中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K及其应用的利记博彩app
【专利摘要】一种中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K，含有26个氨基酸残基，分子量2613.21Da，理论等电点10.60，序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。在制备抗大肠杆菌药物、抗多重耐药大肠杆菌H1药物、抗肺炎克雷伯氏菌药物、抗粪嗜冷杆菌药物、抗鲍氏不动杆菌药物、抗痢疾志贺氏菌药物、抗金黄色葡萄球菌药物、抗枯草芽孢杆菌药物、抗藤黄微球菌药物中的用途。它具有结构简单、细胞毒性小、人工合成方便等优点。
【专利说明】中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K及其应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽【技术领域】，具体涉及到中国林蛙抗菌肽BreVinin-2CE改造体 B2-N26-V5K。
【背景技术】
[0002] Brevinin-2 抗菌肤是 1992 年在JapanesepondfrogR.brevipoda的皮肤分 泌物中首次被分离出来，近年来在娃的胃部组织中也发现了brevinin-2家族抗菌肽。 Brevinin-2具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、某些真菌具有 非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药菌同样具有作用。除此之外，brevinin-2还具有 刺激胰岛素释放的功能。针对brevinin-2的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备 价值。
[0003] 随着青霉素等传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越 来越强的耐受性，在临床上已经出现了大量完全能够耐受青霉素等传统抗生素的微生物， 已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗 菌肽分子量小于l〇〇〇〇Da，带正电，富含疏水氨基酸残基，能够形成两亲性的结构。到目前 为止，人们认为抗菌肽的杀菌机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细 胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致 细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式 的不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。除此之 夕卜，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁的合成、改 变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的 合成。
[0004] 很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍（Bufo gargarizans),大暖铃蟾（Bombianmaxima),黑斑娃（Pelophylaxnigromaculata),沼娃 (Hylaranaguentheri)和泽娃（Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和 内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇 痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物 的寻找已是新药研发的热点。目前，国外有许多公司正在进行抗菌肽的研发工作，已有多种 抗菌肽进入临床试验阶段。如来源于多粘杆菌的PolymixinB-Colistin-Colomycin用于 治疗革兰氏阴性菌引起的皮肤感染，已上市。来源于非洲爪蟾magainin的MSI-78对糖尿 病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床III期试验阶段。来源于猪protegrin 的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃瘍，已进入临床I期试验。来源于人lactoferrin的 hLF-1-l用于治疗骨髓干细胞移植相关的感染，已进入临床II期。除此之外，一些用于伤口 愈合，内毒素感染，肿瘤，病毒感染的抗菌肽也已进入临床试验阶段。
[0005] 我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要 集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。
[0006] 发明人将本发明的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K全序列氨基 酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有的抗菌活性的中国林蛙抗菌肽 fcevinin-2CE改造体B2-N26-V5K。
[0008] 本发明所要解决的另一个技术问题在于为中国林蛙抗菌肽Brevinin_2CE改造体 B2-N26-V5K提供一种新用途。
[0009]解决上述技术问题所采用的技术方案是：中国林娃抗菌肽Brevinin_2CE改造体， 命名为B2-N26-V5K，含有26个氨基酸残基，分子量2613. 21Da，理论等电点10. 60,序列为 GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL〇
[0010] 其合成方法如下：
[0011] (1)设计中国林娃抗菌肽Brevinin-2CE改造体序列
[0012] 中国林娃Brevinin_2CE的蛋白序列号为GenBank:ADD51562. 1，通过截断 Brevinin-2CE的C端11个氨基酸并将第五位的缬氨酸替换为赖氨酸，设计中国林蛙抗菌肽 fcevinin-2CE改造体，其序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
[0013] (2)合成中国林蛙抗菌肽fcevinin-2CE改造体B2-N26-V5K
[0014] 采用固相合成法，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯 化，得中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体，确定其纯度，应大于95%，用ESI-MS测其分子 量，计算理论等电点。
[0015] 本发明采用截短、替换方法设计Brevinin-2CE的改造体B2-N26-V5K，该抗菌肽 不仅对多种致病菌有非常强的杀灭作用，而且对临床分离的多重耐药菌具有很好的抑制作 用，具有结构简单、细胞毒性小、人工合成方便等有益特点。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于下述的实施例。
[0017] 实施例1
[0018] 中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体，命名为B2-N26-V5K，含有26个氨基酸残 基，分子量 2613. 21Da，理论等电点 10. 60,序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
[0019] 上述中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K的合成方法如下：
[0020] (1)设计中国林娃抗菌肽Brevinin-2CE改造体序列
[0021] 中国林娃Brevinin_2CE的蛋白序列号为GenBank:ADD51562. 1,通过截断 Brevinin-2CE的C端11个氨基酸并将第五位的缬氨酸替换为赖氨酸，设计中国林蛙抗菌肽 Brevinin-2CE改造体的序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL，是一种直链多肽，含有26个 氨基酸残基。
[0022] (2)合成中国林蛙抗菌肽fcevinin-2CE改造体B2-N26-V5K
[0023] 采用固相合成法，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯 化，得中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K，确定其纯度，应大于95%。
[0024] (3)测试分子量、计算理论等电点
[0025] 用ESI-MS测其分子量，分子量为2613. 21Da。
[0026] 用网站http://web.expasy.org/protparam/计算理论等电点，测定结果为：理论 等电点为10. 60。
[0027] 实施例2
[0028] 中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K(以下简称B2-N26-V5K)在制 备抗大肠杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0029] B2-N26-V5K 2000ug
[0030] 注射用水 加至1000mL
[0031] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K2yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0032] 实施例3
[0033] B2-N26-V5K在制备抗多重耐药大肠杆菌H1药物中的用途，其使用方法如下：
[0034] B2-N26-V5K 4000ug
[0035] 注射用水 加至1000mL
[0036] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4iig， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0037] 实施例4
[0038] B2-N26-V5K在制备抗肺炎克雷伯氏菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0039] B2-N26-V5K 8000 ug
[0040] 注射用水 加至1000mL
[0041] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0042] 实施例5
[0043] B2-N26-V5K在制备抗粪嗜冷杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0044] B2-N26-V5K 8000 ug
[0045] 注射用水 加至1000mL
[0046] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8iig， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0047] 实施例6
[0048] B2-N26-V5K在制备抗鲍氏不动杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0049] B2-N26-V5K 15000ug
[0050] 注射用水 加至1000mL
[0051] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K15yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0052] 实施例7
[0053] B2-N26-V5K在制备抗痢疾志贺氏菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0054] B2-N26-V5K 4000ug
[0055] 注射用水 加至lOOOmL
[0056] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0057] 实施例8
[0058] B2-N26-V5K在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0059]B2-N26-V5K 16000ug
[0060] 注射用水 加至1000mL
[0061] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K16yg， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0062] 实施例9
[0063] B2-N26-V5K在制备抗枯草芽孢杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0064] B2-N26-V5K 4000ug
[0065] 注射用水 加至1000mL
[0066] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4iig， 成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
[0067] 实施例10
[0068] B2-N26-V5K在制备抗藤黄微球菌药物中的用途，其使用方法如下：
[0069]B2-N26-V5K 8000ug
[0070] 注射用水 加至1000mL
[0071] 按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8i!g， 成人用量每天肌肉注射每天一次，每次1瓶2mL。
[0072] 为了验证活性成分B2-N26-V5K的有益效果，发明人进行了细胞实验如下：
[0073]1、检测B2-N26-V5K抑菌活性
[0074] 吸取4iiL保存于甘油中的实验菌株接种到4mLMH液体培养基中，30°C或 37°C220rpm震荡培养14-16h至对数生长期，利用稀释平板计数法对培养物进行计数，再用 新鲜的肉汤液体培养基（MHB)稀释到106cfu/mL。
[0075] 利用倍比稀释法配制抗菌肽B2-N26-V5K，取8个离心管，标记为1-8,每管中加入 100iiLMH液体培养基，然后取100iiL200iiM的抗菌肽B2-N26-V5K加入第1管中，混匀后 取100yL加入到第2管中，按照相同方法依次进行倍比稀释，最后从第8管中吸出100yL 液体弃去。
[0076] 向8管含有100iiL抗菌肽B2-N26-V5K中加入已稀释好的菌液100iiL，同时设置 对照组100yL菌液+100i!LMH液体培养基以及100i!L菌液+100i!L1 %TritonX-100,混 匀后放置30°C或37°C220rpm震荡培养18-20h，于595nm波长处测定吸光值。最小抑菌浓 度为看不见细菌生长的最低浓度。结果如表1所示：
[0077] 表 1B2-N26-V5K抗菌活性
[0078]
【权利要求】
1. 一种中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K，其特征在于：它含有26个 氨基酸残基，分子量2613. 21Da，理论等电点10. 60,序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
2. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 大肠杆菌药物中的用途。
3. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 多重耐药大肠杆菌H1药物中的用途。
4. 一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 肺炎克雷伯氏菌药物中的用途。
5. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 粪嗜冷杆菌药物中的用途。
6. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 鲍氏不动杆菌药物中的用途。
7. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 痢疾志贺氏菌药物中的用途。
8. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 金黄色葡萄球菌药物中的用途。
9. 一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗 枯草芽孢杆菌药物中的用途。
10. -种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备 抗藤黄微球菌药物中的用途。
【文档编号】C07K14/46GK104387463SQ201410583120
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】孙燕, 王晓艳, 李治 申请人:陕西师范大学