具有her2亲和性的新多肽的利记博彩app

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【专利摘要】本发明揭示了HER2结合多肽，其包含氨基酸序列EX1 RNAYWEIA LLPNLTNQQK RAFIRKLYDD PSQSSELLX2E AKKLNDSQ，其中位置2的X1是M、I或者L；位置39的X2是S或者C(SEQ ID NO:1)。此外，本发明揭示了包含螯合环境的这种肽。本发明还揭示了包含螯合环境和放射性核素的肽形成的放射性标记的多肽。本发明还揭示了患有或者怀疑患有特征在于HER2过表达的癌症的哺乳动物对象身体的体内成像方法，所述方法包括给予这种放射性标记的多肽，随后使用医学成像设备获得身体图像；本发明还揭示了治疗这种癌症的方法。此外，本发明还揭示了这种放射性标记的多肽在诊断和治疗特征在于HER2过表达的癌症中的应用。本发明还揭示了编码所述多肽的核酸、包含所述核酸的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。
【专利说明】具有HER2亲和性的新多肽
[0001] 本申请是申请日为2008年12月22日，申请号为200880126835. 4,发明名称为"具 有HER2亲和性的新多肽"的申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及结合人表皮生长因子受体2 (在后文称作HER2)的新多肽。本发明还 涉及这种HER2结合多肽作为诊断剂和/或药物的应用，特别是其作为诊断和/或治疗特 征在于HER2过表达的癌症的诊断剂和/或药物的应用。
[0003] 置量
[0004]HER2及其在癌症疾病中的作用
[0005]HER2原癌基因编码已知产生称作HER2蛋白或者受体的185kDa细胞表面受体蛋 白（HynesNEetal(1994)BiochimBiophysActa1198:165-184)。这个基因有时也称 作neu、HER2/neu或者c-erbB-2。Neu首先在已经用乙基亚硝基脲治疗的大鼠中发现，并 表现为这个基因突变（ShihCetal(1981)Nature290:261-264)。突变形式的neu导致 组成型活性形式的受体产生，且组成可在低拷贝数转化细胞的强力致癌基因（HynesNEet al,supra)〇
[0006] 正常细胞以组织特异性方式在其浆膜上表达少量HER2蛋白。目前没有已知的 HER2配体；然而，HER2已经示出与HERl(表皮生长因子受体，EGFR)、HER3和HER4形成异 源二聚体，与这些受体的配体复合。这种异源二聚体形成使得激活的HER2受体从细胞外部 向细胞核传递生长信号，因此控制正常细胞生长和分化（SundaresanSetal(1999)Curr OncolRepl:16-22)。
[0007] 在肿瘤细胞中，DNA复制系统中的错误可导致一个染色体上存在多个基因拷贝， 这是已知称作基因扩增的现象。HER2基因的扩增导致这个基因的转录增加。这样提高了 HER2mRNA水平及增加伴随的HER2蛋白合成增加，由此导致HER2蛋白在这些肿瘤细胞表面 上过表达。这种过表达可导致HER2蛋白水平与在相邻的正常细胞中的发现的那些表达水 平高10-100倍。由此导致细胞分化增加及伴随的较高的细胞生长速度。HER2基因的扩增 参与正常细胞转化为癌症表型（HynesNEetal,supra;SundaresanSetal,supra)。
[0008] 据认为HER2蛋白的过表达导致HER2的同源二聚体形成，这导致组成型活性受体 形成（SliwkowskiMXetal(1999)SeminOncol26(4Suppll2) :60-70)。在这些条件下， 生长促进信号在不存在配体的情况下可以持续地传递进细胞中。因此，多个细胞内信号转 导途径被激活，导致不受控制的细胞生长，以及在一些情况中出现致癌转化（HynesNEet al，supra)。因此，由生长因子受体介导的信号转导机制是抑制细胞复制和肿瘤生长的重要 靶位。
[0009] 乳腺癌在美国是女性最常见的恶性肿瘤，在2001年新增病例已经是192200 例（GreenleeRetal(2001)CACancerJClin51:15-36)。在大约 25 % 的所有乳 腺癌患者中，均存在HER2基因由于其扩增而过表达（SlamonDJetal(1989)Science 244:707-712)。HER2蛋白的这种过表达与一些阴性预后变量相关，包括雌激素受体阴性 状态、高s-期细胞比值（highs-phasefraction)、阳性淋巴结转移（positivenodal status)、突变的p53 以及高核级别（highnucleargrade)(SjogrenSetal(1998)JClin Oncol16(2) :462-469)。根据Slamon等（如前）所述，发现HER2基因的扩增与淋巴结阳 性转移患者的缩短的无疾病存活期和缩短的整体存活期明显相关。
[0010] 为此，重要的目标是继续进一步研究HER2在乳腺癌的发病机制和治疗中的作用。 与HER2相互作用的分子的鉴别是这项研究的一部分。
[0011] 临床前体外研究检验了HER2活性抑制是否能影响肿瘤细胞生长。用4D5, 一些鼠 抗HER2单克隆抗体之一，治疗过表达HER2蛋白的SK-BR-3乳腺癌细胞，与用对照的单克隆 抗体治疗相比，确实抑制肿瘤细胞增殖。给予具有过表达HER2的人乳腺癌和卵巢癌（异种 移植）的小鼠4D5延长其无肿瘤存活时间。相似的研究证实在小鼠中人胃癌异种移植物的 生长被抗-HER2 单克隆抗体抑制（PietrasRJetal(1994)Oncogene9:1829-1838)。
[0012] 在抑制肿瘤细胞表面大量存在的HER2蛋白的方法中，一种治疗方法在近年来已 经可商购。因此，单克隆抗体4D5的人源化变体或者trastuzumab为此由F Hoffman-La Roche和Genentech以Herceptill?商标销售。
[0013] 因此已经针对乳腺癌描述了HER2的过表达。其与卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺 癌、肺癌（Holbroetal·，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 2004. 44:195-217)以及食管癌 (Ekmanetal·，Oncologist2007 ;12 ;1165-1177,具体参见第 1170-1171 页）也相关。
[0014] 尽管抗体在治疗特征在于HER2蛋白过表达的癌症中显示了明显优势，但是仍 存在各种因素具有降低抗体效力的可能性的事实（见例如ReillyRMetal(1995)Clin Pharmacokinet28:126-142)。这些因素包括：（1)所述抗体穿透大的实体肿瘤或者穿透 重要区域如脑的通透性有限；（2)所述抗体由于血管通透性降低而外渗进靶位点的能力降 低；（3)抗体与正常组织的交叉反应性和非特异性结合降低靶效应；(4)异质肿瘤吸收导致 未得治疗带；（5)注射的抗体代谢增加降低治疗效力；以及^)HAM与人抗人抗体的快速形 成使治疗性抗体失活。
[0015] 此外，毒性作用在癌症的治疗性抗体的开发中具有很大障碍（Carter P(2001) Nat Rev Cancer 1: 118-129 ；Goldenberg DM(2002)J Nucl Med43:693-713 ；Reichert JM(2002)Curr Opin Mol Ther 4:110-118)。与健康组织的交叉反应性可导致未缀合的 (裸）抗体的副作用，这种副作用在抗体与毒素或者放射性同位素缀合时可额外增强。免疫 介导的并发症包括肺毒性反应的呼吸困难，偶尔的中枢和周围神经系统并发症，以及肝功 和肾功衰退。有时可以见到预料之外的毒性并发症，如HER2祀向抗体trastuzumab相关的 心脏毒性反应（Schneider JW et al (2002) Semin Oncol 29 (3suppl 11) :22-28).使用同位 素缀合的抗体进行的放射性免疫治疗也可以导致骨髓抑制。
[0016] 尽管近年来目前使用的抗癌抗体取得了临床和商业上的成功，但是关于抗体使用 前景仍存在许多重要问题。因此，继续提供具有相当HER2亲和性的制剂以及提供这种分子 在诊断和治疗疾病中的应用仍是本领域的一个重要议题。
[0017]HER2结合Z变体分子
[0018] 使用不同的相互作用靶位，从这种分子的随机化文库中选择衍生自金黄色 葡萄球菌A蛋白（SPA)的B结构域的蛋白质Z相关的分子（NilssonBetal(1987) ProteinEngineering1,107-133)(见例如W095/19374;NordKetal(1997) NatureBiotechnology15, 772-777 ；W02005/000883 ；W02005/075507 ；W02006/092338 ；W02007/065635)。
[0019] 在W02005/003156中，揭示了具有与HER2相互作用的能力的大量Z变体。
[0020] 发明福示
[0021] 本发明的一个目的是通过提供特征在于与HER2特异性结合的多肽满足持续提供 具有HER2亲和性的物质的需求。
[0022] 本发明的一个相关目的是HER2结合多肽，其显示较少或者无非特异性结合。
[0023] 本发明的另一目的是提供HER2结合多肽，其可易于用作融合多肽中的一部分。
[0024] 本发明的另一目的是提供HER2结合多肽，其解决了与现有抗体试剂相关的一或 多个已知问题。
[0025] 本发明的另一目的是提供HER2结合多肽，其适用于治疗性应用中。
[0026] 本发明的另一目的是提供HER2结合多肽，其适用于诊断性应用中。
[0027] 本发明的一个相关目的是在特征在于HER2蛋白过表达的癌症疾病的临床背景中 发现治疗、抑制和/或靶向的新形式。
[0028] 本发明的另一方面是提供HER2结合多肽，其易于由化学肽合成方法合成。
[0029] 本发明的一个相关目的是发现HER2结合多肽，其与已知的HER2结合剂相比呈现 出改良的稳定性。
[0030] 本发明的再一目的是获得HER2结合多肽，其在体内用于哺乳动物时呈现出低抗 原性。
[0031] 本发明的另一目的是提供HER2结合多肽，其在给予哺乳动物时具有改良的生物 分布性。
[0032] 本发明的这些及其它目的由所附权利要求所要求的本发明的不同方面符合。因 此，第一方面，本发明提供了多肽，其具有包含如下序列的氨基酸序列：
[0033]EX1RNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0034] 其中位置2的X1是Μ、I或者L，位置39的X2是S或者C(SEQIDNO: 1)，
[0035] 或者在一些情况中，更优选
[0036]YAKEX1RNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0037] 其中位置5的X1是11或者L，位置42的X2是S或者C(SEQIDNO:2)，
[0038] 或者在一些情况中，更优选
[0039]AeaKYAKEX1RNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSEL·LX2EAKKLNDSQ
[0040] 其中位置9的X1是Μ、I或者L，位置46的X2是S或者C(SEQIDNO: 3)，
[0041] 或者在一些情况中，更优选
[0042]EseKYAKEX1RNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0043] 其中位置9的X1是Μ、I或者L，位置46的X2是S或者C(SEQIDNO:4)。
[0044] 据此，本发明人发现例如与在W02005/003156中揭示的HER2结合多肽相比，包含 SEQIDNO: 1-4任一序列的多肽呈现出令人惊奇的优势，同时保留这些前述描述的多肽的 结合靶HER2的能力。由本发明的多肽的一或多个实施方案呈现出的这些优势的非限制性 实例如下所述：
[0045] ?本发明的多肽包含更少的在多肽序列的化学合成中可导致如低产量和成功率等 问题的氨基酸，如天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸和甲硫氨酸。
[0046] ?本发明的多肽包含更少的赋予表面疏水性的氨基酸残基，因此与先前描述的相 关的HER2结合多肽相比具有更亲水性谱。这意味着具有更少的低溶解性和聚集的问题。不 受理论的限制，目前也认为更亲水性特性作用于在给予宿主时改变多肽的生物分布性，从 肝胆途径（通过肝脏排泄）转向更希望的肾排泄途径（通过肾排泄）。
[0047] ?本发明的多肽包含更少的与多肽稳定性问题相关的氨基酸残基，如甲硫氨酸、 天冬酰胺和二肽天冬酰胺-脯氨酸。甲硫氨酸易于氧化，天冬酰胺易于去酰胺化，天冬酰 胺-脯氨酸键易于裂解，因此其导致终产物的非均质性。
[0048] ?本发明的多肽缺少在相似的序列中已发现增加与含有VH3重链可变结构域的免 疫球蛋白相互作用的氨基酸残基（SilvermanG.J.，Int.Rev.Immunol. 1992 ;9 (I) : 57-78)。 不受理论的限制，目前认为本发明的多肽中这些氨基酸残基的置换在将该多肽给予宿主时 降低了多肽的抗原性。
[0049] 本发明的多肽具有替代HER2抗体的不同的应用。作为非限制性的例子，它们可用 于治疗特征在于HER2过表达的癌症、通过结合细胞表面上的HER2而用于抑制细胞发信号、 用于在体内和体外诊断特征在于HER2过表达的癌症、用于将药剂靶向过表达HER2的细胞、 用于检测HER2的组织化学方法中，以及用于分离及其它应用方法中。本发明的多肽可用于 依赖于试剂的HER2亲和性的任何方法中。因此，所述多肽在这种方法中可用作检测试剂、 捕获试剂或者分离试剂，用作诊断剂以在体内或者在体外进行诊断，或者自身用作治疗剂 或者用作靶向HER2蛋白的其它治疗剂或者诊断剂的工具。在体外应用本发明的多肽的方 法可以不同形式进行，如在微滴定平板中、在蛋白质阵列中、在生物传感器表面上、在组织 切片上等。
[0050] 在不偏离本发明范围的条件下，可以对本发明的多肽进行不同的修饰和/或添 力口，以使所述多肽适于特定用途。这种修饰和添加在下文更详细描述，包括在相同多肽链中 包含的额外氨基酸，或者与本发明的多肽化学缀合的或者另外方式结合的标记和/或治疗 剂。
[0051] 短语"HER2结合亲和性"、"HER2结合"等是指多肽的通过例如使用表面等离子共 振技术如Biacore?'设备（GEHealthcare)可以检测的性质。HER2结合亲和性可以在实验 中检测，其中HER2或者其片段如胞外结构域或者其融合蛋白固定在该设备的传感器芯片 上，使含有待检测的多肽的样品经过该芯片。或者，将待检测的多肽固定在该设备的传感器 芯片上，使含有HER2或者其片段如胞外结构域的样品经过该芯片。然后技术人员解释获得 的传感图，以确定该多肽的HER2结合亲和性的至少定性测量。如果尝试定量测量，例如为 了确定相互作用的某KD值，也可以使用表面等离子共振技术。结合值可例如在Biacore? 2000设备（GEHealthcare)中限定。HER2或者其片段如胞外结构域固定在设备的传感器 芯片上，通过系列稀释制备待确定其亲和性的多肽样品并以随机顺序注射。然后从结果中 计算KD值，使用例如由设备生产商提供的BIAevaluation3. 2软件的I:ILangmuir结合模 式进行。
[0052] 本发明还涵盖了这样的多肽，其中上述HER2结合多肽以HER2结合结构域形式存 在，在其每一末端已经添加额外的氨基酸残基。这些额外的氨基酸残基在该多肽与HER2的 结合中可起作用，但是在一些其它目的中可以相同地起作用，例如多肽的生产、纯化、稳定 化、偶联或者检测等一或多个目的中。这些额外的氨基酸残基可包含为了进行化学偶联而 添加的一或多个氨基酸残基。一个实例是在多肽链的第一位或者最后一位即在N末端或 者C末端添加半胱氨酸残基。用于化学偶联的半胱氨酸残基也可通过置换该蛋白质结构域 表面上的另一氨基酸而导入，优选在不参与靶向结合的表面部分。这种额外的氨基酸残基 也可包含"标记"以纯化或者检测所述多肽，如六组氨酸（His6)标记，或者"myc"标记或者 "FLAG"标记以与特异于该标记的抗体相互作用。本领域技术人员知道其它选择。
[0053] 在具有额外的氨基酸残基的多肽的一个具体实施方案中，本发明提供了包含如下 氨基酸序列的HER2结合多肽：
[0054]AEAKYAKEMRNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPKVD C(SEQIDNO:5) 〇
[0055] 在具有额外的氨基酸残基的多肽的另一个具体实施方案中，本发明提供了包含如 下氨基酸序列的HER2结合多肽：
[0056] ESEKYAKEMR NAYffEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK(SEQ ID N0:6)。
[0057] 上述"额外的氨基酸残基"也组成具有任何希望功能的一或多个多肽结构域，如与 第一个HER2结合结构域相同的结合功能，或者另一种结合功能，或者酶功能，或者荧光功 能，或者其混合物。
[0058] 因此，本发明涵盖了包含SEQIDNO: 1-6所示任何序列的多肽的多聚体。令人感 兴趣地是例如当使用本发明的多肽诊断或者治疗癌症或者用于纯化HER2的方法中时，获 得更强于本发明的一种多肽与HER2的结合。在这种情况中，所述多肽的多聚体如二聚体、 三聚体或者四聚体可提供必要的亲和性作用。所述多聚体可由适当数目的本发明的多肽组 成。在本发明的多聚体中连接的多肽"单位"可以通过使用已知的有机化学方法共价结合 连接，或者在多肽重组表达系统中表达为一或多个融合蛋白，或者以任何其它方式直接或 者通过接头如氨基酸接头结合。
[0059] 此外，本发明还涉及"异种"融合多肽，其包含在本发明范围内，其中包含SEQID NO: 1-6所示任意序列的多肽组成第一个结构域或者第一部分，第二部分以及其它部分具 有除了结合HER2之外的其它功能。所述融合多台的第二部分及其它部分可包含具有除了 HER2之外另一靶分子亲和性的结合结构域。结果是融合多肽具有至少一个HER2结合结构 域以及具有所述其它靶分子亲和性的至少一个结构域。这使得可以产生可用于不同生物技 术应用中的多特异性的试剂，如用作治疗剂或者用作捕获、检测或者分离试剂。其中至少 一个多肽结构域包含SEQIDNO: 1-6所示任意序列的这种多特异性多肽多聚体的制备，可 以如上文针对一些HER2结合"单位"的多聚体所述实现。所述第二部分或者其它部分可以 是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白质A的结构域的变体，如"Z结构域"或者"蛋白质Z"的变体 (NilssonBetal(1987)，supra),或者包含具有祀亲和性的不相关的天然发生的或者重组 的蛋白质（或者其保留天然发生的或者重组蛋白质的结合能力的片段）。具有人血清白蛋 白亲和性及可用作本发明多肽的融合配体这种结合蛋白的实例是链球菌菌株G148(Nygren P-Aetal(1988)MolRecogn1:69-74)的蛋白质G的白蛋白结合结构域之一，如GA1、GA2 或者GA3结构域。蛋白质G的GA3结构域也称作ABD，即白蛋白结合结构域。包含SEQID NO: 1-6所示任意序列的HER2结合多肽与链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域之间的融合 多肽因此包含在本发明范围内。当将本发明的多肽作为诊断剂、治疗剂或者靶向剂给予人 时，其与结合血清白蛋白的部分的融合蛋白在体内半衰期方面可提供益处，这种融合蛋白 与分离的HER2结合部分相比其半衰期延长（这个原理已经在例如W091/01743中描述）。 同样，根据在W02005/097202中阐释的原理，所述融合多肽可以呈现出比分离的HER2结合 部分低的免疫原性。
[0060] 本发明也涵盖了产生融合多肽的其它可能性。因此，根据本发明第一方面的多肽 可以与第二部分或者其它部分共价结合，其除了靶向结合之外还呈现出其它功能，或者代 替靶向结合而呈现出其它功能。一个实例是包含SEQIDNO: 1-6所示任意序列的一或多个 多肽与作为报道或者效应部分的酶活性多肽之间的融合蛋白。可以与包含SEQIDNO: 1-6 所示任一序列的多肽偶联形成融合蛋白的报道酶的实例为本领域技术人员已知，包括如 β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、羧肽酶。本发明的融合多肽的第二部分及其 它部分的其它选项包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶及其变体。
[0061] 本发明的融合多肽的第二部分及其它部分的其它选项包括治疗性应用部分。在治 疗性应用中，其它分子也可以通过其它方式与本发明多肽共价或者非共价偶联。非限制性 实例包括酶的ADEPT(抗体定向的酶前药治疗）应用，使用本发明的多肽定向效应酶（例 如羧肽酶）；蛋白质，用于补充免疫系统的效应细胞及其它成分；细胞因子，如IL-2、IL-12、 TNFa、IP-10 ;促凝因子，如组织因子、v〇nWillebrand因子；毒素，如蓖麻毒素A、假单胞菌 外毒素、calcheamicin、maytansinoid;毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素。
[0062] 关于上文对于掺入本发明的HER2结合多肽的融合蛋白的描述，应注意第一部分、 第二部分及其它部分的名称是为了清晰起见而命名，用以一方面在HER2结合部分之间加 以区分，以及另一方面区分呈现其它功能的部分。这些名称不是指融合蛋白的多肽链中不 同结构域的实际顺序。因此，例如所述第一部分不限于在融合蛋白的N末端、中间或者在C 末端。
[0063] 本发明涵盖了这样的多肽，其中为上述HER2结合多肽提供标记基团，如至少一个 荧光团、生物素或者放射性同位素，例如用以检测所述多肽。特别地，本发明涵盖了放射性 标记的多肽，其由上述HER2结合多肽与放射性核素如放射性金属的放射性螯合物组成。 [0064] 大多数放射性核素具有金属性质，且金属与蛋白质和肽中存在的元素典型不能形 成稳定共价键。为此，使用螯合剂、多配位基配体（multidentateligand)，用放射性金属标 记靶向蛋白质，与该金属形成称作螯合物的非共价化合物。在本发明多肽的一个实施方案 中，掺入放射性核素可以通过提供螯合环境使得该放射性核素可以与所述多肽配位、螯合 或者复合。
[0065] 本发明多肽的一个具体的实施方案中，其包含特征为N3S螯合剂的四配位基螯合 环境。术语N3S是指这个螯合剂的四个附着的基团由三个氮原子和一个硫原子形成。在N3S螯合剂中，N和S原子在空间上排列为提供合适的" 口袋"，用于放射性金属的复合或者附 着。
[0066]在一些实施方案中，根据本发明的HER2结合多肽可进一步包含与其N末端偶联的 巯基乙酰基，其中通过N末端的前三个连续肽键的氮原子以及巯基乙酰基的SH基团一起提 供了由N3S螯合剂基序组成的螯合环境。
[0067]在一些实施方案中，根据本发明的HER2结合多肽的N末端的前三个连续肽键可由 残基ESE的氨基基团提供。
[0068] N3S螯合剂可以通过适当选择多肽的氨基酸序列中的氨基酸残基而提供。
[0069]例如，N3S螯合环境可以通过巯基乙酰基与本发明多肽的N末端偶联而提供。在 这个实施方案中，巯基乙酰基提供了必需的S原子，而肽主链中前三个N原子组成四配位基 螯合剂的三个N原子。优选地，巯基乙酰基与包含SEQIDNO:4所示氨基酸序列为大多数 N-末端氨基酸序列的多肽偶联，产生包含如下氨基酸序列的多肽：
[0070] IiiaESEKYAKEX1RNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0071] 其中ma是巯基乙酰基，位置9的X1是11或者L，位置46的X2是S或者C。在特 别优选的实施方案中，所述多肽具有如下序列：
[0072]maESEKYAKEMRNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
[0073] 其中ma是巯基乙酰基（SEQIDN0:7)。
[0074] 在一些实施方案中，根据本发明的HER2结合多肽可包含半胱氨酸残基，所述半胱 氨酸残基已经存在于序列中或者作为额外的氨基酸残基或者通过置换不参与HER2结合的 表面暴露的氨基酸残基。优选地，所述半胱氨酸残基可位于SEQIDN0:5的C末端，或者所 述额外的半胱氨酸可位于SEQIDN0:l-4或者6-7任一序列的C末端，其中所述半胱氨酸 残基任选随后是一或多个其它氨基酸残基，且由半胱氨酸和两个前面的氨基酸残基组成的 一段氨基酸残基序列的三个连续肽键的氮原子以及半胱氨酸残基的SH基团一起提供了由 N3S螯合剂基序组成的螯合环境。优选地，根据本发明的HER2结合多肽可包含由通过硫醇 基团与所述多肽偶联的聚氨基聚羧酸酯螯合剂提供的螯合环境。更优选地，所述聚氨基聚 羧酸酯螯合剂可以是1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸或者其衍生物。更优 选地，所述聚氨基聚羧酸酯螯合剂可以是二乙烯三胺五乙酸或者其衍生物。
[0075] 在另一个实施方案中，三个N基团可以由多肽链中三个连续肽键的N原子提供，最 后一个是半胱氨酸残基，其包含在其侧链上的SH基团。半胱氨酸侧链的S原子组成N3S螯 合剂中的S原子。换句话说，N3S螯合剂是三肽序列XXC形式，其中X是任何氨基酸残基。 这种三肽序列可最初包含于本发明的多肽中或者作为一或多个额外的氨基酸添加而包含 于本发明的多肽中。优选半胱氨酸残基位于SEQIDN0:5的C末端或者一额外的半胱氨酸 直接位于SEQIDNO: 1-4或者6-7任一序列的C末端。所述半胱氨酸残基也可以后接一或 多个其它氨基酸残基。
[0076] 本发明的多肽包含特征为N3S螯合剂的四配位基螯合环境，由与N末端偶联的 巯基乙酰基和三个连续肽键的氮原子提供，或者由三个连续肽键的氮原子与在多肽C末 端的半胱氨酸残基提供，所述多肽可用于提供由HER2结合多肽与放射性核素的放射性 螯合物组成的放射性标记的多肽，所述放射性核素适于医学成像，例如是99mTc(Engfeldt etal(2007)Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging34 (5) : 722-22；Engfeldtetal(2007)Eur. J.Nucl.Med.Mol.Imaging34(11) :1843-53),或者所述放射性核素适于治疗，选自186Re和 188Re。在一些实施方案中，放射性核素通过螯合环境与HER2结合多肽复合。
[0077] 当本发明的多肽包含两个、三个或者更多个XXC三肽时，优选末端那个用于与放 射性核素复合。当所述多肽以此方式放射性标记时，其它XXC三肽优选被保护。
[0078] 本发明的放射性标记的多肽的一个特别优选的实施方案是具有如下氨基酸序列 的HER2结合多肽与99mTc的放射性螯合物：
[0079]maESEKYAKEMRNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
[0080] 其中ma是巯基乙酰基（SEQIDN0:7)。
[0081] 使用多肽在N末端的maESE-或者在C末端的-VDC螯合的99mTc的假定结构分别 是：
[0082]
【权利要求】
1. HER2结合多肽，其包含氨基酸序列 EX^NAYWEIA LLPNLTNQQK RAFIRKLYDD PSQSSELLX2E AKKLNDSQ, 其中位置2的乂1是11或者L，位置39的&是3或者C(SEQ ID N0:1)。
2. 权利要求1的HER2结合多肽，其包含氨基酸序列 YAKEXiRNAYff EIALLPNLTN QQKRAFIRKL YDDPSQSSEL LX2EAKKLNDS Q 其中位置5的乂1是11或者L，位置42的&是3或者C(SEQ ID N0:2)。
3. 权利要求1或2的HER2结合多肽，其包含氨基酸序列 AEAKYAKEXiR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLX2EAKK LNDSQ 其中位置9的乂1是11或者L，位置46的&是3或者C(SEQ ID N0:3)。
4. 权利要求1或2的HER2结合多肽，其包含氨基酸序列 ESEKYAKEXiR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLX2EAKK LNDSQ 其中位置9的Xi是1 I或者L，位置46的X2是S或者C(SEQ ID N0:4)。
5. 权利要求3的HER2结合多肽，包含氨基酸序列 AEAKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPKVD C(SEQ ID NO:5)〇
6. 权利要求4的HER2结合多肽，其包含氨基酸序列 ESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLSEAKK LNDSQAPK (SEQ ID NO:6)〇
7. 权利要求1-6任一项的HER2结合多肽，其进一步包含与其N末端偶联的巯基乙酰 基，其中通过N末端的前三个连续肽键的氮原子以及巯基乙酰基的SH基团一起提供了由 N3S螯合剂基序组成的螯合环境。
8. 权利要求7的HER2结合多肽，其中N末端的前三个连续肽键由残基ESE的氨基基团 提供。
9. 权利要求6-8任一项的HER2结合多肽，其具有序列：maESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLSEAKK LNDSQAPK 其中ma是巯基乙酰基（SEQ ID NO:7)。
10. 权利要求1-6任一项的HER2结合多肽，其包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基已 经存在于序列中或者作为额外的氨基酸残基或者通过置换不参与HER2结合的表面暴露的 氨基酸残基。
11. 权利要求10的J1ER2结合多肽，其中所述半胱氨酸残基位于SEQ ID N0:5的C末 端，或者所述额外的半胱氨酸位于SEQ ID N0:l-4或者6-7任一序列的C末端，其中所述半 胱氨酸残基任选随后是一或多个其它氨基酸残基，且其中螯合环境由N3S螯合剂基序组成， 所述基序由半胱氨酸和两个前面的氨基酸残基组成的一段氨基酸残基序列的三个连续肽 键的氮原子以及半胱氨酸残基的SH基团一起提供。
12. 权利要求10的HER2结合多肽，其包含由通过硫醇基团与所述多肽偶联的聚氨基聚 羧酸酯螯合剂提供的螯合环境。
13. 权利要求12的HER2结合多肽，其中所述聚氨基聚羧酸酯螯合剂是1，4, 7, 10-四氮 杂环十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸或者其衍生物。
14. 权利要求13的HER2结合多肽，其中所述1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1，4, 7, 10-四 乙酸衍生物是1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1，4, 7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺。 15. HER2结合多肽，其由与1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1，4, 7-三-乙酸-10-马来酰 亚胺乙基乙酰胺偶联的SEQ ID NO:5组成。
16. 权利要求12的HER2结合多肽，其中所述聚氨基聚羧酸酯螯合剂是二乙烯三胺五乙 酸或者其衍生物。
17. 由权利要求7-9和11任一项的HER2结合多肽的放射螯合物（radiochelate)和放 射性核素组成的放射标记的多肽，其中所述放射性核素适于医学成像、是"mTc，或者所述放 射性核素适于治疗、选自186Re或者188Re。
18. 由权利要求9的HER2结合多肽的放射螯合物与99mTc组成的放射标记的多肽。
19. 由权利要求12-16任一项的HER2结合多肽的放射螯合物与放射性核素组成的放射 标记的多肽，其中所述放射性核素适于医学成像，选自61Cu、64CU、 66Ga、67Ga、68Ga、n°mIn、 mIn、44Sc和86Y，或者所述放射性核素适于治疗，选自225AC、 212Bi、213Bi、67Cu、166H〇、 mLu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th和9°Y，其中所述放射性核素通过螯合环境与HER2结合多肽复合。
20. 由权利要求15的HER2结合多肽的放射螯合物与mIn组成的放射标记的多肽。
21. 由通过接头分子与放射性核素连接的权利要求10的HER2结合多肽组成的放射标 记的多肽，所述放射性核素适于医学成像和/或治疗，选自211At、76Br、18F和碘同位素组成的 组。
22. 患有或者怀疑患有特征在于HER2过表达的癌症的哺乳动物包括人对象的身体的 体内成像方法，包括如下步骤： -将权利要求17-21任一项的放射性标记的多肽给予哺乳动物对象身体内，其中所述 放射性核素适于成像； -在给予所述放射性标记的多肽1-72小时内，使用医学成像设备获得对象身体至少一 部分的一或多个图像，所述图像示出身体内所述放射性核素的存在。
23. 权利要求22的方法，包括在给予步骤之前制备权利要求17-21任一项的放射性标 记的多肽的步骤，其中所述放射性核素适于成像，所述步骤包括混合权利要求10-16任一 项的多肽与合适的放射性核素。
24. 权利要求22的方法，包括在给予步骤之前制备权利要求18的放射性标记的多肽的 步骤，所述步骤包括混合权利要求9的多肽与99mTc。
25. 权利要求22的方法，包括在给予步骤之前制备权利要求20的放射性标记的多肽的 步骤，所述步骤包括混合权利要求15的多肽与mIn。
26. 权利要求22-25任一项的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、 唾液腺癌、肺癌和食管癌（cancer in the esophagus)。
27. 权利要求17-21任一项的放射性标记的多肽，其中所述放射性核素适于成像，所述 放射性标记的多肽用于诊断。
28. 权利要求17-21任一项的放射性标记的多肽，其中所述放射性核素适于成像，所述 放射性标记的多肽用于诊断属于特征在于HER2过表达频繁出现的癌症的组的癌症。
29. 权利要求17-21任一项的放射性标记的多肽，其中所述放射性核素适于成像，用于 癌症的诊断和/或分子学鉴定，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺 癌和食管癌。
30. 权利要求17-21任一项的放射性标记的多肽用于制备对哺乳动物包括人对象的身 体进行体内成像的诊断剂的应用，其中所述放射性核素适于成像。
31. 治疗患有特征在于HER2过表达的癌症的哺乳动物对象包括人的方法，所述方法包 括将治疗有效量的权利要求17、19或者21的放射性标记的多肽给予对象身体内，其中所述 放射性核素适于治疗。
32. 权利要求31的方法，包括在给予步骤之前制备权利要求17、19或者21的放射性标 记的多肽的步骤，其中所述放射性核素适于治疗，包括混合权利要求10-16任一项的多肽 与合适的放射性核素。
33. 权利要求31或者32的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液 腺癌、肺癌和食管癌。
34. 权利要求17、19或者21的放射性标记的多肽，其中所述放射性核素适于治疗，所述 放射性标记的多肽用于治疗中。
35. 权利要求17、19或者21的放射性标记的多肽，其中所述放射性核素适于治疗，所述 放射性标记的多肽用于治疗特征在于HER2过表达的癌症。
36. 权利要求17、19或者21的放射性标记的多肽，其中所述放射性核素适于治疗，所述 放射性标记的多肽用于治疗选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌以及食管癌 的癌症。
37. 权利要求17、19或者21的放射性标记的多肽在制备治疗特征在于HER2过表达的 癌症的药物中的应用，其中所述放射性核素适于治疗。
38. 权利要求17、19或者21的放射性标记的多肽在制备治疗癌症的药物中的应用，其 中所述放射性核素适于治疗，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌 以及食管癌。
39. 编码权利要求1-6或者10任一项的多肽的核酸。
40. 包含权利要求39的核酸的表达载体。
41. 包含权利要求39的表达载体的宿主细胞。
【文档编号】C07K14/485GK104327179SQ201410529294
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2008年12月22日 优先权日:2007年12月21日
【发明者】L·亚伯拉罕森, N·赫内, J·费尔德维施, C·伦德尔, V·托尔马切夫 申请人:阿菲博迪公司