一种磷酸化修饰lea蛋白及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，公开了一种磷酸化修饰LEA蛋白及其制备方法和应用。该磷酸化修饰LEA蛋白在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团，其制备方法包括以下步骤：克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体，将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用酪蛋白激酶磷酸化修饰所述LEA蛋白。所制得磷酸化修饰LEA蛋白对蛋白类产品的保护作用显著增强，可广泛应用于制备蛋白质类产品的保护剂。
【专利说明】一种磷酸化修饰LEA蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法及其用于制备蛋白质类产品的保护剂的应用。
【背景技术】
[0002]LEA (late embryogenesis abundant,胚胎晚期富集)蛋白家族有800多个成员，存在于植物、细菌、酵母、线虫、真菌和摇蚊等200多个生物体中。在植物发育晚期种子中大量积累，与植物的抗逆能力密切相关。LEA家族基因的表达调控不同，有的LEA基因的表达是不受外界因素影响的，而有的LEA基因的表达受干旱、低温、高盐等逆境胁迫的诱导。 [0003]根据LEA蛋白的保守序列，可将其分为7组。其中，LEA3蛋白在生物界中的分布最广泛。LEA3蛋白不仅广泛分布在植物细胞内，而且在非植物物种中发现的LEA蛋白多为LEA3类似蛋白，如原核生物、摇蚊。尤其是在几乎可耐受完全干燥环境的脱水休眠生物(Anhydrobiotes,如齒虫、线虫和轮虫等)中均存在LEA3类似蛋白(Hand S C，etal,2011;Hincha DK, et al，2012)。大量实验证据表明，LEA3蛋白可对脱水胁迫下的蛋白、植物、脱水休眠生物起到很好的保护效果，并可以用于人肝癌细胞的保存(Li S etal，2012)。此外，与其他组LEA蛋白不同的是，LEA3蛋白的表达受脱落酸(ABA)的诱导。因此，从LEA3蛋白的起源早、高保守性、分布的广泛性分析，LEA3蛋白是一类具有生物抗脱水保护功能的重要LEA蛋白。
[0004]现有研究表明，LEA3蛋白序列中存在多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，这些均为可发生磷酸化修饰的氨基酸。然而，目前还不清楚LEA3蛋白是否可被磷酸化修饰及磷酸化修饰后的LEA3蛋白具有哪些功能。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法及其应用。
[0006]本发明所采用的技术方案是提供一种磷酸化修饰LEA蛋白，在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团。
[0007]本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，包括以下步骤:克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体，将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用酪蛋白激酶(Casein Kinase II，CKII)磷酸化修饰所述LEA蛋白。
[0008]本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的应用，将所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂。
[0009]本发明的有益效果在于:通过基因克隆原核表达LEA蛋白，再利用CKII进行磷酸化制备磷酸化修饰LEA蛋白，生产效率高，成本较低。所制得磷酸化修饰后LEA蛋白对蛋白质类产品的保护作用显著增强，可有效保护酶制剂的活性。磷酸化修饰LEA蛋白可广泛应用于制备蛋白质类产品的保护剂，利于产品的稳定及保存。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本发明实施例1大豆PM18B双向电泳图谱；
[0011]图2是本发明实施例PM18B基因PCR产物电泳图；
[0012]图3是PM18基因与本文克隆的PM18B基因的碱基序列比对图，其中，
[0013]NCBI PM18为NCBI公布的大豆PM18碱基序列；PM18B为本发明中克隆
[0014]的PM18B 基因；
[0015]图4 是 BL21-pET-28a-PM18B 菌液 PCR 鉴定电泳图；
[0016]图5是PM18B蛋白SDS-PAGE电泳图；
[0017]图6是本发明实施例1大豆PM18B蛋白对LDH酶的保护作用
【具体实施方式】
[0018]为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]本发明实施例提供了`一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，包括以下步骤:克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体:将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；表达获得所述LEA蛋白:将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用蛋白激酶CKII磷酸化修饰所述LEA蛋白。
[0020]其中，所述LEA蛋白为大豆PM18B基因，所述PM18B基因经过磷酸化修饰后，可明显增强其对酶的保护效果。
[0021 ] 本发明中还提供一种磷酸化LEA蛋白，所述磷酸化LEA蛋白为磷酸化PM18B蛋白。
[0022]本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的应用，将所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂。
[0023]本发明方法生产效率高，成本较低，所制得磷酸化修饰LEA蛋白可应用于制备蛋白质类产品的保护剂，尤其可应用于作为酶制剂的保护剂，可有效保持酶的活性，延长保存期限。以下列举LEA3族的大豆PM18基因为例结合具体参数进一步说明。
[0024]实施例1大豆PM18蛋白存在磷酸化修饰
[0025]采用Hepes等缓冲液和热处理的方法提取了萌发后，胚根未突破种皮的大豆胚根的热稳定蛋白质，定量后运用双向电泳技术将热稳定蛋白质组进行双向电泳，电泳图谱如图1所示。实验结果表明，PM18共含有5个异构体，它们的分子量一致(Mr=35kDa)，而等电点不一致(ΡΙ=6.2,6.0,5.8,5.6 和 5.4)。
[0026]运用MALD1-T0F/T0F MS进一步鉴定了 ΡΜ18蛋白的准分子离子峰的理论值和测量值(m/z[M+H] + )，结果显示，PM18 Tyr-136的准分子离子峰的理论值和测量值(m/z [M+H]+)(500.3130Da与402.2715Da)之间相差98.04Da,为一个磷酸分子的分子量(98Da)。由此可见，PM18的Tyr-136发生了磷酸化修饰。
[0027]实施例2磷酸化修饰LEA蛋白的制备
[0028](I)大豆PM18B基因的克隆[0029]制备培养24小时的大豆种子(白农六号)胚根的总cDNA。以cDNA为模板，PM18AF和PM18AR为引物，PCR扩增得到约970bp的特异片段，与理论值一致，如图2所示。将基因片段与PMD18-T (simple)载体连接，连接产物转化大肠杆菌T0P10。将阳性重组菌测序，结果表明所克隆到得大豆PM18B基因与NCBI上登录的pGmPM18基因(GenBank:AF009953.1)相比，结果如图3所示，在第712bp至第732bp (包括这两个碱基)处缺少21bp，我们暂时将克隆得到的该基因命名为PM18B基因。
[0030]引物序列如下所示:
[0031 ] PM18AF:5' -CCGTCATGAGGCATCATCATCATCATCACATGGCGTCAAGACAGCAAT-3，PM18AR:5' -CACGGAATTCTCACATTTTCTCCCTACGA-3'
[0032](2)原核表达载体pET-28a-PM18B_His的构建及鉴定
[0033]利用pag I和EcoR I双酶切克隆有PM18B基因的T载体，回收约1000bp的酶切产物，并与经过Nco I (pag I的同尾酶)和EcoR I双酶切过的pET_28a连接，连接产物转化T0P10。提取菌液PCR鉴定为阳性的重组菌的质粒pET-28a-PM18B，转化大肠杆菌BL21。菌液PCR法鉴定重组菌BL21-PM18B，结果表明前者的PCR产物中有特异的条带，分子量约960bp，与理论值相符。
[0034](3)大肠杆菌原核表达的PM18B蛋白的获得
[0035]挑取BL21-PM18B菌株的单克隆进行过夜培养。扩大培养至0D600值约为0.6~
0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导外源蛋白质在大肠杆菌中表达。8h后收集菌体，利用快速蛋白液相色谱系统对这两个蛋白进行纯化，得到PM18B蛋白。
`[0036](4)大豆PM18B蛋白磷酸化处理
[0037]真核生物发生磷酸化修饰的位点为Ser, Thr和Tyr。而原核生物大肠杆菌表达的蛋白质在Ser位点发生磷酸化修饰，Thr和Tyr位点不发生磷酸化修饰。因此，我们利用CKII对原核表达的PM18B蛋白进行磷酸化修饰。取2支EP管，分别加入0.94 μ I TrisBuffer, 0.1 μ I IOOmM ΑΤΡ，I μ I 浓度为 100 μ M 的 ΡΜ18 蛋白；然后一管加入 0.1 μ I CKII,一管不加CKII，37°C水浴反应5h，加入26 μ IPBS buffer，4°C保存过夜。
[0038]实施例3磷酸化修饰对大豆PM18B蛋白保护LDH酶活性的影响
[0039]将磷酸化前后的PM18B蛋白与LDH酶(SOyg/ml)，按照摩尔比(蛋白:LDH酶)为1:1、4:1和8:1的比例配制成40μ1的酶溶液。将酶溶液放入液氮速冻lmin。然后放置于25°C恒温器中复性5min。反复冻融3次。取5 μ I酶溶液加入到2ml底物中(IOmmoI/LKH2P04-K2HP04, PH7.5,7.5mmol/L丙酮酸，0.lmmol/L NADH)，利用紫外分光光度计测定反应体系在起始2min内A34tl的减少值。每个反应重复2次。每次2个平行。综合4次实验结果，计算平均值和标准差。根据以下公式计算出残留酶活。LDH酶残留酶活(％)=(待测样品冻融后」A34c/冻融前」A340)X 100%o以残留酶活为纵座标，蛋白与LDH酶的质量比为横坐标，绘制出LDH酶的残留酶活柱形图。以溶菌酶作为阴性对照组。
[0040]结果如图6所示，当加入溶菌酶即摩尔比为0:1的时候，LDH酶在冻融后残留活性为2.1%;当PM18B蛋白与LDH酶的摩尔比为1:1时，LDH酶冻融后的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为2.6%，磷酸化后为3.9% ;在PM18B蛋白与LDH酶的摩尔比为4:1时，LDH酶的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为9.1%，磷酸化后为17.9%，二者达到极显著性差异(P〈0.01);当PM18B蛋白与LDH酶摩尔比为8:1时，LDH酶的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为15%，磷酸化后为21.1%，二者达到显著性差异(P〈0.05)。
[0041]综上所述，磷酸化修饰后LEA蛋白对酶活性的保护作用显著增强，可应用于制备蛋白质类产品的保护剂，尤其是酶制剂存放及稳定的保护剂。
[0042]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任 何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种磷酸化修饰LEA蛋白，其特征在于，所述磷酸化修饰LEA蛋白在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团。
2.根据权利要求1所述的磷酸化修饰LEA蛋白，其特征在于，所述LEA蛋白为LEA3蛋白。
3.根据权利要求1所述的磷酸化修饰LEA蛋白，其特征在于，所述LEA蛋白为大豆PM18蛋白。
4.一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，包括以下步骤:克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体，将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用酪蛋白激酶磷酸化修饰所述LEA蛋白。
5.根据权利要求4所述的磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，其特征在于，所述LEA蛋白为LEA3蛋白。
6.根据权利要求4所述的磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，其特征在于，所述LEA蛋白为大豆PM18蛋白。
7.磷酸化修饰LEA蛋白的应用，其特征在于，将如权利要求1~3任一项所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂`。
8.根据权利要求7所述的磷酸化修饰LEA蛋白的应用，其特征在于，所述蛋白质类产品为酶制剂。
9.根据权利要求7所述的磷酸化修饰LEA蛋白的应用，其特征在于，所述蛋白质类产品为乳酸脱氢酶制剂。
【文档编号】C07K1/107GK103755790SQ201310752496
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】刘昀, 郑易之, 石晓英, 吴佳辉, 胡莹莹 申请人:深圳大学