瑞香狼毒提取物在抗耐药性的药物中应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明的目的在于提供瑞香狼毒提取物或单体组分在制备抗肿瘤耐药性的药物中的应用。本发明所述瑞香狼毒提取物和单体既可以在市场上购买到，也可以通过常规技术手段加工得到，包括：粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到。
【专利说明】瑞香狼毒提取物在抗耐药性的药物中应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药学领域，涉及瑞香狼毒提取物在抗肿瘤及抗耐药性的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]据美国癌症协会估计，90%以上肿瘤患者的死亡受到不同程度耐药影响，肿瘤多药耐药(MDR)已成为肿瘤成功化疗的重要障碍之一。因此克服MDR就成为肿瘤成功化疗的当务之急，寻找具有抗耐药活性的新型化合物已成为克服肿瘤MDR的有效策略之一。
[0003]目前，肿瘤MDR产生的机制主要包括:肿瘤细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号与增殖信号通路的异常活化、药物靶分子修饰或空间构象改变、药物外排泵(P-glycoprotein, Ρ-gp等)的过度表达、DNA损伤修复机制活性增强、药物解毒与消除酶的表达增多(如谷胱甘肽转移酶，GST)等。细胞存活AKT、ERK等信号通路是连接细胞外刺激和细胞内基因表达的桥梁，在肿瘤MDR中发挥着重要作用，其中AKT过表达可导致细胞的恶性转化、产生耐药表型，与肿瘤化疗耐受的关系十分密切。
[0004]在中药中寻找毒副作用小、药理作用独特的抗肿瘤耐药药物是解决肿瘤耐药性问题的途径之一，瑞香狼毒抗肿瘤作用历史悠久，为瑞香科狼毒属植物的根，又名红狼毒、棉大戟、断肠草，是狼毒中的正品，在我国大部分地区均有野生，中药狼毒始载于《神农本草经》，谓其具有散结、逐水、止痛、杀虫的功能；目前国内对瑞香狼毒化学成分的分离研究较多，相关的活性研究并不深入，以往主要研究成果主要有:(1)肿瘤细胞增殖的抑制作用:瑞香狼毒可以抑制肿瘤细胞有丝分裂、诱导细胞凋亡、调节细胞周期等，从而起到抑制细胞增殖的作用。(2)增加化疗药物对肿瘤多药耐药的敏感性。(3)免疫调节作用:增加小鼠免疫器官的重量，显著提高小鼠腹腔吞噬细胞活性，可明显促进脾淋巴细胞转化，从而有助于增强瑞香狼毒的抗肿瘤作用。而对于瑞香狼毒对耐药细胞的直接作用未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供瑞香狼毒提取物或单体组分在制备抗肿瘤耐药性的药物中的应用。
[0006]特别是，瑞香狼毒提取物或单体组分可引起KB及KBv200细胞Gl期阻滞。
[0007]特别是，瑞香狼毒提取物或单体组分引发了细胞内源性凋亡通路。
[0008]特别是，瑞香狼毒提取物或单体组分能有引起KB、KBV细胞发生凋亡。
[0009]瑞香狼毒提取物或单体组分具有治疗肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、皮肤癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、白血病、淋巴癌、鼻咽癌等疾病的作用。
[0010]本发明所述瑞香狼毒提取物和单体既可以在市场上购买到，也可以通过常规技术手段加工得到，包括:粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到。
[0011] 本发明的所述的瑞香狼毒提取物，可以通过以下方法制备得到:[0012](I)正相硅胶柱层析:
[0013]取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏，以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解，在不断搅拌下，加入与浸膏等质量的200-300目柱层析硅胶，拌样，常温下充分晾干；之后干法上样，常压下过200-300目硅胶柱，依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱，收集氯仿-甲醇20:1流份，负压浓缩回收溶剂后，得一级粗分物。
[0014](2)反相ODS柱层析:
[0015]将上述一级粗分物以甲醇溶解后，加入与一级粗分物等质量的粒径为40-50 μ mODS柱层析填料拌样，常温下充分晾干并处理成粉状；之后干法上样，过40-50 μ m ODS层析柱(柱长40cm，内径8cm)，中压泵加压，压力为5_10MPa，流量控制在50_100ml/min，依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱，收集70%甲醇-水流份，负压浓缩回收溶剂后，得二级粗分物。
[0016]本发明所述的瑞香狼毒提取物可以是一级粗分物，也可以是二级粗分物。
[0017]本发明所述瑞香狼毒单体组分，可以通过以下方法制备得到:
[0018](I)高效液相色谱制备:
[0019]将上述二级粗分物以DMSO溶解，配制成浓度为50-100mg/ml的供试品溶液，经
0.45 μ m微孔滤膜过滤；滤液采用柱长25-50cm、直径2-lOcm的高效液相制备色谱柱进行分离，每次进样体积为0.5-2.5ml,以体积浓度70%-80%甲醇-水或45%_55%乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在10-100ml/min，在线紫外检测，检测波长设定为295nm，分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份，负压干燥得6种粉末，即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、
5、6纯品。
[0020]上述方法中，高效液相制备柱的填料为C18键合相，其粒径为5-10 μ m，紫外检测波长优选295nm，具体检测波长根据样品中目标化合物信号的超载情况而定。
[0021]经鉴定，化合物1-6分别为:异西瑞香素，雁皮素D，雁皮素C，( + )-狼毒宁B，异狼毒宁B，狼毒宁E。
[0022]本发明还提供以瑞香狼毒提取物或单体组分作为活性成分的药物组合物在制备抗肿瘤耐药性的药物中的应用。
[0023]本发明的药物组合物中，瑞香狼毒提取物或单体组分所占重量含量的99.9%-0.1%。
[0024]本发明的药物组合物可以制备成任何可药用的剂型，这些剂型包括:片剂、糖衣片齐?、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如:胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。最优选的是胶囊剂。
[0025]本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
[0026]适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
[0027] 可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
[0028]口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
[0029]对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
[0030]本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自:甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β —环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
[0031]本发明以具有肿瘤耐药细胞株为研究对象，观察瑞香狼毒提取物及单体对肿瘤敏感及耐药株的作用，研究显示瑞香狼毒可以诱导耐药株发生周期阻滞，进而发生凋亡，对耐药细胞株有良好的杀伤作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1a:瑞香狼毒提取物可引起KB细胞凋亡。
[0033]图1b:瑞香狼毒提取物可引KBV200细胞凋亡。
[0034]图2:瑞香狼毒提取物对KB，KBV细胞线粒体膜电位的影响
[0035]图3a:瑞香狼毒提取物对KB细胞Be 1-2、Bax的影响
[0036]图3b:瑞香狼毒提取物对KBV200细胞Bcl_2、Bax的影响
[0037]图4a:瑞香狼毒提取物对KB细胞Caspase_3活性的影响
[0038]图4b:瑞香狼毒提取物对KBv200细胞Caspase_3活性的影响
【具体实施方式】
[0039]通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。
[0040]实施例1、瑞香狼毒提取物的制备方法
[0041] 本实施例中，以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料，第一步正相柱层析采用200-300目硅胶，第二步反相柱层析采用40-50 μ m 0DS，第三步高效液相色谱制备采用5 μ mC18键合相制备柱，采用体积浓度75%的甲醇-水溶液为洗脱体系，经三步分离即获得6种化合物纯品。具体工艺步骤如下:
[0042](I)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏，以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解，在不断搅拌下，加入与浸膏等质量的200-300目柱层析硅胶，拌样，常温下充分晾干；之后干法上样，常压下过200-300目硅胶柱，依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱，收集氯仿-甲醇20:1流份，负压浓缩回收溶剂后，得一级粗分物。
[0043](2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后，加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50 μ m ODS柱层析填料拌样，常温下充分晾干并处理成粉状；之后干法上样，过40~50 μ m ODS层析柱(柱长40cm，内径8cm)，中压泵加压，压力为5~lOMPa，流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱，收集70%甲醇-水流份，负压浓缩回收溶剂后，得二级粗分物。
[0044]实施例2、提取组分单体化合物的制备和纯化；
[0045]高效液相色谱制备:将上述二级粗分物以DMSO溶解，配制成浓度为70mg/ml的供试品溶液，经0.45 μ m微孔滤膜过滤；色谱柱为Chromatorex C18制备柱,粒径5 μ m,尺寸500X60mm ;进样体积为1.4ml,以体积浓度为70%甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在60ml/min，在线紫外检测，检测波长设定为295nm，分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份，负压干燥得6种淡棕色粉末，即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品(质量依次约 5.8mg, 14.lmg, 5.8mg, 23.5mg, 20.4mg, 25.8mg)。
[0046]提取组分和单体化合物的化学鉴定
[0047]上述6种化合物的物理参数及结构鉴定结果如下:
[0048]化合物1，白色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:205，350。MS (+ESI) m/z:353.068([M+H]+)。分子量352，分子式为C19H1207。该化合物鉴定为异西瑞香素。
[0049]化合物2，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215, 295。CD (c=0.lmg/ml, MeOH)未出峰。MS (+ESI )m/z:557.148 ([M+H]+)。分子量 556，分子式为 C31H24010。该化合物为新异构体，命名为雁皮素D。
[0050]化合物3，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215, 295。CD (c=0.lmg/ml，MeOH)未出峰。MS (+ESI )m/z:557.148 ([M+H]+)。分子量 556，分子式为 C31H24010。该化合物鉴定为雁皮素C。
[0051]化合物4，淡棕色粉末。UVCMeOH, ) λ maxnm:215, 295? CD(c=0.lmg/ml，MeOH)_4.2(346),0 (325),+13.8 (302),+1.0(274),+3.2(253),0 (240),-2.7 (233),-0.3 (225),-7.3(217)。=+121。( c=0.lmg/ml，MeOH)。MS (+ESI) m/z:571.165 ([M+H]+)。分子量 570，分子式为C32H26010。该化合物鉴定为(+ )-狼毒宁B。
[0052]化合物5，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215, 295。CD (c=0.2mg/ml, MeOH)未出峰。MS (+ESI)m/z:571.165 ([M+H]+)。分子量 570，分子式为 C32H26010。该化合物
鉴定为异狼毒宁B。
[0053]化合物6，淡棕色粉末。UV (MeOH, ) λ maxnm:215，295。CD (c=0.lmg/ml,MeOH) -13.0(309) ,0 (299)， +19.4 (286)，O (260)，-1.1 (254) ,0 (247)，+1.6(241)，O (234)，-14.1(217)。MS(+ESI)m/z:571.165( [M+H]+)。分子量 570，分子式为 C32H26010。该化合物为新异构体，命名为狼毒宁E。[0054]实施例3、耐药性实验
[0055]实验中所用的瑞香狼毒提取物为实施例1的二级粗分物。
[0056]实验中所用的狼毒宁为( + )_狼毒宁B。
[0057]MTT 实验
[0058]以敏感株细胞KB及其耐药株细胞KBv200，敏感株细胞A549及其耐药株细胞A549/tax,Bel7402及其耐药株Bel7402/FU为实验对象，2种常用抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶、长春新碱(VCR)为阳性对照药，采用MTT方法测定瑞香狼毒提取物及狼毒宁抗肿瘤多药耐药(ant1-MDR)的活性。取对数生长期的敏感和耐药株肿瘤细胞胰酶消化后，混匀，计数，接种于96孔培养板内。待细胞培养贴壁后，加入不同浓度的待测药物与2种常用的抗肿瘤药物(VCR、5-FU)，每个药物浓度设3-4个平行孔。继续培养72h后，弃去培养液，每孔加入MTT(0.5mg/ml)继续培养4h，弃去MTT，每孔加入DMSO混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值，抑制率=(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值X 100%,计算IC50及耐药因子(RF resistant factor)。如表1_3所示两种药物均具有较好的抗耐药作用。
[0059]表1
[0060]
【权利要求】
1.瑞香狼毒提取物或单体组分在制备抗肿瘤耐药性的药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，瑞香狼毒提取物或单体组分可引起KB及KBv200细胞Gl期阻滞。
3.权利要求1所述的应用，其特征在于，瑞香狼毒提取物或单体组分引发了细胞内源性凋亡通路。
4.权利要求1所述的应用，其特征在于，瑞香狼毒提取物或单体组分能有引起KB、KBV细胞发生凋亡。
5.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述瑞香狼毒提取物或单体组分既可以在市场上购买到，也可以通过常规技术手段加工得到。
6.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述瑞香狼毒提取物的制备工艺: (1)正相硅胶柱层析: 取瑞香狼毒药材95% 乙醇(体积浓度，下同)提取浸膏，以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解，在不断搅拌下，加入与浸膏等质量的200-300目柱层析硅胶，拌样，常温下充分晾干；之后干法上样，常压下过200-300目硅胶柱， 依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1(体积比，下同)、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱，收集氯仿-甲醇20:1流份，负压浓缩回收溶剂后，得一级粗分物。(2)反相ODS柱层析: 将上述一级粗分物以甲醇溶解后，加入与一级粗分物等质量的粒径为40-50 μ m ODS柱层析填料拌样，常温下充分晾干并处理成粉状；之后干法上样,过40-50 μ m ODS层析柱(柱长40cm，内径8cm)，中压泵加压，压力为5-10MPa，流量控制在50_100ml/min，依次以15%(体积浓度，下同)、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱，收集70%甲醇-水流份，负压浓缩回收溶剂后，得二级粗分物。
7.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述瑞香狼毒单体组分的制备工艺: (O高效液相色谱制备: 将上述二级粗分物以DMSO溶解，配制成浓度为50-100mg/ml的供试品溶液，经0.45 μ m微孔滤膜过滤；滤液采用柱长25-50cm、直径2-lOcm的高效液相制备色谱柱进行分离，每次进样体积为0.5-2.5ml,以体积浓度70%-80%甲醇-水或45%_55%乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在10-100ml/min，在线紫外检测，检测波长设定为295nm，分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份，负压干燥得6种粉末，即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品。
8.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述瑞香狼毒单体组分选自:异西瑞香素，雁皮素D，雁皮素C，( + )-狼毒宁B，异狼毒宁B，狼毒宁E。
9.以瑞香狼毒提取物或单体组分作为活性成分的药物组合物在制备抗肿瘤耐药性的药物中的应用。
10.权利要求7所述的应用，其特征在于，药物组合物中还含有药学上可接受的载体。
【文档编号】C07D311/32GK103933029SQ201410139111
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】朱晓新, 李玉洁, 肖红斌, 李琦, 王娅杰, 陈颖, 杨庆, 翁小刚, 刘晓霓 申请人:中国中医科学院中药研究所