一种多肽提取与分离方法
【专利摘要】本发明涉及一种多肽提取与分离方法。本发明以大尺寸的二氧化硅（亚毫米级）共价负载聚乙撑亚胺作为吸附剂(SiO2@PEI)，在不同的pH环境下能提取等电点不同的多肽，而降低pH则多肽可被高效释放。这是由于该吸附剂易质子化而呈阳离子性，而多肽随pH降低可由带负电变成带正电，因此与吸附剂间由静电互补吸附变成静电互斥而释放。吸附剂与多肽间的络合常数一般都高于1012M-1,因此即使含量在亚飞摩尔级的痕量多肽也可被提取。同时，对绝大多数多肽，释放率达到79-92%。该吸附剂至少能提取相对丰度仅为0.1%的多肽。该吸附剂制备简单，能反复使用。
【专利说明】一种多肽提取与分罔方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种分离技术和生物分析与检测领域，具体涉及一类能高效提取水中 某些多肽，又能高效脱附的多肽提取与分离方法。
【背景技术】
[0002] 多肽的提取与分离是当今的一项重要技术。比如某些多肽有特定的生理功能，但 在原料中含量很低，这时就需要进行提取浓缩。再比如在蛋白、核酸分析中，基质辅助激光 解析离子化飞行谱（MALDI-T0F)是一种极为灵敏的质量检测技术，适合大分子质量的检 测，灵敏度非常高，特别适合多肽、蛋白等检测，但是在体系中丰度较低的多肽却很难被检 测到。这种情况下就可采用提取洗脱技术进行检测。这对于构建蛋白和核酸序列是十分必 要的。科学界针对多肽的分离和检测已开发了多种技术，例如双向电泳，各种色谱技术等。 这些技术针对微量操作效果是理想的，在检测上也有重要意义，主要是确定化学物种的存 在，但一般不能直接提供分子量等信息。其它技术如等电点沉降对痕量物种效果不理想。近 年来，提取特定多肽的技术有重大突破。例如以结构明确的磁性纳米颗粒吸附特定多肽，再 进行洗脱浓缩和分析。这些技术对于磷蛋白、糖蛋白等翻译后改性蛋白的分析是非常有用 的。但这些材料的合成要求很高，一般针对特定多肽有效。总体而言，还缺乏一种通用而高 效的多肽提取剂。
[0003] 另一方面，多肽的脱附是一个重要的技术挑战。一般而言，多肽分子量较大，与吸 附剂间作用点多，与吸附剂的作用很强。正如有文献指出的那样，缔合常数与作用点成指数 增长关系。而多肽不同于小分子，作用点很多，故强吸附通常容易发生，但解吸很难。因此 在多肽的提取分离中，难解吸是重要技术挑战之一。应该注意到，多肽尽管可以带一定电荷 并且可以是水溶性的，但本质上都有一定亲油性，这种亲油作用是导致其难以从吸附剂上 解吸下来的重要原因之一。一般而言，常规吸附剂都具有选择性偏低，解吸率低的特点。本 发明的目的是提供一种能高效、高选择地吸附某一等电点的多肽同时又能高效地解吸的吸 附剂。利用对吸附剂的设计或选择，可最大化pH-可逆的离子作用而最小化亲油互补作用， 就能实现商效吸附和商效解吸。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种多肽提取与分离方法，该法并能有效提取等电点在特 定范围的多肽，并通过分离洗脱来达到纯化目的。
[0005] 本发明提出的多肽提取与分离方法，具体步骤如下： (1)对单一多肽的吸附与释放 (1. 1)配置浓度为1X ΚΓ2摩尔/升X ΚΓ8摩尔/升的多肽的缓冲水溶液，控制缓冲 水溶液pH值大于多肽的等电点pl，然后向所得溶液中加入吸附剂Si02@PEI，并进行紫外/ 可见光谱的时间检测，随着时间加长，吸光度越来越低，直到吸光度不发生变化，即认为达 到了吸附平衡； (1. 2)将上述吸附了多肽的吸附剂Si02@PEI过滤，并采用新鲜的缓冲水溶液洗涤，所述 缓冲水溶液与步骤（1. 1)所述的缓冲水溶液的pH值相同，然后该吸附剂Si02@PEI所吸附 的多肽用另一缓冲水溶液洗脱回收，所述另一缓冲水溶液pH值小于多肽的等电点pl，并继 续进行紫外/可见光谱的时间检测，直到紫外/可见光吸收不发生变化；即认为达到了释放 平衡； (2)对特定多肽的提取与纯化 由于特定多肽具有确定的等电点（pl)，因此先将吸附剂Si02@PEI加入到含有目标提 取多肽和干扰多肽的缓冲水溶液中，控制缓冲水溶液中的pH值大于目标提取多肽的等电 点pi ;经过1~48小时孵化，将吸附剂Si02@PEI分离并在该pH值下采用新鲜的缓冲水溶液 洗涤，该吸附剂Si0 2@PEI所吸附的多肽以另一 pH值低于pi的缓冲水溶液洗脱回收，该过 程采用高效液相色谱（HPLC)或基质辅助激光解吸/离子化时间谱（MALDI-TOF)进行检测； 基于等电点差异的提取方法通过切换pH值即可提取各类目标多肽，完全满足常规的分离 要求。洗脱后的吸附剂可再利用。
[0006] 本发明中，所述二氧化硅至少有一维尺寸在150微米以上，特别是300微米以上的 二氧化硅，目的在于便于过滤或离心分离。
[0007] 本发明中，所述目标提取多肽与干扰多肽的浓度中的任意一种多肽的浓度不低于 或等于1ΧΚΓ 6摩尔/升时，采用高效液相色谱（HPLC)进行检测。
[0008] 本发明中，所述目标提取多肽与干扰多肽中的任意一种多肽的浓度不低于或等于 IX 10_15摩尔/升时，采用基质辅助激光解吸/离子化时间谱（MALDI-T0F)进行检测。
[0009] 本发明利用二氧化硅负载的P E I作为吸附剂，这是由P E I的特点决定的。P E I易于质子化而呈阳离子性，只有当p Η大于1 0时才呈电中性。因此当p Η小于1 0 时，能吸附阴离子性的多肽。同时，当将Ρ Η切换到更低值时，多肽可以由带负电变成带正 电，与PE I产生电荷排斥，从而可以脱附。还应该注意到，PE I在低pH值时呈强烈亲 水性，与多肽的电荷排斥作用强而亲油互补弱，故可能体现高的脱附能力。在这方面，Ρ E I是独特的：它的脂肪胺含量高，易质子化，同时在低pH时亲油性弱。
[0010] 本发明利用较大尺寸的二氧化硅作为载体有利于分离。一般而言，载体颗粒越小， 表面积越大，吸附越快。这是其有利的一方面。但是颗粒小到一定程度则不易分离。故本 发明采用150微米以上的二氧化硅，特别是300微米以上的二氧化硅，目的在于便于过滤或 离心分离。
[0011] 本发明所述的二氧化硅载体可以是多孔的，但PEI不宜在孔中。PEI如果进入孔中 并被固定在其中可能不利于底物的洗脱。
[0012] 本发明所示的吸附剂可以处理含多种多肽的水溶液。多肽的含量可仅为皮摩尔每 升或飞摩尔以下。
[0013] 本发明所述的吸附剂能按pH不同而选择吸附不同的多肽。例如对于等电点分别 为3和5的多肽，可以选择pH为4,则等电点为3的多肽被吸附而等电点为5的保持不动。 如果选择pH为6,则两种多肽都被吸附。但洗脱时如果选择pH为4,则仅一种多肽被洗脱 下来。
[0014] 本发明所述的吸附剂，可以用较强酸处理而再生。所用的酸以无机酸最佳，例如P Η为1或更低。
[0015] 本发明的有益效果在于：能处理痕量级别（飞摩尔量以下）的多肽组分；能高效脱 附，对一般多肽脱附率在79-92% ;能抗干扰，即使目标多肽的相对丰度仅为0. 1%或更低也 能有效选择吸附。本发明非常适合某些特定功能的多肽的提取纯化；也可用于蛋白序列分 析。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1对多肽（A) EE-6和QF-9或（B)PP-6和GI-6在以过量吸附剂处理前(实 线)和处理后（点线）的HPLC检测迹线。测试条件：对（A)的吸附是pH 5 (醋酸缓冲液， 0.01 M)而（B) pH为7.4 (磷酸缓冲液0.01 M);所有多肽储备液的浓度为5.0 X ΚΓ5 M，但在HPLC测试前经冷冻一干燥法浓缩20倍左右；HPLC测试采用梯度洗脱液，即0. 1% CF3C00H乙腈液/0.1% CF3C00H水液，前者在2 5分钟内由18%升至100% (A)或由15% 升至100% (B) ; X代表CF3C00H的信号。
[0017] 图 2 含量仅为 5. 0 X 1(Γ12 Μ 的 PP-6, QF-9, VE-18 和 PH-28 经吸附一分离一 洗脱后进行MALDI-T0F测试的结果。条件：吸附在pH 7.4的磷酸缓冲液中进行，然后再 以pH 4的醋酸缓冲液洗脱后进行测试。
[0018] 图3低丰度的多肽EE-6，ED-9，SP-20和EL-25 (浓度均为4.0 X 1(Γ7 M)和 高丰度的多肽PP-6 (4.0 X 10_4M) -起进行MALDI-T0F测试时，只有后者的信号可以被 观测到（A)，但经过吸附剂吸附、分离和洗脱后，这些低丰度的多肽信号可以被清晰地观 测到（B)。测试条件：孵化时pH 5 (醋酸缓冲液0.01 M)，洗脱时pH 2 (磷酸缓冲液0.01 M)。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例仅为更进一步具体说明本发明，在不违反本发明的主旨下，本发明应 不限于以下实例具体明示的内容。
[0020] 实施例1 (多肽的吸附与释放） 表1.在实施例中涉及到的几种多肽._
【权利要求】
1. 一种多肽提取与分离方法，其特征在于具体步骤如下： 对于单一多肽的吸附与释放 (1. 1)配置浓度为1X ΚΓ2摩尔/升X ΚΓ8摩尔/升的多肽的缓冲水溶液，控制缓冲 水溶液pH值大于多肽的等电点pl，然后向所得溶液中加入吸附剂Si02@PEI，并进行紫外/ 可见光谱的时间检测，随着时间加长，吸光度越来越低，直到吸光度不发生变化，即认为达 到了吸附平衡； (1. 2)将上述吸附了多肽的吸附剂Si02@PEI过滤，并采用新鲜的缓冲水溶液洗涤，所述 缓冲水溶液与步骤（1. 1)所述的缓冲水溶液的pH值相同，然后该吸附剂Si02@PEI所吸附 的多肽用另一缓冲水溶液洗脱回收，所述另一缓冲水溶液pH值小于多肽的等电点pl，并继 续进行紫外/可见光谱的时间检测，直到紫外/可见光吸收不发生变化；即认为达到了释放 平衡； 对于特定多肽的提取与纯化 由于特定多肽具有确定的等电点pl，因此先将吸附剂Si02@PEI加入到含有目标提取 多肽和干扰多肽的缓冲水溶液中，控制缓冲水溶液中的pH值大于目标提取多肽的等电点 pi ;经过1~48小时孵化，将吸附剂Si02@PEI分离并在该pH值下采用新鲜的缓冲水溶液洗 涤，该吸附剂Si0 2@PEI所吸附的多肽以另一 pH值低于pi的缓冲水溶液洗脱回收，该过程 采用高效液相色谱或基质辅助激光解吸/离子化时间谱进行检测；基于等电点差异的提取 方法通过切换pH值即可提取各类目标多肽，完全满足常规的分离要求，洗脱后的吸附剂可 再利用。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述二氧化硅至少有一维尺寸在150微米 以上。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目标提取多肽与干扰多肽中的任意一 种多肽的浓度不低于或等于IX 1〇_6摩尔/升时，采用高效液相色谱进行检测。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目标提取多肽与干扰多肽中的任意一 种多肽的浓度不低于或等于1X 1〇_15摩尔/升时，采用基质辅助激光解吸/离子化时间谱 进行检测。
【文档编号】C07K1/36GK104193799SQ201410396536
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】万德成, 陈 峰, 金明, 浦鸿汀 申请人:同济大学