一种分离纯化11α-羟基坎利酮的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用大孔树脂分离纯化11α-羟基坎利酮的方法，包括菌丝体分离、烘干粉碎、加热醇提取、大孔树脂柱吸附分离纯化、加压连续层析、浓缩烘干。工艺流程简单，成本低，效益高，层析柱可以活化再生，适合工业化分离纯化11α-羟基坎利酮。使用甲醇溶液加热提取，可使11α-羟基坎利酮提取率较高。采用AB-8大孔树脂，可在高压恒流泵驱动下连续层析，最终获得较纯的11α-羟基坎利酮。
【专利说明】—种分离纯化11α-羟基坎利酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及使用大孔树脂分离纯化Ila-羟基坎利酮的方法，属于微生物转化产物的提取分离纯化领域。
【背景技术】
[0002]Ila-羟基坎利酮是坎利酮羟基化反应后形成的留体类衍生物，也是合成依普利酮的重要药物中间体。依普利酮作为治疗高血压和其他心血管疾病的新型药物，具备广阔的市场前景。微生物转化坎利酮合成Ila-羟基坎利酮的方法具有专一性强、反应条件温和、催化效率高、副产物少、成本低、污染少等优点。
[0003]由于11 a -羟基坎利酮在水中的溶解度极低，由微生物发酵合成的Ila-羟基坎利酮主要吸附在菌丝体表面，很难依靠过滤、离心或萃取单纯的物理方法分离。同时，发酵液中还存在未转化的坎利酮，而坎利酮的物理、化学性质与11 a -羟基坎利酮类似，故对提取物的纯化也是一个重要步骤。
[0004]国内目前对微生物发酵合成11 a-羟基坎利酮及其分离纯化有部分研究和报道，发酵合成Ila-羟基坎利酮所用的微生物主要是赭曲霉、根霉等，对发酵完成后产物Ila-羟基坎利酮提取方法主要是有机溶剂萃取，纯化方法主要是多次结晶法。例如专利(CN 101845474A)用经过波长为200nm_280nm紫外线照射10-30小时的赭曲霉，作为发酵合成11 a -羟基坎利酮的微生物，发酵完成后经过离心机菌液分离，获得的菌丝体加入2.5%的二氯甲烷萃取3-4次，弃菌丝体残渣，蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0.5%甲苯，冷却结晶精制，得到11 a-羟基坎利酮;专利(CN 1727494A)和专利(CN 103255192A)分别用赭曲霉(AS 3.4411)和赭曲霉(TCCC41060)进行发酵合成了 11 a -羟基坎利酮，但均未提及产物11 a -羟基坎利酮的提取纯化方法；2005年茅燕勇利用赭曲霉(NG0216)、葡枝根霉(NG0305)和粉红单端孢霉(NG0207)均进行发酵合成了 11 a -羟基坎利酮，其用冷凝回流法对产物11 a-羟基坎利酮进行了提取，用三次重结晶法对提取的Ila-羟基坎利酮进行了纯化；2012年崔凤杰等对利用根霉0%办0/7心sp.UJS-0602)发酵合成的Ila-羟基坎利酮进行分离提取，证明洗脱法和浸泡法对Ila-羟基坎利酮具有较好的分离效果。
[0005]目前提取发酵合成的Ila-羟基坎利酮的方法是将转化后的发酵液过滤，上清液通过有机溶剂萃取，过滤出的菌体通过用有机溶剂加热搅拌提取、浸泡、洗脱或匀浆，然后将有机溶剂合并后，真空浓缩并多次重结晶。这需要大量有毒有机溶剂，且在提取后的11 a -羟基坎利酮的纯化步骤繁琐。因此，寻找一种简便、提取效率高的提取方法，对转化后的发酵液中的11 a -羟基坎利酮的提取纯化就显得极为重要。
【发明内容】
[0006]本发明涉及一种使用大孔树脂分离纯化11 a -羟基坎利酮的工艺，包括菌丝体的抽滤或离心、烘干粉碎、加热浸提、加压高效大孔树脂分离、重结晶等。
[0007]—种使用大孔树脂分离纯化11 a-羟基坎利酮的方法，其方法具体包括以下步骤:
(I)将根霉0%办0/7心sp.UJS-0602，CICC3143，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)或赭曲霉(Aspergillus ocAraceiAs，CICC40239,购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)转化坎利酮制得的含有Ila-羟基坎利酮的发酵液进行1000-6000 r/min离心10-30分钟或抽滤后，取菌丝体或菌体40-10(TC烘干，粉碎至50-200目。
[0008](2)提取:将粉碎过的菌丝体或菌体用1-8倍体积的浓度为20-90%去离子水稀释的甲醇水溶液，于35-60°C浸泡0.5-5小时后，1000-3000r/min离心10-30分钟或过滤后，用0.5-5倍体积的浓度为20-90%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液。
[0009](3)分离:滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱。第一根上至饱和，第二根上至10-80%饱和。然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱。先用20-60%的甲醇水溶液洗脱2-10BV ;然后再用60-90%的甲醇水溶液洗脱2-10BV。
[0010](4)将含Ila-羟基坎利酮的洗脱流分合并，在40-60°C下减压浓缩后，在40_90°C下烘干，得到提纯的11 α -羟基坎利酮。
[0011](5)将柱子用1-5倍乙酸乙酯洗脱ΑΒ-8大孔树脂柱再生，然后用蒸馏水洗至无乙酸乙酯味即可重复使用。
[0012]本方法中，11 α -羟基坎利酮用高效液相色谱(HPLC)检测条件，色谱柱:AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 mmX4.6 mm，5 μ m);测定条件:甲醇-水为流动相,梯度洗脱40 min ;流速:0.8 mL/min ;检测波长280 nm ;柱温:30°C ;进样量:5 μ L。采用外标法计算公式计算坎利酮和11- α -羟基坎利酮。转化率计算方法:
【权利要求】
1.一种分离纯化11 α -羟基坎利酮的方法，其特征在于，按照以下步骤进行: (1)将根霉{Rhiζopussp.UJS-0602)或赫曲霉{Aspergillus ochraceus)转化坎利酮制得的含有11 α -羟基坎利酮的发酵液进行1000-6000 r/min离心10-30分钟或抽滤后，取菌丝体或菌体40-100°C烘干，粉碎至50-200目； (2)提取:将粉碎过的菌丝体或菌体用1-8倍体积的浓度为20-90%去离子水稀释的甲醇水溶液，于35-60°C浸泡0.5-5小时后，1000-3000r/min离心10-30分钟或过滤后，用`0.5-5倍体积的浓度为20-90%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液； (3)分离:滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱；第一根上至饱和，第二根上至10-80%饱和；然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱；先用20-60%的甲醇水溶液洗脱2-10BV ;然后再用60-90%的甲醇水溶液洗脱2-10BV ； (4)将含11α -羟基坎利酮的洗脱流分合并，在40-60°C下减压浓缩后，在40-90°C下烘干，得到提纯的Ila-羟基坎利酮； (5)将柱子用1-5倍乙酸乙酯洗脱AB-8大孔树脂柱再生，然后用蒸馏水洗至无乙酸乙酯味即可重复使用。`
【文档编号】C07J21/00GK103665083SQ201310626460
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】管国强, 黄达明, 孙文敬, 崔凤杰, 崔鹏景, 钱静亚 申请人:江苏大学