促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法
【专利摘要】本发明公开一种促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法，包括以下步骤：将酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原在温度为4～100℃的条件下，放置5-30分钟时间，使其链间非共价结合的多肽和单个多肽通过二硫键结合形成的二聚体向多肽间二硫键共价交联转化，形成多肽链间共价交联抗原颗粒。本发明无需添加化学物质，以简便、低成本的处理方式即可促进高免疫性抗原颗粒的形成。
【专利说明】促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学技术，尤其涉及一种促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)经过纯化，加佐剂后，制成乙肝疫苗，可预防乙型肝炎。这种HBsAg在菌体内表达后，自发地形成球形颗粒，颗粒内部为宿主菌的脂类，外部聚集了 100多条HBsAg多肽，这种颗粒的免疫原性很差，HBsAg多肽亚单位通过非共价结合的疏水作用松散地粘结在一起，以下称之为I型抗原。由于HBsAg富含半胱氨酸，在菌体外I型抗原逐步转变成共价结合的形式，首先单个多肽通过二硫键结合成二聚体，以下称之为II型抗原，II型抗原比I型抗原的免疫原性高5~10倍，I型抗原和 II型抗原最后通过多肽间二硫键交联，逐渐转化为高免疫原性的抗原，以下称之为III型抗原，III型抗原有高度的多肽间二硫键，此时颗粒平均直径为22nm，其形态、化学性质和免疫原性等方面与天然HBsAg颗粒相似。[0003]为提高酿酒酵母菌表达的HBsAg的免疫原性，常常采用化学处理的方式，如尿素法、高PH法、谷胱甘肽法、硫氰酸盐法等，促使I型和II型抗原亚单位之间形成二硫键交联，向III型抗原转化。但上述方法如果过于剧烈或时间过长，会对HBsAg多肽链的一级结构和空间结构造成破坏，反之，又会处理不够完全，达不到最佳效果。此外最终需要去除添加的化学物质，去除过程会增加纯化工艺的复杂性，耗用更多的时间和物料成本，并且某些残留的化学物质可能会对疫苗接种者造成潜在的伤害。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:提供一种促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法，该方法无需添加化学物质，以简便、低成本的处理方式即可促进高免疫性抗原颗粒的形成，安全性高。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
[0006]一种促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法，该方法包括以下步骤:
[0007]将酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原在温度为4_100°C的条件下，放置3 个月-5分钟时间，使其链间非共价结合的多肽和单个多肽通过二硫键结合形成的二聚体向多肽间二硫键共价交联转化，形成多肽链间共价交联抗原颗粒。
[0008]优选地，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[60， 100] °C，放置时间为90-30分钟。
[0009]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[37，60)°C，放置时间为96小时-90分钟。[0010]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[25，37)°C，放置时间为90天-96小时。
[0011]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[4，25) V,放置时间为3个月-90天。
[0012]优选地，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为100°C，放置时间为30分钟。
[0013]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为60°C，放置时间为90分钟。
[0014]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为37°C，放置时间为96小时。
[0015]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为25°C，放置时间为90天。
[0016]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为4°C，放置时间为3个月。
[0017]本发明的有益效果是:
[0018]本发明的实施例通过将酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原在适当的温度条件下放置适当时间，从而促进了其链间非共价结合和低度共价结合的抗原向二硫键链间共价交联颗粒抗原的转化，达到了无需添加化学物质，以简便、低成本的处理方式即可促进高免疫性抗原颗粒的形成的效果，且安全性高。
[0019]下面结合附图对本发明作进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本发明提供的方法第一实施例中A批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0021]图2是本发明提供的方法第一实施例中B批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0022]图3是本发明提供的方法第一实施例中C批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0023]图4是本发明提供的方法第二实施例中A批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0024]图5是本发明提供的方法第二实施例中B批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0025]图6是本发明提供的方法第二实施例中C批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0026]图7是本发明提供的方法第三实施例中A批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0027]图8是本发明提供的方法第三实施例中B批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、 I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意 图。
[0028]图9是本发明提供的方法第三实施例中C批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0029]图10是本发明提供的方法第四实施例中A批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中 1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0030]图11是本发明提供的方法第四实施例中B批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中 1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0031]图12是本发明提供的方法第四实施例中C批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中 1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0032]图13是本发明提供的方法第五实施例中A批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中 1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0033]图14是本发明提供的方法第五实施例中B批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中
1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
[0034]图15是本发明提供的方法第五实施例中C批号酿酒酵母菌表达的重组HBsAg中
1、I1、III型抗原组分含量随时间变化的示意图。
【具体实施方式】
[0035]下面详细描述 本发明提供的促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法，该方法包括以下步骤:
[0036]将酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原在温度为4~100°C的条件下，放置 5分钟-3个月时间，使其链间非共价结合的多肽和单个多肽通过二硫键结合形成的二聚体向多肽间二硫键共价交联转化，形成多肽链间共价交联抗原颗粒。在前述范围内，放置温度与放置时间成反比关系，即放置温度越高，放置时间越短。
[0037]具体实现时，作为本发明的一个较佳实施方式，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为可在[60，100] °C，放置时间可为90-30分钟。
[0038]或者，在上述方法中，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度也可在[37，60) °C范围，放置时间相应地调整为96小时-90分钟。
[0039]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度也可为[25， 37) °C范围，放置时间相应地调整为90天-96小时。
[0040]或者，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度也可在[4，25)°C 范围，放置时间相应地调整为3个月-90天。
[0041]下面参考附图1-图3详细描述本发明提供的促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法的第一实施例。
[0042]实施例1:4°C处理
[0043]本实施例中，取3批浓度为20 U g/ml的经纯化的酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原(r-HBsAg)，在4°C的温度下放置3个月，并在开始0、1、2、3个月的时间点，分别用分子排阻高效液相色谱法分析样品，计算各型抗原吸收峰面积百分率，其结果见表1、图1-图 3。
[0044]表14°C处理不同时间各型抗原吸收峰的面积百分率(％)
【权利要求】
1.一种促进酿酒酵母菌表达的乙型肝炎表面抗原共价交联颗粒形成的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:将酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原在温度为4-100°C的条件下，放置3个月-5分钟时间，使其链间非共价结合的多肽和单个多肽通过二硫键结合形成的二聚体向多肽间二硫键共价交联转化，形成多肽链间共价交联抗原颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[60，100] °C，放置时间为90-30分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[37,60) °C，放置时间为96小时-90分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[25，37) °C，放置时间为90天-96小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为[4,25) °C,放置时间为3个月-90天。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为100°C,放置时间为30分钟。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为60°C,放置时间为90分钟。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为37°C,放置时间为96小时。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为25°C,放置时间为90天。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌表达的重组乙型肝炎表面抗原的放置温度为4°C，放置时间为3个月。
【文档编号】C07K14/02GK103524604SQ201310455366
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】朱征宇, 饶洪冲, 段琰 申请人:深圳康泰生物制品股份有限公司