋转的摇床上，于30℃下培养约24小时。
用如此制得的经过培养的第二期营养培养物(2.4升)，接种80至115升无菌生产培养基Ⅱ。
生产培养基Ⅱ成分量(%)葡萄糖2.35蛋白胨＊0.75赤糖糊糖蜜1.4CaCO30.2
去离子水加至1升未调节pH，在培养基中加入消沫剂(SAG471)控制起沫＊BACTO PEPTONE使接种后的生产培养基在165升搅拌生物反应器中于30℃下发酵7-8天。用计算机控制搅拌容器中的空气流量和搅拌器速度，以保持溶解氧浓度为45%空气饱和。用H2SO4和NaOH控制PH(如果需要)在6.7和7.6之间。在接种25-27小时后，开始以4.5克/升/天的速度送入葡萄糖溶液(0.33克/ml去离子水)。从42-44小时时开始，把速度提高到5.7克/升/天。
实施例2A87689.1的发酵按照实施例1的方法，但使用A87689.1(NRRL18851)培养物来生产化合物A87689。
实施例3A87689的分离和纯化将发酵液(88升，如实施例2所述制备)用陶瓷滤器(Memb-ralox Systems，Illinois Water Treatment，Rockf-ord，Illinois)过滤，得到66升含A87689的滤液。将滤液以500ml/分的流速泵送到DIAION HP-20SS(一种聚苯乙烯型树脂，日本东京三菱化成工业株式会社)(5升)不锈钢柱(3×48英寸)上。用20升甲醇∶水(1∶3)洗柱，用甲醇∶水(1∶1)洗脱出活性，收集10个4升的级分。分析各级分的PLA2抑制活性。将含有大部分活性的级分4和5合并并真空浓缩至2500ml，作为并集液1。将级分3、6、7和8合并作为第二个活性并集液。将并集液1中形成的沉淀物离心出来并溶于60ml DMSO中。从该DMSO溶液中取一份10ml样品，泵送到装有400ml硅胶C8(150A)树脂的DYNAMAX HPLC C8柱上(4.1×30cm，Rainin Instruments Co.，Emeryville，CA)。用乙腈∶水∶5%NH4OAc(10∶85∶5)至乙腈∶水∶5%NH4OAc(50∶45∶5)梯度，以25ml/分钟的流速在70分钟内将柱展开，以25ml为一级分收集。用Waters481检测器(Millipo-re Corporation，Milford，MA)在254nm处监测洗脱过程。滤出级分36、37和38中形成的晶体，并真空干燥。将样品分离过程再重复5次，得到总收量为1162mg的结晶A87689盐(在约300℃分解，没有真实熔点)。
实施例4分离纯化A87689的替代方法将如实施例1所述得到的全发酵液(225升)用压滤器和3%HYFLO SUPERCEL助滤剂(硅藻土，Johns Manville Products Corp.)过滤。用5N HCl将滤液(190升)的PH由7.4调节至7.0，加入DIAION HP-20树脂(20升)并搅拌2小时。滤除树脂，用100升蒸馏水洗涤，然后加100升水∶甲醇(3∶1)在容器中搅拌30分钟进行洗涤。倾出上清液，树脂加50%甲醇水溶液搅拌，以洗脱A87689活性。滤出含活性的甲醇上清液，树脂加100升甲醇进行搅拌，以分离出其余的活性并再生树脂。用蛇毒(Naja naja)PLA2试验监测洗脱过程。
将50%甲醇流出液真空浓缩至20升，调PH至7.0，溶液用20升正丁醇提取两次。废水层经冰冻干燥得到56g粗产物(这种物质不能用正丁醇萃取，其纯化将在实施例4B中叙述)。将正丁醇提取液合并并真空浓缩至干。将残渣溶于100ml水和100ml二噁烷中，经冰冻干燥得到14.7g粗制A87689。将该粗制A87689在超声处理下溶于300ml甲醇，在-10℃下放置直至形成沉淀。滤出沉淀物并真空干燥，得到1.4g部分纯化的A87689。
将该物质(100mg)在10ml水中搅拌，用5N NaOH将该悬浮液调至PH12.0，以溶解沉淀。用5N HCl将PH缓慢调至7.0，并将该溶液加到装有100ml硅胶C8(150A)树脂的DYNAMAX 150A柱上(Rainin Instrument Co.，Emeryville，CA)。用乙腈∶水∶1%NH4OAc(5∶85∶10)至乙腈∶水∶1%NH4OAc(50∶40∶10)梯度，以8ml/分的流速在50分钟内将柱展开。用Waters 481检测器(Millipore Corporation，Milf-ord，MA)在260nm处监测洗脱过程。合并级分2和3，真空浓缩除去乙腈，放置过夜使其结晶。重复这一步骤，合并两次操作得到的晶体，过滤并真空干燥，得到29mg结晶A87689钙盐(m.p.∶300℃以上分解)。这种盐形式在水中的溶解度很低，但易溶于DMSO，在实用性的讨论中将其称为“水不溶性盐”或“钙盐”。
实施例4A另一种分离纯化A87689的替代方法实施例4的一种替代方法是，将部分纯化的A87689干燥沉淀物重新悬浮于水中，不将PH从12调至7，而是直接把溶液加到柱上。将所得的非结晶钠盐冰冻干燥，该盐可溶于水。在实用性的讨论中，这种形式称为“水溶性盐”或“钠盐”。
实施例4B不可用正丁醇萃取的制备物的纯化取一部分实施例4的不可用正丁醇萃取的物质(200mg)，溶于10ml水中，并加到装有100ml硅胶C8树脂的DYNAMAX 150A柱上。用乙腈0.1% NH4OAc(1∶20)至乙腈0.1% NH4OAc(1∶1)梯度，以10ml/分的流速在30分钟内将柱展开，以8ml为一级分进行收集，在260nm处监测洗脱过程。滤出级分22(活性最强的级分)中形成的晶体，真空干燥后得到8mg结晶A87689盐。将滤液冰冻干燥，又得到19mg无定形A87689盐。
实施例5由A87689钙盐制备A87689游离酸在室温下，将如实施例4所述得到的纯化A87689钙盐(0.44g)悬浮在5N HCl(0.05升)中，加入丙酮(0.05升)。10分钟后观察到一种黄色溶液，30分钟后开始沉淀。在室温下，将该悬浮液在氮气中搅拌18小时。将反应混合物真空减至1/2体积并过滤，用1N HCl溶液洗涤后得到黄色粉末(0.58g)。将仍然潮湿的粉末溶于CHCl3(0.2升)中，并用水洗两次。CHCl3层用Na2SO4干燥。过滤并真空除去溶剂后，得到黄色泡沫状物(0.306g)，即为A87689的游离酸。最终物质为黄色结晶状。TLC(Merck SG)用碘蒸气检测出单点物质(Rf＝0.5;氯仿∶甲醇∶氨，6∶3∶1)，HPLC表明纯度为77.9%。用μBondapak C18SG柱(Waters Chromatography Divis-ion，Millipore Corporation)进行HPLC，以2ml/分的流速用CH3CN∶0.1%NH4OAc(1∶9至7∶3)梯度液洗脱，在254nm处进行紫外检测，表明该游离酸的HPLC保留时间为6.4分钟。
A87689的游离酸具有如下特性分子量1184.462经验式C66H72O20FAB-MS(M+1)实测值1185.4695计算值1185.4680元素分析计算值C，66.88;H，6.12实测值C，66.52;H，5.95。未检测到氮或硫。
UV(EtOH，1max)，中性304(e＝54805)238(e＝64335)碱300(e＝56569)237(e＝72695)酸314(e＝59871)236(e＝38628)218(e＝40085)熔点＞200至320℃开始炭化。
滴定表明PKa为3.5(约三个基团)A87689游离酸的红外光谱(KBr片)示于附图2。最有意义的最大吸收出现在下列频率(Cm-1)3439，1758，1688，1636，1568，1395，1002，981和753。
实施例6四乙酸钙盐的制备将A87689钙盐(100mg)溶于无水吡啶(3ml)中。向该溶液中加入乙酸酐(1ml)。在氮气下将溶液加热至40℃120小时。将溶液冷却至室温，真空浓缩至干，得到粘性残渣。将该残渣用氯仿∶甲醇(1∶1)研制，过滤并真空干燥，得到浅黄色粉末(112mg)。A87689四乙酸钙盐在实施例5所述的HPLC系统上的保留时间为12.2分钟。该四乙酸钙盐具有下列特征分子量1390.460经验式C74H78O24CaFAB-MS(M+1)实测值1391.4659计算值1391。4677UV(EtOH，lmax)中性300(e＝31700)238(e＝32700)碱295(e＝57900)206(e＝311000)酸306(e＝53900)225(E＝62300)A87689四乙酸钙盐的红外光谱(KBr片)示于附图3。最有意义的最大吸收出现在下列频率(Cm-1)3436，1728，1641，1457，1241，1027和1003。
实施例7A87689四甲基醚钙盐的制备将A87689钙盐(0.1g)溶于含10%NaOH(1.5ml)的DMSO(10ml)中。向该溶液中加入甲基碘(0.5ml)。在氮气下，将该溶液于40℃下搅拌18小时。冷却至室温，用1N HCl调至PH1.5。过滤收集沉淀，用H2O洗两次，真空干燥，得到115mg褐色粉末。
在实施例5所述的TLC系统上，A87689四甲基醚钙盐的Rf值为0.75。A87689四甲基醚钙盐具有下列附加特征分子量1280经验式C70H78O20CaA87689四甲基醚钙盐的红外光谱(KBr片)示于附图4。最有意义的最大吸收出现在下列频率(cm-1)3434，1718，1637，1465和1089。
实施例8A87689五钠盐的制备将A87689游离酸(70mg)溶于甲醇(1ml)中，向其中加入1ml H2O，然后用2N NaOH将PH调至12。在氮气下，将该溶液室温搅拌1小时。将该溶液真空浓缩至接近干燥，得到半固体物，用2ml乙腈∶甲醇(1∶1)研制并过滤，得到白色粉末(52mg)。将这种水溶性粉末用甲醇研制，收集所得固体并干燥，得到白色固体(38mg)。
A87689五钠盐在实施例5所述的TLC系统上的Rf值为0.3，在实施例5所述的HPLC系统上的保留时间为5.25。A87689五钠盐具有下列附加特征分子量1294.371经验式C66H67O20Na5FAB-MS(M+1)实测值1295.3814计算值1295.3792UV(EtOH，lmax)中性299(e＝40379)237(e＝47771)碱299(e＝42623)235(e＝30162)酸312(e＝40908)235(e＝30162)221(e＝29110)A87689五钠盐的红外光谱(KBr片)示于附图5。最有意义的最大吸收出现在下列频率(cm-1)3430，1710，1623，1436，996，834和701。
实施例9A87689四甲基醚游离酸的制备将A87689钙盐(50mg)溶于含有0.8ml 10%NaOH溶液的5ml DMSO中。向其中加入0.25ml甲基碘。在氮气下，将该反应液于40℃下搅拌18小时。然后将反应液冷却至室温，用5N HCl调PH至2。然后将反应混合物真空浓缩至原始体积的0.75倍，并用100ml CHCl3稀释。CHCl3层用5%Na2S2O3洗2次，接着用水洗2次。移出有机层并真空干燥，得到68mg乳黄色固体。将该固体用石油醚B研制，然后用乙醚研制。过滤收集固体并真空干燥，得到33mg黄色细残渣。
A87689四甲基醚游离酸在实施例5所述的TLC系统上的Rf值为0.7，在实施例5所述的HPLC系统上的保留时间为10.23分钟。A87689四甲基醚游离酸具有下列附加特征分子量1240经验式C70H80O20FAB-MS(M+1)实测值1241.5387计算值1241.5322UV(EtOH，lmax)中性304(e＝47104)239(e＝51704)碱296(e＝51763)233(e＝71752)212(e＝227629)酸312(e＝50737)233(e＝37297)218(e＝37705)
权利要求
1.一种制备A87689或A87689的C1～6烷基醚或C1～6烷酰基酯衍生物、或其可药用盐的方法，该方法包括在深层通气发酵条件下，在含有可吸收碳源、氮源和无机盐源的培养基中，培养Amycolatopsis mediterraneiNRRL18815、NRRL18851、或其A87689生产突变株；如果适当可随后进行成盐、酯化、酰化或形成其醚衍生物。
2.根据权利要求1的方法，其中所制备的是A87689或其可药用盐。
3.根据权利要求1的方法，其中所制备的是A87689的钙盐。
4.根据权利要求1的方法，其中所制备的是A87689的游离酸。
5.根据权利要求1的方法，其中所制备的是A87689的五钠盐。
6.根据权利要求1的方法，其中所制备的是A87689的四甲基醚衍生物。
7.根据权利要求1的方法，其中所制备的是A87689的四乙酸衍生物。
8.一种Amycolatopsis mediterranei NRRL 18815、NRRL 18851或其A87689生产突变株的生物纯培养物。
9.一种制备药物制剂的方法，该方法包括，将如前所述的A87689、或A87689的C1～6烷基醚或C1～6烷酰基酯衍生物、或其可药用盐，与一种或更多种可药用载体、稀释剂或赋形剂混合。
全文摘要
由选自NRRL 18815和NRRL 18851的Amycolatopsis mcditcrranci菌株或其A87689生产突变株生产发酵产物A87689。A87689、其C
文档编号C07K14/41GK1073979SQ92108990
公开日1993年7月7日 申请日期1992年8月1日 优先权日1991年8月1日
发明者D·R·贝里, A·H·丹齐格, M·迪邦诺, R·L·哈米尔, R·M·莫洛伊, 姚慈晃, J·M·科拉奇诺, J·C·C·唐 申请人:伊莱利利公司