一种能提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白e6及其编码基因与应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种具有提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6及其编码基因与应用。该蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物光合效率的蛋白质。结果表明：E6蛋白在光合作用中有重要功能，为高光效工程藻株的改造提供了一个很好的靶标基因，也为作物改良提供良好的备选目标基因。
【专利说明】一种能提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6及其编码基 因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种能提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6 及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 光合作用是生物界赖以生存的基础。它直接或间接地为地球上的生物提供能量， 与人类面临的粮食、能源问题等密切相关。随着世界人口的增加，粮食、能源和资源问题日 益严峻，提高包括藻类等在内的光合生物的光能利用效率，已经成为一项日益紧迫的任务。
[0003] 莱茵衣藻是单细胞真核绿藻，是研究光合作用、光合产氢和细胞逆境适应机制的 模式物种。通过科学研究挖掘重要的可以提高光能利用效率的新基因，不仅可为高放氢工 程藻株设计提供可利用的基因元件，也对发现衣藻高效率低成本制氢的新思路和新方法有 重要价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种具有提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6及其编 码基因。
[0005] 本发明所提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
[0006] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物光合效率相关的蛋白质。
[0008] 本发明所提供的所述蛋白质相关的生物材料，为下述BI)至B5)中的任一种：
[0009] BI)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
[0010] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0011] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0012] B4)含有BI)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
[0013] B5)含有BI)所述核酸分子的重组藻株、或含有B2)所述表达盒的重组藻株、或含 有B3)所述重组载体的重组藻株。
[0014] 上述相关生物材料中，BI)所述的核酸分子如序列表中序列1的第1-579位核苷 酸分子所不。
[0015] 上述蛋白质或相关生物材料在提高植物光合效率中的应用也是本发明的保护范 围。
[0016] 上述应用中，所述植物为藻类，具体为莱茵绿藻。
[0017] 本发明的另一个目的是一种构建光合能力提高的转基因植物的方法。
[0018] 本发明所提供的构建光合能力提高的转基因植物的方法包括如下步骤：将上述所 述蛋白质的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，光合 能力提1?。
[0019] 上述方法中，所述蛋白质的编码基因为序列表中序列1的第1-579位核苷酸的DNA 分子。
[0020] 上述方法中，所述光合能力提1?为光合效率提1?。
[0021] 上述方法中，所述植物为藻类，具体为莱茵衣藻。
[0022] 实验表明：E6基因与E6的光合表型是相关的，E6基因在光合作用中有重要功能， 为高光效工程藻株的改造提供了一个很好的靶标基因，也为作物改良提供良好的备选目标 基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为e6突变体互补藻株筛选。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 植物材料：莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)藻种 CC400 (mt+)，购自美国 杜克大学莱茵衣藻中心（Chlamy center, http: //www. chlamy. org/)〇
[0027] 菌株和质粒：pSI103质粒购自美国杜克大学莱茵衣藻中心（Chlamy center http://www. chlamy. org/) ;pJR38质粒由马普协会分子生理研究所Ralph Bock教授提 供，在文献 "Generation of Chlamydomonas strains that efficiently express nuclear transgenes, Neupert et al·，The Plant Journal, 2009, 57, 1140-1150" 中公开过，公众可 从中国科学院植物研究所获得。PSI103质粒和pJR38质粒中均含有巴龙霉素抗性基因。
[0028] 培养基的配制：
[0029] 1)正常 TAP 培养液：NH4C1 0· 4g/L ;MgS04 · 7H20 0· lg/L ;CaCl2 · 2H20 0· 05g/L ; K2HPO4O. 108g/L ;KH2P040 . 0 56g/L Jrisbase 2. 423g/L ;亨特微量元素（Hunter，s trace elements) lml/L ;冰乙酸 lml/L ;其余为水。
[0030] 2)固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加 I. 5%的琼脂粉。
[0031] 3)亨特微量兀素（Hunter，s trace elements) =H3BO4IL 4g/L ;ZnS04 · 7H20 22. Og/L ；MnCl2 · 4H20 5. 06g/L ；CoC12 · 6H20 1. 61g/L ；CuSO4 · 5H20 I. 57g/L ； (NH4)6Mo7O24 · 4H20L lOg/L ;FeS04 · 7H20 4. 99g/L ;其余为水。
[0032] 4)用 TAP 固体培养基培养莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) CC400 (mt+)、 e6突变体及互补藻株：配制TAP液体培养液，121 °C高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室 温后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻单克隆到液体TAP培养液中，置于恒温光照 培养箱中的摇床上连续光照培养（25°C，60rpm，100 μ Es4HT2)，悬浮培养细胞，固体培养时， 将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。
[0033] 实施例I、E6基因的获得
[0034] 1、莱茵衣藻总RNA的提取：
[0035] 取指数生长期的莱茵衣藻CC400(mt+)细胞（4-6)xl06细胞/毫升，5000rpm离心 5min后，加入ImL裂解液RZ，振荡混匀。室温放置5min后，4°C，12000rpm离心5min，取上清， 转入新的无 RNase的离心管中。加200 μ L氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。 4?，12000rpm离心lOmin。把上层水相转移到新的无 RNase的离心管中，缓慢加入0. 5倍 体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀全部转入吸附柱中。4°C，12000rpm离心30s， 弃离心管中废液，加500 μ L去蛋白液，4°C，12000rpm离心30s，弃废液。加700 μ L漂洗液， 室温静置2min，4°C，12000rpm离心30s，弃废液。再加500 μ L漂洗液，室温静置2min，4°C， 12000rpm离心30s，弃废液。4°C，12000rpm离心2min，去除残余液体，开盖瞭干。将吸附 柱转入一个新的无 RNase的离心管中，加50yL RNase-free dd-H20,室温放置2min，4°C, 12000rpm离心2min。弃上清，获得莱茵衣藻总RNA。
[0036] 2、cDNA 第一链合成：
[0037] 以上述获得的莱茵衣藻总RNA为模板，使用全式金有限公司cDNA第一链合成试剂 盒合成 cDNA 第一链。反应体系：2yL IOx TSII mix，lul ΙΟμπιοΙ 01igodT20，l-5yg 总 RNA，补灭菌双蒸水至20yL。50°C温浴30min，70°C加热15min后终止反应。获得莱茵衣藻 的cDNA第一链。
[0038] 3、E6基因的扩增：
[0039] 以上述获得的莱茵衣藻的cDNA第一链为模板，采用表1中的引物序列PCR扩增E6 基因。反应程序：98°C预变性2min，98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸30s，35个循环， 72°C延伸 5min。反应体系：2XHS GC buffer I 12.5yL，dNTP mixture (各 2.5mM)2yL， 模板 cDNA I μ L，PRMERSTAR(5U/y L)0. 5μ L，F/R各 I μ L，补 ddH20 至 25μ L。以上引物均 在生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见下表1。
[0040] 表I. PCR扩增所用的引物序列
[0041]
【权利要求】
1. E6蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与植物光合效率相关的蛋白质。
2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述BI)至B5)中的任一种： BI)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体； B4)含有BI)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒； B5)含有BI)所述核酸分子的重组藻株、或含有B2)所述表达盒的重组藻株、或含有 B3)所述重组载体的重组藻株。
3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述的核酸分子如序列表中 序列1的第1-579位核苷酸分子所示。
4. 权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述相关生物材料在提高植物光合效率 中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为藻类，具体为莱茵绿藻。
6. -种构建光合能力提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋 白质的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，光合能力 提_。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为序列表中序列1 的第1-579位核苷酸的DNA分子。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述光合能力提高为光合效率提高。
9. 根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物为藻类，具体为莱茵衣 藻。
【文档编号】C07K14/405GK104311649SQ201410490550
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】黄芳, 赵磊, 程冬梅 申请人:中国科学院植物研究所