犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用，所述犬细小病毒单域抗体具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，是以犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼，取外周血得到羊驼抗犬细小病毒血清；提取外周血中RNA，反转录生成cDNA；特异引物扩增纯化VHH片段；将VHH片段与噬菌粒载体连接并转化TG1，构建犬细小病毒单域抗体库；利用犬细小病毒结构蛋白VP2富集所述抗体库，导入表达菌株E.coilHB2151，IPTG诱导具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH表达。本发明制备的犬细小病毒单域抗体检测活性15μg/ml，检测灵敏度250ng/ml，可作为药物应用于犬细小病毒病犬的治疗中。
【专利说明】犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于临床兽医及抗体工程【技术领域】，涉及到一种病毒抗体，特别是涉及一种主要依托羊驼的重链抗体来实现其生物表达的犬细小病毒单域抗体，以及该抗体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]犬细小病毒病由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起，以发病率高、死亡率高、传染性强为特点，一年四季皆可发生，出血性肠炎型和心肌炎型犬细小病毒病的死亡率分别为10%~50%、60%~100%，可造成严重经济损失。预防犬细小病毒病的疫苗主要有:灭活苗、弱毒苗和多联苗，优化的免疫程序可取得较好的免疫效果。但是对市场上疫苗的免疫效果进行检测调查研究发现，仅20%的疫苗能产生100%保护力的抗体。资料表明，我国宠物犬数量达1.5亿，随着宠物犬的数量增多，研究犬细小病毒病的诊断和防治具有重要意义。
[0003]基于抗原与抗体特异性结合的诊断试剂盒，可检测抗原，也可检测抗体，敏感性高、特异性强、稳定性好、操作简便快速、结果易于分析判定。特异性的抗体对于诊断试剂盒的生产至关重要，目前常用抗体有单克隆抗体、多克隆抗体。在治疗方面，早期应用犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清等进行特异性治疗，可以取得较好的效果。但单克隆抗体规模化生产耗时长，抗血清规模化生产不能保证市场需求而且质量不稳定，而且单克隆抗体和抗血清的免疫原性强，在治疗过程中都存在副作用。因此，研究相关特异性强、亲和力高、免疫原性低、可规模化生产的抗体具有重要意义。
[0004]普通抗体IgG(免疫球蛋白G)是血清中最重要的抗体，约占血清中免疫球蛋白总量的75%~80%，在体液免疫中起着“主力免疫”作用。IgG具有2条重链(H链)和2条轻链(L链)，整个抗体分子分为恒定区(C区)和可变区(V区)，分子量为150~160kDa。研究表明，羊驼血清中除了普通抗体IgG，有近一半的IgG为重链抗体，只具有重链可变区(VH)、一个铰链区和两个恒定区(CH2和CH3`)，而对重链抗体的可变区克隆构建只有一个重链可变区的抗体称为单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)，分子量仅为15kD，具有分子量小、结构单一、穿透性好、特异性强、亲和力高以及可溶性高、稳定性强、易克隆、高表达、易纯化等特点。因此，VHH可减少治疗过程中的副作用，可作为生物传感器诊断用靶标试剂，可用于构建免疫融合物、进行靶向治疗，可用于商品化大规模生产。目前，抗体在疾病的治疗方面仅限于细胞表面靶标，全抗体由于分子结构复杂，在细胞内表达困难，限制了其在细胞内的应用，VHH免疫原性低，很难激发T细胞的免疫反应，可以作为治疗性抗体而长期用药。总之，VHH作为一种小型化的基因工程抗体，独特的理化和生物学特性使其在基础研究、药物开发和疾病诊断治疗等领域具有广阔的应用前景。
[0005]随着对基因表达的深入研究，抗体库的出现为抗体制备提供了一种新的手段，利用抗体库技术能够实现抗体的规模化制备，相关的噬菌体展示技术也是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是一种基因表达产物和亲和筛选相结合的技术，其基本原理是将目的基因与编码噬菌体外壳蛋白的基因相连，插入到噬菌体的表达载体上，从而使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合表达并展示在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性；利用噬菌体在大肠杆菌系统易于分离扩增，可以通过与配体的结合选择出表达相应受体的噬菌体颗粒，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，可从中筛选出特异性抗体基因，并可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些生物学活性。这些技术在抗体工程中已有应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清等特异性治疗制剂的缺陷，提供一种分子量小、免疫原性低、特异性强、稳定性强、易克隆表达的犬细小病毒单域抗体，以及该犬细小病毒单域抗体的制备方法和应用。
[0007]为达到上述发明目的，本发明利用噬菌体展示技术，从犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼的外周血中提取RNA，构建CPV-VHH犬细小病毒单域抗体库，并从抗体库中筛选获得具有生物活性的单域抗体。
[0008]本发明的犬细小病毒单域抗体具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本发明上述犬细小病毒单域抗体采用以下步骤进行制备:
1)、提取经犬细小病毒免疫后羊驼外周血中的RNA，反转录生成cDNA;特异引物扩增纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段；
2)、犬细小病毒单域抗体VHH片段与噬菌粒载体连接构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库；
3)、以犬细小病毒结构蛋白VP2加入活化的犬细小病毒噬菌体单域抗体库中，甘氨酸溶液竞争性洗脱，富集噬菌 粒重组载体导入感受态细胞疋HB2151菌株中，IPTG诱导产生具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH蛋白。
[0010]更具体的，步骤1)中是分别以重链可变区特异引物CALL01/ CALL02和VHH特异引物VHH For2/VHH Rev2进行第一次和第二次PCR扩增，回收纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段。
[0011]步骤2)中，是先以犬细小病毒单域抗体VHH片段与质粒载体PMD-18T simple连接构建质粒表达载体PMD-18T-VHH，转化大肠杆菌感受态DH5 α，回收纯化VHH，与噬菌粒载体构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库。
[0012]其中，所述的噬菌粒载体为pCANTAB 5E，构建的噬菌体重组载体为pCANTAB5E-VHH。
[0013]本发明获得的犬细小病毒单域抗体可以作为治疗药物，应用于犬细小病毒病犬的治疗中。
[0014]本发明基于羊驼独特的重链抗体，利用抗体库技术、噬菌体表面展示技术，以犬细小病毒免疫羊驼、建立犬细小病毒单域抗体库，并从中获得了具有生物活性的犬细小病毒单域抗体，可实现抗体的规模化制备。
[0015]羊驼血清中除了普通抗体IgG，有近一半的IgG为重链抗体。以皮下多点免疫法对两只健康成年羊驼进行犬细小病毒免疫，4个免疫周期后，抗血清效价高于1:64。试验表明，以饱和硫酸铵盐析法从羊驼抗犬细小病毒抗血清中初步分离IgG，通过蛋白G亲和层析可以分离纯化出IgGl和IgG3，分子量分别在90kDa和180kDa左右；未结合IgG通过蛋白A亲和层析可以分离出IgG2，分子量在75kD左右。纯化后的羊驼IgG各亚型SDS-PAGE电泳
条带单一。
[0016]本发明利用细胞形态学和噻唑蓝染色，试验观察本发明制备的羊驼抗犬细小病毒抗血清对F81细胞生长及增殖抑制率的影响，结果表明，羊驼抗犬细小病毒抗血清组、犬细小高免血清组细胞生长旺盛，紧密相连，细胞均质而透明；PBS组细胞数量减少、细胞游离、呈拉网状态。细胞增殖抑制率检测表明，羊驼抗犬细小病毒抗血清组、犬细小高免血清组、PBS组与病毒同时作用于F81细胞96h后，细胞增殖抑制率分别为3.9%, 6.2%, 80.8%。
[0017]本发明制备的基于羊驼重链抗体表达的犬细小病毒单域抗体具有分子量小、结构单一、穿透性好、特异性强、亲和力高等特点。本发明利用五轮“吸附-洗脱-扩增”富集法，对噬菌体抗体库进行筛选富集，使噬菌体抗体库富集增长了近4000倍，阳性率达到92%。以ELISA检测犬细小病毒单域抗体的检测活性为15Pg/ml，检测灵敏度为250ng/ml。
[0018]本发明制备的犬细小病毒单域抗体制剂与常规治疗相比，可使死亡率降低，治愈率提高，并可缩短治疗周期，使治愈一只犬细小病犬的费用降低10%~20%。
【具体实施方式】
[0019]下面通过实施例对本发明做进一步的详细说明。应该理解的是，下述实施例仅用于更加清楚地解释本发明，但不能以此限定本发明的保护范围。在本发明权利要求所限定的保护范围内，对其进行的无实质性变化的改变、修改或等效变更，都应落入本发明的保护范围内。
[0020]1、犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼
取CPV病毒液置入三角烧瓶中，加分析纯甲醛稀释至终浓度0.25wt%,边加边摇匀，加塞子并用灭菌纱布包之，37°C作用24~48h ;去塞子，用纱布包三角烧瓶口，间隔摇动，至甲醛味散尽。
[0021]等量病毒液与弗氏完全佐剂乳化，检测效价，作为第一次免疫疫苗；等量病毒液与弗氏不完全佐剂乳化，用血凝试验(HA试验)检测其血凝价，测得结果为29，以此作为疫苗对羊驼进行免疫。
[0022]健康成年雄性羊驼两头(B014、D007)，皮下多点免疫，每隔10天免疫一次，共分四次。每次免疫前颈总动脉取血5mL，离心后收集上层血清，4°C保存。每次免疫完后,血凝抑制试验(HI试验)测抗体效价，效价高于1:64后颈总动脉取血10mL，离心后收集上层血清，获得羊驼抗犬细小病毒血清。
[0023]2、构建犬细小病毒单域抗体库
向250 μ L新鲜全血中加入1000 μ L红细胞裂解液，12000r/min离心30s，留下的白细胞团中加入ImL trizol,Trizol法提取外周血RNA,用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测定RNA浓度和OD值，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
[0024]以RNA为模板,反转录生成cDNA,以β-actin For、β-actin Rev为引物,扩增内参基因β -actin检测cDNA有效性。
[0025]β -actin For:5，-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3，。
β-actin Rev:5’ -AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’。
[0026]以cDNA为模板，用重链可变区特异引物CALL01、CALL02为引物进行第一次扩增，特异扩增产物为600bp的VHH-CH2和900bp的VH-CH1-CH2。
[0027]CALL01:5’ -GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’。
[0028]CALL02:5’ -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’。
[0029]凝胶回收试剂盒回收纯化VHH-CH2，以其为模板，VHH特异引物VHH For2、VHH Rev2为引物进行第二次扩增，特异扩增产物为400bp的VHH。回收纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0030]VHH For2:5， -CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCATGGCCGAKGTSCAGCT-3，。
[0031 ] VHH Rev2:5，-GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCWGGGTCC-3，。
[0032]凝胶回收试剂盒回收纯化犬细小病毒单域抗体VHH，于10 μ L连接体系中连接VHH与质粒载体PMD-18T simple，构建连接物质粒表达载体pMD-18T-VHH。以连接物转化大肠杆菌感受态DH5a，并以蓝白斑筛选挑取白色单克隆菌落于5mL LB培养基中，37°C，200r/min，振荡培养12~16h，质粒提取试剂盒提取菌液质粒，引物VHH For2、VHH Rev2进行PCR鉴定，并进行Not I和Sfi I酶切鉴定。
[0033]Sfi I/Not I双酶切质粒表达载体pMD-18T-VHH和噬菌粒载体pCANTAB 5E，回收纯化的VHH，与噬菌粒载体pCANTAB 5E连接构建噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH。乙醇沉淀法纯化连接产物，并转化经氯化钙法制备的感受态大肠杆菌TG1，挑取单克隆菌落，PCR鉴定和酶切鉴定后，阳性克隆质粒第2次转化TG1，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定。取二次转化的菌液进行10倍、100倍、1000倍滴度稀释，涂布于平板上培养，37°C倒置培养过夜，次日计菌落数，100倍稀释菌生长良好，单克隆明显，100 μ L的涂布菌液生长出约200个单克隆。随机挑取单克隆菌株，PCR鉴定阳性率为90%，有效库容1.8Χ 107。
[0034]3、犬细小病毒单域抗体表达
利用抗原抗体亲和吸附原理，以犬细小病毒结构蛋白VP2为捕捉抗原，加入活化的犬细小病毒噬菌体单域抗体上清，室温静置90min以上，中间不断反复摇动96孔板，弃去未结合噬菌体，用PBS/Tween20(0.05%)洗涤，甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液竞争性洗脱，以五轮“吸附-洗脱-扩增”富集法对噬菌体抗体库进行筛选富集，噬菌体抗体库原始库容1.8X107cfu,活化库容3.6X10ncfu,第一次到第五次富集库容分别为7.8X10ncfu,
1.07X1012cfu, 3.24X1012cfu,9.8X1013cfu,3.lX1015cfu。
[0035]第五次富集结束后，取噬菌体抗体质粒转染TG1菌过夜培养，随机挑选平板上单菌落进行PCR检测，阳性率92%。
[0036]噬菌体抗体库(pCANTAB 5E-VHH)和噬菌粒(pCANTAB 5E)分别转染HB2151感受态细胞，挑取单菌落培养，进行菌液PCR实验，同时提取质粒，用Sfi I/Not I双酶切pCANTAB 5E-VHH噬菌粒，检验导入正确目的载体。
[0037]富集后的噬菌体重组载体pCENTAB 5E-VHH导入到感受态细胞疋co7i HB2151菌株中，由于该宿主细菌无抑制琥珀终止密码子的功能，琥珀终止密码子正常作用，在IPTG诱导下大量表达犬细小病毒单域抗体VHH，产生具有生物活性的可溶性蛋白质。
[0038]利用pCENTAB 5E载体的融合蛋白质标签E_tag特点，设计一抗为兔源Ant1-E-Tag, 二抗为羊抗兔IgG-HRP,进行western-blot检测，蛋白样品中都含有Ε-Tag标签的目的蛋白。
[0039]96孔板包被VP2·蛋白(终浓度15Pg/ml)，将重组表达的VHH蛋白进行梯度稀释，ELISA检测单域抗体活性15Pg/ml。用不同浓度的VP2蛋白包被96孔板，加入VHH蛋白50μ1，ELISA检测单域抗体的灵敏度为250ng/ml。
[0040]将大量表达且经检测具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH真空冷冻干燥，分装安瓿瓶中封口保存。
[0041]以上述制备的羊驼抗犬细小病毒单域抗体对20只犬细小病犬进行治疗，观察其治疗效果，常规治疗组平均连续治疗9天后，死亡率40%，存活率60% ；VHH单域抗体治疗组平均连续治疗8天后，死亡率20%，存活率为80%。
[0042]我国宠物犬数量达1.5亿，犬细小可造成严重经济损失。本发明制备的犬细小病毒单域抗体用于犬细小病犬的治疗，常规治疗组每只病犬治愈期间(9天)总计费用800元,VHH单域抗体治疗组每只病犬治愈期间(8天)总计费用640~720元。与常规治疗相t匕，VHH单域抗体治疗可使死亡率降低，治愈率提高，可缩短治疗周期，使治愈一只犬细小病犬的费用降低10%~20% 。
【权利要求】
1.犬细小病毒单域抗体，具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1犬细小病毒单域抗体的制备方法，采用以下步骤进行制备:1)、提取经犬细小病毒免疫后羊驼外周血中的RNA，反转录生成cDNA;特异引物扩增纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段；2)、犬细小病毒单域抗体VHH片段与噬菌粒载体连接构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库；3)、以犬细小病毒结构蛋白VP2加入活化的犬细小病毒噬菌体单域抗体库中，甘氨酸溶液竞争性洗脱，富集噬菌粒重组载体导入感受态细胞疋HB2151菌株中，IPTG诱导产生具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述步骤1)中，分别以重链可变区特异引物CALL01/ CALL02和VHH特异引物VHH For2/VHH Rev2进行第一次和第二次PCR扩增，回收纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是先以犬细小病毒单域抗体VHH片段与质粒载体pMD-18T simple连接构建质粒表达载体pMD-18T_VHH，转化大肠杆菌感受态DH5 α，回收纯化VHH，与噬菌粒载体构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库。
5.根据权利要求2或4所述的制备方法，其特征是所述的噬菌粒载体为pCANTAB5E。
6.根据权利要求2或4所述的制备方法，其特征是所述构建的噬菌体重组载体为pCANTAB 5E-VHH。
7.权利要求1犬细 小病毒单域抗体在制备治疗犬细小病毒病药物中的应用。
【文档编号】C07K16/08GK103665152SQ201310636895
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】段智变, 孙耀贵, 程志学, 员世宇, 詹俊杰, 杨妍丽, 李小茜 申请人:山西农业大学