专利名称：一种新型药物茯苓素的制造方法
茯苓素是从中药茯苓中制备的一组四环三萜类有效成份，其分子量为500左右。
茯苓是我国传统中药，有数百年使用历史，迄今仍沿用人工栽培的菌核作为原料，制成饮片，加入中药方剂里使用，其药物功效据记载主要为利尿逐水，健脾宁心。国内外有关茯苓的研究，目前主要集中在茯苓多糖，包括其制备、结构测定、化学改造、抗肿瘤作用等方面。但是，近十年中有关茯苓素成分的研究尚未见有报导。
本发明的目的，是把茯苓中的有效成分提取出来，通过试验，进一步开发茯苓的药理功能，并按西医方式用于临床解决特定的适应症。
本发明的内容要点1.茯苓素的制备流程1kg茯苓粉，加入4.5195%乙醇，0.510.5N盐酸，搅拌四小时，抽滤，分开滤液和滤饼。
滤饼再加入4.5195%乙醇，0.510.5N盐酸，搅拌四小时，抽滤，滤饼弃去，滤液用于下批原料的提取。
第一次的滤液用10N氢氧化钠溶液约26ml，调PH至7-8之间，减压浓缩(水浴温度为50℃)，浓缩液吹去残余乙醇，调PH至10，过滤，滤液用6N盐酸酸化至PH2.5-3.0，茯苓素即沉淀出来，在冰箱中静置过夜，使沉淀完全，抽滤，用少量水洗沉淀，在真空干燥箱中抽干，研磨成粉末，即得茯苓素制品，收率为千分之二至三。
2.产品质量检测方法(1)、紫外吸收法(定量测定)定量称取样品，用95%乙醇溶解，使测定时的溶液浓度为50μg/ml，放在光径1cm石英比色杯中，在紫外分光光度计上，用243nm波长，测定其吸收度(A)数值，用下面式子计算样品中茯苓素的含量百分比。
样品中茯苓素的百分含量＝[(A值×200)/99.48]×100%茯苓素的A1%1cm(λ243nm)＝99.48(2)、薄层扫描法(成份分析)定量称取样品，用95%乙醇配制成10mg/ml溶液。
制板方法2g硅胶GF254，加7ml0.5%羧甲基纤维素钠，板长20×5cm。
溶媒系统石油醚苯乙酸乙酯乙醇冰乙酸为4640.20.1。
点样用微量注射器点15μl样品于预先制备好的薄层板上。
推进用上述溶媒系统进行扫描岛津薄层扫描仪，扫描条件样品波长240nm参比波长375nm扫描速度80mm/min记录纸速度40mm/min狭缝10×0.4mm扫描结果由打印机直接打出各组份的含量。
(3)、核苷转运法(生物活性)样品制备定量称取产品，用0.15NNaOH溶解，再用6NHCl把PH校正至7.5左右。
小鼠白血病L1210细胞制备L1210细胞在DBA/2小鼠中传代保存，使用时从腹腔抽取生长6-8天的瘤细胞，用199培养液洗三次，每次用1000rpm，30秒钟除去上清液，细胞再用199培养液稀释成107ml-1。
细胞培养管(板)的组成细胞悬液(106细胞) 100μl小牛血清100μl199培养液700μl药物(100-800μg ml-1) 100μl对照组用盐水代替药物。
培养上述培养悬液在37℃下先培养3小时，取出放入37℃恒温水浴中。
同位素参入每管(孔)加入2μCi3H-胸苷，混匀，再于水浴中培养5分钟，取出立即放入冰水浴中。
记数样品抽滤在滤纸片上，用盐水洗6次，再用10%三氯酸洗一次，无水乙醇洗一次，抽干，取出纸片放入记数小瓶内，加入2ml混合闪烁液，在FJ-2100型液体闪烁记数仪上记数，计算不同浓度药物作用下对3H-胸苷参入L1210细胞的抑制率，以药物浓度为横座标，抑制率为纵座标，制图，从图中求出IC50(半数抑制浓度)。茯苓素的半数抑制浓度约为35-37μg/ml(每ml106L1210细胞)。
3、生物活性(1)免疫活化作用在10-15mg/Kg剂量，三天内，茯苓素可以活小鼠巨噬细胞和淋巴细胞。
(2)、抗肿瘤作用a.用35-37μg/ml，三小时，茯苓素可以抑制肿瘤细胞膜对核苷的转运，因此可以抑制肿瘤细胞DNA的合成，体内对肿瘤细胞的生长有一定抑制作用。肉瘤180抑制率70%，艾氏腹水瘤100%。
b.用4-8mg/Kg剂量，十天，茯苓素可与多种抗癌药协同作用，提高对肿瘤的抑制能力。因此有可能发展成为抗癌增效剂。
c.用4-8mg/Kg剂量，十天，茯苓素有升高白细胞的作用，在与抗癌药合用时，可以防止由抗癌药所引起的白细胞减少症。
d.用10-100μg/ml，十天，茯苓素有促进分化作用。经过茯苓素作用过的人白血病HL-60细胞株，不仅形态可以观察到分化现象，细胞酶活性以及细胞功能均有恢复。
(3).改善心率用8-16mg/Kg剂量，十天，茯苓素可以激活细胞膜上Na+K+ATP酶，促进K+的吸收，因此有改善心率失常的作用，可以开发成治疗心律失常的药物。
(4)利尿、消除水肿用8-16mg/kg剂量，十天，动物实验表明，茯苓素可以明显地消除腹水，可以开发成利尿、消水肿药物。
(5).抗过敏作用用60mg/Kg剂量，七天，茯苓素可以促进细胞CAMP的升高，提高CAMP/CGMP的比值。CAMP升高可以抑制组胺(过敏的原发介质)的释放。茯苓素还可以抑制前列腺素的释出。前列腺素是过敏的继发介质。因此，茯苓素抑制过敏反应的作用，在临床上有可能预防或治疗Ⅰ型变态反应。
(6).抗病毒作用用25-50mg/Kg剂量，五天，经茯苓素活化的巨噬细胞，可以明显地抑制疱疹病毒的生长，在体内也观察到它能抑制鸭肝炎病毒的生长。
4、临床前药理研究(毒理学)(1).致死剂量(LD50)小鼠静脉370mg/Kg腹腔670mg/Kg口服>5000mg/Kg。
(2)、亚急性毒性大鼠和狗50，200，500mg/Kg，口服给药二个月，均未见明显毒性反应，组织切片也未见异常。
(3)、实验结果，未观察到致畸、致突、致癌作用。
(4)、一般药理，对呼吸系统、消化系统、循环系统、泌尿系统均没有影响。
本发明的优点和积极效果在于与传统中药茯苓相比，茯苓素不仅可以调节心率、改善睡眠与食欲、消除水肿、预防过敏反应，动物实验表明，单独使用茯苓素还可抑制小鼠肉瘤180、抑制率70%，艾氏腹水癌抑制率100%，肺癌转移模型抑制率40-60%;与多种抗癌药合用，均表现出明显的协同作用，可防止抗癌药引起的白细胞减少症;用鸭肝炎模型实验证明，25-50mg/Kg给药五天，能明显抑制病毒生长;大鼠自身免疫病模型实验证明，单独使用茯苓素对自身免疫病发病抑制率为50%，结合环磷酰胺使用，有效率达100%(单独使用环磷酰胺的抑制率为20-30%)。因此，茯苓素具有明显的适应症，作用较茯苓更为广泛。茯苓素用量为8-50mg/Kg，即成人用量为400mg/天-2500mg/天，直接使用中药茯苓很难达到这样的剂量。
权利要求
1.一种具有抗肿瘤及免疫活化作用的新型药物茯苓素的制造方法，其特征在于所说的方法是采用现代医药学的研究手段，从传统中药茯苓中提取出有效成分四环三萜类化合物。
2.按照权利要求1所述的制造方法，其特征是将1Kg茯苓粉加入4.5L95%乙醇，0.5L0.5N盐酸，搅伴4小时，抽滤，得到除去多糖的乙醇溶液。
3.按照权利要求2所述的制造方法，其特征是将第一次得到的乙醇滤液，用10N氢氧化钠溶液26ml，调PH至7-8之间，减压浓缩(水浴温度为50℃)。
4.按照权利要求3所述的制造方法，其特征是将浓缩液吹去残余乙醇，调PH至10进行过滤，得到茯苓素溶液。
5.按照权利要求4所述的制造方法，其特征是将茯苓素溶液用6N盐酸酸化至PH2.5-3，茯苓素即被沉淀出来。
6.按照权利要求5所述的制造方法，其特征是将茯苓素沉淀放入冰箱静置过液，使其沉淀完全充分，然后抽滤，用少量水洗涤沉淀，在真空干燥箱中干燥，研磨成粉末，即为茯苓素制品，总收率为千分之二至三。
7.按照权利要求6所述的制造方法，其特征是得到的茯苓素制品，可用紫外吸收法测定243nm波长的含量值[(A值×200)/99.48]×100%。
8.按照权利要求6所述的制造方法，其特征是得到的茯苓素制品，可用薄层扫描法测定其成份，扫描结果显示出各组份的百分含量。
9.按照权利要求6所述的制造方法，其特征是得到的茯苓素制品，可用核苷转运法测定其生物活性，结果表明，它的半数抑制浓为35-37μg/ml(每ml106L1210细胞)。
全文摘要
一种具有抗肿瘤及免疫活化作用的新型药物茯苓素，是从传统中药茯苓中提取的有效成分四环三萜类化合物，其制造方法如流程图所示
文档编号C07C13/66GK1035051SQ8810003
公开日1989年8月30日 申请日期1988年1月12日 优先权日1988年1月12日
发明者许津, 马瑜, 吕丁, 黎红 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所