专利名称：人的碱性fgf突变蛋白质的制备的利记博彩app
技术领域：
本发明是关于制备一种成人碱性成纤维细胞生长因子(下面简写成hbFGF)的突变蛋白质的技术，其中hbFGF的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，这种突变蛋白质可用作伤口愈合促进剂。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种多肽的激素，它具有大约17，000的分子量，且主要由脑下垂体分泌。bFGF最初是作为一种对成纤维细胞(如BALB/c3T3细胞)有很强的生长促进作用的因子而被分离出〔D.Gospodarowicz，Nature 249，123(1974)〕。人们已知FGF对几乎所有的来源于中胚层细胞都有生长促进作用〔D.Gospodarowicz et al.，Nature Cancer Insitute Monograph 48，109(1978)〕。尤其是bFGF生成血管的作用，连同其细胞生长促进作用都提出有将其用作创伤的治疗医药和用作血栓形成、动脉硬化等疾病的预防和治疗医药的可能性。
对hbFGF编码的基因已由Abraham等人〔The EMBO Journal 5，2523～2528(1986)〕和Kurokawa等人〔FEBS Letters 213，189-194(1987)〕克隆化，并在动物细胞中表达〔The Journal of Biological Chemistry 263，16471-16478(1988)〕以及大肠杆菌中表达〔The Journal of Biological Chemistry 263，16297-16302(1988)〕。然而，该物质生产并不充足，且最终的样品太不稳定以至于不能用作医药。为解决不稳定性的各种研究结果已经发现对于hbFGF分子的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代的这类化合物具有高的稳定性且表现出相同的生物活性(Biochemical and Biophsical Research Communication 151，701～708(1988)〕。
进而，又已研究了一种制备一种突变蛋白质的方法，其中hbFGF的至少一种组分氨基酸通过遗传工程技术被另一种氨基酸所取代(见欧洲专利公开No.281，822)。
当采用大肠杆菌制备重组蛋白质时，经常形成水不溶性内包体以累积蛋白质。当所需物质从这类内包体中分离出并纯化时，该内包体通常被所加入的蛋白质变性剂溶解。然而对于hbFGF突变蛋白质，如此溶解的这种蛋白质是失活的，目前还没有研究出使其再活化的技术。
如果使用遗传工程技术，这种突变蛋白质可以大量累积并处于活化状态，进而可高产率地分离并提纯，则hbFGF突变蛋白质可以用作医药。因而，一个关键问题就是建立一种高产率制备这种突变蛋白质的方法。
通常，当采用遗传工程技术制备大量基因产物时，则选择寄主载体体系和启动子是重要的，这种不同的选择取决于各自基因。各种对于hbFGF突变蛋白质的有效表达体系的研究结果已揭示出采用T7启动子的一种大肠杆菌基因表达体系〔F.M.Studier et al.，Journal of Molecular Biology 189，113-130(1986)〕是表达hbFGF突变蛋白质基因极好体系。T7启动子和hbFGF突变蛋白质基因的组合是新颖的。这种T7启动子被认为是一种强启动子。然而在某些情况下，这种累积的蛋白质(如人体内白细胞素-2、促乳素)形成内包体，并且其大多数都是以失活态累积的。本发明者已发现内白细胞素的例子，Paris，N.等人已发现促乳素例子〔Paris，N.et al，Biotechnology and Applied Biochemistry，12，436-449(1990)〕。
本发明者对于积累大量的、处于活性状态的hbFGF蛋白质进行了深入研究，目前已发现加入低浓度的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷是有效的。此外，本发明者进而还建立一种有效地分离和纯化hbFGF蛋白质的方法，这样完成了本发明。
本发明提供(1)含有对一种突变蛋白质编码的核苷酸序列的载体，在这种突变蛋白质中，成人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，而T7启动子在其上游端;
(2)一种由上述(1)中所述载体转化来的转化体;
(3)上述(2)中所述的转化体，其中寄主是具有一个处于lac启动子下游端的T7RNA聚合酶基因;
(4)一种制备突变蛋白质的方法，该突变蛋白质中成熟hbFGF的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，这种方法包括在培养基中培养上述(2)中所述的转化体;
(5)上述(4)中所述的方法，其中，大约3～500μM(毫摩尔)的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷(下面简写为IPTG)在上述(3)所述转化体的对数生长期内加入到培养基中，接着进行培养;以及(6)上述(5)中所述的方法，其中含有突变蛋白质产物的溶液使用色谱法进行纯化，并采用交联多糖硫酸盐、具有磺酸基团作为交换基团的合成聚合物和/或用于凝胶过滤的合成聚合物作为载体。
根据本发明，取代型的成熟hbFGF突变蛋白质可以大量制备，因而本发明可用于工业化生产这种突变蛋白质。
图1示出了实施例1中使用的rhbFGF突变蛋白质CS23的DNA核苷酸序列和核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列;
图2是实施例1中得到的质粒pTB960的结构示意图;
图3示出了实施例5中获得的纯化试样的SDS-pAGE图和标记;以及图4至图6给出了由实施例5中获得的纯化试样的高性能液相色谱图;
图7至图9是由实施例8获得的质粒pHP901，pME901和pCM901的结构示意图。
本发明的成熟的hbFGF是一种由146种氨基酸构成的肽，在图1中，将紧接于N-末端甲硫氨酸的氨基酸脯氨酸作为第一号，而将C-末端的丝氨酸作为第146号。
于本发明中给出的hbFGF突变蛋白质的例子包括这类蛋白质，即成熟hbFGF的至少一组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，如欧洲专利公开说明书No.281，822和Biochemical and Biophysical Research Communication 151，701-708(1988)〕中所述。
至于此种突变蛋白质(其中hbFGF的至少一种氨基酸被另一种氨基酸所取代)在取代前hbFGF的组分氨基酸的数目，它可以是任何数量，只要不丧失FGF的特性(如血管形成特性、细胞生长刺激活性和细胞分化活性)。
在取代前此组分氨基酸的例子包括半胱氨酸和与半胱氨酸不同的氨基酸。特别指出的是半胱氨酸是较佳的。除半胱基酸以外其他氨基酸在取代前作为组分氨基酸的包括天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和缬氨酸。
当取代前组分氨基酸是半胱氨酸时，中性氨基酸作为取代氨基酸是较佳的。中性氨基酸的具体例子包括甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。尤其丝氨酸和苏氨酸是较佳的。
当取代前组分氨基酸是除半胱氨酸以外的一种氨基酸时，选择在亲水性、疏水性和电荷不同于取代前此组分氨基酸的其他氨基酸作为取代氨基酸。特别是，取代前氨基酸是天冬氨酸时，取代氨基酸包括天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，而天冬酰胺和精氨酸是较佳的。
当取代前氨基酸是精氨酸时，取代氨基酸包括谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。谷氨酰胺是特别优选的。
当取代前组分氨基酸是甘氨酸时，取代氨基酸包括苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸。苏氨酸是特别优选的。
当取代前组分氨基酸是丝氨酸时，取代氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和天冬氨酸，而甲硫氨酸是较佳的。
当取代前组分氨基酸是缬氨酸时，取代氨基酸包括丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸和天冬氨酸，而丝氨酸是优选的。
在取代前对作为原始的组分氨基酸来说，天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸和缬氨酸是优选的。
对作为取代氨基酸来说，天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和亮氨酸是优选的。
最佳的被取代的突变蛋白质包括这样一种突变蛋白质，即其中的组分氨基酸半胱氨酸被丝氨酸取代。
在上述的取代反应中，可以同时进行至少两种组分氨基酸的取代。较佳的是取代二至三种组分氨基酸。
在本发明中的hbFGF突变蛋白质的较佳实施例包括成熟的hbFGF突变蛋白质的至少一种半胱氨酸残基被丝氨酸残基所取代而得到的突变蛋白质。
作为突变蛋白质，重组的hbFGF突变蛋白质CS23(下文也简写为rhbFGF突变蛋白质CS23)是特别优选的，其中成熟的hbFGF的处于69和87位置的半胱氨酸残基分别被丝氨酸残基所取代。上述hbFGF的氨基酸位置已经序化，其序化是将氨基酸序列中紧邻于N-未端甲硫氨酸的氨基酸脯氨酸作为第一号，如图1所示。
为制备这种突变蛋白质，采用了定位点诱变。这种技术已广为人知并由R.F.Lather和J.P.Lecoq论述在Gentic Engineering，P13-50，Academic Press(1983)中。定向于低核苷酸诱变由M.Smith和S.Gillam论述在Gentic EngineeringPrinciples and Methods，Vol 3，P1-32，Plenum Prese(1981)中。
制备编码此突变蛋白质的结构基因，例如可用下述步骤制备(a)将含有hbFGF结构基因单链的一种单链DNA同一种致诱变的低核苷酸引物进行杂交(上述引物互补于这样一个区中，即该区包括半胱氨酸被这种单链取代的密码子，或包括一种在某些情况下与这种密码子配对的反义三联体，已经证明，这种情况不能应用于不同于除上述密码子的其他氨基酸的密码子，或不同于在某些情况下的反义三联体)，(b)用DNA聚合酶延伸该引物，形成一种突变异源双链核酸分子，及(c)复制这种突变异源双链核酸分子。
然后，将用于转移经诱变处理的基因的噬菌体DNA进行分离并引入到一种质粒中。
本发明所用的T7启动子可采用在T7DNA上发现的17种启动子的任何一种〔J.L.Oakley et al.，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.74，4266-4270(1977);M.D.Rosa，Cell 16，815-825(1979);N.Panayotatos et al.，Nature 280，35(1979);J.J.Dunn et al.，J.Mol.Biol.166，477-535(1983)〕，而φ10启动子〔A.H.Rosenberg et al.，Gene 56，125-135(1987)〕是优选使用的。
作为本发明所用的转录终止区，任何终止区都可采用，只要它在大肠杆菌体系中起作用，而Tφ终止区(F.W.Studier et al.，J.Mol.Biol.189，113-130(1986)〕是优选使用的。
用于本发明的T7RNA聚合酶包括T7基因1〔F.W.Studier et al.，J.Mol.Biol.189，113-130(1986)〕。
用于形成本发明所采用的载体的载体例子包括pBR322，pUC8，pUC9，pMB9，pRC7，pACYC177和pKN410。
用于本发明中的载体是通过将T7启动子和T7终止区掺合入上述载体中而形成的。这类载体包括pET-1，pET-2，pET-3，pET-4和pET5〔A.H.Roseberg，Gene 56，125～135(1987)〕，而pET-3C(同前)是优选的。
作为用于本发明转化体的寄主，任何已掺入T7RNA聚合酶基因(T7基因1)〔F.W.Studier et al.，J.Mol Biol.189，113-130(1986)〕的大肠杆菌菌株都可使用，例如MM294，DH-1，C600和BL21。菌株MM294和BL21是优选使用的，其中包含T7基因1的λ噬菌体已被溶源化。该T7RNA聚合酶基因也可作为一种具有与表达载体不同源的质粒来寄存。在这种情况下，对T7基因1的启动子是采用lac启动子，它的表达是用异丙基-1-硫代-β-D-吡喃型半乳糖苷(IPIG)诱导的。
用于本发明的转化体可通过使用本领域中已知的方法，用对T7启动子表达有基因转录终止区的质粒将已掺合了上述T7基因1(RNA聚合酶基因)的大肠杆菌转化而获得，这些方法如描述在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，2110(1972)和Gene 17，107(1982)中的。在这些情况下，所用的寄主可先用具有T7溶菌酶基团的质粒转化，这样得到的转化体同时具有两种不同的质粒。
当此转化体被培养时，液态培养基是特别适用于作为培养用介质。碳源、氮源、无机化合物和其它转化体生长必需的物质也含于其中。碳源包括，例如葡萄糖、糊精、溶解淀粉和蔗糖。氮源包括无机或有机物质，例如铵盐、硝酸盐、谷物浸渍液、胨、酪蛋白、酪蛋白氨基酸、肉浸计、大豆粗粉和土豆提取液。无机化合物的例子包括氯化钙、磷酸氢二钠和氯化镁、酵母提取液、维生素、生长促进因子和类似物进而也加入其中。
培养基的PH值希望是6至8。
作为用于培养E.coli转化体的培养基，较优选的是，如M9培养基(Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics 431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)，另外加了葡萄糖和酪蛋白氨基酸。铁离子也可加入到此培养基中。铁离子是那些在溶液中可离解成铁离子的物质或着是可以铁离子形式使用的物质。这类物质包括铁盐，较佳是二价或三价铁无机盐，例如氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁或硫酸铁、磷酸铁和硝酸铁。铁离子的加入量为约10-6至10-4摩尔，较佳的加入量是5×10-6至5×10-5摩尔。培养过程通常在15°至43℃进行约3至72小时，较佳是约12至48小时，如必要进行通气或搅拌。
对于基因表达，比较好的是在培养过程中加入IPTG。由此，连接于lac启动子下游端的T7基因1(RNA聚合酶基因)被表达，而由此制备的T7噬菌体RNA聚合酶1识别出T7启动子。依据现有技术，为表达lac启动子，IPTG加入量为0.1至20毫摩尔，较佳是1至2毫摩尔〔达到1毫摩尔IPTGLφbner-Olesen等人，Cell，57 881-889(1989);2毫摩尔的IPTGErnst H.等人，Gene，68，345-355(1988);20毫摩尔的IPTGLuck，D.N.等人DNA，5，21-28(1986)〕。然而已经发现通过加入这样量的IPTG在诱导表达中累积的蛋白质形成内含体，其有时得到失活的蛋白质累积。关于以溶解状态累积蛋白质的方法的各种研究结果已经发现在培养过程中，加入约3至500μM的IPTG可首先达到目的，较佳的是加入约3至300μM，更佳的是6至200μM，而最佳的是约6至80μM。当进行大规模培养如槽培养时，IPTG的加入量以约10至50μM为佳，较佳是10至200μM，更好是10至100μM，而最佳是10至80μM。当进行小规模培养时如瓶培养时，IPTG的较佳的加入量是3至100μM，更佳的是6至8μM。IPTG首先加入是在开始培养后的1至24小时内，较佳是3至12小时内，而IPTG最好是在对数生长期内加入。此后IPTG按需要以间歇式或连续式加入。含有IPTG的培养基是在温度约20°至40℃，较佳是约20至30℃下培养。作为异丙基硫代吡喃型半乳糖苷的替代物，在某些场合下可使用，如丙基硫代吡喃型半乳糖苷，甲基硫代吡喃型半乳糖苷、丁基硫代吡喃型半乳糖苷和环己基硫代吡喃型半乳糖苷。
在本发明中的hbFGF突变蛋白质可从上述培养基中分离和纯化，例如，可利用下面方法。
当本发明的hbFGF突变蛋白质从培养细胞中提取时，这些细胞采用本领域已知的方法例如离心法在培养后收集。然后将收集到的细胞通过玻璃球、French挤压超声波处理、溶菌酶处理和/或冻结-解冻进行破裂。用玻璃球破裂是尤其优选的。
人们对纯化依据本发明由上述上清液获得的hbFGF突变蛋白质的各种方法进行了研究。结果是高产率地获得了高纯度的试样，采用的方法是下面几种方法的结合即使用一种交联多糖硫酸盐为载体的亲合色谱法，载体是有一个磺酸基团为交换基团的合成聚合物的离子交换色谱法，使用凝胶过滤的合成聚合物为载体的色谱法，将这种方法彼此相结合应用至少一次。
使用在本发明中的交联多糖硫酸盐包括交联纤维素硫酸盐、交联琼脂糖硫酸盐和交联葡聚糖硫酸盐。
上述纤维素是由β-1，4链联接的葡萄糖组成的多糖，其分子量较佳约50，000至2，000，000。它的具体实例包括Avicel(微晶纤维素，Asahi Chemical Industry，Japan)和Cellulofine(Chisso Corporation，Japan)。
上述的琼脂糖是一种以琼脂为主要组分的多糖，具有D-半乳糖基-(β1→4)-3，6-脱水-L-半乳糖基-(α1→3)的重复结构。它的分子量较佳为10，000至5，000，000，它的具体实例包括琼脂糖28(Sepharose 2B)，Sepharose 4B和Sepharose 6B(Pharmacia，Sweden)。
上述的葡聚糖是一种右旋葡萄糖聚合物，其主要有α(1→6)链，例如通过将一种微生物如Leuconostoc mesenteroides对蔗糖作用而形成。它的平均分子量较佳约为1，000至40，000，000。
使用于本发明中的交联多糖硫酸盐的制备是通过将交联多糖，如上述葡聚糖、琼脂糖和纤维素同已知交联剂如表氯醇和2，3-二溴丙醇依照本领域已知的方法进行处理而得到。
这些交联多糖是商业化的，可从Pharmacia(瑞典)购得，商品名为Sephadex G-10，Sephadex G-15，Sephadex G-25，Sephadex G-50和Sephadex G-100(交联葡聚糖)，以及商品名为Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B(交联琼脂糖)。交联纤维素也可从Chisso Corporation(Japan)购买，商品名为Cellulofine(交联纤维素)。所想要的交联多糖硫酸盐可通过将下面已知的硫酸化试剂，如氯代磺酸和硫酸酐酯同这些交联多糖进行反应而合成得到。
这些交联纤维素硫酸盐的实例包括由Seikagaku Kogyo(Japan)投放市场的产品，商品名为Sulfated Cellulofine(交联纤维素硫酸盐)。
交联葡聚糖硫酸盐的实例包括硫酸盐化的Sephadex。
交联琼脂糖硫酸盐的实例包括硫酸盐化的Sepharose。
用于本发明的交联多糖硫酸盐可以是相应盐的形式。其盐的例子包括钠盐、钾盐、铵盐和三甲基铵盐。钠盐是特别优选的。
用于本发明的交联多糖硫酸盐是不溶解于水的，因而最好是通过水化作用以其胶质态来使用。
采用本发明中的交联多糖硫酸盐提纯hbFGF蛋白质的方法包括下述的亲和色谱法。
含有hbFGF突变蛋白质的水培养基是含有hbFGF突变蛋白质的溶液。此水培养基包括水和培养基，主要由水组成，较佳的是用缓冲溶液，如磷酸盐缓冲剂、硝酸盐缓冲剂和Tris-盐酸缓冲剂，调节PH值范围，以防止该hbFGF突变蛋白质失去活性。
接着将含有hbFGF突变蛋白质的溶液重新调整到PH值范围大约5.0至9.0内，然后根据需要用蒸馏水稀释，以使其电导率约为15mυ或更低。将由此得到的含有hbFGF的突变蛋白质溶液与交联多糖硫酸盐胶体相接触。为此目的，批量法和柱层析法都可使用。然而由于柱层析法操作简便而更为适宜。在柱层析法中，此交联多糖硫酸盐凝胶被填充到柱中，随后用一种适宜的缓冲溶液，例如含有0.4M NaCl的50mM的硝酸盐缓冲液(PH7.0)完全地洗涤该柱，以使其平衡化。所需用的凝胶的量取决于填充的含hbFGF蛋白质溶液的性质，而每毫克的hbFGF突变蛋白质约为1至50毫升的范围是优选的。
然后将含有hbFGF突变蛋白质的上述溶液填充入柱内。填充速度选择空速(SV)范围约0.1至5.0。在填充后，将柱充分洗涤，用常规方法提高缓冲溶液的离子强度，以洗脱和回收hbFGF突变蛋白质。为提高离子强度，诸如NaCl盐类可加入其中，或者使用高浓度的缓冲溶液，这样电导率提高到至少约15mυ，较佳的是至少30mυ。对于洗脱过程，分批和浓度梯度洗脱方法均可使用。当采用浓度梯度洗脱方法时，例如NaCl的浓度逐渐由约OM提高到2.0M，这样进行洗脱和回收。结果高纯化的hbFGF突变蛋白质以高产率被制得。
可用于本发明的具有磺酸基作为交换基团的合成聚合物的例子包括那些磺酸基团是直接或非直接引入到亲水性乙烯基聚合物、苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、丙烯酰胺聚合物和类似物的聚合物。从回收和操作观点来看，磺酸基被引入到亲水性乙烯基聚合物的SP(磺丙基)-Toyopearl(Tosoh，Japan)是特别优选使用的。
当进行色谱化时，将部分纯化的含有hbFGF突变蛋白质溶液调整到盐的浓度约为50mM或更低，例如，在以磷酸盐缓冲剂的情形中，将其吸附在上述的树脂上，PH范围为5至7。对吸附步骤而言，分批和柱层析体系都可使用，但从操作观点来看，柱层析体系是优选使用的。采用提高盐浓度的方法从树脂上进行洗脱。对洗脱步骤，分批和浓度梯度法都可使用。当使用分批方法时，例如，一种通过将NaCl加入到上述磷酸盐缓冲液中形成浓度约为50mM至1M的缓冲溶液可被使用。硝酸盐缓冲液可代替磷酸盐缓冲液而被采用。洗脱过程是在温度约为1至25℃，较佳约为1至10℃，最好是在约4℃下进行。
本发明所用的用于凝胶过滤的合成聚合物的实例包括亲水性乙烯基聚合物和丙烯酰胺聚合物。从胶体的耐久性和操作观点来看，Toyopearl HW(Tosoh，Japan)，亲水性乙烯聚合物是优选使用的。
当对含有hbFGF突变蛋白质的已部分纯化的溶液例如在Toyopearl HW-50F色谱柱上进行处理时，诸如磷酸盐缓冲液和硝酸盐缓冲液这类缓冲液都可用作展开溶剂。然而，比较有利的是使用50mM的硝酸盐缓冲液(PH7.0)。处理过程是在约1至25℃，较佳是在约1至10℃，最佳是在约4℃下进行。
除上述方法以外的其他方法也可用作纯化步骤之一。在这类方法中，举例来说，天然产品如纤维素、琼脂糖和葡聚糖以及无机材料如玻璃球也可被用作离子交换色谱法中的载体。
作为凝胶过滤的载体，也可类似地使用主要由天然产品，(如纤维素、琼脂糖和葡聚糖)组成的凝胶，以及基于无机材料(如玻璃球)的凝胶。
这样获得的试样也可进行透析并冷冻干燥而形成干态粉末。进而，可将血清清蛋白加入试样中，作为载体贮存它们，由此试样避免被吸附在容器上。
在提纯或贮存过程中，与痕迹量的还原剂共存便于抑制试样被氧化。这种还原剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和谷胱甘肽。
依据本发明，制得了本质上无热原和内毒素的基本纯的hbFGF突变蛋白质。依据本发明制得的基本纯的hbFGF突变蛋白质包括含有本发明hbFGF突变蛋白质的产品，其以蛋白质含量计量，占95%(W/W)，较佳的是占98%(W/W)或更多。
由本发明的上述方法制得的hbFGF突变蛋白质具有成纤维细胞生长促进活性、血管内皮细胞生长促进活性和生成血管的活性，且具有高稳定性和低毒性。因而，它们可用作烧伤、创伤、手术后组织和类似伤口的愈合促进剂，或根据其生成血管活性，用作治疗血栓形成、动脉硬化和类似疾病的医药。它们还可用作促进细胞培养的试剂。特别指出的是至少一种组分半胱氨酸残基被一种丝氨酸残基所取代的这种突变蛋白质是优选的，这是因为其高稳定性。
当本发明的hbFGF突变蛋白质用作药用制剂时，它们可通过肠胃外给药或口服给药于温血动物(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、狗和猫)，可以粉末形式，或与适于药用的载体、赋形剂和稀释液一起用作药用组合物，例如以注射液、片剂、胶囊、溶液或软膏形式。
注射液可用传统的方法制备，例如使用生理盐水或含有葡萄糖或其他辅剂的形成药液。其药用组合物，如片剂或胶囊也可根据常规方法制备。
当本发明的hbFGF突变蛋白质用作上述药用制剂时，它们给药于上述温血动物的适宜剂量为每天约1ng/kg体重到100μg/kg体重，要考虑到给药的途径和病症本身等等。
进而，当本发明的hbFGF突变蛋白质被用作加速细胞培养的试剂时，最好是将其加入到培养基中，加入量为每升培养基约0.01至10μg，较佳加入量为每升培养基约为0.1至10μg。
当本说明书及附图中的碱、氨基酸用缩写表示时，则所用缩写是IUPAC-IUB Commission采纳的生化词汇或在本领域中常用的缩写，如采用下列缩写。当这类氨基酸的旋光异构体存在时，除另有说明外，则所表示的是左旋型(L型)。
DNA脱氧核糖核酸cDNA互补脱氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸
dATP脱氧腺苷三磷酸dTTP脱氧胸苷三磷酸dGTP脱氧鸟苷三磷酸dCTP脱氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸Tdr胸苷EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基磺酸钠Gly苷氨酸Ala丙氨酸Val缬氨酸Leu亮氨酸Ile异亮氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Asp精氨酸Lys赖氨酸Arg精氨酸His组氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸
Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gln谷氨酰胺参见图1，就hbFGF-组分氨基酸的序效而言，该氨基酸序列的N-末端的Met是排列为第1号。而在本说明书中，紧挨Met后的Pro是被编成第1号。
用于下述实施例1中的载有质粒pTB762的转化体E.Coli.MM294/PTB762，于实施例1中制得的转化体E.Coli MM294(DE3)/PTB960及于实施例8中制得的转化体E.Coli MM294(DE3)/PCM901已委托日本的InStitute for Fermentation，Osaka(IFO)，及日本的Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(FRI)保藏。它们的入藏登记号及存放日期列于表1。在FRI保藏的E.Coli MM294/PTB762开始是以FERM P号码标记的入藏登记号。所说的寄存物被转为按Budapest Treaty的寄存物，而该转化体已在FRI以FERM BP号标识的入藏登记号存放。
表1转化体 IFO FRIE.Coli MM294 IFO14613 FERM P-9409PTB762 (1987.5.27) (1987.6.11)FERM BP-1645E.Coli MM294 IFO14979 FERM BP-2690(DE3)/PTB960 (1989.12.12) (1989.12.16)E.Coli MM294 IFO15104 FERM BP-3168(DE3)/PCM901 (1990.10.26) (1990.11.17)此后本发明将以下列实施例详述。当然应理解的是这些实施例的用意不是用来限制本发明的范围。
实施例1制备rhbFGF突变蛋白质CS23的重组体含有为rhbFGF突变蛋白质CS23编码的基因质粒PTB 762经用EcoRI及PstI处理，切去了为rhbFGF突变蛋白质CS23编码的DNA片断，而在此突变蛋白质中四个处于hbFGF中的半胱氨酸残基的69位和87位置上的半胱氨酸残基被丝氨酸残基所取代〔Senoo等人，Biochemical and Biophysical Research Communicatton 151，701-708(1988)，欧洲专利公开281，822〕。然后用EcoRI和PstI将质粒PTB1004(欧洲专利公开336，383)完全消化，在此后该片断被T4DNA连接酶接在此所得到的最大片断上，则构成质粒PTB921。然后质粒PTB921用限制性内切酶EcoRI裂开，使绿豆核酸酶与该产物反应则使其末端变为平齐端，接着用限制性内切酶Bg1II分裂，则得到含有为此rhbFGF突变蛋白质编码基因的DNA片断。另外，载有对T7噬菌体〔F.W.Studier等人，Journal of Molecular Biology 189 113-130(1986)的一种φ10启动子用限制性内切酶裂开，然后该产物用绿豆核酸酶处理则将其末端变成平齐末端，接着再进行与限制性内切酶BamHI的反应。用T4连接酶将含有rhbFGF突变蛋白质CS23的DNA片断连接到所得到的DAN片断上，结果获得表达质粒PTB960(图2)。
E.Coli MM294与λ噬菌体DE3溶源化以制备E.Coli菌株MM294(DE3)，在该噬菌体中插入了该噬菌体的一种RNA聚合酶基因〔F.W.Studier等人，Journal of Molecular Biology 189，113-130(1986)。通过表达质粒PTB960使此E.Coli菌株转化，由此获得带有示于图1的为rhbFGF突变蛋白质CS23编码的基因重组体E.Coli MM294(DE3)/PTB960(IFO14979，FERM BP-2690)。
实施例2将一菌杯量的重组体E.Coli MM294(DE3)/PTB960(IFO14979，FERM BP-2690)接种于30ml的含50mg/l的氨苄青霉素钠的LB培养基(10克/升的细菌胰胨、5克/升的细菌酵母提取液及5克/升的NaCl)中，然后于37℃下摇动培养一整夜。将1.5ml的此培养液移到30ml的M-9培养基中(16.8克/升的Na2HPO4·12H2O、3克/升的KH2PO4、1克/升的NH4Cl、0.5克/升的NaCl及0.246克/升的MgSO4·7H2O)、该培养液中补加15克/升的葡萄糖、15克/升的酪蛋白氨基酸、1毫克/升的盐酸硫胺素及50毫克/升的氨苄青霉素钠，然后在37℃下摇动培养。当该培养物生长到100-120Klett单位的浊度时，加入IPTG以得到多种浓度，然后将此培养继续进行四小时，经离心分离收集细胞并在-20℃下存放。
制备两份相同的样品。向一样品中加7M的盐酸胍，然后使细胞充分散开，接着静置1小时。后经离心分离得到上清液(bFGF突变蛋白质的总量)。向另一样品中加50微克/毫升的溶菌酶溶液(10%的蔗糖、10mM的EDTA、100mM的NaCl、1mM的APMSF及10mM的TriS-HCl，PH＝7.6)，然后将此混合物于4℃下静置1小时。再用超声波破碎法(Kubota Insonater 200M)使这些细胞破碎，接着经离心分离得到一种上清液(有可溶性的hbFGF突变蛋白质)。对这两种经提取的溶液稀释，用一种ELISA方法确定rhbFGF突变蛋白质CS23的量，其结果示于表2。
表2IPTG加入量 rhFGF突变蛋白质 可溶性rhbFGF突变(μm) CS23的累积量 蛋白质CS23的(mg/l) 形成率(%)400 35 13100 41 1275 62 2550 73 2825 81 326.3 96 603.2 15 801.6 ＜5 -如上所示，在小规模培养如曲颈瓶中培养时，可加入少量IPTG范围达到本发明的效果。也就是说，大约加入1mM IPTG则得到
ac启动子。当以100μM或更大的量加入IPTG时，产率低且大部份所需产物以不溶态累积，与此相对照，依据本发明，IPTG以3μM～100μM，特别是以6μM至80μM的范围的量加入时，结果就得到了完全出乎意料的结果，即在产率及以可溶性蛋白质累积比例方面得到显著地提高。
实施例3将含15g/l葡萄糖、15g/l酪蛋白氨基酸、及5mg/l盐酸硫胺素的M-9培养基(PH＝6.8)以2.5升的量置于一个5升容积的发酵罐中，然后进行消毒。再将125ml的菌株培养液(按实施例2中所述方式制备的)接种于该培养基，接着将PH调至6.8，在37℃下，以2.5升/分的流量通气，以1000转/分的搅拌速度下进行培养。当在此培养期间(开始培养后3小时)内浊度达到120Klett单位时，加入IPTG使其量达10μM。开始培养8小时后，再加葡萄糖及酪蛋白氨基酸以使其含量分别为10g/l，培养继续进行总共长15小时。结果rhbFGF突变蛋白质以可溶态累积量达440mg/l。反之，在同样条件下加400μM IPTG，仅产生17.5mg/l的rhbFGF突变蛋白质CS23。
实施例4将用实施例2中所述方式得到的种子培养液转移到一个5升容积的发酵罐中，此罐中装有与实施例3相同的培养基，然后在30℃，PH＝6.8，通气流量为2.5升/分，以1000转/分的速度搅拌条件下开始培养。当培养开始7小时后，浊度达约700个Klett单位时，加入42μM的IPTG。开始培养8.5小时后，在PH＝6.8下加入20g/l的葡萄糖及20g/l酪蛋白氨基酸。由此培养进行36小时。在该培养液中积累了860mg/l的可溶态的rhbFGF突变蛋白CS23。
实施例5将含有15g/l的葡萄糖、15g/l的酪蛋白氨基酸、及5mg/l的盐酸硫胺素的M-9培养基(PH6.8，2.5升)置于一个5升的发酵罐中并消毒。然后将铁离子以表3所示的浓度在经过消毒后加入该罐中。对所得的培养基接种一份125ml的以实施例2中所述方式制备的菌株培养液，接着将PH调至6.8，在30℃、以2.5l/分的流量通气，1000转/分的转速搅拌的条件下进行培养。当培养物生长至大约300个Klett浊度单位时(大约在开始培养后5.5～6小时)，加入IPTG以使其含量达40μM，并在与此同时，将培养温度降至25℃，接着再培养23.5小时。开始培养7～7.5小时后，各自以15g/l的比例加葡萄糖和酪蛋白氨基酸，并在培养过程中将PH值保持在6.8。结果示于表3。
表3铁离子加入量 rhbFGF突变蛋白质CS23产率0 1.002×10-6M 1.429×10-6M 2.603.6×10-5M 2.061×10-4M 1.23(注此铁离子加入量表示的是后加入该培养基中的铁离子量。该产率表示一种重量比，当所加入铁离子量为0时，取该比值为1)实施例6对含有50mg/l的氨苄青霉素钠的1升LB培养基用1ml重组体E.Coli MM294(DE3)/PTB960(IFO14979，FERM BP-2690)的主细胞进行接种，再于30℃摇动培养8小时。将其全部量转至到一个50升容积的盛有20升的LB培养基(含50mg/l的氨苄青霉素钠)的培养罐中，再于30℃、1.0kg/cm2表压的内压下，以10
/分的流量通气，以300转/分的搅拌速度下培养7小时。然后将所得的培养溶液18升移至360升的发酵培养基中(含15g/l的葡萄糖、15g/l的酪蛋白氨基酸、5mg/l的维生素B1及5mg/l的FeSO4·7H2O的M-9培养基)，再于30℃，在1.0kg/cm2G的内压下，以240升/分的流量通气、搅拌速度为250转/分条件下开始培养。当该培养液达到约1000个Klett单位时，以相当于100μM的量加入IPTG，然后将培养温度降至25℃。与此同时，将含18kg葡萄糖、5.4kg的酪蛋白氨基酸的消毒液50升以大约2升/时的速率加入其中，然后继续培养36小时。结果累积得到1.2g/l的可溶态的rhbFGF突变蛋白质CS23。将这样培养成的产物用沙氏离心机分离收集到湿细胞，于-80℃将其冰冻存放。
实施例7纯化rhbFGF突变蛋白质CS23将1kg实施例6中于-80℃冰冻存放的细胞(E.Coli MM294(DE3)/PTB960)悬浮于4升的含25mM磷酸盐缓冲液(PH＝6.0)、0.1mM的对-脒基苯基甲磺酰氟盐酸化物(APMSF)和2mM的二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中。用5升容量的Dynomill型号KD-5仪器(Willybachfen，Switzerland)，采用4升玻璃珠，在冰冷却下将该细胞破碎5个周期。用大约5升的该缓冲液洗此玻璃珠，再将洗液用提取液收集。将所得的大约10升此溶液以10，000转/分的转速进行离心分离(Model 21，Beckman.U.S.A.)长达60分钟，结果得到一种上清液。将所获得的上清液倒入Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo，Japan)柱中(内径25.2cm×50cm)。吸附后用25升25mM的含0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗涤此柱。然后用30升含1M NaCl的25mM的磷酸盐缓冲液(PH＝7.0)完成这洗脱过程。用一台超滤器(Pellicon Casset System，Millipore，U.S.A.)浓缩该洗脱物直至在280nm处的吸光度显示出3～4。将得到的浓缩溶液对大约60升的25mM的磷酸盐缓冲液(PH6.0)进行渗析一整夜。用一台离心机(Beckman.U.S.A.)以4，200转/分的转速分离此渗析物30分钟，则得到一种上清液。将此上清液倒入柱(内径17.0cm×33.0cm，SP-Toyopearl 650M，由Tosoh，日本制造)中。用7升含200mM NaCl的25mM的磷酸盐缓冲液(PH6.0)洗此柱，再用10升，25mM的含500mM NaCl的磷酸缓冲液(PH6.0)进行洗脱。将该洗脱物倒入Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo)柱(15.0cm内径×50.0cm)，使用高性能液相色谱仪(Gilson，France)。通过在20升50mM的柠檬酸盐缓冲液(PH7.0)和30升50mM的含2M NaCl的柠檬酸盐缓冲液(PH7.0)间的线性梯度完成此洗脱。收集主馏份并用10mM的柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)稀释至电导率为mmho或更小。将此被稀释的溶液倒入一种SP-Toyopeal 650M(Tosoh，Japan)的柱(内径14.0cm×39.0cm)中。用10升含0.5M NaCl的25mM的柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)洗此柱，再用10升25mM的含0.5M NaCl的柠檬酸盐缓冲液(PH＝6.0)进行洗脱过程。将此洗脱物倒入Toyopearl HW-50F(Tosoh，Japan)的柱(14.0cm内径×90.0cm)中，再用50mM的柠檬酸(PH7.0)展开。收集主馏分，并通过一台Millipak 20滤器(Millipore，U.S.A.)消毒，则得到一种纯化的rhbFGF突变蛋白质CS23存贮液。产量是17.0克(百分产率为7%)。N-末端氨基酸序列分析、C-末端氨基酸分析及氨基酸组成分析分别示于表4-6中。
表4 N-末端氨基酸序列分析环号 氨基酸残基(Pmol) 由核苷酸序列导出rhbFGF突变蛋白质CS23 的氨基酸(750Poml)1 Pro(530) Pro2 Ala(553) Ala3 Leu(488) Leu4 Pro(433) Pro5 Glu(228) Glu6 Asp(269) Asp7 Gly(370) Gly8 Gly(470) Gly9 Ser(8) Ser10 Gly(328) Gly11 Ala(283) Ala12 Phe(341) Phe13 Pro(181) Pro14 Pro(338) Pro15 Gly(279) Gly16 His(69) His17 Phe(146) Phe18 Lys(264) Lys19 Asp(104) Asp20 Pro(125) Pro
＊用一台Model 477 A蛋白质序列分析仪(应用生物系统)进行分析。
表5 C-末端氨基酸分析C-末端氨基酸 产率(%)Ser 41.0＊ 肼解法＊＊ 用一台6330型氨基酸分析仪(Beckman)分析。
表6 氨基酸组成分析氨基酸 rhbFGF突变蛋白质CS23 理论值Asp/Asn 11.9 12Thr 4.8 5Ser 10.7 12Glu/Gln 12.3 12Pro 9.0 9Gly 14.9 15Ala 9.0 9Cys - 2Val 6.4 7Met 2.1 2Ile 3.8 4Leu 13.3 13Tyr 5.9 7Phe 8.0 8His 3.1 3Lys 14.2 14Arg 10.6 11Trp1)1.1 1- 未鉴定＊ 盐酸水解法＊＊ 用6330型氨基酸分析仪(Beckman)
1)Edelhoch法进而图3示出了在还原条件(100mM DTT，50℃，15分钟)下所得的SDS-PAGE的结果。参见图3，(1)和(2)分别代表该标记和rhbFGF突变蛋白质CS23。
图4示出了用肝素-5PW(Tosoh，Japan)为载体的柱(内径7.5mm×7.5cm)的高性能液相色谱法分析的结果，其操作条件如下洗脱液A溶液〔50mM磷酸盐缓冲液(PH7)〕B溶液〔含2M NaCl的50mM的磷酸盐缓冲液(PH7)〕流速0.8ml/分检测波长280nm。
图5示出了以ODP-50(Asahi Chemical Industry，Japan)作载体的柱(内径4.6mm×150cm)的高性能液相色谱法的分析结果，分析条件如下洗脱液A溶液(0.1%的三氟乙酸)B溶液(含0.1%三氟乙酸的80%的乙腈)流速1.0ml/分检测波长280nm图6示出用G2000SW(Tosoh，Japan)作载体的柱(7.5mm内径×7.5cm)的高性能液相色谱法的分析结果，分析条件如下展开液;0.1M的磷酸盐缓冲液(PH＝7)+0.1M的硫酸钠流速0.5ml/分检测波长280nm生物活性是用这样一种方法鉴定的，即对胎牛犊心内皮细胞的生长促进活性的测定量作为该生物活性的指标。结果给出了与此样品活性相当的一种活性。
实施例8制备具有一种四环素抗性标记的rhbFGF突变蛋白质CS23的重组体含有为rhbFGF突变蛋白质CS23编码的基因质粒PTB 762被AvaI和PstI完全消化，结果得到含有大部分rhbFGF突变蛋白质CS23的大约有0.45K碱基对的DNA片断，在此rhbFGF突变蛋白质CS23中的存在于hbFGF的69位和87位上的四个半胱氨酸残基被丝氨酸残基所取代〔Senoo等人，Biochemical and Biophysical Research Communicalion 151，701-708(1988)，欧洲专利公开NO.281，822〕。用T4DNA连接酶将合成DNA(
)接在所得的片断上，然后将此生成物用AvaI和PstI消化则得到一片断A，在其中，一个PstI卵裂位点被修饰成BglII卵裂位点。此后，质粒PTB955〔已缺失hbFGF的C-末端的为rhbFGF突变蛋白质C128编码的一种基因〔Seno等人，European Journal of Biochemistry，188，239-245，(1990)〕插入其中〕被SalI及BamHI完全消化而得到一种大约4.1K碱基对的片断B。PTB955被AvaI和SalI完全消化，结果得到一个约有390个碱基对的片断C。
用T4DNA连接酶将这三个片断A、B和C连接则得到一种含氨苄青霉素抗性标记的表达质粒PHP901(图7)。
用EcoRI和BglII将PHP901完全消化就得到一个约1.1K碱基对的片断，其含对rhbFGF突变蛋白质CS23编码的一种基因、一个T7启动子和一个T7终止区。用T4DNA连接酶将该片断接到用EcoRI和BamHI完全消化的pUC18上结果获得质粒pME901(图8)。
用EcoRI和HindIII将pME901完全消化则获得一个含有一个为rhbFGF突变蛋白质CS23编码的基因，一个T7启动子和一个T7终止区的约0.77K碱基对的片断。用T4DNA聚合酶孵化该片断以将其末端改变为平齐末端。用T4DNA连接酶将该片断接到经ScaI消化的pBR322上则获得含四环素标记的表达质粒pCM901(图9)。
用噬菌体DE3使E.Coli μM294溶源化以制备E.Coli菌株MM294(DE3)，在噬菌体DE3中插入了该T7噬菌体的RNA聚合酶基因〔F.W.Studier等人，Journal of Molecular Biology，189，113-130(1986)〕。通过用表达质粒PCM901使这种E.Coli菌株转化，由此得到带有该rhbFGF突变蛋白质CS23编码的基因的重组体E.Coli MM294(DE3)/PCM901(IFO15104，FERM BP-3168)。
实施例9用1ml重组体E.Coli MM294(DE3)/PCM901(IFO15104，FERM BP-3168)的主细胞对1升的含5mg/l四环素盐酸化物的LB-培养基进行接种，然后于30℃摇动培养8小时。将其全部量移至盛于一50升容积的培养罐中的20升的LB培养基中(含5mg/l的四环素盐酸化物)，然后在30℃，1.0kg/cm2表压的内压下伴随通气(流量10升/分)及转速为3000转/分的搅拌速度下进行培养直至Klett单位为700。然后将所得的培养液全部移至360升的发酵培养基中(含15g/l的葡萄糖、15g/l的酪蛋白氨基酸、16.8g/l的Na2HPO4·12H2O、3g/l的KH2PO4、1g/l的NH4Cl、0.5g/l的NaCl、0.5g/l的MgSO4·7H2O、5mg/l的盐酸硫胺素、2.5mg/l的FeSO4·7H2O及0.2g/l的防沫剂的M-9培养基)，然后在28℃、1.0kg/cm2表压的内压下，以240l/分的流量通气、250转/分的转速搅拌的条件下开始培养。当该培养液的浊度达约450Klett单位时，向其中加入10mg/l(42μM)的IPTG。由于余量糖浓度为1%，所以加入一种含葡萄糖(60g/l)和酪蛋白水解产物(15g/l)混合物的溶液，然后继续培养40小时。结果累积出可溶态的1.6g/l的rhbFGF突变蛋白质CS23。将这样获得的培养产物用沙氏离心机收集湿细胞，再将该细胞于-80℃下冰冻存放。
用与实施例7相似的方式处理1kg这种所得的细胞，则得到纯化的rhbFGF突变蛋白质CS23原始溶液(产量25.0g)。该溶液的质量在生物活性及物理和化学测定方面均与自实施例7中的样品相当。
权利要求
1.一种含有对一种突变蛋白质编码的核苷酸序列的载体，在该蛋白质中至少一种成人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的组分氨基酸是被另一种氨基酸所取代，且T7启动子位于其上游端。
2.权利要求1的载体，在其中至少一种组分氨基酸是至少一种半胱氨酸的残基，而另一种氨基酸是丝氨酸的残基。
3.权利要求1的载体，在其中该突变蛋白质是一种在成熟的hbFGF组分氨基酸中处于69-和87-位上的半胱氨酸残基被丝氨酸残基所代替的一种突变蛋白质。
4.一种被权利要求1中的载体所转化的转化体。
5.权利要求4的转化体，在其中寄主是处在lac启动子下游端的具有T7聚合酶基因的大肠杆菌(Escherichia Coli)。
6.权利要求5的转化体，它具有E.Coli MM294(DE3)/PCM960的特性。
7.权利要求5的转化体，它具有E.Coli MM294(DE3)/PCM901的特性。
8.制备成熟的hbFGF的至少一种组分氨基酸是被另一种氨基酸所取代的突变蛋白质的方法，它包括在一种培养基中培养权利要求4的转化体。
9.根据权利要求8的方法，在其中按权利要求5中的转化体的对数生长期向该培养基添加约3～500μM的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)，接着进行培养。
10.根据权利要求9的方法，在其中使用3～300μM的IPTG。
11.根据权利要求10的方法，在其中使用6～200μM的IPTG。
12.根据权利要求11的方法，在其中使用6～80μM的IPTG。
13.根据权利要求8的方法，在其中含有突变蛋白质产物的溶液用色谱法提纯，采用一种交联多糖硫酸盐、一种具有一个磺酸基作为交换基的合成聚合物和/或一种用于凝胶过滤的合成聚合物作为载体。
全文摘要
于此公开的是(1)一种含对一种突变蛋白质编码的核苷酸序列的载体，在该突变蛋白质中成人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)中的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，而T7启动子处于其上游端；(2)一种被(1)的载体转化的转化体；(3)制备突变蛋白质的方法，(4)(3)的方法，其中约3～500μm的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷(IPTC)按转化体的对数生长期加于培养基中，(5)(4)的方法，进一步包括纯化过程。
文档编号C07K14/50GK1055009SQ9011011
公开日1991年10月2日 申请日期1990年12月19日 优先权日1989年12月19日
发明者北野一昭, 栗山正人, 西村纪, 五十岚贡一 申请人:武田药品工业株式会社