同时提取白腐真菌复合吸附剂中sod、cat、nadh氧化酶和atp的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，包括以下步骤：将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；向培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的复合物；本发明采用重金属胁迫提高SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力和ATP的含量，具有细胞破碎效果好，提取效率高等优势。
【专利说明】同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和 ATP的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境微生物【技术领域】，尤其涉及一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中 SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法。
【背景技术】
[0002] 水中重金属离子的污染备受关注，生物吸附是一种有效去除水中重金属离子的方 法。包埋白腐真菌的复合吸附剂对水中重金属离子，例如Cd 2+、Pb2+、Cr6+等有很强的去除效 果，重金属离子对复合吸附剂微生物有毒害作用，同时微生物对重金属离子有一定的耐受 性，这与复合吸附剂的微生物的抗氧化机制和磷酸氧化机制有关。
[0003] SOD和CAT是生物体内内源性抗氧化防御系统中的主要酶，它们与自由基之间处 于一种动态平衡，当细胞处于应激状态下，体内氧化磷酸化作用增强，从而产生足够的能量 维持生命需要，但同时也导致了自由基的产生增多，导致脂质出现氧化损伤。如果测定的 SOD和CAT活性升高，说明它们清除氧自由基的能力增强，即减少自由基带来的氧化损伤。
[0004] NADH氧化酶是细胞中重要的氧代谢酶，它能够清除细胞内氧毒性，帮助细胞抗击 外界氧压力，对于维持细胞内氧平衡具有重要作用。ATP用于储存能量，当细胞需要能量时， ATP分解释放能量。当ATP的含量增大时，说明细胞需要的能量增多，此时通过调节呼吸链 和氧化磷酸化反应来增加 ATP的含量，满足细胞的供能需要。
[0005] 目前有用粉碎-浸提-离心分离-超滤-浓缩-离心喷雾干燥的方法提取植物中 S0D，用CO2超临界萃取法提取动物肝脏中CAT，用离心、超声破碎法和渗透压冲击法破碎细 胞提取细菌中FMN-NADH氧化还原酶，几种传统的微生物体内ATP的提取方法有加热、超声、 酸、氯仿等。由于提取S0D、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法不尽相同，而且提取的方法复杂， 要同时提取复合吸附剂的微生物SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP就有困难。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重金属胁迫下同时提 取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，具有简单、便捷、有效、可靠 等优势，其中SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力和ATP含量随重金属离子浓度的变化，可应用 于废水中重金属的处理。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中S0D、CAT、 NADH氧化酶和ATP的方法，包括以下步骤：
[0008] S1、将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白 腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；
[0009] S2、向培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮 研磨得到研磨样品；
[0010] S3、将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧 化酶和ATP的复合物。
[0011] 进一步的，前述白腐真菌复合吸附剂包括氮修饰的二氧化钛、海藻酸钠溶液、白腐 真菌孢子悬浮液。
[0012] 进一步的，前述白腐真菌孢子悬浮液为为黄孢原毛平革菌孢子液，每mL黄孢原毛 平革菌孢子悬浮液含孢子I. ox IO6个，前述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的含量为2wt%。
[0013] 进一步的，前述氮修饰的二氧化钛与前述2wt %的海藻酸钠、黄孢原毛平革菌孢子 液的质量体积比为2g : 100ml : 100ml。
[0014] 进一步的，前述SI步骤具体为：制备包埋包腐真菌的小球，然后将小球加到Kirk 无机培养基中进行恒温振荡培养。
[0015] 进一步的，前述振荡速度为150rpm，前述培养温度为37°C，前述培养时间为72h。
[0016] 进一步的，前述S2步骤中前述Cd2+在前述培养液中的浓度为0. 1?0. 7mmol/L。
[0017] 进一步的，前述S2步骤中前述胁迫培养的时间为12?14h。
[0018] 进一步的，前述S3步骤中前述超声处理的功率为400w?600w，总时间3min? 5min，单次超声持续时间为2s?4s，单次超声间隔时间为8s?12s。
[0019] 本发明的创新点在于：
[0020] 本发明采用重金属胁迫提取白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶和 ATP，重金属镉的存在，可以增强白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶的活性，同 时ATP的含量也显著提高。但是由于白腐真菌复合吸附剂的破碎难度大，这三种酶和ATP 存在于细胞组织中，常规的提取方法并不能同时提取SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP ;同时提 取得到的SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活性也不高。
[0021] 本发明采用液氮研磨、磷酸缓冲液提取和超声方法联合提取白腐真菌复合吸附剂 中的SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP，其中磷酸缓冲液里能发挥这三种酶活力，而液氮研磨和 冰浴超声处理使细胞破碎更充分，都在低温条件下进行，能保持酶活性。
[0022] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0023] (1)本发明采用液氮研磨法初步提取酶和ATP，研磨速度快，细胞破碎效果好，提 取效率高。
[0024] (2)本发明将液氮研磨后的初提取物再用磷酸缓冲液提取，同时使用冰浴超声和 二次离心处理，能保证提取过程中是低温环境，酶和ATP处于抑制状态，不影响酶活力测定 和ATP含量的计算，且提取充分、完全。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0026] 图1为本发明实施例1中白腐真菌复合吸附剂经0?0. 7mmol/L的Cd2+的胁迫培 养所得的体内SOD、CAT和NADH氧化酶活力变化图。
[0027] 图2为本发明实施例2中白腐真菌复合吸附剂经0?0. 7mmol/L的Cd2+的胁迫培 养所得的体内ATP含量变化图。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0029] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中白腐真菌采用黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)BKMF_1767,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC AF96007。
[0030] 实施例1
[0031] 一种重金属胁迫下同时提取白腐真菌复合吸附剂中超氧化物歧化酶（SOD)、过氧 化氢酶（CAT)和还原型辅酶I氧化酶（NADH氧化酶）和ATP的方法，包括以下步骤：
[0032] (1)把2g氮修饰二氧化钛加入IOOmL质量分数为2%的海藻酸钠溶液中得到混合 溶液，将IOOmL孢子数为I. 0 X IO6个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液加入到上述混合溶液 中，搅拌均匀得到白腐真菌复合吸附剂。用注射器将白腐真菌复合吸附剂滴加到200mL质 量分数为3%的CaCl 2溶液中制成包埋黄孢原毛平革菌的小球。把包埋有黄孢原毛平革菌 的小球加到Kirk无机培养基（Kirk无机培养基的组分为I. 2mmol/L的酒石酸铵，56mmol/ L 的葡萄糖，20mmol/L 的无水乙酸钠，0? 2g/L 的 KH2P04,0 . 05g/L 的 MgSO4 WH2C^O. 01g/L 的 CaCl2, lml/L的无机溶液，0. 5ml/L的维生素溶液）中进行恒温振荡培养72h，振荡培养的温 度是37°C，振荡速度150rpm，得到培养液。
[0033] (2)将步骤（1)制备得到的培养液平均分为6组，向每组培养液中分别加入Cd2+， 使最终溶液的Cd 2+的浓度分别为0、0. lmM、0. 25mM、0. 5mM、0. 6mM、0. 7mM ;然后将培养液进行 胁迫培养12h (胁迫培养的时间为12?14h均能达到相同或相似的技术效果），取出包埋小 球过滤分离并用蒸馏水清洗3次，将水分去掉测定湿重（每组中取3个出来测定干重），用 液氮将其研磨得到研磨样品。
[0034] (3)将步骤⑵中制备得到的研磨样品加入0?4°C预冷的浓度为0. 2mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液定容至40mL，转移到离心管中，冰浴下超声处理（超声处理的功率为 500w，总时间3min，单次超声持续时间为3s，单次超声间隔时间为9s)，然后8000r/min离心 15min，取上清液为提取液于0?4°C保存备用。
[0035] 实施例1仅为本发明的优选实施例，在本发明中超声处理的功率为400w?600w， 总时间3min?5min，单次超声持续时间为2s?4s，单次超声间隔时间为8s?12s均能达 到相同或相似的技术效果。
[0036] 测定提取液中SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力：
[0037] 测定SOD酶活力：
[0038] 取IOmL提取液于4°C下以8000r/min离心15min，取离心后的上清液作为酶液，将 酶液采用硝基四唑氮蓝法测定SOD酶活力。
[0039] 酶促反应体系包括I. 5mL的0? 05mol/L pH 7. 8的磷酸缓冲液；0? 3mL的 0? 013mol/L甲硫氨基酸溶液；0? 3mL的75 ii mol/L硝基四唑氮蓝溶液；0? 3mL的10 ii mol/L EDTA-Na2 ;0. 3mL 的 2 ii mol/L 核黄素溶液；0. 05mL 酶液。
[0040] 对照反应体系：不加实施例1的提取液（相当于酶促反应体系中的酶液），其余成 分与酶促反应体系相同的的反应体系。
[0041] 将上述酶促反应体系装于透光性好的容器中并混合均匀，然后置于40001X，将上 述对照反应体系装于另一容器中混合均匀后置于暗处放置相同时间（20min)。反应结束后 以不照光的对照管作为空白，在波长560nm下测定各管吸光度。以抑制硝基四唑氮蓝光化 反应为蓝色的甲腙的50%为一个酶活单位计算SOD活性。
[0042]
【权利要求】
1. 一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，其特征 在于，包括以下步骤： 51、 将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中，制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐 真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液； 52、 向所述培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出所述包埋白腐真菌的小球，进行 液氮研磨得到研磨样品； 53、 将所述研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧 化酶和ATP的复合物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白腐真菌复合吸附剂包括氮修饰的 二氧化钛、海藻酸钠溶液、白腐真菌孢子悬浮液。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述白腐真菌孢子悬浮液为黄孢原毛平 革菌孢子液，每mL黄孢原毛平革菌孢子悬浮液含孢子1. 0 X 106个，所述海藻酸钠溶液中海 藻酸钠的含量为2wt%。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮修饰的二氧化钛与所述2wt %的海 藻酸钠、黄孢原毛平革菌孢子液的质量体积比为2g : 100ml : 100ml。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述恒温振 荡培养具体为：将包埋白腐真菌的小球加到Kirk无机培养基中进行恒温振荡培养。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述振荡速度为150rpm，所述培养温度为 37°C，所述培养时间为72h。
7. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述S2步骤中所述Cd2+在 所述培养液中的浓度为〇. 1?〇. 7mmol/L。
8. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述S2步骤中所述胁迫培 养的时间为12?14h。
9. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述S3步骤中所述超声处 理的功率为400w?600w，总时间3min?5min，单次超声持续时间为2s?4s，单次超声间 隔时间为8s?12s。
【文档编号】C07H19/20GK104293742SQ201410513186
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】谭琼, 陈桂秋, 曾光明, 晏铭, 陈安伟, 左亚男, 黄真真, 郭志 申请人:湖南大学