单唾液酸四已糖神经节苷脂钠gm1原料的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，包括如下步骤：a.取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，即得沉淀脑蛋白；b.将沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，然后搅拌，离心过滤，即得醇提液；c.将醇提液浓缩，得醇提浓缩液；d.将经上述步骤得到的醇提浓缩液，水解，然后离心分离，收集上清液，即得水解液；e.将水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得GM1溶液纯品；f.将GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。
【专利说明】单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法。
【背景技术】
[0002] 单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1广泛存在于哺乳类动物大脑细胞膜表面和中 枢神经组织中。单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1对神经系统损伤后的修复、促进神经的 生长和再生、促进神经支配功能的恢复、保护神经细胞膜等都有积极的作用。
[0003] 目前获取单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1的方法是从动物脑组织中提取分离。 然而，神经节苷脂种类多，在脑组织中含量少，特别是其分子组成、结构物理化学性质等因 素十分相近，所以高纯度GM1的提取分离难度大，特别是大规模工业化提取工艺还未见有 报道和应用。到目前为止，国内GM1提取分离的工艺主要有Momoi. T方法和利用微生物转 化的方法或者用硅胶柱从混合神经节苷脂中分离，成本太高，难以大规模应用于临床，操作 步骤繁琐、工艺复杂、并消耗大量有机溶剂，提取的GM1含量仅为脑组织含量的万分之一， 而且纯度不高、仅为99%。
[0004] 本领域技术人员渴望获得一种成本低、纯度更高、能大规模工业化提取的单唾液 酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料，但一直没有解决这个技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题就是提供一种成本低、纯度更高、适于大规模工业化应 用的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备 方法，包括如下步骤： a. 取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，去除上 层乳浊液，收集沉淀物，即得沉淀脑蛋白； b. 将经上述步骤得到的沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，再用氢氧化钠调pH值为7-9,然 后搅拌，离心过滤，收集上清液，即得醇提液； c. 将经上述步骤得到的醇提液浓缩，得醇提浓缩液； d. 将经上述步骤得到的醇提浓缩液，调pH值为2-5,水解，然后离心分离，收集上清 液，即得水解液； e. 将经上述步骤所得水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物 质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得 GM1溶液纯品； f. 将经上述步骤所得GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原 料。
[0007] 进一步改进，所述a步骤，取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后 加入猪脑重2-5倍重量的纯化水用胶体磨匀浆lOmin，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热 至80-85°C后保温10-20min，再按猪脑重每lkg加入2-5 ml的比例加入浓度为12mol/L的 浓盐酸搅匀、冷却至20-50°C，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳 浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白。
[0008] 进一步改进，所述b步骤，将经a步骤所得纯化蛋白按猪脑重量3-6倍的比例加入 浓度为75-95%的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为7-9， 加热保温至40-60°C搅拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上 清液，即得醇提液。
[0009] 进一步改进，所述C步骤，将经b步骤所得醇提液，60-80°C条件下真空减压浓缩至 猪脑重量的1/3-1/5,即得醇提浓缩液。
[0010] 进一步改进，所述d步骤，将经C步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH 值为2-5,60-80°C条件下水解3-5h，然后冷却至20-50°C，以3500-4000r/min的速度离心分 离5min，弃沉淀，收集上清液，再用6mol/L氢氧化钠溶液调pH值为7-8,即得水解液。
[0011] 进一步改进，所述e步骤，将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿 的中空纤维超滤膜内进行连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得 GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中 超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品。
[0012] 进一步改进，所述f步骤，将e步骤所得GM1溶液纯品以-60°C冷冻干燥或喷雾干 燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料。
[0013] 本发明的方法利用ph梯度的极性有机溶剂少量的甲醇，经调整ph值和温度、能高 效地将GM1从猪脑组织中经过纯化蛋白、醇提、浓缩、水解、提纯、干燥步骤处理，所提取的 GM1含量达到猪脑组织含量的千分之一，纯度可达99. 9%以上，详见附图，其各项质量指标 都符合相关标准要求；且有机溶剂用量少、工艺简单、周期短，因而成本低。
[0014] 本发明的方法简单可控，能适用于大批量制备单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1 原料，能够一次性处理大量猪脑组织，纯化量大，可以进行规模化生产，适于大规模工业化 应用。
[0015] 采用本发明的方法制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料可以用于制备 医用注射液、冻干粉针及口服制剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是本发明方法制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的GM1含量HPLC 色谱图。
【具体实施方式】
[0017] 下面详细说明本发明方法的实施方式，但不仅限于以下实施例。
[0018] 实施例一 本发明的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法包括如下步骤： a.取冻存新鲜猪脑50Kg，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入100kg纯化水用 胶体磨匀浆l〇min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至80°C后保温lOmin，再加入150 ml 的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至20°C，再以3500r/min的速度离心分离 5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白； b. 将经a步骤所得纯化蛋白加入150kg浓度为75%的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提 取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为7,加热保温至40°C搅拌3h，再以3500r/min的速度 离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液； c. 将经b步骤所得醇提液，60°C条件下真空减压浓缩至17kg，即得醇提浓缩液； d. 将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为2,60°C条件下水解3h， 然后冷却至20°C，以3500r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，用6mol/L氢氧 化钠溶液调PH7. 5,即得水解液； e. 将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连 续5次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯 品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔 顿以下的物质，得GM1溶液纯品； f. 将e步骤所得GM1溶液纯品置于冷冻干燥机中以-60°C冷冻干燥，即得单唾液酸四 已糖神经节苷脂钠 GM1原料。
[0019] 实施例二 a. 取冻存新鲜猪脑50Kg，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入100kg纯化水用 胶体磨匀浆l〇min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至85°C后保温15min，再加入250 ml 的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至35°C，再以3800r/min的速度离心分离 5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白； b. 将经a步骤所得纯化蛋白加入250kg浓度为75%的甲醇，胶体磨勻楽1次、lOmin, 倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为8. 5,加热保温至52°C搅拌6h，再以3800r/min 的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液； c. 将经b步骤所得醇提液，70°C条件下真空减压浓缩至12. 5kg，即得醇提浓缩液； d. 将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为3. 5, 75°C条件下水解 4h，然后冷却至3(TC，以3800r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，用6mol/L 氢氧化钠溶液调PH7. 6,即得水解液； e. 将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连 续6次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯 品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔 顿以下的物质，得GM1溶液纯品； f. 将e步骤所得GM1溶液纯品置于冷冻干燥机中以-60°C冷冻干燥，即得单唾液酸四 已糖神经节苷脂钠 GM1原料。
[0020] 实施例三 a. 取冻存新鲜猪脑50Kg，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入200kg纯化水用 胶体磨匀浆lOmin，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至85°C后保温20min，再加入250 ml 的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至50°C，再以4000r/min的速度离心分离 5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白； b. 将经a步骤所得纯化蛋白加入300kg浓度为95%的甲醇，胶体磨勻楽1次、lOmin, 倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为9,加热保温至60°C搅拌8h，再以4000r/min 的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液； c. 将经b步骤所得醇提液，80°C条件下真空减压浓缩至10kg，即得醇提浓缩液； d. 将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为3. 8,80°C条件下水解 5h，然后冷却至5(TC，以4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，用6mol/L 氢氧化钠溶液调PH7. 5,即得水解液； e. 将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连 续6次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯 品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔 顿以下的物质，得GM1溶液纯品； f. 将e步骤所得GM1溶液纯品置于喷雾干燥机以180°C喷雾干燥，即得单唾液酸四已 糖神经节苷脂钠 GM1原料。
[0021] 上述例举了 3个典型的实施例，但不限于这些实施例。 申请人:经过反复试验得到 本发明的方法，方法简单可控，并按照该方法进行了反复的试验，所制备的单唾液酸四已糖 神经节苷脂钠 GM1原料都符合相关标准要求，试验数据详见下表。
【权利要求】
1. 一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征在于包括如下步 骤： a. 取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，去除上 层乳浊液，收集沉淀物，即得沉淀脑蛋白； b. 将经上述步骤得到的沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，再用氢氧化钠调pH值为7-9,然 后搅拌，离心过滤，收集上清液，即得醇提液； c. 将经上述步骤得到的醇提液浓缩，得醇提浓缩液； d. 将经上述步骤得到的醇提浓缩液，调pH值为2-5,水解，然后离心分离，收集上清 液，即得水解液； e. 将经上述步骤所得水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物 质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得 GM1溶液纯品； f. 将经上述步骤所得GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原 料。
2. 根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征在 于：所述a步骤，取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入猪脑重2-5倍 重量的纯化水用胶体磨匀浆lOmin，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至80-85°C后保温 10-20min，再按猪脑重每lkg加入2-5 ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却 至20-50°C，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀 物，即得纯化脑蛋白。
3. 根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征在 于：所述b步骤，将经a步骤所得纯化蛋白按猪脑重量3-6倍的比例加入浓度为75-95%的甲 醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为7-9,加热保温至40-60°C 搅拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液。
4. 根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征 在于：所述c步骤，将经b步骤所得醇提液，60-8(TC条件下真空减压浓缩至猪脑重量的 1/3-1/5,即得醇提浓缩液。
5. 根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征在 于：所述d步骤，将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为2-5,60-80°C 条件下水解3-5h，然后冷却至20-50°C，以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀， 收集上清液，再用6mol/L氢氧化钠溶液调pH值为7-8,即得水解液。
6. 根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征在 于：所述e步骤，将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜 内进行连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将 GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为 1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品。
7. 根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠 GM1原料的制备方法，其特征在 于：所述f步骤，将e步骤所得GM1溶液纯品以-60°C冷冻干燥或喷雾干燥，即得单唾液酸 四已糖神经节苷脂钠 GM1原料。
【文档编号】C07H1/00GK104151372SQ201410368540
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】钏助胜, 彭亚琦 申请人:湖南利诺生物药业有限公司