3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法，包括：（1）以D-核糖为起始原料制备单磷酸-3-乙酰吡啶-α-D-核苷；（2）以腺嘌呤核苷为主要原料制备吗啡啉单磷酸腺苷；（3）将吗啡啉单磷酸腺苷和单磷酸-3-乙酰吡啶-α-D-核苷进行对接反应，制备得到3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸。本发明化学合成的方法的起始原料为商品化的工业品D-核糖，中间体制备过程中没有用到任何酶，原料价格低廉、易于购买，大大降低了产品的生产成本；此外，本发明化学合成方法的产品收率高，反应的总收率为4.2%，显著高于现有的生物合成方法的产品收率。
【专利说明】3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的合成方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种嘌呤衍生物的合成方法，尤其涉及3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法，属于3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的合成领域。【背景技术】[0002]3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸能够作为生化试剂原料广泛应用于各种领域。最早报道的有关3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的合成方法的是一篇1956年的文献(The Journal of Biological Chemistry, 1956，221，823-832.)，该方法所公开的 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的合成方法属于生物合成方法。此后，Nathan 0.Kaplan等人公开了一种从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)制备3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的生物合成方法，该方法以NAD为原料，利用猪脑NPD酶的糖苷转移作用，将烟酰胺部分转化成3-乙酰吡啶从而制得3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸。上述这些生物合成方法所用的原料——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)——均存在不易获得的问题。NAD的化学合成方法最早见于Todd等人的报道。然而，这也只是从单磷酸腺苷和单磷酸烟酰胺核苷为原料的半合成方法。后来，David R.Walt 等人以游离的单磷酸腺苷为原料，经过一步水解，脱去腺嘌呤。再通入氨气形成胺基糖。胺基糖与活化过的烟酰胺反应，形成单磷酸烟酰胺核苷。再在酶的作用下和三磷酸腺苷二钠盐作用，形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) (JACS, 1980，102，7805.JACS, 1984，106，234)；[0003]生物合成方法需要专用的场地和设备，所需要的专一性酶只能在实验室制备，并没有商业化的酶可以购买。后处理若处理不好，很容易造成产品酶解。原料NAD和各种酶的成本都很高。[0004]因此，实践中亟待需要开发一种制备成本相对低廉、产物收率高、不需要专一性酶的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的是提供一种制备成本相对低廉、产物收率高的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法。[0006]本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的:[0007]—种3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法，包括以下步骤:[0008](I)以D-核糖为起始原料制备单憐酸-3-乙酸吡唳-a -D-核苷；[0009](2)以腺嘌呤核苷为主要原料制备吗啡啉单磷酸腺苷；[0010](3)将吗啡啉单磷酸腺苷和单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷进行对接反应，制备得到3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸。[0011]其中，优选的，步骤(3)中在甲酰胺，二氯化锰和无水硫酸镁存在下，将吗啡啉单磷酸腺苷和单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷混合搅拌，室温下进行反应， 制备得到3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸；所述的室温优选为20_25°C。[0012]其中，各成分的用量优选为:按摩尔比计，二氯化锰:无水硫酸镁:吗啡啉单磷酸腺苷；单磷酸-3-乙酰吡啶-a-D-核苷=1: (2-3): (0.9_1): 1，甲酰胺过量；[0013]所述的单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷可通过以下方法制备得到:[0014](I)、用三苯基氯甲烷作为D-核糖5-位的保护基，制备得到5-Tr-D-核糖；[0015]优选的，在无水吡啶存在下，将D-核糖与三苯基氯甲烷混合搅拌，在60_85°C，搅拌反应；优选的，按摩尔比计，将D-核糖与三苯基氯甲烷按照1: (1-1.2)的摩尔用量配比在75°C条件下搅拌反应4小时。[0016](2)、由5-Tr-D-核糖制备得到5_Tr_l-胺基-D-核糖；[0017]优选的，步骤(2)中通过以下反应制备得到5-Tr-l-胺基-D-核糖:[0018]将5-Tr-D-核糖在过量的甲醇氨饱和溶液中0_4°C反应，制备得到5_Tr_l-胺基-D-核糖。[0019](3)将5-Tr-l-胺基-D-核糖与3_乙酰吡啶反应，制得3_乙酰吡啶-5_Tr- a -D-核苷;[0020]优选的，步骤(3)中在无水甲醇和三氟甲磺酸三甲基硅酯存在的条件下，将5-Tr-l-胺基-D-核糖的甲醇溶液加入到3-乙酰吡啶中，室温下搅拌进行反应；将反应粗产物用柱层析分离，得到3-乙酰吡啶-5-Tr-a-D-核苷。[0021]其中5-Tr-l-胺基-D-核糖与3_乙酰吡啶的摩尔比优选为1: (1-1.2)；[0022](4)将3-乙酰吡啶-5-Tr- a -D-核苷脱掉保护基，得到3_乙酰吡啶-a -D-核苷 (化合物4)。[0023]优选的，步骤(4)中将3-乙酰吡啶-5-Tr- a -D-核苷在甲醇-稀盐酸中搅拌反应， 脱去保护基。[0024](5)将3-乙酰吡啶-a -D-核苷在三氯氧磷和磷酸三甲酯的作用下，制得单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷(化合物5)。[0025]优选的，步骤(5)中在保持0-4°C温度条件下，将3-乙酰吡啶-a -D-核苷加入到三氯氧磷和磷酸三甲酯中搅拌反应，即得；[0026]进一步，本发明提供了从上述反应产物中分离纯化得到单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷的方法，包括:向反应产物中加入Dowex树脂调节pH到5 ；Dowex树脂用水冲洗后合并水相浓缩后上离子柱，用水洗脱，将洗脱液蒸干水，析出固体，即得。[0027]优选的，本发明通过以下方法以腺嘌呤核苷为主要原料制备吗啡啉单磷酸腺苷:[0028](I)将腺嘌呤核苷在三氯氧磷和磷酸三甲酯的作用下，制得单磷酸腺嘌呤核苷(化合物6)。[0029]在保持0_4°C下，向三氯氧磷和磷酸三甲酯中加入腺嘌呤核苷。保持0_4°C反应； 即得；[0030]本发明还进一步提供了从上述反应产物中分离纯化得到单磷酸腺嘌呤核苷的方法，包括:向反应产物中加入Dowex树脂调节pH到5 ；Dowex树脂用水冲洗后合并水相浓缩后上离子柱，用水洗脱，将洗脱液蒸干水，析出固体，即得。[0031](2)将单磷酸腺 嘌呤核苷在DCC、吗啡啉作用下，制得吗啡啉单磷酸腺苷。[0032]现有的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸合成方法均为生物合成方法，本发明用完全采用化学合成的方法制备了 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸，起始原料为商品化的工业品 D-核糖。中间体制备过程中没有用到任何酶，都是常用的化学试剂，化学原料价格低廉、易于购买，因此总成本远远低于生物合成方法，大大降低了产品的生产成本；此外，本发明方法的产品收率高，八步反应的总收率为4.2%，现有的的生物合成方法(The Journal of Biological Chemistry, 1956，221，823-832.JACS, 1980，102，7805)从全乙酰-D-核糖计算， 总收率仅有2%左右，本发明化学合成方法的总收率显著高于现有的生物合成方法。[0033]本发明与现有技术相比，主要具备以下优点:[0034]第一，本发明完全采用化学方法合成，避开了较为昂贵的酶催化剂。所选用的化学原料在各大试剂公司均有销售。化学原料价格低廉、易于购买，因此总成本远远低于生物合成方法，大大降低了产品的生产成本。[0035]第二，在合成路线上，本发明设计了两个关键中间体:单磷酸-3-乙酰吡啶-a-D-核苷和吗啡啉单磷酸腺苷，分别用独立的路线合成出其中一个关键中间体，然后再进行对接，这样有效的避免了线性合成路线可能带来的合成风险，也显著提高了产物的收率。【专利附图】
【附图说明】[0036]图1本发明3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法的工艺路线图。【具体实施方式】 [0037]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0038]实施例15-Tr-D-核糖(化合物I)的合成。[0039]将15.0g D-核糖加入到250ml三口瓶中，加入100ml无水吡啶，开启搅拌。加入 27.8g三苯基氯甲烷。加热到75°C，搅拌反应4小时。减压下蒸出大部分吡啶，再用甲苯带三次，蒸干得棕色糖浆状产物。再用200ml氯仿溶解，依次用冰水和饱和食盐水洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干，乙醇重结晶得到39.4g产品。即为5-Tr-D-核糖。[0040]LC-MS:【M+Na】+=415。HNMR (MeOH_d4): δ:7.605-7.104 (m, 15H) ；6.260 (d, 1H);5.832 (d, 1H) ;5.201 (d, 1H) ; 5.006 (d, 1H) ppm.[0041]实施例2:5-Tr-l-胺基_D_核糖(化合物2)的合成。[0042]将39.4g5-Tr-D-核糖溶于200ml无水甲醇中，置于恒温低温水浴中，保持(TC。 搅拌下，不断通入干燥的氨气，20小时后检测原料消失，几乎定量的转变成5-Tr-l-胺基-D-核糖。得39.2g黄色固体，即为产物。[0043]LC-MS:【M+H】+=392。HNMR (MeOH_d4): δ:7.523-7.078 (m, 15H) ；5.891 (d, 1H) ;5?755 (d, 1H) ; 4.568 (d, 1H) ; 4.306 (d, 1H) ppm.[0044]实施例3:3-乙酰吡啶-5-Tr- a -D-核苷(化合物3)的合成。[0045]室温下，250ml三口瓶中加入50ml无水甲醇，搅拌下滴入6.0g3_乙酰吡啶。缓慢滴加11.6g三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf )。半小时后，加入5-Tr-l-胺基-D-核糖的甲醇溶液(19.6克5-Tr-l-胺基-D-核糖溶在50ml甲醇中)。滴加完毕，室温搅拌5个小时。 减压蒸出溶剂。用尽量少体积的甲醇溶解，缓慢加入无水乙醚，有固体析出。过滤，干燥，得粗产品。柱层析，用二氯甲烷和甲醇体系洗脱，得3-乙酰吡啶-5-Tr-a-D-核苷9.65g。[0046]LC-MS:[M] +=496 (扣除三氟甲磺酸根之后)。HNMR (DMS0_d6): δ:9.472 (s ，1H) ;9.387 (s, 1H) ;9.165 (d, 1H) ;9.076 (d, 1H) ;8.245-8.134 (m, 1H) ; 7.412-7.30 5 (m, 15H) ; 6.784 (d, 1H) ; 6.543 (d, 1H) ; 4.851-4.741 (m, 1H) ; 4.562-4.021 (m, 2H);-3.623-3.268 (m, 2H) ; 2.656 (s, 3H) ppm.[0047]实施例4:3-乙酰吡啶-a -D-核苷(化合物4)的合成。[0048]室温下，将10.0g3-乙酰吡啶-5-Tr-a-D-核苷溶解在50ml无水甲醇中，开启搅拌，缓慢加入25mll%的稀盐酸。搅拌15分钟左右，出现大量沉淀。过滤,滤液减压蒸出溶剂。用尽量少体积的水溶解，用C-2反相柱(Merck，70-230目)做柱层析。层析液旋干，几乎定量的得到3-乙酰吡啶-a -D-核苷。干燥称重:6.22g。[0049]LC-MS:[M]+=254 (扣除三氟甲磺酸根之后)。HNMR (DMS0-d6): δ:10.512 (s, 1H);9.772 (s, 1H) ;9.310 (d, 2H) ;8.642 (s, 1H) ; 8.154(t, 1H) ; 7.220 (d, 1H) ; 5.985 (t, 1H) ; 5.53 2 (t, 1H) ;5.218 (d, 1H) ; 4.496 (dd, 1H) ; 4.348 (dd, 1H) ; 2.716 (s, 3H) ppm.[0050] 实施例5单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷(化合物5 )的合成[0051](TC下，向反应瓶中加入0.06ml三氯氧磷和0.36ml磷酸三甲酯。开启搅拌,加入 10011^3-乙酰吡啶-0-0-核苷。反应物保持O度，反应4小时。加入几滴水，再加入Dowex 树脂(Dowex resinl X 8，HCO3-型，20-50目)调节pH到5。树脂用200ml水冲洗。水相合并，浓缩至IOml,上样到离子柱。填料为Dowex resinl X 2, CH3COO-型,200-400目，8 X Icm, 用水洗脱。通过和标准样品比对，确定产品所在的层析液，合并，30度下蒸干水。加入丙酮析出固体，过滤得到无定形粉末56mg。[0052]LC-MS:【Μ-1=332。HNMR (D2O): δ:9.987 (s, 1Η) ; 9.885 (d, 1Η) ; 9.654 (d, 1Η) ; 8?876 (t, 1Η) ; 5.223 (d, 1Η) ; 4.865 (t, 2Η) ; 4.436 (d, I H) ; 3.912 (d, I H) ; 3.658 (t, 1Η) ; 2.665 ( s, 3Η) ppm.[0053]实施例6:单磷酸腺嘌呤核苷(化合物6)的合成。[0054](TC下，向反应瓶中加入0.6ml三氯氧磷和3.6ml磷酸三甲酯。开启搅拌，加入 80Img腺嘌呤核苷。反应物保持(TC，反应5小时。加入2ml /K，再加入Dowex树脂(Dowex resinl X 8，HCO3-型，20-50目)调节pH到5。树脂用1000ml水冲洗。水相合并，浓缩至 50ml，上样到离子柱。填料为Dowex resinl X 2，CH3COO-型，200—400目，8 X lcm，用水洗脱。 通过和标准样品比对，确定产品所在的层析液，合并，30°C下蒸干水。加入丙酮析出固体，过滤得到无定形粉末0.56g。收率54%。[0055]LC-MS:[M-1 ]_=346ο HNMR (D2O): δ:8.956 (s, 1H) ; 8.458 (s, 1H) ; 6.054 (d, 1H) ; 5?147 (t, 1H) ; 4.763 (t, 2H) ;4.261 (d, 1H) ;4.013 (d, 1H) ; 3.657 (d, 1H) ppm.[0056]实施例7吗啡啉单磷酸腺嘌呤核苷(化合物7)的合成。[0057]反应瓶中加入347mg单磷酸腺苷和IOml水，IOml叔丁醇,0.34ml (4mmol)纯化过的吗啡啉。加热至回流。缓慢滴加DCC的叔丁醇溶液。(824mg，4mmolDCC溶在15ml叔丁醇中。)整个滴加过程约3-4小时。反应液继续搅拌几个小时，直至在HPLC上显示一个主点。 此时，反应液冷却至室温，析出的固体用过滤的方法除去，并且用叔丁醇洗涤滤饼。滤液在真空下蒸干，直至大部分叔丁醇除去。剩下的水相用乙醚提取三次。提取过程中如有需要可以过滤除去固体。乙醚相蒸干，最后剩余的一点水用油泵抽干，得到玻璃状的残留物。用尽可能少的甲醇溶解，转移到单口瓶中。缓慢蒸出甲醇，加入干燥乙醚，沉淀，得白色固体粉末。干燥，称重:295mg，收率:71%。[0058]LC-MS:【Μ-1=415。HNMR (D2O): δ:9.235 (s, 1Η) ; 8.391 (s, 1Η) ; 5.964 (d, 1Η) ; 4?648 (t, 1Η) ; 4.542 (t, 2Η) ; 4.139 (d, 1Η) ; 4.007 (d, I H) ; 3.912 (d, I H) ; 3.689 (m, 4Η) ; 3.457 ( m, 4Η) ppm.[0059]实施例83-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(化合物8)的合成。[0060]反应瓶中加入20ml甲酰胺，加入187mg 二氯化锰和240mg无水硫酸镁。再加入 416mg的吗啡啉单磷酸腺嘌呤核苷，搅拌15分钟。再加入362mg的3-乙酰吡啶-a -D-核苷。室温搅拌16小时。反应完毕，反应液加入乙腈，粗产品析出。再用树脂(S印hadex QAE A-25)纯化，用0.25M的碳酸氢铵溶液洗脱。再用Amberite XAD-16纯化，用水-甲醇梯度洗脱。之后，冷冻干燥。得到黄色粉末355mg。HPLC纯度98%。[0061]LC-MS:[M+l]+=663o HNMR (D2O): δ:9.332 (s, 1H) ; 9.156 (d, 1H) ; 8.965 (d, 1H) ; 8?440 (s, 1H) ;8.241 (s, 1H) ;8.110 (t, 1H) ;6.100 (t, 2H) ;4.614(t, 1H) ;4.465-4.102 (9H) ;2.756 (s, 3H) ppmo
【权利要求】
1.一种3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的化学合成方法，包括以下步骤:(1)以D-核糖为起始原料制备单憐酸-3-乙酸吡唳-a-D-核苷；(2)以腺嘌呤核苷为主要原料制备吗啡啉单磷酸腺苷；(3)将吗啡啉单磷酸腺苷和单磷酸-3-乙酰吡啶-a-D-核苷进行对接反应，制备得到3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中在甲酰胺、二氯化锰和无水硫酸镁存在下，将吗啡啉单磷酸腺苷和单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷混合搅拌，室温下进行反应，制备得到3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸；其中，各成分的用量优选为:按摩尔比计， 二氯化锰:无水硫酸镁:吗啡啉单磷酸腺苷；单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷=1: (2-3): (0.9-1):1，甲酰胺过量。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的单磷酸-3-乙酰吡啶-a-D-核苷可通过以下方法制备得到:(1)、用三苯基氯甲烷作为D-核糖5-位的保护基，制备得到5-Tr-D-核糖；(2)、由5-Tr-D-核糖制备得到5-Tr-l-胺基-D-核糖；(3)将5-Tr-l-胺基-D-核糖与3-乙酰吡啶反应，制得3-乙酰吡啶_5_Tr-a -D-核苷;(4)将3-乙酰吡啶-5-Tr-a -D-核苷脱掉保护基，得到3_乙酰吡啶-a -D-核苷；(5)将3-乙酰吡啶-a-D-核苷在三氯氧磷和磷酸三甲酯的作用下，制得单磷酸-3-乙酰吡啶-a-D-核苷。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(I冲在无水吡啶存在下，将D-核糖与三苯基氯甲烷混合搅拌，在60-85°C，搅拌反应；优选的，按摩尔比计，将D-核糖与三苯基氯甲烷按照1: (1-1.2)的摩尔用量配比在75°C条件下搅拌反应4小时。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(2)中通过以下反应制备得到5-Tr-l-胺基-D-核糖:将5-Tr-D-核糖在过量的甲醇氨饱和溶液中0_4°C反应。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(3)中在无水甲醇和三氟甲磺酸三甲基硅酯存在的条件下，将5-Tr-l-胺基-D-核糖的甲醇溶液加入到3-乙酰吡啶中，室温下搅拌进行反应；将反应粗产物用柱层析分离，得到3-乙酰吡啶-5-Tr-a -D-核苷。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(4)中将3-乙酰吡啶-5-Tr-a-D-核苷在甲醇-稀盐酸中搅拌反应，脱去保护基；步骤(5)中在保持0-4°C温度条件下，将3-乙酰吡啶-a-D-核苷加入到三氯氧磷和磷酸三甲酯中搅拌反应，即得单磷酸-3-乙酰吡啶-a -D-核苷粗产物。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于:步骤(5)中还包括向单磷酸-3-乙酰吡唳-a -D-核苷粗产物中加入Dowex树脂调节pH到5 ；Dowex树脂用水冲洗后合并水相浓缩后上离子柱，用水洗脱，将洗脱液蒸干水，析出固体，即得单磷酸-3-乙酰吡啶- a -D-核苷纯品。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中以腺嘌呤核苷为主要原料制备吗啡啉单磷酸腺苷的方法包括:(1)将腺嘌呤核苷在三氯氧磷和磷酸三甲酯的作用下，制得单磷酸腺嘌呤核苷；(2)将单磷酸腺嘌呤核苷在DCC、吗啡啉作用下，制得吗啡啉单磷酸腺苷。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于:步骤(1)在保持0-4°C温度条件下，向三氯氧磷和磷酸三甲酯中加入腺嘌呤核苷，保持0-4°C温度进行反应，即得单磷酸腺嘌呤核苷;其中， 将单磷酸腺嘌呤核苷粗产物制备成单磷酸腺嘌呤核苷纯品的方法，包括:向粗产物中加入Dowex树脂调节pH到5 ；Dowex树脂用水冲洗后合并水相浓缩后上离子柱，用水洗脱，将洗脱液蒸干水，析出固体，即得纯品。
【文档编号】C07H21/02GK103601780SQ201310520771
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司